ES2322035T3 - D-amidasa de variovorax. - Google Patents
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Abstract
D-amidasa, caracterizada porque la misma procede de V. paradoxus 19-3 DSM 14468.
Description
D-amidasa de
Variovorax.
La presente invención se refiere a una amidasa
procedente del organismo del género Variovorax, así como a
los ácidos nucleicos que codifican esta enzima y vehículos que
contienen estos ácidos nucleicos.
Particularmente, la invención se refiere al
descubrimiento de una amidasa de Variovorax paradoxus
19-3 DSM 14468, así como a los ácidos nucleicos que
codifican esta enzima y a la cepa en sí misma.
Las amidasas o amidohidrolasas se dividen
conforme al sistema E.C. en dos subclases, E.C.3.5.1.1 hasta
3.5.1.77 y E.C.3.5.2.1 hasta 3.5.2.14. Representantes de la primera
subclase son p.ej. la asparaginasa (E.C.3.5.1.1), ureasa
(E.C.3.5.1.5) y la aquí considerada con mayor detalle
acil-amida amidohidrolasa (E.C.3.5.1.4).
Entre los microorganismos, la acilamida
amidohidrolasa está muy extendida y se encuentra entre otras, en
especies como Corinebacterias, Pseudomónadas, Bacilos,
Brevibacterias, Rodococcenos y Alcaligenes. En la mayoría de los
casos se trata de enzimas inducibles, cuya especificidad varía
notablemente de organismo a organismo (Maestracci, M.; Bui, K.;
Thiéry, A.; Arnaud, A.; Galzy, P. (1988), The Amidases from a
Brevibacterium Strain: Study and Applications, Adv. Biochem. Eng.
36, 69-115).
Las enzimas de Mycobacterium neoaurum
ATCC 25795 (Hermes, H. F. M.; Tandler, R. F.; Sonke, T.; Dijkhuizen,
L.; Meijer, E. M. (1994), Purification and Characterization of an
L-Amino Amidase from Mycobacterium neoaurum
ATCC 25795, Appl. Environ. Microbiol. 60, 153-159) y
Pseudomonas putida ATCC 12633 (Hermes, H. F. M.; Sonke, T.;
Peters, P. J. H.; van Balken, J, A. M.; Kamphuis, J.; Dijkhuizen,
L.; Meijer, E. M. (1993), Purification and Characterization of an
L-Aminopeptidase from Pseudomonas putida ATCC
12633, Appl. Environ. Microbiol. 59, 4330-4334)
tienen importancia técnica particularmente para la hidrólisis de las
amidas de L-aminoácidos. Ambas enzimas muestran una
afinidad relativamente alta para las amidas de aminoácidos o
dipéptidos ramificados en N y se clasifican por tanto como
aminopeptidasas (E.C.3.4.). La L-aminopeptidasa de
Pseudomonas putida ATCC 12633 se emplea para la disociación
estereoespecífica de una mezcla de
D,L-fenilglicinamida en
D-fenilglicinamida y
L-fenil-glicina. Un proceso
desarrollado por la DSM utiliza células enteras de Pseudomonas
putida para la producción de D- y L-aminoácidos
puros a partir de amidas de D,L-aminoácidos
(Kamphuis, J.; Boesten, W. H. J.; Broxterman, Q. B.; Hermes, H. F.
M.; Balkan van, J. A. M.; Meijer, E. M.; Shoemaker, H. E. (1990),
New developments in the chemo-enzymatic production
of amino acids, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 42,
133-186).
Adicionalmente, ha sido patentado por la
compañía Schering AG un proceso para la producción de
L-aminoácidos y amidas de aminoácidos a partir de
D.L-\alpha-aminonitrilos (Klages,
U.; Weber, A. (1988), Verfahren zur Herstellung von
L-Aminosäuren und Aminosäureamiden, DE 3 816 063 A1;
WO 8 910 969). En esta biotransformación con células enteras se
hidrolizan en primer lugar con A-cinetobacter calcoaceticus
DSM 3875 los D,L-aminonitrilos a amidas de
D,L-aminoácidos. Con una
L-aminoácido-amidasa y una amida de
aminoácido-racemasa en Arthrobacter sp
ATCC 31652 o Corynebacterium sp ATCC 31662 es posible
en principio una conversión completa en el
L-aminoácido.
L-aminoácido.
Gracias al descubrimiento de racemasas de amidas
de aminoácido en Pseudomonas putida y Rhodococcus sp.
pudo patentarse por Novo Industri A/S, Dinamarca y Stamicarbon B.V.,
Países Bajos, un proceso para la racemización de amidas de
aminoácido e hidrólisis por una L- o D-amidasa en el
aminoácido respectivo (Godtfredsen, S. E.; Clausen, K.; Ingvorsen,
K.; Hermes, H. F.; Van Balken, J. A.; Meijer, E. M. (1989), EP 0 307
023; WO 8 901 525). Se describió aquí una actividad de
D-amidasa en Pseudomonas putida NCIB 40042 y
Rhodococcus sp. NCIB 40041.
Hermes y colaboradores describen el
descubrimiento de una racemasa de amida de aminoácido adicional en
Klebsiella oxytoca (Hermes, H. F. M.; Peeters, W. P.;
Peters, P. J. (1990), EP 0 383 403).
Amidasas adicionales con una especificidad D en
lo que respecta a las amidas de aminoácido se describen en
Comamonas acidovorans
KPO-2771-4 (Hayashi, T.; Yamamoto,
K.; Matsuo, A.; Otsubo, K.; Muramatsu, S.; Matsuda, A.; Komatsu,
K.-I. (1997), Characterization and Cloning of an Enantioselective
Amidase from Comamonas acidovorans
KPO-2771-4, J. Ferment.Bioeng. 83,
139-145) y en dos cepas de Ochrobactrum
anthropi, SCRC C1-38 (Asano, Y.; Kato, Y.;
Yamada, A.; Kondo, K. (1992) Structural Similarity of
D-Aminopeptidase to Carboxypeptidase DD and
\beta-Lactamases, Biochem. 31,
2316-2328; Asano, Y.; Nakazawa, A.; Kato, Y.; Kondo,
K. (1989), Properties of a Nobel D-Stereospecific
Aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi, J. Biol., Chem.
264, 14233-14239) y SCRC-SV3
(Komeda, H. y Asano, Y. (2000), Gene cloning, nucleotide sequencing,
and purification and characterisation of the
D-stereospecific amino-acid amidase
from Ochrobactrum anthropi SV3, Eur. J. Biochem. 267,
2028-2035; Asano, Y.; Mori, T.; Hanamoto, S.; Kato,
Y.; Nakazawa, A. (1989), A New D-Stereospecific
Amino Acid Amidase from Ochrobactrum anthropi, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 162, 470-474).
A pesar de ello, hay necesidad adicional de
D-amidasas, especialmente porque sus espectros de
sustrato no cubren el 100%, y gracias al descubrimiento de nuevas
enzimas podrían producirse a partir de ahora en escala industrial
sustratos difícilmente transformables con anterioridad desde puntos
de vista económicamente ventajosos.
\newpage
La finalidad de la presente invención residía
por tanto en la puesta a disposición de nuevas
D-amidasas.
