JP7244089B2 - ペニシリンgアシラーゼ - Google Patents
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- C12Y305/01011—Penicillin amidase (3.5.1.11), i.e. penicillin-amidohydrolase
Description
配列表、表またはコンピュータプログラムに対する参照
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
配列番号6と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有し、54、62、115、125、127、127、185、253、254、254/255、254/255/370、255、256、257、257、260、268、322、325、348、369、370、372、373、377、378、384、384/513/536、388、389、391、435、461、517、530、554、556、557、559、560、600/623、623、624、626、627、705、706、707、723、740、748、および752位から選択される位置での少なくとも1つの置換を有する、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体であって、前記位置が配列番号6を基準として付番されている、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目2)
配列番号6と85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有し、54C、62G、115A/P、125L/T、127S/V、185V、253K/V、254T、254W/255G、254W/255G/370I、255L、255M/Q/T/Y、256Q、257I、257V、260A/P、268S/V、322P、325G、348C、348Q、369L、369P、369V、369W、370F/G/S、372A/H/L、373F/M、377P、378H、384A、384F/513Q/536M、384G/L、388T、389L、391P/S、435R、461A、517L/P、530C/Y、554A/E/P/V、556G、557G/S、559P/S、560I、600T/623V、623A/G/R/W、 624A、626G、627G/H、705G/P、706G、707S、723A/G、740L、748G、および752Eから選択される少なくとも1つの置換を有する、項目1に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目3)
配列番号8と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有し、103/370/444/706/766、103/369/370/442/444/536/556/766、103/369/370/444、103/369/370/444/556/706/766、103/369/370/444/765/766、103/369/370/765/766、257/362/384/451、257/362/384/451/723、362/451/705、369/370、369/370/444/706/766、369/370/556/766、369/370/388/444/556/766、369/370/444、369/370/444/556/766、369/370/556、369/370/556/765、369/370/556/766、369/370/766、369/370/444/556、369/370/444/556/612/766、369/370/444/556/706/765、369/370/444/706/765/766、372/373/384/513/560、372/384/451/705、372/384/560/705、384/451/560/705/723、384/451/705/723、451/560/705/723、および451/705/723位から選択される少なくとも1つの置換セットを有する、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体であって、前記位置が配列番号8を基準として付番されている、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目4)
前記置換セットが、103V/370F/444S/706G/766G、103V/369W/370F/442I/444S/536M/556G/766G、103V/369W/370F/444S、103V/369W/370F/444S/556G/706G/766G、103V/369W/370F/444S/765P/766G、103V/369W/370F/765P/766G、257V/362V/384A/451R、257V/362V/384L/451R/723L、362V/451R/705D、369P/370F、369P/370F/444S/706G/766G、369P/370F/556G/766G、369V/370F/388T/444S/556G/766G、369V/370F/444S、369V/370F/444S/556G/766G、369V/370F/556G、369V/370F/556G/765P、369V/370F/556G/766G、369V/370F/766G、369W/370F/444S/556G、369W/370F/444S/556G/612A/766G、369W/370F/444S/556G/706G/765P、369W/370F/444S/706G/765P/766G、372A/373M/384L/513Q/560G、372A/384L/451R/705D、372A/384L/560G/705D、384A/451R/560G/705D/723L、384L/451R/705D/723L、451R/560G/705D/723L、および451R/705D/723Lから選択される、項目3に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目5)
配列番号34と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有し、55、275、403、482、496、541、616、619/664、622、639、664、747、および759位から選択される位置での少なくとも1つの置換または置換セットを有する、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体であって、前記位置が配列番号34を基準として付番されている、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目6)
前記少なくとも1つの置換または置換セットが、55V、275E、403T、482A/S、496K、541A、616G、619N/664G、622R、639G、664G、747G、および759Nから選択される、項目5に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目7)
配列番号34と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有し、103/372/373/557、253/322/369/623、253/254/322/369/623、253/254/369/391/623/723、253/254/369/619/623/723、253/254/369/623/723、253/254/373/623/723、253/254/255/369/623/723、253/254/369、253/322/369/373/723、253/369/623/723、253/373/623、253/254/255/322/369/619/723、260/372/373/556、260/372/373/556/557/559、322/369、322/369/373/723、322/369/623/723、および369/373/556から選択される少なくとも1つの置換セットを有する、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体であって、前記位置が配列番号34を基準として付番されている、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目8)
