KR101734935B1

KR101734935B1 - 메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 지질분해효소 및 그의 생산 방법

Info

Publication number: KR101734935B1
Application number: KR1020170026539A
Authority: KR
Inventors: 김훈; 김희정; 정유석; 정원경
Original assignee: 순천대학교 산학협력단; (재) 순천천연물의약소재개발연구센터
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2017-05-16

Abstract

본 발명은 메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K), 상기 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체 또는 에스테라아제 또는 리파아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포를 이용하여 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 에스테라아제(Est3K) 및 리파아제(Lip3K)는 알칼리성 및 내열성을 가지고, 각각 p-니트로페닐 부티레이트(C4) 및 p-니트로페닐 옥타노에이트(C8)를 선택적으로 가수분해하는 활성을 나타내며, 특히 리파아제(Lip3K)는 Ca2+ 이온 또는 30% 메탄올 존재 하에 지질분해 활성이 향상되므로, 유지방 분해제나 유제품 내의 지질 분해제, 사료 조성물, 세제 조성물, 섬유제품 첨가제 또는 고분자 합성 첨가 조성물은 물론 바이오 디젤을 생산하는 에스터 교환반응의 강력한 생촉매제 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 지질분해효소 및 그의 생산 방법{Novel lipolytic enzyme from metagenomic library and process for preparing the same}

본 발명은 메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 지질분해효소 및 그의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 지질분해효소, 상기 지질분해효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체 또는 상기 지질분해효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포를 이용하여 지질분해효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

지질분해효소(lipolytic enzymes)인 에스테라아제(esterases) 및 리파아제(lipases)는 카르복시에스테르 가수분해효소(carboxylic ester hydrolases)로서, 글리세롤의 가수분해를 촉진하며, α/β 가수분해효소 접힘(α/β hydrolase fold) 부분을 갖는 초군(superfamily)에 속한다(Ollis, D. L., et al., 1992, Protein Engineering, 5:197-211.). 지질분해효소 중 에스테라아제는 10개 이하의 탄소를 함유하는 짧은 사슬 지방산(short chain fatty acids)의 에스테르 결합을 가수분해하며, 리파아제는 10개 이상의 긴 사슬 지방산(long chain fatty acids)의 에스테르 결합을 가수분해한다. 이러한 에스테라아제 및 리파아제는 바이오폴리머, 바이오디젤, 키랄 중간체(chiral building block), 의약품, 방향 화합물 및 농약의 합성 및 생산에 사용될 뿐만 아니라 라세미 혼합물의 분해 등 광범위하게 사용된다(Jaeger, K. E., and Eggert, T., 2002, Current Opinion in Biotechnology, 13:390-397.).

지질분해효소는 각종 동물, 식물, 곰팡이 및 세균으로부터 발견되었으며, 그 중에서도 미생물(곰팡이 및 세균)이 생산하는 지질분해효소가 다양한 기질특이성, 위치특이성, 입체특이성을 가지고 있어 산업적으로 많이 이용되고 있다.

세균성 지질분해효소는 8개의 군(family)으로 나누어지며, 최근에는 새로운 지질분해효소가 발견되어 15개 군으로 확장되었다(Arpigny, K. E. and Jaeger, K. E., 1999, Biochemical Journal, 343:177-183.; Charbonneau, D. M. and Beauregard, M., 2013, PLoS One, 8:e76675.). 구체적으로 Family I은 가장 큰 군으로 그람 음성 박테리아로부터 분리된 아군(subfamily) I.1, I.2 및 I.3을 포함하는 7개의 아군(I.1~I.7)으로 세분된다(Jaeger, K. E., and Eggert, T., 2002, Current Opinion in Biotechnology, 13:390-397.). 상기 아군 I.3 효소의 구조 및 기능은 아군 I.1 및 I.2 효소와 비교되는데, 전형적으로 아군 I.3 리파아제는 타입 I 분비 시스템을 통해 분비된다. Family IV 리파아제는 호르몬 민감성 리파아제(hormone sensitive lipase, HSL) 군으로 이들의 아미노산 서열은 포유동물의 HSL과 유사하다(Arpigny, K. E. and Jaeger, K. E., 1999, Biochemical Journal, 343:177-183.).

한편, 메타게놈(metagenome)은 많은 개체의 게놈을 구성하는 환경적인 시료로 모든 유전적인 물질(genetic material)과 관련이 있다(Handelsman, J. 2004, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68:669-685.). 이러한 메타게놈은 새로운 생체촉매의 검출에 유용하며, 특히 미생물을 분리하거나 배양하지 않고도 미생물의 유전자를 연구할 수 있는 이점이 있다. 많은 에스테라아제 및 리파아제 유전자는 해양 환경, 토양, 물, 산림 토양, 및 퇴비를 포함하는 다양한 환경의 메타게놈으로부터 분리할 수 있다고 보고되어 있다(Biver, S. and Vandenbol, M., 2013, Applied Microbiology and Biotechnology, 97:8559-8568.; Fang, Z., et al., 2014, Journal of Microbiology and Biotechnology, 24: 771-780.; Chow, J., et al., 2012, PLoS One, 7:e47665.; Bunterngsook, B., et al., 2010, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 74:1848-1854.; Kim, Y. H., et al., 2010, Biochemical and Biophysical Research Communications, 393;45-49.).

이에 본 발명자들은 다양한 에스테라아제 및 리파아제 유전자를 다양한 환경의 메타게놈 라이브러리로부터 분리할 수 있다는 사실에 근거하여 유류로 오염된 갯벌의 메타게놈 라이브러리로부터 신규한 에스테라아제 및 리파아제를 분리 및 동정하였고, 상기 분리된 에스테라아제 및 리파아제는 알칼리성 및 내열성을 가지며, 지방산을 효율적으로 가수분해함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 에스테라아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 리파아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 에스테라아제 또는 리파아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 에스테라아제 또는 리파아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 에스테라아제 또는 리파아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 형질전환체, 또는 상기 에스테라아제 또는 리파아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포를 이용하여 에스테라아제 또는 리파아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 분자량이 34 kDa이고, 최적 활성 온도 및 pH는 각각 50℃ 및 pH 9.0이며, pH 8.0 내지 10.0 및 40 내지 55℃에서 효소 활성이 안정한 알칼리성 및 내열성을 가지고, p-니트로페닐 부티레이트(C4)를 선택적으로 가수분해하는 것을 특징으로 하는 신규 에스테라아제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 에스테라아제는 총 900bp의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 것이고, 299개의 아미노산으로 번역되며, 신호 펩타이드(signal peptide)를 가지고 있지 않는다.