La finalidad se resuelve de acuerdo con las
reivindicaciones. La reivindicación 1 se refiere a una
D-amidasa del género Variovorax paradoxus.
La reivindicación 2 pone bajo protección los ácidos nucleicos que
codifican esta enzima. La reivindicación 3 se refiere a su vez a
vehículos que contienen los ácidos nucleicos correspondientes a la
invención, y la reivindicación 4 protege iniciadores preferidos. Las
reivindicaciones 5 y 6 se refieren a aplicaciones determinadas de
las D-amidasas correspondientes a la invención o
ácidos nucleicos correspondientes a la invención. La reivindicación
7 se refiere a catalizadores de células enteras. La reivindicación 8
protege el nuevo organismo Variovorax paradoxus
19-3 DSM 14468.
Gracias a la puesta a disposición de una
D-amidasa de Variovorax paradoxus DSM 14468,
se tiene la posibilidad de resolver ventajosamente la finalidad
indicada.
La D-amidasa correspondiente a
la invención es capaz de catalizar la hidrólisis de un amplio
espectro de amidas de ácidos carboxílicos para dar los ácidos
carboxílicos correspondientes. En este caso se transforman
parcialmente mezclas racémicas de p.ej. amidas de amino-ácido con
selectividad D notable. Con la presente invención es posible,
sorprendentemente, obtener
D-terc-leucina enantioméricamente
enriquecida a partir de terc-leucinamida racémica
en una frecuencia de renovación satisfactoria para un proceso
técnico.
En una realización subsiguiente, la invención se
ocupa de ácidos nucleicos que codifican una
D-amidasa correspondiente a la invención.
A pesar de la susceptibilidad de cultivo de las
cepas de Variovorax y la disponibilidad fácil de la enzima
por métodos cromatográficos se llega, por la indicación de los
ácidos nucleicos que codifican una D-amidasa
correspondiente a la invención de manera adicionalmente preferida a
sustancias, lo cual hace posible (sic) asegurar las enzimas
necesarias para un proceso técnico-enzimático para
la obtención de compuestos enantioméricamente enriquecidos por
técnicas recombinantes en cantidad suficiente. Con los ácidos
nucleicos es posible obtener con altos rendimientos las enzimas a
partir de organismos hospedadores que se desarrollan rápidamente.
Además de ello, las secuencias génicas correspondientes a la
invención pueden emplearse para la obtención de mutantes
mejorados.
En una realización siguiente, la invención se
refiere a plásmidos o vectores que poseen uno o más de los ácidos
nucleicos correspondientes a la invención.
Como plásmidos o vectores son apropiadas en
principio todas las formas de realización disponibles para los
expertos con esta finalidad. Plásmidos y vectores de este tipo
pueden deducirse p.ej. de Studier y colaboradores (Studier, W.F.;
Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7
RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods
Enzymol. 185, 61-89) o de los folletos de las firmas
Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech o Gibco BRL. Otros
plásmidos y vectores preferidos pueden encontrarse en: Glover, D.
M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol.
I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodríguez, R.L. y
Denhardt, D. T. (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular
cloning vectors and their uses, 179-204,
Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for
heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185,
3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y Maniatis, T.
(1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Nueva York. Plásmidos, con los cuales el
constructo génico que posee el ácido nucleico correspondiente a la
invención puede clonarse de manera sumamente preferida en el
organismo hospedador son: pUC18 (Roche Biochemicals),
pKK-177-3H (Roche Biochemicals),
pBTac2 (Roche Biochemicals),
pKK-233-3 (Stratagene) o pET
(Novagen).
(Novagen).
La invención se refiere también a
microorganismos que poseen los ácidos nucleicos correspondientes a
la invención.
El microorganismo, en el cual se clonan los
ácidos nucleicos, sirve para proliferación y obtención de una
cantidad suficiente de la enzima recombinante. Los procesos para
ello son bien conocidos por los expertos (Sambrook, J.; Fritsch, E.
F. y Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual,
2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York). Como
microorganismos puede recurrirse en principio a todos los
organismos apropiados para este fin de acuerdo con los expertos,
como p.ej. levaduras tales como Hansenula polymorpha,
Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, procariotas, como E.
coli, Bacillus subtilis o eucariotas, como células de mamífero
y células de insecto. Preferiblemente, se emplean para este fin
cepas de E. coli. Son muy particularmente preferidas: E.
coli XL1 Azul, NM 522, JM 101, JM 109, JM 105, RR1,
DH5\alpha, TOP 10^{-} o HB101. Plásmidos con los cuales se clona
el constructo génico que contiene el ácido nucleico correspondiente
a la invención preferiblemente en el organismo hospedador se han
indicado anteriormente.
Se encuentran también comprendidos en la
descripción ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones severas
con los ácidos nucleicos monocatenarios correspondientes a la
invención o sus ácidos nucleicos monocatenarios complementarios.
Como tales puede considerarse p.ej. la sonda génica de acuerdo con
See. 5 (sic).
La expresión "en condiciones severas" debe
entenderse en esta memoria como se describe en Sambrook et
al. (Sambrook, J.; Frisch, E. F. y Maniatis, T. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York). Preferiblemente, existe una
hibridación severa de acuerdo con la presente descripción cuando,
después de lavado durante una hora con 0,2 x SSC y 0,1% SDS a 50ºC,
preferiblemente a 55ºC, más preferiblemente a 62ºC y de modo muy
preferible a 68ºC se observa todavía una señal de hibridación
positiva.
positiva.
Un aspecto subsiguiente de la invención se
refiere a iniciadores para la producción de las secuencias génicas
correspondientes a la invención por medio de todo tipo de reacciones
PCR. Se incluyen los iniciadores sentido y antisentido que
codifican las secuencias de aminoácidos respectivas, o secuencias de
DNA complementarias conforme a las secuencias 2 < ... >.
Iniciadores apropiados pueden en principio obtenerse según procesos
conocidos por los expertos. La localización de los iniciadores
correspondientes a la invención se realiza por comparación con
secuencias de DNA conocidas o por traducción de las secuencias de
aminoácidos consideradas en el codón preferido del organismo
considerado (p.ej. para Streptomyces: Wright F. y Bibb. M.J. (1992))
Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome,
Gene 113, 55-65). Características comunes en la
secuencia de aminoácidos de proteínas de las denominadas
superfamilias son asimismo de utilidad en este caso (Firestine, S.
M.; Nixon, A. E.; Benkovic, S. J. (1996), Threading your way to
protein function, Chem. Biol. 3, 779-783).
Informaciones adicionales a este respecto pueden encontrarse en
Gait, M. J. (1984), Oligonucleotide synthesis: a practical
approach, IRL Press Ltd., Oxford; Innis, M. A.; Gelfound, D. H.;
Sninsky, J. J. y White, T.J. (1990), PCR Protocols: A guide to
methods and applications, Academic Press Inc., San Diego. Los
iniciadores son los siguientes:
- AAH-N1: 5' GTS GGC CGS CGS ATC CAG CAG AAG GA 3'
- (Secuencia 3)
- AAH-C1: 5' GGG ATS CGG ATC GAG CCG CCS GTS TC 3'
- (Secuencia 4)
La designación S representa G + C en la
secuencia de AAH-N1 y AAH-C1 (código
de grupos IUB para la identificación de redundancias).