前記置換セットが、103V/372S/373F/557G、253H/322T/369W/623G、253H/254Q/322T/369W/623G、253H/254Q/369W/391A/623G/723A、253H/254Q/369W/619R/623G/723A、253H/254Q/369W/623G/723A、253H/254Q/373L/623G/723A、253H/254S/255V/369W/623S/723A、253H/254S/369W、253H/322T/369W/373W/723A、253H/369W/623G/723A、253H/373L/623S、253S/254S/255V/322T/369W/619R/723A、260S/372S/373F/556G、260S/372S/373F/556G/557V/559S、322T/369W、322T/369W/373W/723A、322T/369W/623G/723A、および369W/373F/556Gから選択される、項目7に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目9)
配列番号46と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有し、9/25/103/253/348/444/557/623、9/103/322/391/444/557/623、9/103/253/322/348/444/556/557/623、25/103/241/253/322/348/444/556/557/623、28、71、77、103/257/260/322/348/384/444/556/623、103/257/260/322/348/444/557、103/322/348/373/444/556/557、103/260/322/348/444/556/557/623、103/260/322/348/444/623、103/260/322/348/373/391/444/556/557/623、111、128、129、131、146/309/556/619/748、176/233/373/619/664、176/373/482/569、176/373/482/622/664、176/373/482/622、176/373/482/569/622/623/764、176/482、225/304/309/556/557/619/748、225/304/322/494/496/616/619/664/747/756、225/304/494/616/619/664/747/759、233/275/482/569/664、233/275/482/619、233/373/482/622/664、304/496/616/619/664/747/756/759、322/348/373/391/444/556/623、322/348/444/557、369、369/764、370、373/482/569/619/764S、373、379D、380、389、451、471、482/623、494/496/616/619/664、616、617、619、622、626、および705位から選択される位置での少なくとも1つの置換または置換セットを有する、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体であって、前記位置が配列番号46を基準として付番されている、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目10)
前記少なくとも1つの置換または置換セットが、9K/25V/103V/253S/348A/444S/557G/623D、9K/103V/322T/391A/444S/557G/623D、9K/103V/253S/322T/348A/444S/556G/557G/623D、25V/103V/241K/253S/322T/348A/444S/556G/557G/623D、28A/C/Q/S、A71C/F/G,L、77T/V、103V/257V/260S/322T/348A/384T/444S/556G/623D、103V/257V/260S/322T/348A/444S/557G、103V/322T/348A/373A/444S/556G/557G、103V/260S、322T/348A/444S/556G/557G/623D、103V/260S/322T/348A/444S/623D、103V/260S/322T/348A/373A/391A/444S/556G/557G/623D、111S、128H、129E、131D、146M/309D/556N/619S/748A、176S/233E/373A/619N/664R、176S/373F/482A/569W、176S/373F/482A/622F/664G、176S/373F/482A/622V、176S/373F/482C/569W/622C/623D/764S、176S/482A、225K/304C/309V/556N/557R/619S/748A、225T/304I/322T/494E/496N/616G/619N/664G/747S/756P、225T/304I/494E/616G/619N/664G/747P/759E、233E/275E/482A/569W/664G、233E/275E/482C/619N 233E/373F/482A/622V/664G、304I/496K/616S/619N/664E/747P/756P/759E、322T/348A/373A/391A/444S/556G/623D、322T/348A/444S/557G、369A/E/L、369、369L/764G、369V、I370M/Q、373A/482C/569W/619N/764S、373G、379D/S、380D、389V、451H、471V 482S/623D、494E/496K/616S/619N/664E、616D/E/G/N/Q/T、617W、619A/H/L/P/S/V、622I/V、626D/E、および705Nから選択される、項目9に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ。
(項目11)
配列番号54と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有し、28/71/128/176/619/664、28/71/128/176/626/753、71、71/176/233/260/275/482/619/759、71/176/233/482、71/176/260/451/619、71/176/275/482、71/176/275/664、71、71/128/176/373/482/496/619、71/128/176/373/482/496/569、71/128/176/482/496、71/128/176/496/664、71/128/373/482/664/753、71/176/233/260/451/482/664/759、71/176/233/373/482/569/753、71/176/260/275/482/557/759、71/176/260/482、71/176/260/482/557/619/664、71/176/373/626/664/753、71/176/451/482/619/759、71/176/482、71/176/482/619/664/759、71/233/260/482/557/759、71/260/451/482/664/759、71/373/756、82、122、126、128/176/233/373/482/626/753、128/176/233/496/664/753、128/176/373/482/664、128/176/373/496/753、176/233/260/275/482/664/759、176/233/451/482/619/664/759、180、184、472、496、658、679、686、および739位から選択される位置での少なくとも1つの置換または置換セットを有する、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体であって、前記位置が配列番号54を基準として付番されている、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目12)
