JP2002510506A

JP2002510506A - 遺伝子配列に遺伝障害を有する植物を得る方法

Info

Publication number: JP2002510506A
Application number: JP2000542485A
Authority: JP
Inventors: ツァン，ユーリン
Original assignee: テラスジェネティックリソーシズ，インコーポレイティド
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2002-04-09
Also published as: AU3221699A; EP1068351A2; KR20010034731A; WO1999051774A2; US6484105B2; WO1999051774A3; IL138800A0; US20020064879A1; CA2326835A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、既知のポリヌクレオチド配列により野生型の染色体において隣接される遺伝子配列に障害を含む植物を同定する方法を提供する。この方法は、供給源植物からの核酸のコレクションを提供すること、各核酸をその供給源植物と結びつけるデータベースを提供すること、核酸のコレクションを増幅し、それによって障害を検出すること、および、データベースを使用して障害を有する供給源植物を同定することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願への相互参照本願は、米国特許仮出願番号第60/080,401号（1998年、４月２日出願）に優先
権主張しており、この出願は、参照することにより、その全部が本明細書に組入
れられる。連邦政府に後援された研究および開発下でなされた発明に対する権利に関する記
述あてはまらず発明の背景ここ数年、幾つかの生物体のゲノム配列決定が完成され、多くの他の生物体の
ゲノム配列決定も開始されてきた。さらに、ヒト、幾らかのモデル生物例えばC.
エレガンス(elegans)、ドロソフィラ(Drosophila)およびアラビドプシス(Arabid
opsis)ならびに、いくらかの経済的に重要な作物および動物を含む多くの生物体
の完全なゲノム配列が、次の10年間に知られるであろう。この研究から同定され
た遺伝子の多くは、しかしながら、未知の機能を有する。

【０００２】遺伝子の機能を調べる１つのアプローチは、生物体の遺伝子をノックアウト(k
nock-out)し、変異体生物に何が起こるのかを見つけ出すことである。変異体生物の研究はしばしば、遺伝子の機能のよりよい理解に至る。また、遺伝子ノック
アウトは、望ましくない特性の特異的除去または変更を見込む。現今、相同の組換えによってノックアウト動物を作るのに利用可能な技術があ
る。例えば、ガリ‐タリアドロス(Galli-Taliadoros)ら、「J. Immunol. Method
s」 181(1):1-15 (1995)；ビュールステッデ(Buerstedde)ら、「Cell」 67:179-
88 (1991)；ジャシン(Jasin)ら、「Genes and Devel.」 2:1353-63 (1988)；セディビィ(Sedivy)ら、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」 86:227-31 (1989)参照。そのような技術は高価で効率が悪い。しかしながら、未知の理由のために、植
物における相同の組換えの頻度はあまりに低いので、相同の組換えによってノッ
クアウト植物を作ることは可能でない。何人かの研究者が、ある種の植物遺伝子
の発現レベルを低くすることに、これらの遺伝子のアンチセンスRNAを発現するトランスジェニック植物を作ることによって成功したが、彼らは、これらの遺伝
子の発現および機能を完全に除去できたわけではない。多くの場合、遺伝子の機
能の完全な除去が必要とされる。また、多くの作物種においてトランスジェニッ
ク植物を作ることは、現今では、非常に困難であるか、または不可能である。

【０００３】ベンゼン(Bensen)ら、「Plant Cell」 7(1):75-84 (1995)は、トランスポゾン
配列と特定の遺伝子配列との間の領域を増幅することによって、既知のトウモロ
コシ遺伝子配列においてトランスポゾン挿入変異体を同定する方法を教示する。
しかしながら、この方法は、特性決定されたトランスポゾン系を有する少数の植
物系に限定されるか、または異種の植物においてそのような系の導入を必要とす
る。この方法はしたがって、任意の植物種の既知の配列における変異の同定のた
めの普遍的な方法を提供しない。