- AAH-GW-F1: 5' GCG TCA CGC CGC CGG TCA ATC CGT GGA A 3'
- (Secuencia 6)
- AAH-GW-F2: 5' GGC GCA CTG GTC GGG TGC CTC GTC GA 3'
- (Secuencia 7)
- AAH-GW-R1: 5' CAG CGC GTG TTC GGC CAT CAC GAT CAC ATA 3'
- (Secuencia 8)
- AAH-GW-R2: 5' CTC TTG AGC GCG CCG TCG ACC TTC TCG A 3'
- (Secuencia 9)
- AAH-K-N2: 5' CTG GTC ATC AAG CGC GGC CAG ATC GGC 3'
- (Secuencia 10)
- AAH-K-C2: 5' GAT CGG CCG ACA GCC GAT TGG CCA GC 3'
- (Secuencia 11)
- AAH-N-EcoRI: 5' CCG GAA TTC ATG AGC AAC GAA CTG CAT TAC CT 3'
- (Secuencia 12)
- AAH-C-HindIII: 5' ATC CCA AGC TTT TAC AGC ACC GGA TGC CG 3'
- (Secuencia 13)
La presente invención se ocupa asimismo de la
utilización de las D-amidasas correspondientes a la
invención para la producción de ácidos carboxílicos o compuestos
orgánicos eventualmente quirales enantioméricamente enriquecidos,
como p.ej. aminoácidos.
Adicionalmente, los ácidos nucleicos
correspondientes a la invención, que codifican las
D-amidasas consideradas, son apropiados
preferiblemente para la producción de catalizadores de células
enteras.
Es asimismo objeto de la invención un
catalizador de células enteras que contiene un gen clonado para una
nitril-hidratasa y un gen clonado para una amidasa
correspondiente a la invención y opcionalmente un gen clonado para
una \alpha-aminonitril-racemasa,
una cianhidrin-racemasa, una racemasa de ácidos
\alpha-hidroxicarboxílicos o una racemasa de
(\alpha- o, \beta-)-amida de aminoácido (Hermes,
H. F. M.; Peeters, W. P.; Peters, P. J. (1990), EP 0 383 403; y WO
8 901 525; Wilms, L.; Bartsch, K. (1995), EP 0 690 133; Klages, U.;
Weber, A (1989), WO 8 910 969).
El catalizador de células enteras
correspondiente a la invención contiene una
D-amidasa de Variovorax paradoxus, DSM
14468. La producción de un organismo de este tipo es familiar para
el experto (Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.;
Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE19920712).
La ventaja de un organismo de este tipo es la
expresión simultánea de ambos sistemas enzimáticos, con lo cual
sólo es necesario recurrir a un rec-organismo para
la reacción. A fin de ajustar la expresión de las enzimas en lo que
respecta a sus velocidades de transformación, los fragmentos de
ácido nucleico respectivamente codificantes pueden hospedarse en
diferentes plásmidos con números de copias diferentes y/o pueden
utilizarse promotores de fuerza diferente para una expresión fuerte
diferente de los genes.
En el caso de sistemas enzimáticos ajustados de
este tipo ventajosamente no se presenta una acumulación de un
compuesto intermedio que actúa eventualmente como inhibidor, y la
reacción considerada puede transcurrir con una velocidad global
óptima. Esto es sin embargo suficientemente conocido por los
expertos (Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.;
Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996),
Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of
the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae, catalase
T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46,
46-54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.;
Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE19920712).
Los ácidos nucleicos correspondientes a la
invención pueden emplearse por tanto ventajosamente para la
producción de rec-D-amidasas. Por
técnicas recombinantes, que son suficientemente conocidas por los
expertos (véase más adelante), se llega a organismos que son
capaces de proporcionar la enzima considerada en cantidad suficiente
para un proceso técnico. La producción de las
rec-enzimas correspondientes a la invención se
realiza según procesos de tecnología genética conocidos por los
expertos (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York; Balbas, P. y Bolivar, F. (1990),
Design and construction of expression plasmid vectors in E.
coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodríguez,
R.L. y Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular
cloning vectors and their uses, 205-225,
Butterworth, Stoneham). Por lo que respecta al procedimiento general
(PCR, clonación, expresión etc.) se remite a la bibliografía
siguiente y a los textos citados en dicho lugar: Manual del Usuario
del Kit Universal Genome-Walker^{TM}, Clontech,
3/2000 y la bibliografía citada en dicho lugar; Triglia T.;
Peterson, M. G. y Kemp, D.J. (1988), A procedure for in vitro
amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of
known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch,
E. F. y Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory
manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York;
Rodríguez, R.L. y Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of
molecular cloning vectors and their uses, Butterworth,
Stoneham.
La finalidad de la invención es asimismo el
microorganismo Variovorax paradoxus 19-3 de
acuerdo con el Tratado de Budapest, depositado en el DSMZ en fecha
22 de agosto de 2001 bajo el número 14468.
La D-amidasa de Variovorax
paradoxus se clasifica según el sistema E.C. como una
acilamida-amidohidrolasa (E.C.3.5.1.4). La
secuencia génica completa de la D-amidasa de
Variovorax paradoxus se muestra en Seq. 1. Un segmento del
gen de la D-amidasa se obtuvo por una reacción PCR
con DNA genómico de Variovorax paradoxus. Un iniciador
AAH-N1 (Seq. 3), pudo obtenerse a partir del término
N de la secuencia de aminoácidos determinada. El segundo iniciador,
AAH-C1 (Seq. 4) se dedujo por razón de la semejanza
de secuencias del término N con representantes de la denominada
familia de las amidasas a partir de la región de consenso. Con estos
dos iniciadores se amplificó un fragmento grande de 509 pb del gen
de la D-amidasa por la técnica PCR, que puede
emplearse fundamentalmente como sonda génica. Su orden de sucesión
de pares de bases se representa en la secuencia 5.
Con ayuda de este fragmento se construyeron
otros iniciadores específicos de genes, que eran necesarios para el
método del Kit Universal Genome-Walker^{TM}
(Manual del Usuario del Kit Universal
Genome-Walker^{TM}, Clontech, 3/2000 y la
bibliografía allí citada) de la firma Clontech para el
descubrimiento del gen completo (Seq. 6 a 9).
Según el método del Kit Universal
Genome-Walker^{TM} se cortó en primer lugar DNA
genómico de Variovorax paradoxus en cada caso con las
enzimas de restricción EcoRV, PvuII, ScaI y StuI. Las mezclas de
reacción con los fragmentos de DNA obtenidos se ligaron con el
adaptador Genome-Walker^{TM} añadido, para el cual
existen dos iniciadores.