또한, 상기 에스테라아제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되어 있고, 'HGGG' 모티프를 74번째 내지 78번째 아미노산 영역에 가지고 있으며, 'GXSXG' 모티프를 144번째 내지 148번째 아미노산 영역에 가지고 있으며, 'DPL' 모티브를 244번째 내지 246번째 아미노산 영역에 가지고 있으며, 'HGF' 모티프를 270번째 내지 272번째 아미노산 영역에 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 이는 본 발명의 에스테라아제가 지질분해효소 중 Family Ⅳ에 속함을 의미한다.

따라서, 본 발명의 에스테라아제는 Family Ⅳ에 속하는 신규한 지질분해효소이다. 본 발명에서는 상기한 특징을 가지는 에스테라아제를 Est3K라 명명하였다.

본 발명에 있어서, 상기 신규 에스테라아제는 메타게놈 라이브러리를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체로부터 정제하여 수득할 수 있다. 이때, 상기 메타게놈 라이브러리는 자연 또는 특정 지역(온천, 농장, 퇴비, 유류 오염 지역)에 존재하는 미생물 군집을 채취하고, 상기 미생물 군집으로부터 유전체를 직접 추출하여 벡터에 도입시켜 이루어진 것이다.

구체적으로, 본 발명의 에스테라아제는 메타게놈 라이브러리를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하고, 상기 제조된 형질전환체를 배양한 후 그 배양 상등액으로부터 당업계에 공지된 단백질 정제방법을 통해 정제하여 수득할 수 있다. 여기서, 상기 숙주세포는 형질전환을 위해 정상적인 숙주세포에 화학적 처리를 하여 외래 유전자가 세포 내에 잘 들어가 외래 유전자의 형질을 나타낼 수 있는 능력을 가지는 세포로서, 상기 정상적인 숙주세포는 대장균(E. coli), 바실러스 속(Bacillus) 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 균주 및 슈도모나스 속(Pseudomonas) 균주 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 정제방법은 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등을 통해 에스테라아제를 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 에스테라아제는 알칼리성 및 내열성을 가지며, pH 8.0 내지 10.0 및 40 내지 55℃의 온도에서 p-니트로페닐 부티레이트(C4)를 가수분해하는 활성을 나타내므로, 유지방 분해제나 유제품 내의 지질 분해제, 사료 조성물, 세제 조성물, 섬유제품 첨가제 또는 고분자 합성 첨가 조성물 등에 유용하게 이용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 분자량이 64 kDa이고, 최적 활성 온도 및 pH는 각각 50℃ 및 pH 9.0이며, pH 7.0 내지 9.5 및 45 내지 55℃에서 효소 활성이 안정한 알칼리성 및 내열성을 가지고, p-니트로페닐 옥타노에이트(C8)를 선택적으로 가수분해하며, Ca² ⁺ 이온 첨가 시 지질분해 활성과 열 안정성이 각각 180 내지 200%, 20 내지 40% 증가하고, 30% 메탄올 첨가 시 지질분해 활성이 150 내지 180%로 증가하는 것을 특징으로 하는 신규 리파아제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 리파아제는 총 1,951bp의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 것이고, 616개의 아미노산으로 번역되며, 신호 펩타이드(signal peptide)를 가지고 있지 않는다.

또한, 상기 리파아제는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되어 있고, 'VTLVG'모티프를 598번째 내지 602번째 아미노산 영역에 가지고 있으며, 'GGXGDXUX'모티프를 372번째 내지 416번째 아미노산, 492번째 내지 545번째 아미노산, 및 548번째 내지 556번째 아미노산 영역에 가지고 있으며, 'GXSXG'모티프를 204번째 내지 208번째 아미노산 영역에 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 이는 본 발명의 리파아제가 지질분해효소 중 Family I.3에 속함을 의미한다.

따라서, 본 발명의 리파아제는 Family I.3에 속하는 신규한 지질분해효소이다. 본 발명에서는 상기한 특징을 가지는 리파아제를 Lip3K라 명명하였다.

본 발명의 리파아제는 상기 에스테라아제와 동일하게 메타게놈 라이브러리를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체로부터 정제하여 수득할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 리파아제는 메타게놈 라이브러리를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하고, 상기 제조된 형질전환체를 배양한 후 그 배양 상등액으로부터 당업계에 공지된 단백질 정제방법을 통해 정제하여 수득할 수 있다. 상기 숙주세포의 특징, 숙주세포의 종류, 및 정제방법 등은 상기 기재한 바와 같으므로 이하에서는 생략한다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 리파아제는 알칼리성 및 내열성을 가지고, pH 7.0 내지 9.5 및 45 내지 55℃에서 p-니트로페닐 옥타노에이트(C8)를 가수분해하는 활성을 나타내며, 특히 Ca² ⁺ 이온 또는 30% 메탄올 존재 하에서 지질분해 활성이 향상되므로 유지방 분해제나 유제품 내의 지질 분해제, 사료 조성물, 세제 조성물, 섬유제품 첨가제 또는 고분자 합성 첨가 조성물은 물론 바이오 디젤을 생산하는 에스터 교환반응의 강력한 생촉매제로 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기한 특징을 나타내는 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이때, 상기 에스테라아제(Est3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있고, 리파아제(Lip3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드 서열, 폴리뉴클레오타이드 분자, 핵산, 핵산분자, 핵산서열 등의 용어와 동등한 의미로 사용되며, 상기 핵산은 RNA(ribonucleic acid) 또는 DNA(deoxyribonucleic acid)를 포함한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "벡터"는 적합한 숙주세포 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 벡터 중 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 벡터는 (a) 숙주세포 당 수백 개의 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 형질전환을 위해 정상적인 숙주세포에 화학적 처리를 하여 외래 유전자가 세포 내에 잘 들어가 외래 유전자의 형질을 나타낼 수 있는 능력을 가지는 세포로서, 상기 정상적인 숙주세포는 대장균(E. coli), 바실러스 속(Bacillus) 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 균주 및 슈도모나스 속(Pseudomonas) 균주 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환하는 방법은 재조합 벡터가 숙주세포 안으로 삽입되는 것이라면 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들어, CaCl₂ 방법, 전기천공방법, 미세주입법 등 어느 것이나 가능하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "재조합 벡터"는 통상 이종의 DNA 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 수용성 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 재조합 벡터는 일단 수용성 세포 내에 있으면 수용성 세포의 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며, 벡터 수개의 카피 및 그의 삽입된 이종 DNA가 생성될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "형질전환"은 도입과 동등한 의미로 사용되며, 사용된 방법에 관계없이 외래 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포로의 전달을 모두 포함한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 제조하는 방법을 제공한다.

a) 상기 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포를 배양하는 단계; b) 상기 형질전환체 또는 세포에서 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)의 발현을 유도하는 단계; c) 상기 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)가 발현되는 형질전환체 또는 세포를 분쇄한 후 침전시켜 얻어진 상등액으로부터 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 용출하는 단계; 및 d) 상기 용출된 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 정제하는 단계.