前記少なくとも1つの置換または置換セットが、28A/71L/128H/176S/619N/664E、28A/71L/128H/176S/626D/753C、71F/176S/233E/260G/275C/482S/619N/759D、71F/176S/233E/482A、71F/176S/260G/451H/619V、71F/176S/275C/482S、71F/176S/275E/664D、71F/G/I/L、71L/128H/176S/373A/482C/496K/619S、71L/128H/176S/373A/482S/496K/569C、71L/128H/176S/482S/496K、71L/128H/176S/496K/664E、71L/128H/373A/482S/664E/753C、71L/176S/233E/260G/451H/482S/664C/759E、71L/176S/233E/373A/482C/569C/753C、71L/176S/260G/275C/482A/557G/759E、71L/176S/260G/482A、71L/176S/260G/482A/557G/619P/664D、71L/176S/373A/626E/664E/753C、71L/176S/451H/482A/619V/759E、71L/176S/482A、71L/176S/482A/619P/664D/759E、71L/233E/260G/482A/557G/759E、71L/260G/451H/482A/664D/759E、71L/373A/756C、71M/V、82V、122M、126L、128H/176S/233E/373A/482S/626E/753C、128H/176S/233E/496K/664E/753C、128H/176S/373A/482S/664E、128H/176S/373A/496K/753C、176S/233E/260G/275E/482C/664E/759D、176S/233E/451H/482S/619N/664C/759D、180F、184A/F、472F/V、496K、658C、679L、686A、およびP739D/Sから選択される、項目11に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目13)
配列番号74と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有し、71/352、71/451/748、71/353/357/451/705/748、71/451/556/705/748、77/176/712、111/176/352、176、176/233、176/233/352、176/233/557/619/759、176/233/759、176/275/348/557/759、176/275/569/759、176/275/557/759、176/275、176/348/557/569/616、176/352、176/361、176/482/616/759、176/557/616、176/557/708、176/557/569/616/708、176/557/569/616、176/557/619、176/569/616/619/759、176/616、176/616/619、176/616、および176/Q759位から選択される位置での少なくとも1つの置換または置換セットを有する、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体であって、前記位置が配列番号74を基準として付番されている、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目14)
前記少なくとも1つの置換または置換セットが、71C/352S、71C/451H/748A、71F/353A/357A/451H/705N/748A、71F/451H/556N/705N/748A、77T/176S/712V、111S/176S/352S、176S、176S/233E、176S/233E/352S、176S/233E/557G/619G/759D、176S/233E/759E、176S/275C/348M/557G/759D、176S/275C/569W/759D、176S/275E/557G/759E、176S/275E、176S/348M/557G/569W/616G、176S/352S、176S/361T、176S/482C/616G/759E、176S/557G/616N、176S/557G/708L、176S/557G/569W/616G/708L、176S/557G/569W/616T、176S/557G/619G、176S/569W/616G/619S/759D、176S/616G、176S/616S、176S/616G/619R、176S/616T、および176S/759Dから選択される、項目13に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ。
(項目15)
ヒスチジンタグを含む、項目1~14のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目16)
前記ヒスチジンタグが、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体のC末端に存在する、項目15に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目17)
改変体番号1~308に示されるポリペプチド配列を含む、項目1~16のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目18)
配列番号4~配列番号90の間の偶数配列から選択されるポリペプチド配列を含む、項目1~17のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目19)
項目1~18のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体をコードする操作されたポリヌクレオチド配列。
(項目20)
配列番号5~配列番号89の間の奇数配列から選択される配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超えて同一であるポリヌクレオチド配列を含む、項目19に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
(項目21)
項目19および/または20に記載の操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクター。
(項目22)
少なくとも1つの制御配列をさらに含む、項目21に記載のベクター。
(項目23)
項目21および/または22に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目24)
項目1~18のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を生成するための方法であって、項目23に記載の宿主細胞を、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体が前記宿主細胞によって産生される条件下で培養することを含む、方法。