Con estas mezclas de reacción como molde se
llevó a cabo con ayuda de uno de los iniciadores específicos del
gen mencionados AAH-GW-F1 (Seq. 6) o
AAH-GW-R1 (Seq. 8) y un
iniciador-adaptador una reacción PCR en ambas
direcciones. Una denominada PCR anidada (Manual del Usuario del Kit
Universal Genome-Walker^{TM}, Clontech, 3/2000 y
la bibliografía allí citada) con los iniciadores
AAH-GW-F2 (Seq. 7) o
AAH-GW-R2 (Seq. 8) (sic) y un
iniciador-adaptador debería impedir la formación de
productos PCR inespecíficos. Con los fragmentos PCR obtenidos de
hasta 3500 pb (aguas abajo) y 1800 pb (aguas arriba) se hizo
asequible la secuencia génica completa de la
D-amidasa.
Para los trabajos ulteriores y para una
comprobación de la secuencia génica se amplificó a partir del DNA
genómico y los iniciadores siguientes (Seq. 10 y 11) el gen completo
de D-amidasa con 92 pb antes del codón de inicio y
80 pb detrás del codón de parada en tres mezclas de reacción
paralelas con dos DNA-polimerasas diferentes con
lectura de pruebas (VentR®, New England Biolabs y Herculase®,
Stratagene).
Los productos PCR obtenidos se ligaron con
extremos romos al vector pUC18 y se transformaron en E. coli
XL1 Azul. A partir del DNA plasmídico pudo asegurarse y comprobarse
de este modo la secuencia de la D-amidasa (Seq. 1)
(Fa. Sequiserve, Vaterstetten, Alemania).
Por una reacción PCR se introdujeron para la
expresión de la D-amidasa un punto de corte con
EcoRI en el extremo 5' y un punto de corte con HindIII en el
extremo 3' (Seq. 12 y 13) y el producto PCR se ligó en el vector
pBTAC y se transformó en E. coli JM 101.
En un primer ensayo de expresión, pudo
determinarse una actividad específica comprendida entre 80 y 210
mU/mg para Dri-Tle-NH_{2} en el
extracto bruto. En comparación con la actividad específica en
Variovorax comprendida entre 20 y 30 mU/mg en el extracto
bruto pudo conseguirse una sobreexpresión clara. Un análisis de las
fracciones soluble e insoluble de los extractos brutos por
SDS-PAGE demostró que una gran parte de la
D-amidasa expresada en forma insoluble, denominada
cuerpos de inclusión, está presente en el sedimento de células.
La purificación de la amidasa se realiza en tres
pasos de cromatografía, encontrándose en la mayoría de los casos
después del segundo paso sólo una proporción muy pequeña de proteína
extraña:
1. Cromatografía de intercambio iónico:
Q-Sepharose FF (Pharmacia).
2. Cromatografía de interacción hidrófoba:
Butil-Sepharose 4FF (Pharmacia).
3. Filtración con gel: Superdex 200 PG
(Pharmacia).
Para los dos primeros pasos de purificación,
puede calcularse un rendimiento de 88%, estando presente una
actividad específica de 0,68 U/mg para
DL-Tle-NH_{2} como sustrato. Para
la D-amidasa de Variovorax paradoxus
purificada homogéneamente se dedujo una actividad específica de 1,4
U/mg para DL-Tle-NH_{2}.
La idoneidad de la amidasa se confirma en los
ensayos siguientes:
La medida de la actividad se realizó por
determinación de los iones amonio por medio de la
glutamato-deshidrogenasa (Bergmeyer, H. U., and
Beutler, H.-O. (1985), Ammonia. In: Methods of Enzymatic Analysis.
VCH-Verlag, 3rd Edition, Vol. 8:
454-461, Weinheim). La enzima utilizada era una
D-amidasa purificada conforme al segundo paso
cromatográfico con una actividad específica de 0,51 U/mg. Los
sustratos se emplearon en el test enzimático 40 mM, y
adicionalmente diamida del ácido succínico y diamida del ácido
adípico en cada caso 10 mM y bencilamida 20 mM. Dado que las
actividades se determinaron solamente en cada caso para una
concentración de sustrato, se indican actividades relativas.
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Para prolinamida, y la amida de ácido
\alpha-hidroxicarboxílico lactamida
(Lac-NH_{2}) y la amida del ácido
2-hidroxi-4-metilmercaptobutírico
(MHA-NH_{2}), el análogo de metionina amida del
ácido \alpha-hidroxicarboxílico, no es posible la
determinación del producto con la analítica de HPLC existente hasta
ahora. Para este sustrato se determinó la actividad con ayuda de la
determinación de NH_{4}^{+}. La enzima utilizada era una
D-amidasa purificada según el segundo paso de
cromatografía con una actividad específica de 0,56 U/mg. Todos los
sustratos se emplearon en el test enzimático a concentraciones 40
mM. En la columna 4 se asignó para una comparación ulterior una
actividad igual a 1 para el enantiómero menos abundante y se calculó
a partir de ello una actividad relativa para el enantiómero
preferido.
Se investigó adicionalmente la idoneidad de la
D-amidasa para la disociación cinética del racemato
de DL-Tle-NH_{2} según el esquema
siguiente:
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A fin de evaluar la idoneidad para una
disociación cinética del racemato de
DL-Tle-NH_{2}, se determinó la
enantioselectividad en función de la conversión. Ya con enzima
purificada según el primer paso de cromatografía (cromatografía de
intercambio iónico: Q-Sepharose FF (Pharmacia)) se
determinaron para una conversión mayor que 45%
enantioselectividades de -96,6% referidas a D-Tle.
Con enzima prácticamente homogénea se midieron en el campo de 45 a
50% de conversión valores ee comprendidos entre 99,4 y 98,6%. Para
ambas series de ensayos se calcula por consiguiente un valor E
(Straathof, A. J.J. y Jongejan, J.A. (1997). The enantiomeric ratio:
origin, determination and prediction, Enzyme Microb. Technol. 21,
559-571) mayor que 100. Éste es un sustrato muy
satisfactorio para la disociación del racemato con una conversión
deseada prácticamente completa del
D-enantiómero.
Adicionalmente, se testaron a este respecto
DL-valin-, DL-leucin- y
DL-fenilalaninamida. Para ello se determinó con
enzima purificada de Variovorax paradoxus
19-3 según el primer paso de cromatografía la
enantioselectividad en función de la conversión. La Fig. 1 muestra
la enantioselectividad para D-Val,
D-Leu y D-Phe en función de la
conversión.
En la tabla siguiente se indican a modo de
ilustración algunos valores de medida, particularmente en el campo
de 50% de conversión y los valores E calculados a partir de
ellos.
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En el campo de 40 a 50% de conversión se
obtienen enantioselectividades para D-Val en el
campo de 98,1 a 95,1%, para D-Leu en el campo de
96,7 a 90,8% y para D-Phe en el campo de 55%. Para
la Val-NH_{2} y Leu-NH_{2}
racémicas se calculan valores E medios mayores que 100, y para
Phe-NH_{2} un valor E de 5.
En lo que respecta a una disociación del
racemato con una conversión deseada prácticamente total del
enantiómero D es, la D-amidasa es, por
consiguiente, muy apropiada en principio para
DL-Val-NH_{2} y
DL-Leu-NH_{2}.
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La disociación del racemato de las amidas de
amino-ácidos formiladas en N se comprobó por medio de la
D-amidasa correspondiente a la invención.