상기 제조방법에 있어서, 상기 a) 단계에서 재조합 벡터를 형질전환시킬 수 있는 숙주세포로는 외래 유전자가 세포 내에 잘 들어가 외래 유전자의 형질을 나타낼 수 있는 능력을 가지는 세포라면 어느 것이나 이용할 수 있으며, 예를 들어, 대장균(E.coli), 바실러스 속(Bacillus) 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 균주 및 슈도모나스 속(Pseudomonas) 균주 등을 사용할 수 있다.

상기 a) 단계에서 형질전환체 또는 세포의 배양은 LB(Luria-Bertani) 액체 배지에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 상기 형질전환체 또는 세포를 선별적으로 증식시킬 수 있는 암피실린, 가나마이신 및 테트라사이클린 등의 항생제를 포함한 LB 액체배지, 보다 바람직하게는 암피실린을 함유한 LB 액체배지에서 배양할 수 있다.

상기 b) 단계에서 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)의 발현 유도는 알로락토오즈(allolactose) 및 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside) 등의 유도물질을 처리하여 유도할 수 있으며, 바람직하게는 IPTG를 최종농도가 0.01 내지 1 mM, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 mM, 보다 바람직하게는 0.1 mM가 되도록 처리하여 유도할 수 있다.

상기 c) 단계에서 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)의 용출은 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)의 생물학적 기능에 손실을 주지 않는 무기산 또는 유기산의 염을 포함하고 있는 완충용액을 사용하여 용출할 수 있다. 예를 들어, 구연산염, 초산염, 호박산염, 유산염, 타르타르산염, 포름산염, 프로피온산염, 인산염, 또는 붕산염을 포함하는 완충용액일 수 있다.

상기 d) 단계에서 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)의 정제는 당업계에 공지된 단백질 정제 방법을 이용하여 정제할 수 있으며, 바람직하게는 이온교환 크로마토그래피, 겔-투과 크로마토그래피, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 및 친화성 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 에스테라아제(Est3K) 및 리파아제(Lip3K)는 알칼리성 및 내열성을 가지고, 각각 p-니트로페닐 부티레이트(C4) 및 p-니트로페닐 옥타노에이트(C8)를 선택적으로 가수분해하는 활성을 나타내며, 특히 리파아제(Lip3K)는 Ca² ⁺ 이온 또는 30% 메탄올 존재 시 지질분해 활성이 향상된다. 따라서, 본 발명의 에스테라아제(Est3K) 및 리파아제(Lip3K)는 유지방 분해제나 유제품 내의 지질 분해제, 사료 조성물, 세제 조성물, 섬유제품 첨가제 또는 고분자 합성 첨가 조성물은 물론 바이오 디젤을 생산하는 에스터 교환반응의 강력한 생촉매제 등에 이용될 수 있으므로, 그 산업적 가치가 매우 크다 할 것이다.

도 1은 본 발명의 Est3K와 종래 지질분해효소의 아미노산 서열을 비교분석(alignment)한 그림이다.
도 2는 본 발명의 Lip3K와 종래 지질분해효소의 아미노산 서열을 비교분석(alignment)한 그림이다.
도 3은 본 발명의 Est3K와 Lip3K의 계통수를 나타낸 그림이다.
도 4는 에스테라아제 활성을 가지는 SKE3 균주와 에스테라아제 및 리파아제 활성을 가지는 SKEL5 균주로부터 크로마토그래피를 통해 정제한 Est3K 또는 Lip3K의 분자량을 SDS-PAGE로 분석한 겔(gel) 사진이다.
도 5는 본 발명의 Est3K 또는 Lip3K이 p-니트로페닐 에스테르를 분해하는 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 반응 온도에 따른 본 발명의 Est3K 또는 Lip3K의 효소 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 반응 온도 및 시간에 따른 본 발명의 Est3K 또는 Lip3K의 효소 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 pH에 따른 본 발명의 Est3K 또는 Lip3K의 효소 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 Ca² ⁺ 이온 존재 하에서 반응 온도 및 시간에 따른 본 발명의 Lip3K의 효소 활성 변화를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시 예들을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예들은 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예들에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시 예 1: 유류 오염된 갯벌로부터 메타게놈 라이브러리( metagenomic library)의 제작 및 에스테라아제/리파아제 활성 클론 선택

유류로 오염된 태안군의 갯벌로부터 Kim et al.(Biochem Biophys Res Commun., 2010, 393(1):45-49.)에 기재된 방법을 사용하여 30 내지 60 kb 크기의 메타게놈 DNA를 추출하였다. 상기 추출된 메타게놈 DNA에 Sau3AⅠ를 처리하여 DNA를 3~8kb의 크기로 잘라준 후 0.7% 아가로오즈 겔에 전기영동하여 메타게놈 DNA를 용출하였다. 그 다음 상기 용출된 메타게놈 DNA를 BamHⅠ으로 잘린 pUC19 벡터에 결찰(ligation)시킨 후 열충격(heat-shock) 방법을 사용하여 E. coli DH5α(Yeastern Biotech. Co., Taipei, Taiwan) 안으로 도입시켰다. 상기 메타게놈 DNA를 포함한 pUC19 벡터가 도입된 E. coli는 암피실린(50 ㎍/ml), X-Gal, 및 IPTC가 함유된 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 그 다음 이쑤시개로 상기 배양된 균주를 채취한 후 1.0% 글리세릴 트리부티레이트(glyceryl tributyrate) 또는 1.0% 글리세릴 트리옥타노에이트(glyceryl trioctanoate)가 각각 함유된 LB 고체 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 에스테라아제/리파아제 활성을 가지는 균주를 선별하였다.

그 결과, 7개의 에스테라아제 활성을 가지는 균주와 2개의 리파아제 활성을 가지는 균주를 선별하였다. 특히, 상기 선별된 균주 중 SKE3 균주는 높은 에스테라아제 활성을 나타내었으며, SKEL5는 에스테라아제 및 리파아제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시 예 2: 에스테라아제 및/또는 리파아제의 유전자 및 아미노산 서열 분석, 및 계통수 작성

2-1. 에스테라아제 활성을 나타내는 SKE3 균주의 유전자 및 아미노산 서열, 및 계통수 작성

상기 실시 예 1에서 선별된 에스테라아제 활성을 나타내는 SKE3 균주로부터 에스테라아제 활성 클론이 재조합된 플라스미드의 제한효소 맵을 구축하고 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열을 솔젠트(SolGent, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 상기 클로닝된 유전자의 보전 영역의 뉴클레오타이드 서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BlastP를 이용하여 확인하고, CBS(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) SignalP 3.0을 이용하여 신호 펩타이드(signal peptide)를 예측하였다.