(項目25)
前記宿主細胞によって産生された前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を回収するステップをさらに含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
保護インスリンを脱アシル化することができる、項目1~18、24、および/または25のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目27)
前記保護インスリンが、2重保護または4重保護インスリンを含む、項目26に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目28)
前記保護インスリンが、二量体または四量体である、項目1~18、24~27のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
(項目29)
i)項目1~18、24~28に記載の少なくとも1つの操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体、およびA1/B1/A1’/B1’-テトラフェニル酢酸保護基を含むインスリン二量体を含む組成物を提供することと、ii)前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体が前記A1/B1/A1’/B1’-テトラフェニル酢酸保護基を除去し遊離インスリンが生成されるような条件下で、前記操作されたペニシリンGアシラーゼを、A1/B1/A1’/B1’-テトラフェニル酢酸保護基を含む前記インスリン二量体に曝露することとを含む、遊離インスリンを生成するための方法。
(項目30)
i)項目1~18、24~28に記載の少なくとも1つの操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体、およびA1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を含むインスリン二量体を含む組成物を提供することと、ii)前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体が前記A1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を除去し遊離インスリンが生成されるような条件下で、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を、A1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を含む前記インスリン二量体に曝露することとを含む、遊離インスリンを生成するための方法。
(項目31)
i)項目1~18、24~28に記載の少なくとも1つの操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体、およびA1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を含むインスリンを含む組成物を提供することと、ii)前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体が前記A1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を除去し遊離インスリンが生成されるような条件下で、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を、A1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を含む前記インスリンに曝露することとを含む、遊離インスリンを生成するための方法。
の表題は、単に組織化を目的とするものであり、記載されている主題を限定するものとは解釈されない。
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
本開示に関して、本明細書における説明で使用される科学技術用語は、明確な定義がない限り当業者に一般に理解されている意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。加えて、本明細書で言及される特許および刊行物は、このような特許および刊行物に開示されているすべての配列を含めて、すべてが、明白に参照により組み込まれる。
局所相同性アルゴリズムによって;NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、48巻:443頁、[1970年]の相同性アラインメントアルゴリズムによって;PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85巻:2444頁、[1988年]の類似性調査法によって;ならびに/または、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御による実行によって[GCG Wisconsin Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA])、または当技術分野で一般に公知の方法を使用した視覚的な検査によって行うことができる。さらに、配列アラインメントおよびパーセント配列同一性の決定には、GCG Wisconsin Software Package中のBESTFITまたはGAPプログラムを、提供されるデフォルトのパラメータを使用して用いることができる(Accelrys、Madison WI)。
るために使用される標準的なアッセイのいずれか1つによって測定することができる(例えば、SimonsおよびGibson、Biotechnol. Tech.、13巻:365~367頁、[1999年]を参照のこと)。いくつかの実施形態では、PGA活性は、切断生成物である5-アミノ-2-ニトロ-安息香酸が分光光度的に検出可能な(λmax=405nm)6-ニトロフェニルアセトアミド安息香酸(NIPAB)を使用することによって測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に記載されるように、酵素の規定の調製、所定の条件下での規定のアッセイ、および1つ以上の規定の基質を使用して行われる。一般に、溶解産物が比較される場合、宿主細胞によって産生され、溶解産物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用されると共に、細胞数およびアッセイされるタンパク質の量が決定される。
ば、5~99%)の溶媒(例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルtert-ブチルエーテルなど)に、一定期間(例えば、0.5~24時間)曝露した後、無処理の酵素と比較して同様の活性(例えば、例えば、60%~80%超)を維持するポリペプチドの能力を指す。
システイン(または「L-Cys」もしくは「[C]」)は他のL-Cys(C)アミノ酸または他のスルファニル含有アミノ酸もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成し得るという点で、普通ではないことに留意する。「システイン様残基」として、システインおよびジスルフィド架橋の形成に利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸が挙げられる。L-Cys(C)(および-SHを含有する側鎖を有する他のアミノ酸)の、ペプチド内に、還元型遊離-SHまたは酸化型ジスルフィド架橋形態のいずれかで存在する能力は、L-Cys(C)がペプチドへの正味の疎水性または親水性特徴に寄与するかどうかに影響を及ぼす。L-Cys(C)は、Eisenbergの正規化されたコンセンサス尺度(Eisenbergら、1984年、上記)に従って0.