La enzima utilizada era una
D-amidasa purificada según el primer paso de
cromatografía. La medida de la actividad se realizó por
determinación de los iones NH_{4}^{+} mediante la
glutamato-deshidrogenasa (Bergmeyer, H.U., and
Beutler, H.-O. (1985) Ammonia. In: Methods of Enzymatic Analysis.
VCH-Verlag, 3rd Edition, Vol.
8:454-461, Weinheim). Los sustratos siguientes se
emplearon en el ensayo enzimático a concentraciones 10 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
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Parece interesante la transformación de la
N-formil-valinamida racémica, que se
convierte con un factor 2,8 veces mejor que
DL-Tle-NH_{2}.
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En Fig. 2 y 3 se representa la dependencia de la
actividad respecto a la temperatura y el valor de pH. Para la
D-amidasa se deduce de ella un óptimo de temperatura
en el campo de 47 y 48ºC. Fig. 3 muestra un valor óptimo de pH
amplio comprendido en el intervalo de 7,5 a 9,5 con aproximadamente
la misma actividad. Se encontró la actividad máxima en el tampón de
carbonato de sodio a pH 9.
Una comparación de la secuencia completa de
aminoácidos de la D-amidasa correspondiente a la
invención con amidasas existentes en bancos de datos de proteínas
en NCBI por Internet (http://www.ncbi.nlm.nib.gov/blast con
el programa: BLASTP 2.2.1, base de datos: nr, pat, SwissProg)
conduce a analogías con una multiplicidad de amidasas conocidas. La
analogía de la secuencia de aminoácidos es en el mejor de los casos
66% (303/457 AS) o 50%. La identidad (229/457 AS) con una posible
amidasa de Mycobacterium tuberculosis, (gi: 6225047; Cole,
S. T. et al. (1998), Deciphering the biology of
Mycobacterium tuberculosis from the complete genome
sequence, Nature 393, 537-544). La amidasa
enantioselectiva de Rhodococcus sp es, con 52% o 37%, la
segunda proteína por analogía (gi: 152052; Mayaux, J.-F.;
Cerbelaud; E.; Soubrier, F.; Yeh, P.; Blanche, F.; Pétré, D.
(1991), Purification, Cloning, and Primary Structure of a New
Enantiomer-Selective Amidase from a Rhodococcus
Strain: Structural Evidence for a Conserved Genetic Coupling
with Nitrile Hydatase, J. Bacteriol. 173, 6694-6704)
que posee también ya por comparación del término N una alta
homología con la D-amidasa.
En la presente invención se trata por tanto de
una nueva D-amidasa con la capacidad, entre otras
cosas, de transformar
DL-Tle-NH_{2} en
D-Tle con valores ee y rendimientos excelentes.
Dado que hasta ahora estos antípodas ópticos de
los aminoácidos eran sólo difícilmente accesibles, la puesta a
disposición de las nuevas D-amidasas significa un
paso importante para la producción industrial de este amino-ácido
no natural, que puede encontrar aplicación especialmente en
miméticos de péptidos bioactivos.
Para la aplicación puede utilizarse la enzima
considerada en forma libre como compuestos homogéneamente
purificados o como enzima producida por medios recombinantes.
Adicionalmente, la enzima puede emplearse también como constituyente
de un organismo inquilino intacto o en asociación con la masa de
células disgregada y altamente purificada convencional del
organismo hospedador. Es posible asimismo la utilización de las
enzimas en forma inmovilizada (Sharma B. P.; Bailey L. F. y Messing
R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialiern - Techniken und
Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852).
Ventajosamente, la inmovilización se realiza por liofilización
(Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994),
Aqueous-Like Activity of
\alpha-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous
Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010;
Mori; T.; Okahata, Y. (1997), A variety of
lipi-coated glycoside hydrolases as effective
glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents,
Tetrahedron Lett. 38,1971-1974; Otamiri. M.;
Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between
chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme
in active form in toluene, Biocatalysis 6,
291-305). Se prefiere muy particularmente la
liofilización en presencia de sustancias tensioactivas, como
Aerosol OT o polivinilpirrolidona o polietilenglicol (PEG) o Brij 52
(dietilenglicol-monocetiléter) (Kamiya, N.;
Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997),
Surfactant-horseradish peroxidase complex
catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11,
375-378). Es asimismo imaginable la utilización como
CLECs (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000),
Cofactor-bound cross-linked enzyme
crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39,
380-383).
Bajo compuestos ópticamente enriquecidos
(enantiómeros enriquecidos enantioméricamente enriquecidos (sic))
se entiende en el marco de la invención la existencia de un antípoda
óptico en mezcla con el otro en proporción > 50% molar.
Bajo el concepto ácidos nucleicos, están
incluidas todas las clases de DNA monocatenario o bicatenario, así
como RNA o mezclas de los mismos.
Bajo rec-enzimas mejoradas se
entienden de acuerdo con la invención particularmente enzimas de
este tipo, que tienen un espectro de sustratos modificado, que son
más activas y/o más selectivas o más estables en las condiciones de
reacción empleadas.
En las secuencias de proteínas reivindicadas y
las secuencias de ácido nucleico están comprendidas también de
acuerdo con la invención secuencias de este tipo que tienen una
homología (con exclusión de la degeneración natural) mayor que 80%,
preferiblemente mayor que 90%, 91%, 92%, 93% o 94%, más
preferiblemente mayor que 95% o 96% y de modo particularmente
preferido mayor que 97%, 98% o 99% respecto a una de estas
secuencias, con tal que se mantenga el modo de acción o la
finalidad de una secuencia de este tipo. La expresión
"homología" (o identidad), como se utiliza en esta memoria,
puede definirse por la ecuación H (%) = [1 - V/X] x 100, donde H
significa homología, X es el número total de nucleobases/aminoácidos
de la secuencia de comparación y V es el número de
nucleobases/aminoácidos diferentes de la secuencia a considerar
referido a la secuencia de comparación. En cada caso, están
abarcados en el concepto ácidos nucleicos que codifican secuencias
de aminoácidos, todas aquellas secuencias que se revelan posibles
conforme a la degeneración del código genético.
Las citas bibliográficas mencionadas en esta
memoria se consideran incluidas en la descripción.
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(Secuencias pasan a página
siguiente)
\newpage
La cepa Variovorax paradoxus
19-3 DSM 14468 se cultivó para la inducción de la
D-amidasa en un medio mínimo con
Tle-NR_{2} racémica como fuente de nitrógeno;
composición del medio mínimo:
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La esterilización se realizó por tratamiento en
autoclave durante 20 minutos a 121ºC y 1,2 bar. Dado que glucosa,
CaCl_{2}, MgSO_{4} x 7 H_{2}O, la solución de vitaminas, y
DL-Tle-NH_{2} reaccionan
sensiblemente a este tipo de esterilización, se añadieron las
mismas a las soluciones nutrientes sólo después del tratamiento en
autoclave por filtración estéril sobre membranas de 0,2 \mum
(Sartorius).