한편, 효소의 계통수는 DNA/MAN(Lynnon Biosoft, version 4.11, Quebec, Canada)을 사용하여 작성하였다. 코딩된 단백질의 분자량 및 암호화된 단백질의 등전점(pI; isoelectric point)은 ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)를 사용하여 분석하였고, 코딩된 단백질의 활성 부위(active site)는 pfam 데이터베이스를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 1 및 도 3에 나타내었다.

실험결과, SKE3 재조합 플라스미드에 약 3.3kb 크기의 DNA 단편이 삽입되어 있으며, 삽입된 DNA 단편 중 에스테라아제와 매우 유사한 활성을 나타내는 효소를 코딩하는 ORF(open reading frames)는 900bp의 폴리뉴클레오타이드(서열번호 1)로 이루어져 있음을 확인하였다. 본 발명자는 에스테라아제와 매우 유사한 활성을 나타내는 지질 분해효소를 Est3K라고 명명하였다.

도면에는 나타내지 않았지만 Est3K는 299개 아미노산(서열번호 2)을 암호화하고 있고, 신호 펩타이드(signal peptide)는 확인되지 않았으며, 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.) Ag1 의 에스테라아제(GenBank accession number WP_008438797) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)의 에스테라아제/리파아제(WP_023659021)와 99%의 높은 상동성을 가지며, 슈도모나스 종 PAMC 26793 에스테라아제(WP_026078148) 95% 상동성을 가지며, 슈도모나스 종 PAMC 25886의 에스테라아제(WP_010175806)와 89%의 상동성을 가지며, 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae)의 에스테라아제(WP_027901927)와 76%의 상동성을 가짐을 확인하였다.

도 1에서 보듯이, Est3K는 Family Ⅳ에 속하는 지질분해효소가 가지는 보존 영역인 HGGG(oxyanion hole) 모티프(74번째 내지 78번째 아미노산), GXSXG 모티프(144번째 내지 148번째 아미노산), DPL 모티프(244번째 내지 246번째 아미노산) 및 HGF 모티프(270번째 내지 272번째 아미노산) 영역을 포함하고 있고, Est3K의 분자량 및 이론적 등전점은 각각 32,354 Da 및 8.82로 추정된다.

또한, 도 3에서 보듯이 계통수 작성을 통해 Est3K는 Family Ⅳ에 속함을 확인하였다.

2-2. 에스테라아제 및 리파아제 활성을 나타내는 SKEL5 균주의 리파아제 활성 유전자 및 아미노산 서열, 및 계통수 작성

상기 실시 예 1에서 선별된 에스테라아제 및 리파아제 활성을 나타내는 SKEL5 균주로부터 리파아제 활성 클론이 재조합된 플라스미드의 제한효소 맵을 구축하고 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열을 솔젠트(SolGent, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석한 다음, 상기 2-1과 동일한 방법으로 리파아제 활성을 가지는 유전자의 서열 및 신호 펩타이드, 리파아제 활성 효소의 아미노산 서열, 분자량, 이론적 등전점(pI) 및 계통수를 작성하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

실험 결과, SKEL5 재조합 플라스미드에서 리파아제를 코딩하는 ORF(open reading frames; lip3K)는 총 1,951bp의 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3)로 이루어져 있음을 확인하였다. 본 발명자는 리파아제 활성을 나타내는 지질 분해효소를 Lip3K 라고 명명하였다.

도면에는 나타내지 않았지만, Lip3K는 616개 아미노산(서열번호 4)을 암호화하고 있고, 신호 펩타이드(signal peptide)는 확인되지 않았으며, 슈도모나스 종 UB48 (AAG09700) 리파아제, 슈도모나스 종 GM30 (WP_007967001)의 추정 칼슘-결합 단백질 및 슈도모나스 종 MIS38 (BAA84997)의 리파아제와 93%의 상동성을 가지며, 슈도모나스 플루오레센스 B52 (AAT48728) 및 슈도모나스 종 CR-611 (AFP20145)의 리파아제와 92%의 상동성을 가짐을 확인하였다.

도 2에서 보듯이 Lip3K는 Family 1.3에 속하는 지질분해효소가 가지는 보존 영역인 5개의 잔기 서열 모티프 VTLVG(598번째에서 602번째), 9개 잔기 서열 모티프 GGxGxDxux(372번째에서 416번째, 492번째에서 545번째, 및 548번째에서 556번째)의 반복 서열 및 GxSxG(204번째에서 208번째) 영역을 포함하고 있고, Lip3K의 분자량 및 이론적 등전점은 각각 64,408 Da 및 4.53로 추정된다.

또한, 도 3에서 보듯이, 계통수 작성을 통해 Lip3K는 Family I.3에 속함을 확인하였다.

실시 예 3: Est3K 또는 Lip3K 정제

상기 실시 예 1에서 선별된 에스테라아제 활성을 가지는 SKE3 균주와 에스테라아제 및 리파아제 활성을 가지는 SKEL5 균주를 각각 100 ㎍/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 액체배지(10 g/L Bacto trypton, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl)에 접종하여 37℃의 진탕 배양기에서 200 rpm의 속도로 12시간 동안 배양한 다음, Jeong et al.(2012, Applied Biochemistry and Biotechnology, 166:1328-1339.)에 기재된 방법으로 조효소 용액을 회수하였다. 그 다음 상기 SKE3 균주부터 회수된 조효소 용액은 High-Q 컬럼(5ml, Bio-Rad, California, USA), CHT-Ⅱ 컬럼(5ml, Bio-Rad, California, USA) 및 t-ButylHIC 컬럼(5ml, Bio-Rad, California, USA)에 통과시켜 Est3K를 분리하였다. 또한, SKEL5 균주로부터 회수된 조효소 용액은 High-Q 컬럼(5ml, Bio-Rad, California, USA)에 통과시켜 Lip3K를 분리하였다. 컬럼에 통과시킨 활성 분획물을 가열수조에 1분 동안 담가 준 후 11.5% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하였다. 그 후 상기 겔은 이소프로판올에서 2번, 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에서 2번 세척한 다음, 1% glyceryl trioctanoate가 포함된 아가 스트립(agar strip)을 겔에 얹어 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 Lip3K를 확인하였다. 겔에서 확인된 Lip3K는 오리고, 잘게 부수어 4℃에서 하루 동안 용출하여 단백질의 양을 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보듯이, Est3K는 약 34 kDa 크기에서 단일 밴드가 확인되었으며, 그 양은 8.4 U/mg로 확인되었다. 반면, Lip3K는 약 64 kDa 크기에서 단일 밴드가 확인되었으며, 그 양은 10.3 U/mg으로 확인되었다.