【０００４】したがって、既知の植物遺伝子配列において遺伝障害を得、かつ検出すること
の必要性が存在する。理想的には、この方法は、できるだけ広範囲の植物におい
て有用であるべきであり、したがって、形質転換法の利用可能性のような基準に
依存してはならない。発明の概要本発明は、遺伝子配列に障害を含む植物を同定するための方法を提供する。こ
の方法は、核酸試料のコレクション(collection)またはプール(pool)を提供する
ことを含み、ここで、各試料は、個々の植物から集められる。典型的には、この
方法において使用される個々の植物は、供給源植物の変異誘発された個体群に由
来し、それによって、個体群内の遺伝的多様性を保証する。

【０００５】本発明の方法はまた、各核酸試料を、核酸試料の由来する供給源植物と結びつ
けるデータベースを提供する。さらに、本発明の方法は、野生型染色体における遺伝子配列に隣接する既知の
ポリヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリッド形成するプライマーを用い
て、核酸のコレクションを増幅することを含む。１つの態様においては、増幅は
、障害を有する核酸を選択的に増幅するために短くされた伸長(extension)段階を含む。例えば、伸長時間は、72℃で0.5〜2分間であり得る。１つの態様におい
ては、伸長時間は1.5分間である。

【０００６】核酸が増幅された後、試料のうちの１つの遺伝子配列内の遺伝障害が検出され
る。例えば、障害は、増幅生成物の大きさの変化として検出することができる。
障害を含む核酸試料が同定されると、データベースを使用して、核酸試料が由来
した供給源植物を同定する。 1つの態様においては、障害は欠失である。

【０００７】別の態様においては、核酸のコレクションは、障害が検出される前に、サブセ
ットプールへと分けられる。例えば、このプールは、約100〜約3000の異なる供給源植物からの核酸を含むことができる。別の態様においては、プールは、少な
くとも約1500の異なる供給源植物を含むことができる。複数の供給源植物または供給源植物の先祖(progenitor)は、例えば変異原と接
触させることができる。１つの態様においては、変異原は高速中性子である。

【０００８】 1つの態様においては、野生型植物における既知のヌクレオチド配列間の距離は、約３キロベース〜７キロベースである。本発明の方法は、例えば複数の供給源植物、たとえばコメ、トマトまたはアラ
ビドプシス(Arabidopsis)において行うことができる。１つの態様においては、供給源植物の数は、約10,000〜約50,000である。

【０００９】上記した方法によって同定される植物は、本発明に包含される。本発明の好ましい態様においては、遺伝子配列に欠失を有する供給源植物が同
定される。この態様においては、複数の変異誘発された植物からの核酸のコレク
ション（そのうちの少なくとも１つは、遺伝子配列に欠失を有する）が提供され
る。コレクション中の各核酸と核酸の供給源植物とを結びつけるデータベースも
提供される。核酸のコレクションは次に増幅される。増幅は、野生型の染色体に
おいて約3kb〜約7kb離れたポリヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリッド
形成し、かつ遺伝子配列内の、または遺伝子配列に隣接するポリヌクレオチド配
列に対して特異的にハイブリッド形成するプライマーを提供することを含む。増
幅はさらに、72℃で約0.5〜約2分間の伸長段階を含み、それによって欠失を有す
る核酸を優先的に増幅する。欠失を有する核酸の存在は、増幅生成物を野生型の
植物からの増幅生成物と比較することによって確認される。次に、データベース
を使用して、欠失を有する供給源植物を同定し、それによって欠失と関係のある
変異体表現型の評価のために遺伝子配列に欠失を有する植物を提供する。定義「遺伝子配列」は、オープンリーディングフレームからの配列またはサブ配列
(subsequence)および／またはゲノムDNAまたはcDNAにおける調節配列を含む核酸
配列をいう。

【００１０】「野生型染色体」は、ヒトにより開始された(human-initiated)変異誘発が行われる前に植物に存在するポリヌクレオチド配列をいう。「ヒトにより開始され
た変異誘発」は、例えば選択的育種による作物栽培的に価値のある特性の選択を
含まないが、個体群における遺伝的多様性を増大させるための変異原化合物また
は要素の導入を含む。そのような変異原化合物は、例えばトランスポゾンを含む
。