Los cultivos se lavaron una sola vez después de
la cosecha por centrifugación con tampón de fosfato de potasio, 100
mM de pH 7, 5, y se preparó una suspensión de células
aproximadamente al 20%. La digestión de las células en escala
analítica se realizó por molienda húmeda con ayuda de un molino
oscilante de la firma Retsch (Hummel, W.; Kula, M.-R. (1989). A
Simple Method for Small-Scale Disruption of Bacteria
and Yeasts, J. Microbiol. Methods 9, 201-209), o
por ultrasonidos mediante un sonificador de impulsos de la firma
Branson.
Para la disminución de las actividades de
proteasa se realizaron todos los pasos de trabajo ulteriores con
enfriamiento a 4ºC. La determinación del contenido de proteínas
según Bradford (Bradford, M. M. (1976), A Rapid and Sensitive
Methode for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein
Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding,
Anal. Biochem. 72, 248-254) en el extracto bruto
hizo posible la evaluación del producto de digestión.
Se pusieron en copas Eppendorf de 1,5 ml 1,2 g
de perlas de vidrio (diámetro 0,3 mm) y 0,6 ml de suspensión de
células, y se disgregaron por medio de un molino oscilante durante
10 minutos a la frecuencia de oscilación máxima. Se separaron las
perlas de vidrio y los residuos celulares del homogeneizado de
células por medio de centrifugación durante 10 minutos a 10.000 rpm
y 4ºC, y se empleó el sobrenadante como extracto bruto en los tests
enzimáticos.
Se disgregaron cultivos de Variovorax
paradoxus en porciones de 10 ml como máximo con 8 descargas de
60 s a impulsos de 70% e intensidad de 80% y con 60 s de
enfriamiento intermedio en cada caso. Se disgregaron cultivos de
E. coli en porciones de 1 ml con 4 descargas de 60 s a
impulsos de70% e intensidad de 80% y con 60 s de enfriamiento
intermedio en cada caso. El homogeneizado de células se centrifugó y
se retiró el extracto bruto.
La digestión para la purificación de la
D-amidasa de Variovorax paradoxus de
volúmenes comprendidos entre 20 y 200 ml se realizó en un
disgregador S de la firma IMA. Para ello se mezclaron la suspensión
de células y perlas de vidrio (de 0,3 mm de diámetro) en una
relación 1:1,5 y se disgregaron las células durante 20 min a 3500
rpm.
Para ello se cultivó la cepa Variovorax
paradoxus en medio DSMZ No. 1 completo hasta una densidad óptica
DO_{660} de aprox. 1,0; composición (DSMZ, Catálogo de Cepas
(1938), Braunschweig):
\newpage
El cultivo se cosechó en condiciones estériles y
se lavó una sola vez con tampón de fosfato de potasio estéril 20 mM
de pH 6,5.
La preparación del DNA genómico se realizó por
medio del Kit Dneasy Tissue (Qiagen). La realización se efectuó de
acuerdo con el protocolo para bacterias
gram-negativas del manual del Kit Qiagen Dneasy
Tissue (4/99).
\vskip1.000000\baselineskip
La designación S representa G + C en la
secuencia de AAH-N1 y AAH-C1 (código
de grupos IUB para la identificación de redundancias).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los métodos de tecnología genética aquí
utilizados son, excepto que se indique otra cosa, los descritos por
Sambrook (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York) y Hopwood et al. (Hopwood, D.
A.; Bibb, M. J.; Chater, K. F.; Kieser, T.; Bruton, C. J.; Kieser,
H. M.; Lydiate, D. J.; Smith, C. P.; Ward, J. M.; Schrempf, H.
(1985), Genetic manipulation of Streptomycetes: A laboratory
manual, The John Innes Foundation, Norwich). Todas las enzimas y
tampones correspondientes se utilizaron conforme a los datos del
fabricante. Las secuenciaciones fueron realizadas por la firma
Sequiserve, Vaterstetten.
\vskip1.000000\baselineskip
Las amplificaciones de DNA por medio de la
reacción en cadena de la polimerasa se realizaron con el Ciclador
Personal Biometra^{TM} (Göttingen) basándose en Saiki et
al. (Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S.; Scharf, S. J.;
Higuchi, R.; Horn, G. T.; Mullis, R. B.; Ehrlich, H. A. (1988),
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with
a thermostable DNA polymerase, Science 239;
487-491).
Se utilizaron las
DNA-polimerasas termoestables Vent_{R}® (New
England Biolabs) y Herculase^{TM} (Stratagene) y los tampones
suministrados asimismo por el fabricante. Las parejas de iniciadores
utilizadas se enumeran en la
Tabla 10.
Tabla 10.
Se amplificó en primer lugar por PCR un
fragmento de 509 pb de tamaño del gen de D-amidasa,
en presencia de la secuencia génica completa de la
D-amidasa por el método GenomeWalker (Stratagene)
del gen completo de D-amidasa a partir de DNA
genómico. Después del aseguramiento y comprobación de esta secuencia
génica de D-amidasa en el vector pUC18 se utilizó
como molde DNA plasmídico.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de reacción PCR se cubrieron con
aproximadamente 50 \mul de aceite mineral ligero. Para el programa
PCR se estableció la temperatura de reasociación TA por encima de
la temperatura de fusión del DNA (Tm) de los oligonucleótidos. El
tiempo X para la reacción en cadena de la
DNA-polimerasa se ajustó según la regla de
1 kb = 1 min.
1 kb = 1 min.
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Los pasos 2-4 se realizaron 10
veces, reduciéndose la temperatura de reasociación del paso 3 en
-1ºC por ciclo. A continuaron se realizaron 20 veces los pasos
5-7.
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Los pasos 2-3 se realizaron 10
veces y a continuación se realizaron 520 veces los pasos 4
(sic).
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Los pasos 2-4 se realizaron 12
veces, reduciéndose la temperatura de reasociación del paso 3 en
-1ºC por ciclo. A continuación se realizaron 20 veces los pasos
5-7.
La purificación y el aislamiento de los
productos PCR se realizó o bien directamente por medio del Kit de
Purificación PCR (Qiagen) o por electroforesis en gel de agarosa de
la mezcla de reacción PCR total y aislamiento subsiguiente del
fragmento de DNA por medio del Kit de Extracción con Gel QIAquick
(Qiagen).
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Con ayuda del fragmento ya conocido de 509 pb de
tamaño del gen de D-amidasa (Seq. 5) el Kit
GenomeWalker^{TM} Universal hizo posible una clonación mediada
por PCR del gen completo de DS-amidasa a partir de
DNA genómico de Variovorax paradoxus.
Para una denominada "Biblioteca
GenomeWalker" se hidrolizó DNA genómico con cuatro enzimas de
restricción diferentes (EcoRV, ScaI, PvuII y StuI).
Después de purificación de la mezcla de reacción de restricción de
DNA se realizó en cada caso una ligación de extremos romos con los
Adaptadores GenomeWalker añadidos, para la cual se disponía de dos
adaptadores-iniciadores (AP1 y AP2). La restricción
del DNA genómico y la ligación de los adaptadores se realizaron a
continuación de acuerdo con el Manual del Usuario del Kit
GenomeWalker^{TM} Universal (3/2000, Clontech).