실시 예 4: Est3K 또는 Lip3K의 기질 특이성 분석

상기 실시 예 3에서 정제한 Est3K 또는 Lip3K의 활성은 p-니트로페닐 에스테르(p-nitrophenyl esters; Sigma, St. Louis, MO, USA; p-nitrophenyl caproate from Tokyo Chemical Industry Co., Tokyo, Japan)으로부터 분리된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 측정하여 확인하였다. 구체적으로, 에스테라아제 Est3K 또는 리파아제 Lip3K를 각각 1 mM 농도의 p-니트로페닐 에스테르(p-nitrophenyl esters), p-니트로페닐 아세테이트(p-nitrophenyl acetate; C2), p-니트로페닐 부티레이트(p-nitrophenyl butyrate; C4), p-니트로페닐 카프로에이트(p-nitrophenyl caproate; C6), p-니트로페닐 옥타노에이트(p-nitrophenyl octanoate: C8), p-니트로페닐 카프레이트(p-nitrophenyl caprate; C10), p-니트로페닐 라우레이트(p-nitrophenyl laurate; C12), p-니트로페닐 미리스테레이트(p-nitrophenyl myristate; C14), 및 p-니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate; C16)가 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 넣고 25℃에서 1분 동안 반응시킨 다음, 분광 광도계(spectrophotometer; Mecasys, Model OPTIZEN, KOREA)를 사용하여 450nm에서 Est3K 또는 Lip3K의 활성을 측정하였다. Est3K 또는 Lip3K의 활성은 p-니트로페놀의 흡광도 계수를 사용하여 백분율로 나타내었다. Est3K 또는 Lip3K의 1 unit는 1분 동안 1 μmol의 p-니트로페놀이 측정되는 양으로 정하였다. 또한, p-니트로페놀의 흡광계수를 사용하여 그 결과를 도 5 및 표 1에 나타내었다.

	효소 활성(△A/min)
	Est3K	Lip3K	Est3K + Lip3K
pNP-butyrate(C4)	0.522(1.00)	0.301(1.00)	0.711(1.00)
pNP-octanoate(C8)	0.364(0.70)	0.465(1.54)	0.703(0.99)

도 5에서 보듯이, Est3K는 짧은 사슬 지방산의 p-니트로페닐(pNP) 에스테르를 가수분해하며, Lip3K는 중간 사슬 지방산의 p-니트로페닐(pNP) 에스테르를 가수분해하는 활성을 나타내었다.

*구체적으로, Est3K가 p-니트로페닐 부티레이트(pNP-butyrate; C4), p-니트로페닐 카프로에이트(pNP-caproate; C6), p-니트로페닐 옥타노에이트(pNP-octanoate; C8) 및 p-니트로페닐 아세테이트(pNP-acetate; C2)를 분해하는 활성은 각각 100%, 78.0%, 70.1% 및 60.7%로 나타났으며, Lip3K가 p-니트로페닐 옥타노에이트(pNP-octanoate; C8), p-니트로페닐 카프레이트(pNP-caprate; C10), p-니트로페닐 아세테이트(pNP-acetate; C2), p-니트로페닐 부티레이트(pNP-butyrate; C4) 및 p-니트로페닐 카프로에이트(pNP-caproate; C6)를 분해하는 활성은 각각 100%, 78.9%, 69.3%, 67.0%, 및 60.4%로 나타났다.

한편, 상기 표 1에서 보듯이 Est3K가 C4 및 C8으로 가수분해하는 활성비는 1:0.7이였고, Lip3K가 C4 및 C8으로 가수분해하는 활성비는 1:1.5이였다. 또한, Est3K 및 Lip3K를 동일한 양으로 혼합한 혼합물이 C4 및 C8으로 가수분해하는 활성비는 1:0.99이었다.

이러한 결과를 통해 본 발명의 Est3K와 Lip3K는 우수한 지질가수분해 효능을 가지고 있으며, 상기 두 효소는 서로 시너지 효과를 나타내지 않는 것을 알 수 있었다.

실시 예 5: Est3K 또는 Lip3K이 최적 활성을 나타내는 온도, 열 안정성 및 pH 선택 실험

5-1. Est3K 또는 Lip3K의 최적 온도 선택 실험

상기 실시 예 3에서 정제한 Est3K 또는 Lip3K를 각각 최적 기질인 p-니트로페닐 p-니트로페닐 부티레이트(pNP-butyrate; C4)와 p-니트로페닐 옥타노에이트(pNP-octanoate; C8)가 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 넣고 30~70℃ 범위의 온도에 대하여 10℃ 간격으로 상대적인 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보듯이, Est3K는 50℃에서 최적 활성을 나타내었으며, 40℃에서 85%의 활성을 나타내었다.

반면, Lip3K는 50℃에서 최적 활성을 나타내었으며, 이외의 온도에서는 50% 이하의 활성을 나타내었다.

5-2. Est3K 또는 Lip3K의 온도 안정성 실험

상기 실시 예 3에서 정제한 Est3K 또는 Lip3K를 각각 최적 기질인 p-니트로페닐 p-니트로페닐 부티레이트(pNP-butyrate; C4)와 p-니트로페닐 옥타노에이트(pNP-octanoate; C8)가 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 넣고 30~70℃ 범위의 온도에서 1시간 동안 보관한 후 그 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 보듯이, Est3K는 30℃에서 1시간 동안 보관하더라도 그 활성이 약 100%를 나타내었다. 그러나, 40℃에서 30분 동안 보관하는 경우 활성이 62%로 감소하였으며, 50℃에서 30분 동안 보관하였을 때 활성이 거의 나타나지 않음을 확인하였다.

Lip3K 역시 30℃에서 1시간 동안 보관하더라도 그 활성이 약 100%를 나타내었다. 그러나, 40℃ 또는 50℃에서 30분 동안 보관하는 경우 활성이 각각 64%, 50%로 감소하였으며, 60℃에서 30분 동안 보관하였을 때 활성이 거의 나타나지 않음을 확인하였다.