29の疎水性を示すが、本開示の目的に関しては、L-Cys(C)は、独自の群にカテゴリー化されることが理解されるべきである。
ペニシリンGアシラーゼ
)。ペニシリンGアシラーゼは、ペニシリンG、セファロスポリンG、および関連する抗生物質の側鎖に作用して、共通の副生成物としてフェニル酢酸を伴い、β-ラクタム系抗生物質中間体である6-アミノペニシラン酸および7-アミノデス-アセトキシセファロスポラン酸を生成させる加水分解酵素である。これらの抗生物質中間体としては、アンピシリン、アモキシシリン、クロキサシリン、セファレキシン、およびセフォタキシム(cefatoxime)などの、半合成抗生物質の潜在的な構成要素がある。
]を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、宿主細胞および他の因子に応じて、他のシグナルペプチドが使用される。糸状菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼ、Humicola lanuginosaリパーゼ、およびT.reeseiセロビオヒドロラーゼIIから得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。細菌宿主細胞のためのシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Bacillus NClB11837マルトース生成アミラーゼ(maltogenic amylase)、Bacillus stearothermophilus α-アミラーゼ、Bacillus licheniformisサブチリシン、Bacillus licheniformis β-ラクタマーゼ、Bacillus stearothermophilus中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)、およびBacillus subtilis prsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。いくつかのさらなる実施形態では、他のシグナルペプチドが本発明において使用される(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、SimonenおよびPalva、Microbiol. Rev.、57巻:109~137頁、[1993年]を参照のこと)。酵母宿主細胞についてのさらなる有用なシグナルペプチドとしては、Saccharomyces cerevisiae α-因子、Saccharomyces cerevisiae SUC2インベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられる(例えば、TaussigおよびCarlson、Nucl. Acids Res.、11巻:1943~54頁、[1983年];SwissProtアクセッション番号P00724;およびRomanosら、Yeast、8巻:423~488頁、[1992年]を参照のこと)。いくつかの実施形態では、これらのシグナルペプチドの改変体および他のシグナルペプチドが使用される。実際に、当技術分野で公知の任意の適切なシグナルペプチドが本発明において使用されるので、本発明は、いかなる特定のシグナルペプチドにも限定されるものではない。
これらのデータセットは、当技術分野で周知であるように、発現タンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列(例えば、完全なタンパク質コード配列-CDS)、発現配列タグ(EST)、またはゲノム配列の予測されるコード領域を含む。改変体PGAをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して調製され得る。一般には、オリゴヌクレオチドを個々に合成し、次いで結合(例えば、酵素的ライゲーション法もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって)して、基本的に任意の所望の連続的な配列を形成する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、限定されないが、自動化された合成法を含む当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用した化学合成によって調製される。例えば、ホスホラミダイト法では、オリゴヌクレオチドを合成し(例えば、自動DNAシンセサイザーで)、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。いくつかの実施形態では、次いで、二本鎖DNA断片を、相補鎖を合成し、その鎖を一緒に適切な条件下でアニーリングすることによって、または、適切なプライマー配列を有するDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することによってのいずれかで得る。本発明において有用な方法を提供する多数の一般的な標準的なテキストが当業者に周知である。
cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(ADH2/GAP)、およびS.cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に対して有用なさらなる有用なプロモーターは当技術分野で公知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Romanosら、Yeast、8巻:423~488頁、[1992年]を参照のこと)。さらに、真菌におけるキチナーゼ産生に関連するプロモーターが本発明において使用される(例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれるBlaiseauおよびLafay、Gene、120243~248頁、[1992年];ならびにLimonら、Curr. Genet.、28巻:478~83頁、[1995年]を参照のこと)。
したがって、いくつかの実施形態では、得られたポリペプチドを回収/単離し、場合により、当技術分野で公知のいくつもの方法のいずれかによって精製する。例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除)、または沈殿を含む従来の手順によって栄養培地から単離する。いくつかの実施形態では、所望の通り、成熟タンパク質の立体配置の完成において、タンパク質リフォールディングステップを使用する。さらに、いくつかの実施形態では、最終的な精製ステップにおいて高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いる。例えば、いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の方法が本発明において使用される(例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Parryら、Biochem. J.、353巻:117頁、[2001年];およびHongら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、73巻:1331頁、[2007年]を参照のこと)。実際に、当技術分野で公知の任意の適切な精製方法が本発明において使用される。