Esta biblioteca sirvió como modelo para una
primera reacción PCR (PCR primaria). Para cada reacción PCR en
ambas direcciones se utilizaron en cada caso los pares de
iniciadores AP1/AAH-GW-F1 (aguas
abajo) y AP1/AAH-GW-R1 (aguas
arriba). A fin de hacer posible una amplificación de los fragmentos
grandes de DNA ("PCR a larga distancia") se empleó como
DNA-polimerasa Herculase® (Stratagene).
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Las mezclas de reacción PCR se cubrieron con
aproximadamente 50 \mul de aceite mineral ligero.
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Los pasos 2-3 se realizaron 10
veces. A continuación se realizaron 25 veces los pasos
4-5, prolongándose la duración del paso 5 en 10
segundos por ciclo (incremento de tiempo).
Con los productos PCR obtenidos se realizó una
segunda PCR (PCR secundaria o anidada) con los pares de iniciadores
AP2/AAH-GW-F2 (aguas abajo) y
AP2/AAH-GW-R2 (aguas arriba), por
medio de lo cual puede minimizarse una formación de productos PCR
inespecíficos. Los productos amplificados por PCR se diluyeron
dependiendo de la concentración hasta 1:50 con agua desmineralizada
y se emplearon así como moldes.
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Las mezclas de reacción PCR se cubrieron con
aprox. 50 \mul de aceite mineral ligero.
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Los pasos 2-3 se realizaron 10
veces y a continuación se realizaron 20 veces los pasos
4-5.
Los productos PCR resultantes de 2ª PCR se
separaron en un gel de agarosa y el producto amplificado
predominante se purificó y secuenció como se ha descrito. En
resumen, a partir de la biblioteca GenomeWalker se obtuvieron por
tanto después de la segunda PCR los amplificados pCR: siguientes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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Los productos PCR de tres mezclas de reacción
paralelas con el gen completo de D-amidasa con 92 pb
antes del codón de iniciación y 80 pb después del codón de parada
se ligaron para los trabajos ulteriores en el vector pUC18 (Roche
Biochemicals) y se transformaron en E. coli XL1 Azul. Estas
técnicas se describen detalladamente en Sambrook et al.
(Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989), "Molecular
cloning: a laboratory manual, 2nd ed." Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York) y Hopwood et al. (Hopwood, D.
A.; Bibb, M. J.; Chater, K. F.; Dieser, T.; Bruton, C. J.; Kieser,
H. M.; Lydiate, D. J.; Smith, C. P.; Ward, J. M.; Schrempf, H.
(1985), Genetic manipulation of Streptomycetes: A laboratory
manual, The John Innes Foundation, Norwich) y son por tanto
conocidas por los expertos.
La secuencia del gen de
D-amidasa (Seq. 1) de los plásmidos se comprobó por
secuenciación y era idéntica para las tres mezclas de reacción. El
plásmido se designó pUC-AAH (Fig. 4). En Fig. 4 se
representa un mapa plasmídico de pUC-aah. Se
muestra el producto PCR de 1,6 kb de tamaño con el gen AAH y 92 pb
antes del codón de iniciación y 80 pb después del codón de parada
en pUC18. (Par de iniciadores:
AAH-K-N2/AAH-R-C2).
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Como se ha descrito ya en 5, se introdujo
partiendo del plásmido pUC-AAH para expresión de la
D-amidasa por medio de la reacción PCR un punto de
corte EcoRI en el extremo 5' y un punto de corte HindIII en el
extremo 3', y el producto PCR se ligó en el vector pBTAC y se
transformó en la cepa de expresión de E. coli JM 101.
La expresión heteróloga estandarizada se realizó
conforme a Sambrook et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. y
Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).
Los derivados transformados en E. coli JM
101 se incubaron en medio LB (con 0,1 mg/ml de ampicilina) durante
una noche a 37ºC. Se inocularon luego 30 ml de los cultivos (medio
LB con 0,1 mg/ml de ampicilina en 4 matraces Schikane) con 0,3 ml
de cultivo nocturno (1:100). Se indujo la expresión de la amidasa a
una densidad de células DO_{600nm} con 30 \mul de una solución
1 M de IPTG (concentración en el cultivo 1 mM; IPTG =
isopropiltiogalactosido). Después de 4-6 horas
adicionales de incubación a 30ºC se cosecharon las células.
En los extractos brutos de los clones de
expresión, que se extrajeron de la manera descrita, pudo
determinarse una actividad de D-amidasa de
80-210 mU/mg de proteína total para
DL-Tle-NH_{2} como sustrato.
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En la transformación de leucinamida terciaria (y
en general de las amidas de ácido) por la D-amidasa
se llega a la formación de amoníaco o iones amonio y leucina
terciaria (y en general al ácido) en cantidades equimolares. Como
comprobación de la actividad de amidasa se recurrió por ello a la
determinación del aumento de iones amonio o de la formación de
leucina terciaria por HPLC. La variación de la concentración de los
componentes implicados puede medirse en un test enzimático, que
consiste en una incubación durante 10 a 60 minutos a 30ºC de la
mezcla de test siguiente.
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Se inició el test enzimático por adición del
sustrato, y la parada de la reacción se realizó por calentamiento
durante 3 minutos a 95ºC. El análisis de los iones amonio de los
productos de reacción se realizó por determinación enzimática de
amonio mediante la glutamato-deshidrogenasa
(Bergmeyer, H. U., and Beutler, H.-O. (1985) Ammonia. In: Methods
of Enzymatic Analysis. VCH-Verlag, 3rd Edition, Vol.
8: 454-461, Weinheim) o de D- y
L-leucina terciaria por HPLC (Brückner, H., Wittner
R., and Godel H., (1991) Fully automated
high-performance liquid chromatographic separation
of DL-amino acids derivatized with
o-Phthaldialdehyde together with
N-isopropylcysteine. Application to food samples.
Anal. Biochem. 144(1): 204-206). Como
controles se utilizaron mezclas de reacción, a las que no se había
añadido sustrato alguno.
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima
glutamato-deshidrogenasa (GluDH; E.C.1.4.1.3)
transforma 2-oxoglutarato en
L-glutamato, consumiéndose iones amonio y
oxidándose NADH a NAD+ (Bergmeyer, H. U. y Beutler, H.-O. (1985),
Ammonia. In: Methods of Enzymatic Analysis.
VCH-Verlag, 3rd Edition, Vol. 8:
454-461, Weinheim).
La cantidad de NADH consumida durante la
reacción es equivalente a la cantidad de iones amonio. La variación
de la concentración de NADH es la magnitud de medida, y puede
determinarse espectrofotométricamente a una longitud de onda de 340
nm.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón de 2-oxoglutarato/ADP/TEA: 9,3 g TEA, 95 mg ADP, 670 mg
- 2-oxoglutarato en agua desmineralizada hasta 100 ml, pH 8,0
- Solución de NADH: Se disuelven 30 mg NADH, 60 mg NaHCO_{3} en 6 ml de agua desmineralizada
- Glutamato-deshidrogenasa: de hígado de bovino en glicerina al 50%, 120 U/mg.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los componentes del test se pipetearon en
cubetas de plástico (cubetas Brand de un solo uso, semimicro, de
1,5 ml), se mezclaron, y se midió la extinción después de 5 min a
340 nm. A continuación se realizó la adición de 10 \mul de GluDH
y después del transcurso total de la reacción, por regla general al
cabo de 30 min, se efectuó una nueva medida de la extinción.