5-3. Est3K 또는 Lip3K의 최적 pH 선택 실험

상기 실시예 3에서 정제한 Est3K 또는 Lip3K를 각각 최적 기질인 p-니트로페닐 p-니트로페닐 부티레이트(pNP-butyrate; C4)와 p-니트로페닐 옥타노에이트(pNP-octanoate; C8)가 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)를 일반적인 용액(boric acid/citric acid/trisodium orthophosphate)과 반응시켜 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서 보듯이, Est3K와 Lip3K의 최적 pH는 모두 pH 9.0에서 확인되었다.

실시 예 6: 금속 이온 또는 유기용매가 Est3K 또는 Lip3K의 활성에 미치는 영향 분석

6-1. 1가 또는 2가 금속 이온이 Est3K 또는 Lip3K의 활성에 미치는 영향 분석

상기 실시예 3에서 정제한 Est3K 또는 Lip3K를 5 mM K⁺, Na⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Mn²⁺, Zn² ⁺, 또는 Cu² ⁺와 미리 반응시킨 후 각각 최적 기질인 p-니트로페닐 p-니트로페닐 부티레이트(pNP-butyrate; C4)와 p-니트로페닐 옥타노에이트(pNP-octanoate; C8)가 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 넣고 보관하여 활성을 측정하였다. 대조군으로는 금속이온 대신 1% 이소프로판올을 사용하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

	효소 활성(%)
	Est3K	Lip3K
대조군(+1% 이소프로판올)	100.0	100.0
금속이온(5 mM)
K⁺	93.9±4.5	89.9±2.2
Na⁺	92.2±3.8	103.0±2.8
Ca² ⁺	91.1±2.0	190.9±7.1
Mg² ⁺	88.4±2.5	122.2±1.3
Mn² ⁺	86.7±4.2	83.8±1.6
Zn² ⁺	85.0±2.3	49.5±5.3
Cu² ⁺	59.3±5.7	16.2±3.4

상기 표 2에서 보듯이, 대부분의 1가 및 2가의 금속이온은 Est3K 및 Lip3K의 활성에 큰 영향을 끼치지 않았으나, 5 mM Cu² ⁺는 Est3K와 Lip3K의 활성을 각각 40.7%, 83.8% 억제시켰으며, 5 mM Zn² ⁺는 Lip3K의 활성을 50.5% 억제시켰다. 반면, 5 mM Ca² ⁺는 Lip3K의 활성을 109.9% 증가시켰다.

6-2. Ca² ⁺이온이 Lip3K의 활성에 미치는 영향 분석

상기 실시예 3에서 정제한 Lip3K를 5 mM Ca² ⁺와 미리 반응시킨 후 기질인 p-니트로페닐 옥타노에이트(p-nitrophenyl octanoate: C8)가 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 넣고 30~60℃ 범위의 온도에서 1시간 동안 보관하여 그 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서 보듯이, Ca² ⁺ 존재 하에 Lip3K를 60℃에서 15분 동안 보관하는 경우 Lip3K의 활성이 33% 감소하였다. 반면, 도 7에서 보듯이 Ca² ⁺ 없이 Lip3K를 60℃에서 15분 동안 보관하는 경우 Lip3K의 활성은 82% 감소하였다.

즉, Ca² ⁺는 높은 온도에서 Lip3K의 활성을 증가시킴을 알 수 있었다.

6-3. 유기 용매가 Est3K 또는 Lip3K의 활성에 미치는 영향 분석

상기 실시 예 3에서 정제한 Est3K 또는 Lip3K를 5% 이소프로판올, 30% 이소프로판올, 5% 메탄올, 30% 메탄올, 5% 아세토니트릴, 또는 30% 아세토니트릴과 반응시킨 후 각각 최적 기질인 p-니트로페닐 p-니트로페닐 부티레이트(pNP-butyrate; C4)와 p-니트로페닐 옥타노에이트(pNP-octanoate; C8)가 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 넣고 보관하여 그 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

	효소 활성(%)
	Est3K	Lip3K
대조군(+1% 이소프로판올)	100.0	100.0
유기 용매
이소프로판올(5%)	99.2±2.5	109.1±2.8
이소프로판올(30%)	87.5±4.4	114.1±2.0
메탄올(5%)	93.8±3.5	101.0±2.7
메탄올(30%)	86.9±2.2	166.7±4.8
아세토니트릴(5%)	49.6±5.6	30.3±3.0
아세토니트릴(30%)	47.7±5.1	37.4±4.6

상기 표 3에서 보듯이, Est3K은 5%의 이소프로판올 또는 메탄올, 30%의 이소프로판올 또는 메탄올 존재 하에 85% 이상의 활성을 나타내었으나, 5% 아세토니트릴 및 30% 아세토니트릴 존재 하에서는 50% 이하의 활성을 나타냄을 확인하였다.

반면, Lip3K는 5%의 이소프로판올 또는 메탄올, 30%의 이소프로판올 또는 메탄올 존재 하에서 활성이 향상되었으며, 특히 30% 이소프로판올 및 30% 메탄올 존재 하에서 활성이 각각 14.1%, 66.7% 향상되었음을 확인하였다. 그러나, Lip3K 역시 5% 아세토니트릴 및 30% 아세토니트릴 존재 하에서는 40% 이하의 활성을 나타냄을 확인하였다.

상기한 결과를 통해, Est3K 또는 Lip3K는 미생물 또는 산림토양의 메타게놈으로부터 유래한 종래 지질분해효소와 낮은 상동성 및 특징을 나타내는 신규한 지질분해소임을 알 수 있었다. 종래 지질분해효소와 본 발명의 Est3K 또는 Lip3K의 염기서열 상동성과 특징은 하기 표 4에 나타내었다.