1992年]を参照のこと)での精製を容易にし、エンテロキナーゼ切断部位は、改変体PGAポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段を提供する。外来ポリペプチドをグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるために、pGEXベクター(Promega)も使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞から、リガンド-アガロースビーズ(例えば、GST融合物の場合にはグルタチオン-アガロース)への吸着、その後の遊離のリガンドの存在下での溶出によって容易に精製され得る。
以下の代表的な実施例において、本開示の様々な特徴および実施形態を例証するが、これらは例示的なものであり、限定的なものではない。
組換えPGA遺伝子を含有するE.coli発現宿主
本発明の改変体酵素を生成するために使用する最初のPGA酵素を、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許出願公開第2016/0326508号に開示された改変体から得た。PGAパネルプレートは、野生型Kluyvera citrophila PGAと比較して改善された特性を有する操作されたPGAポリペプチドのコレクションを含む。野生型PGA遺伝子は、54個のアミノ酸のスペーサー領域によって連結されたアルファサブユニット(23.8KDa)およびベータサブユニット(62.2KDa)からなるヘテロ二量体である。スペーサー領域が存在することに起因して、活性なタンパク質を形成するためには自己プロセシングステップが必要である。本発明の開発の間に、野生型遺伝子を改変してスペーサー領域を排除し、したがって、自己プロセシングステップを排除した。PGAパネルプレート(Codexis)は、スペーサー領域を欠くPGA改変体を含有する(例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2010/0143968号を参照のこと)。C末端ヒスチジンを遺伝子に付加し、PGAコード遺伝子を、laclリプレッサーの制御下でlacプロモーターと動作可能なように連結した発現ベクターpCK110900内にクローニングした(どちらもすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2006/0195947号および第2016/0244787号を参照のこと)。発現ベクターはP15a複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有する。生じるプラスミドを、当分野で公知の標準方法を使用してE.coli W3110内に形質転換させた。当分野で公知のように、細胞をクロラムフェニコール選択に供することによって形質転換体を単離した(例えば、それぞれがすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,383,346号およびWO2010/144103号を参照のこと)。
(実施例2)
HTP PGAを含有する湿潤細胞ペレットの調製
HTP PGAを含有する細胞溶解産物の調製
まず、50mMのトリス-HCl緩衝液、pH7.5、1mg/mLリゾチーム、および0.5mg/mL PMBSを含有する溶解緩衝液200μlを実施例2に記載の通り生成した各ウェル中の細胞ペーストに添加した。細胞を、卓上振盪機で振盪しながら室温で2時間溶解させた。次いで、プレートを4000rpmおよび4℃で15分間遠心分離した。次いで、透明な上清を、それらの活性レベルを決定するための生体触媒反応において使用した。
振盪フラスコ(SF)培養物由来の凍結乾燥溶解産物の調製
上記の通り成長させた選択されたHTP培養物を、1%グルコースおよび30μg/ml CAMを伴うLB寒天プレートにプレーティングし、37℃で一晩成長させた。各培養物からの単一コロニーを、1%グルコースおよび30μg/ml CAMを伴うLB 6mlに移した。培養物を30℃、250rpmで18時間成長させ、30μg/ml CAMを含有するTB 250ml中、およそ1:50で継代培養して、最終的なOD600を0.05にした。培養物を30℃、250rpmでおよそ195分間成長させてOD600を0.6~0.8にし、1mM IPTGを用いて誘導した。次いで、培養物を30℃、250rpmで20時間成長させた。培養物を4000rpmで20分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを20mMトリス-HCl、pH7.5、30mlに再懸濁させた。細胞をペレット化し(4000rpmで20分間)、-80℃で120分間凍結させた。凍結したペレットを20mMトリス-HCl、pH7.5、30mlに再懸濁させ、Microfluidizer(登録商標)プロセッサシステム(Microfluidics)を18,000psiで使用して溶解させた。溶解産物をペレット化し(10,000rpmで60分間)、上清を凍結させ、凍結乾燥して振盪フラスコ(SF)酵素を作製した。
(実施例5)
4重保護インスリン係留二量体に対する配列番号4および配列番号6の振盪フラスコ粉末の評価
ハイスループットスクリーニングにおける、配列番号6と比較したインスリンの脱アシル化の改善
ハイスループットスクリーニングにおける、配列番号8と比較したインスリンの脱アシル化の改善
30%のDMSO中のハイスループットスクリーニングにおける、配列番号34と比較したインスリンの脱アシル化の改善
ハイスループットスクリーニングにおける、配列番号46と比較したインスリンの脱アシル化の改善
ハイスループットスクリーニングにおける、配列番号54と比較したインスリンの脱アシル化の改善
ハイスループットスクリーニングにおける、配列番号74と比較したインスリンの脱アシル化の改善
インスリン二量体およびその脱アシル化生成物の分析的検出
Claims (25)