La variación de la extinción \DeltaE se obtuvo
sustrayendo el segundo valor del primero. Para las muestras
respectivas resulta un campo de medida de iones amonio hasta 2
mM.
Una comparación entre las mezclas de reacción de
muestra y controles correspondientes proporcionó información acerca
de si los valores medidos a partir de
D,L-Tle-NH_{2} eran atribuibles a
iones amonio liberados a partir de
D,L-Tle-NH_{2} o a iones amonio ya
existentes en el extracto bruto.
Con ayuda de la construcción de una recta de
contraste por medio de cantidades definidas de cloruro de amonio
pudo determinarse la concentración de iones amonio a partir de las
variaciones de extinción.
\vskip1.000000\baselineskip
La separación y determinación cuantitativa de
los enantiómeros D y L de leucina terciaria se realizó por una
"derivatización quiral" basada en dialdehído
o-ftálico
(OPA)/N-isobutiril-L-cisteína
o
N-isobutiril-D-cisteína
(Brückner, H.; Wittner R. y Godel H. (1991), Fully automated
high-performance liquid Chromatographic separation
of DL-amino acids derivatized with
o-Phthaldialdehyde together with
N-isopropyl-cysteine. Application to
food samples. Anal. Biochem. 144, 204-206). Los
derivados de isoindol diastereoisómeros formados se separaron en
una columna RP-18-(fase inversa) y se detectaron por
fluorescencia. Como fase móvil se utilizó un sistema de dos
tampones constituido por tampón de acetato acuoso y una mezcla
acetonitrilo/agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Fase estacionaria: columna HPLC Kromasil^{TM},
250 x 4 mm, 5 \mum, 100 \ring{A} (firma Eka Nobel)
Fase móvil:
- Medio de paso A: acetato de sodio 23 mM, pH 6,0
- Medio de paso B: acetonitrilo (grado HPLC) y agua desmineralizada: 10:1,5 (v/v)
- Caudal: 1 ml/min
- Volumen de muestra: 20 \mul
- Detección: fluorescencia: extinción 340 nm/emisión 440 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La purificación de la D-amidasa
se realizó después de digestión de las células en tres pasos de
cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
- Material de la columna: Q-Sepharose-FF (Pharmacia)
- Tampón A: tampón de fosfato de potasio, 20 mM, pH 6,5
- Tampón B: tampón A + Na_{2}SO_{4} 150 mM
- Elución en un gradiente lineal.
\vskip1.000000\baselineskip
- Material de la columna: Butil-Sepharose 4 FF (Pharmacia)
- Tampón A: Tampón de fosfato de potasio, 20 mM, pH 6,5 + Na_{2}SO_{4} 150 mM
- Tampón B: Tampón de fosfato de potasio, 20 mM, pH 6,5
- Elución en un gradiente lineal
\vskip1.000000\baselineskip
- Material de la columna: Superdex 200 PG (Pharmacia)
- Tampón: Tampón de fosfato de potasio, 20 mM, pH 6,5 + NaCl 180 mM
Después del segundo paso, en la mayoría de los
casos está presente sólo una proporción muy pequeña de proteína
extraña. Para los dos primeros pasos de purificación puede
calcularse un rendimiento de 88%, estando presente una actividad
específica de 0,68 U/mg para
DL-Tle-NH_{2}. Para la
D-amidasa de Variovorax paradoxus purificada
homogéneamente se obtuvo una actividad específica de 1,4 U/mg para
DL-Tle-NH_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación del óptimo de temperatura
se utilizó enzima purificada prácticamente homogénea con una
actividad específica de aproximadamente 1,3 U/mg. Se realizó una
determinación de la actividad, como se describe en 8, con
DL-Tle-NH_{2} como sustrato desde
20º a 50ºC en pasos de 5ºC, estudiándose más detalladamente el
intervalo de 409 hasta 55ºC (sic) con medidas ulteriores. El tiempo
de incubación se seleccionó relativamente breve, de 15 min. La
evolución de la actividad en función de la temperatura se representa
en Fig. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Para esto se determinó con enzima purificada
después de la cromatografía de intercambio iónico la actividad para
valores de pH comprendidos en el intervalo de 3,5 a 11 con las
sustancias tampón siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La investigación de la actividad se realizó como
se describe en el apartado 8, con
DL-Tle-NH_{2} como sustrato y una
incubación de 30 min a 30ºC. La evolución de la actividad en función
del valor de pH y de la sustancia tampón respectiva se representa
en Fig. 3.
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Amidasa de Variovorax
paradoxus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 010199 AM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Variovorax paradoxus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1398)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Variovorax paradoxus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador AAH-N1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtsggccgsc gsatccagca gaagga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador AAH-C1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatscgga tcgagccgcc sgtstc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Sonda génica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador AAH-GW-F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtcacgcc gccggtcaat ccgtggaa
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador AAH-GW-F2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgcactgg tcgggtgcct cgtcga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador AAH-GW-R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcgcgtgt tcggccatca cgatcacata
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador AAH-GW-R2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcttgagcg cgccgtcgac cttctcga
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador AAH-K-N2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtcatca agcgcggcca gatcggc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador AAH-K-C2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcggccga cagccgattg gccagc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador
AAH-N-EcoRI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggaattca tgagcaacga actgcattac ct
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador
AAH-C-HindIII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcccaagct tttacagcac cggatgccg
\hfill29
Claims (8)
1. D-amidasa,
caracterizada porque
la misma procede de V.
paradoxus 19-3 DSM
14468.
2. Ácidos nucleicos que codifican una amidasa
según la reivindicación 1.
3. Plásmidos, vectores, y microorganismos que
contienen uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 2
clonados.
4. Iniciadores para la producción de ácidos
nucleicos según la reivindicación 2 por PCR, seleccionados del
grupo constituido por Seq. ID No: 3, Seq. ID No: 4, Seq. ID No: 6,
Seq. ID No: 7, Seq. ID No: 8, Seq. ID No: 9, Seq. ID No: 10, Seq.
ID No: 11, Seq. ID No: 12, y Seq. ID No: 13.
5. Utilización de las D-amidasas
según la reivindicación 1 para la producción de ácidos carboxílicos
o compuestos orgánicos quirales enantioméricamente enriquecidos,
como p.ej. aminoácidos.
6. Utilización de los ácidos nucleicos según la
reivindicación 3 para la producción de catalizadores de células
enteras.
7. Catalizadores de células enteras que
contienen un gen clonado para una nitrilhidratasa y un gen clonado
para una amidasa según la reivindicación 1 y opcionalmente un gen
clonado para una
\alpha-aminonitril-racemasa, una
cianhidrin-racemasa, una racemasa de ácido
\alpha-hidroxi-carboxílico o una
racemasa de (\alpha- o \beta-)amida de aminoácido.
8. Variovorax paradoxus 19-3 DSM
14468.
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| EP1318193A3 (de) | 2003-09-17 |
| EP1318193B1 (de) | 2009-02-11 |
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