<110> Sunchon University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> {Novel lipolytic enzyme from metagenomic library and process for preparing the same <130> PA-15- 0201 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF sequence of est3K gene <400> 1 atgcagcgct ttaaccagaa gctcgcctgg atgccgcgtt ttcgcatccg caaccgcgtg 60 acgccccggg tgatccaggc gctgttgcgc tccagccaga tggtggccgg caacaagttg 120 ctcaagcatg gcctgcaggc tgaaagccgg cgggtgggct cggtgccggt gcgcatcatc 180 cggccgaagg gcaaggccaa aggcgtggtg ctggatatcc atggcggcgg ctgggtgatc 240 ggcaatgcgc agatgaatga cgacctcaac gtggccatgg tgaatgcgtg cgaggtggcg 300 gtggtgtcgg tggattaccg gctggcggtg aatacgccgg tcgaagggat tctggaagac 360 tgcctggcca cggcgcgctg gttgctggcg gactgtgagg agttcgccgg cctgccggtg 420 atcgttgtcg gcgagtctgc cggtgggcat ctggcggcgg ccacgctgct ggcgctgaag 480 caatcgcccg aattgctggc gcgggtgagc ggggcggtgc tgtattacgg cgtctacgat 540 ttgaccggta cgccgagcgt gcgcacggca ggacgcgaaa cgctgctgct ggacgggccg 600 ggcatggtgg aggcgctgcg tttgctgacg ccgggcctga gtgacgagca gcgccggcag 660 ccgccgttgt caccgttgta tggcgaccta gccgggctgc cgccagcgct gatgtttgtg 720 ggggagctgg acccgttgct ggacgacacg ctgcagatgg ccgagcgatg ggcggggtcc 780 gaggtgtttt tgttaccgca ggcggctcat gggtttattc attttccgac ggcgatgtcg 840 ggccgcgtgc tggcttacag tcgcgagtgg ataacgggtc gtttacgctc ggttggttga 900 900 <210> 2 <211> 299 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Est3K <400> 2 Met Gln Arg Phe Asn Gln Lys Leu Ala Trp Met Pro Arg Phe Arg Ile 1 5 10 15 Arg Asn Arg Val Thr Pro Arg Val Ile Gln Ala Leu Leu Arg Ser Ser 20 25 30 Gln Met Val Ala Gly Asn Lys Leu Leu Lys His Gly Leu Gln Ala Glu 35 40 45 Ser Arg Arg Val Gly Ser Val Pro Val Arg Ile Ile Arg Pro Lys Gly 50 55 60 Lys Ala Lys Gly Val Val Leu Asp Ile His Gly Gly Gly Trp Val Ile 65 70 75 80 Gly Asn Ala Gln Met Asn Asp Asp Leu Asn Val Ala Met Val Asn Ala 85 90 95 Cys Glu Val Ala Val Val Ser Val Asp Tyr Arg Leu Ala Val Asn Thr 100 105 110 Pro Val Glu Gly Ile Leu Glu Asp Cys Leu Ala Thr Ala Arg Trp Leu 115 120 125 Leu Ala Asp Cys Glu Glu Phe Ala Gly Leu Pro Val Ile Val Val Gly 130 135 140 Glu Ser Ala Gly Gly His Leu Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Leu Lys 145 150 155 160 Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ala Arg Val Ser Gly Ala Val Leu Tyr Tyr 165 170 175 Gly Val Tyr Asp Leu Thr Gly Thr Pro Ser Val Arg Thr Ala Gly Arg 180 185 190 Glu Thr Leu Leu Leu Asp Gly Pro Gly Met Val Glu Ala Leu Arg Leu 195 200 205 Leu Thr Pro Gly Leu Ser Asp Glu Gln Arg Arg Gln Pro Pro Leu Ser 210 215 220 Pro Leu Tyr Gly Asp Leu Ala Gly Leu Pro Pro Ala Leu Met Phe Val 225 230 235 240 Gly Glu Leu Asp Pro Leu Leu Asp Asp Thr Leu Gln Met Ala Glu Arg 245 250 255 Trp Ala Gly Ser Glu Val Phe Leu Leu Pro Gln Ala Ala His Gly Phe 260 265 270 Ile His Phe Pro Thr Ala Met Ser Gly Arg Val Leu Ala Tyr Ser Arg 275 280 285 Glu Trp Ile Thr Gly Arg Leu Arg Ser Val Gly 290 295 <210> 3 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF sequence of lip3K gene <400> 3 atgggtgtgt acgactacaa gaacttcagc tcagcggatt ccaaggcgtt gttcactgat 60 gccatggcga tcacgctgta ctcctatcac aacctcgaca acggtttcgc tgtcgggtat 120 cagcacaacg gcttcggcct cggcctgccg gccacgctgg tttcggcgct gatcggcggc 180 acggattcgc aaggcgtgat tccggactcc gtggaccccg actcggaaaa actcgctctg 240 gacgccgtga aaaaggctgg ctggacgccc atcaccgcct cgcaactggg ctatgacggc 300 aagaccgacg ctcgcggaac cttcttcggc gaaaaggccg gctacaccag cgcgcaagtg 360 gaaatcctcg gcaagtacga cgcccagggt catctcacgg aaatcggcat cgcctttcgc 420 ggcaccagcg gcccgcggga aatcctgatc ggcgactcca tcgccgacgc catcaatgac 480 ctgctcgccg cgttcggccc caaggattac gccaagaact acgttggtga agccttcggc 540 aacctgctga acgatgtggt ggccttcgcc aaggccaacg gtctcaccgg caaggacgtg 600 ctggtcagtg gtcacagcct cggcggcctg gcggtcaaca gcatggcgga cttgagcggc 660 ggcaaatggg gcgggttctt ccaggactcc aactacatcg cctacgcctc accgacccaa 720 agcagcaccg acaaagtgct caacgtcggc tacgagaacg acccggtctt ccgcgcgctc 780 gacggctcga ccttcaccgg cgcctcgctt ggcgtacacg acgcgtcgaa agtgtcggcg 840 accgacaaca tcgtcagctt caacgaccac tacgcttcga acgtgtggaa cgtgctgcca 900 ttctcgatcg tcaacgtccc gacctggatc tcgcacctgc cgacagccta cggcgacggc 960 atgaaccggg tgatcgagtc gaagttctac gatctcacca gccgtgactc gacgatcatc 1020 gtcgccaacc tgtcggaccc ggcgcgggcc aacacctggg tgcaggacct caaccgcaac 1080 gccgaaaccc acaagggcag caccttcatc atcggcagcg acggcaacga cctgatccag 1140 ggcggcagcg gcaatgacta ccttgaagga cgggccggca acgacacgtt ccgtgacagc 1200 ggcggctaca acgtcattct tggcggtgcc ggcaacaaca ccctcgactt gcagcagtcg 1260 gtgaacaagt tcgacttcgc caacgacggc gccggcaacc tgtacatccg cgatgccaac 1320 ggcgggatca gcatcacccg cgacatcggc agcatcgtca ccaaggagcc gggtttcctc 1380 tggggcctgt tcaaggacga cgtgacccac agcgtcacgg cggatggcct gaaggtcggc 1440 aacaacgtca cccagtacga gtcgagcgtg aagggcacca gtggcgtcga caccctcaag 1500 gcccacgcca gcggtgactg gctgttcggc ctggacggca acgatcacct gatcggtggc 1560 gtgggcaacg acgtgtttgt cggcggcgcc ggcaatgacc tgatggagtc gggtggcggg 1620 gcggatacgt tcctgttcaa cggcgcgttc ggccaggatc gggtggtggg attcaccggc 1680 aacgacaaac tggtgtttct cggcgtgcag ggcgtgttgc cgggcgatga cttccgcgcc 1740 catgccacct cggtggggca ggatacggtg ctgaagttcg gcggtgattc cgtgacgctg 1800 gtcggggttt cgctgagcag tctcagtgcc gatggcatcg ttatcgcctg a 1851 <210> 4 <211> 616 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Lip3K <400> 4 Met Gly Val Tyr Asp Tyr Lys Asn Phe Ser Ser Ala Asp Ser Lys Ala 1 5 10 15 Leu Phe Thr Asp Ala Met Ala Ile Thr Leu Tyr Ser Tyr His Asn Leu 20 25 30 Asp Asn Gly Phe Ala Val Gly Tyr Gln His Asn Gly Phe Gly Leu Gly 35 40 45 Leu Pro Ala Thr Leu Val Ser Ala Leu Ile Gly Gly Thr Asp Ser Gln 50 55 60 Gly Val Ile Pro Asp Ser Val Asp Pro Asp Ser Glu Lys Leu Ala Leu 65 70 75 80 Asp Ala Val Lys Lys Ala Gly Trp Thr Pro Ile Thr Ala Ser Gln Leu 85 90 95 Gly Tyr Asp Gly Lys Thr Asp Ala Arg Gly Thr Phe Phe Gly Glu Lys 100 105 110 Ala Gly Tyr Thr Ser Ala Gln Val Glu Ile Leu Gly Lys Tyr Asp Ala 115 120 125 Gln Gly His Leu Thr Glu Ile Gly Ile Ala Phe Arg Gly Thr Ser Gly 130 135 140 Pro Arg Glu Ile Leu Ile Gly Asp Ser Ile Ala Asp Ala Ile Asn Asp 145 150 155 160 Leu Leu Ala Ala Phe Gly Pro Lys Asp Tyr Ala Lys Asn Tyr Val Gly 165 170 175 Glu Ala Phe Gly Asn Leu Leu Asn Asp Val Val Ala Phe Ala Lys Ala 180 185 190 Asn Gly Leu Thr Gly Lys Asp Val Leu Val Ser Gly His Ser Leu Gly 195 200 205 Gly Leu Ala Val Asn Ser Met Ala Asp Leu Ser Gly Gly Lys Trp Gly 210 215 220 Gly Phe Phe Gln Asp Ser Asn Tyr Ile Ala Tyr Ala Ser Pro Thr Gln 225 230 235 240 Ser Ser Thr Asp Lys Val Leu Asn Val Gly Tyr Glu Asn Asp Pro Val 245 250 255 Phe Arg Ala Leu Asp Gly Ser Thr Phe Thr Gly Ala Ser Leu Gly Val 260 265 270 His Asp Ala Ser Lys Val Ser Ala Thr Asp Asn Ile Val Ser Phe Asn 275 280 285 Asp His Tyr Ala Ser Asn Val Trp Asn Val Leu Pro Phe Ser Ile Val 290 295 300 Asn Val Pro Thr Trp Ile Ser His Leu Pro Thr Ala Tyr Gly Asp Gly 305 310 315 320 Met Asn Arg Val Ile Glu Ser Lys Phe Tyr Asp Leu Thr Ser Arg Asp 325 330 335 Ser Thr Ile Ile Val Ala Asn Leu Ser Asp Pro Ala Arg Ala Asn Thr 340 345 350 Trp Val Gln Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Thr His Lys Gly Ser Thr 355 360 365 Phe Ile Ile Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Gln Gly Gly Ser Gly 370 375 380 Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Arg Ala Gly Asn Asp Thr Phe Arg Asp Ser 385 390 395 400 Gly Gly Tyr Asn Val Ile Leu Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Asp 405 410 415 Leu Gln Gln Ser Val Asn Lys Phe Asp Phe Ala Asn Asp Gly Ala Gly 420 425 430 Asn Leu Tyr Ile Arg Asp Ala Asn Gly Gly Ile Ser Ile Thr Arg Asp 435 440 445 Ile Gly Ser Ile Val Thr Lys Glu Pro Gly Phe Leu Trp Gly Leu Phe 450 455 460 Lys Asp Asp Val Thr His Ser Val Thr Ala Asp Gly Leu Lys Val Gly 465 470 475 480 Asn Asn Val Thr Gln Tyr Glu Ser Ser Val Lys Gly Thr Ser Gly Val 485 490 495 Asp Thr Leu Lys Ala His Ala Ser Gly Asp Trp Leu Phe Gly Leu Asp 500 505 510 Gly Asn Asp His Leu Ile Gly Gly Val Gly Asn Asp Val Phe Val Gly 515 520 525 Gly Ala Gly Asn Asp Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Ala Asp Thr Phe 530 535 540 Leu Phe Asn Gly Ala Phe Gly Gln Asp Arg Val Val Gly Phe Thr Gly 545 550 555 560 Asn Asp Lys Leu Val Phe Leu Gly Val Gln Gly Val Leu Pro Gly Asp 565 570 575 Asp Phe Arg Ala His Ala Thr Ser Val Gly Gln Asp Thr Val Leu Lys 580 585 590 Phe Gly Gly Asp Ser Val Thr Leu Val Gly Val Ser Leu Ser Ser Leu 595 600 605 Ser Ala Asp Gly Ile Val Ile Ala 610 615