- 配列番号6内に少なくとも1つの置換を有する操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体であって、前記少なくとも1つの置換は、54C、62G、115A/P、125L/T、127S/V、185V、253K/V、254T、254W/255G、254W/255G/370I、255L、255M/Q/T/Y、256Q、257I、257V、260A/P、268S/V、322P、325G、348C、348Q、369L、369P、369V、369W、370F/G/S、372A/H/L、373F/M、377P、378H、384A、384F/513Q/536M、384G/L、388T、389L、391P/S、435R、461A、517L/P、530C/Y、554A/E/P/V、556G、557G/S、559P/S、560I、600T/623V、623A/G/R/W、624A、626G、627G/H、705G/P、706G、707S、723A/G、740L、748G、および752Eから選択される、操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
- ヒスチジンタグを含む、請求項1に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
- 前記ヒスチジンタグが、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体のC末端に存在する、請求項2に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
- 配列番号8~配列番号20の間の偶数配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項1~3のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
- 請求項1~4のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体をコードする操作されたポリヌクレオチド。
- 前記操作されたポリヌクレオチドが配列番号7~配列番号19の間の奇数配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項5に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 請求項5および/または6に記載の操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 少なくとも1つの制御配列をさらに含む、請求項7に記載のベクター。
- 請求項7および/または8に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1~4のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を生成するための方法であって、請求項9に記載の宿主細胞を、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体が前記宿主細胞によって産生される条件下で培養することを含む、方法。
- 前記宿主細胞によって産生された前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を回収するステップをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体が保護インスリンを脱アシル化することができる、請求項1~4のいずれかに記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
- 前記保護インスリンが、2重保護または4重保護インスリンを含む、請求項12に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
- 前記保護インスリンが、二量体または四量体である、請求項12または13に記載の操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体。
- 前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体が保護インスリンを脱アシル化することができる、請求項10または11に記載の方法。
- 前記保護インスリンが、2重保護または4重保護インスリンを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記保護インスリンが、二量体または四量体である、請求項15または16に記載の方法。
- i)請求項1~4、および12~14に記載の少なくとも1つの操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体、およびA1/B1/A1’/B1’-テトラフェニル酢酸保護基を含むインスリン二量体を含む組成物を提供することと、ii)前記A1/B1/A1’/B1’-テトラフェニル酢酸保護基を除去して遊離インスリンを生成するための条件下で、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を、A1/B1/A1’/B1’-テトラフェニル酢酸保護基を含む前記インスリン二量体に曝露することとを含む、遊離インスリンを生成するための方法。
- i)請求項1~4、および12~14に記載の少なくとも1つの操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体、およびA1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を含むインスリン二量体を含む組成物を提供することと、ii)前記A1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を除去して遊離インスリンを生成するための条件下で、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を、A1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を含む前記インスリン二量体に曝露することとを含む、遊離インスリンを生成するための方法。
- i)請求項1~4、および12~14に記載の少なくとも1つの操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体、およびA1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を含むインスリンを含む組成物を提供することと、ii)前記A1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を除去して遊離インスリンを生成するための条件下で、前記操作されたペニシリンGアシラーゼ改変体を、A1/A1’-ジフェニル酢酸保護基を含む前記インスリンに曝露することとを含む、遊離インスリンを生成するための方法。
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