Claims

서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되고, 분자량이 64 kDa이고, 최적 활성 온도 및 pH는 각각 50℃ 및 pH 9.0이며, pH 7.0 내지 9.5 및 45 내지 55℃에서 효소 활성이 안정한 알칼리성 및 내열성을 가지고, p-니트로페닐 옥타노에이트(C8)를 선택적으로 가수분해하며, Ca² ⁺ 이온 첨가 시 지질분해 활성과 열 안정성이 각각 180 내지 200%, 20 내지 40% 증가하고, 30% 메탄올 첨가 시 지질분해 활성이 150 내지 180%로 증가하는 것을 특징으로 하는 신규 리파아제(Lip3K).
제1항의 리파아제(Lip3K)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제2항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제3항의 재조합 벡터를 도입하여 형질전환된 형질전환체.
a) 제4항에 따른 형질전환체 또는 제2항의 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포를 배양하는 단계; b) 상기 형질전환체 또는 세포에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 신규 리파아제인 Lip3K의 발현을 유도하는 단계; c) 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 신규 리파아제인 Lip3K가 발현되는 형질전환체 또는 세포를 분쇄한 후 침전시켜 얻어진 상등액으로부터 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 신규 리파아제인 Lip3K를 용출하는 단계; 및 d) 상기 용출된 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 신규 리파아제인 Lip3K를 정제하는 단계;를 포함하는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 신규 리파아제인 Lip3K의 제조방법.