【００１１】「供給源植物」は、核酸が収集される特定の植物または植物の遺伝的等価物で
ある。本発明の目的のためには、遺伝的に等価の植物は、同じ特定の遺伝障害を
回収することができる植物である。遺伝的に等価の植物は、興味ある植物からの
きょうだいまたは子孫を含む。かくして、M1種子が変異誘発され、M1植物に成長
し、それらのM2種子が収集されると、同じ親からのプールされたM2種子は、同じ
「供給源植物」である。というのは、M1親から受け取った１つのM2植物の特定の
突然変異は、同じM1親からのM2きょうだいのプールにおいて見出されるようであ
るからである。同様に、M2植物が特定の遺伝障害を有するなら、M2植物からのM3
子孫のプールがまた、おそらくその障害を有するであろう。

【００１２】「障害」は、野生型の核酸に対しての、核酸の任意の分子変更であり得る。例
えば、障害は、核酸配列における欠失、反転、挿入、重複または転位であること
ができる。障害は好ましくは欠失である。「複数の供給源植物の先祖」は、供給源植物の特定のコレクションの先祖であ
る。例えば、M1種子が変異誘発され、M1植物に成長し、次いでM2種子がM1植物か
ら集められると、M1植物はM2植物の先祖である。

【００１３】「変異体表現型の評価」は、野生型の植物の特性とは異なる、遺伝障害を有す
る植物の物理的特性を同定することをいう。そのような特性の表現は、植物の遺
伝的構成(makeup)、例えば、植物が特定の対立遺伝子（障害を含む対立遺伝子を
含む）についてホモ接合かヘテロ接合かに依存し、ならびに全体にわたる遺伝的
背景レベルに依存する。障害が、ホモ接合の致死の表現型を引き起こすなら、次
に、障害はヘテロ接合状態で後の世代に維持され得る。

【００１４】「核酸配列」という句は、５’から３’末端へと読まれる、デオキシリボヌク
エオチドまたはリボヌクエオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖のポリマーをいう
。それは、染色体DNA、自己複製プラスミド、DNAもしくはRNAの感染性ポリマーまたは主として構造的役割を行うDNAもしくはRNAを含む。「プロモーター」という語は、転写の開始から上流および／または下流に配置
された領域または配列をいい、RNAポリメラーゼおよび転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関係する。「植物プロモーター」は、植物細胞におい
て転写を開始することができるプロモーターである。

【００１５】「植物」という語は、完全な植物、若木の(shoot)生長器官／構造物（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花の器官／構造物（例えば、苞（ほう）、
萼（がく）、花弁、おしべ、心皮、葯および胚珠）、種子（胚、内胚乳および種
皮を含む）および果実（成熟子房）、植物組織（例えば、管組織、地面組織(gro
und tissue)等）および細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、トリコーム(trichome
)等）ならびにこれらの後継物(progeny)を包含する。本発明の方法において使用
することができる植物の種類は一般に、形質転換技術を受けやすい、より高い植
物およびより低い植物の種類にわたって広く、被子植物（単子葉植物および双子
葉植物）、裸子植物、シダ類ならびに多細胞の藻類を包含する。それは、種々の
倍数性レベルを有する植物を含み、異数体、倍数体、二倍体、半数体およびヘミ
接合を包含する。

【００１６】ポリヌクレオチド配列は、外来種由来であるなら、生物体または第２のポリヌ
クレオチド配列に「異種」であり、または、同種由来であるなら、その原形から
変形される。例えば、異種コード配列に操作可能に(operably)結合されたプロモ
ーターは、プロモーターが誘導される、それとは異なる種からのコード配列をい
うか、または同種由来なら、プロモーターと天然に関連しないコード配列をいう
（例えば、遺伝的に操作されたコード配列または異なる生態型もしくは品種から
の対立遺伝子）。

【００１７】「組換え」は、ヒトの操作したポリヌクレオチドまたは、ヒトの操作したポリヌクレオチドの複製もしくは相補物(complement)をいう。例えば、第２のポリヌ
クレオチドに操作可能に結合したプロモーターを含む組換え発現カセット(casse
tte)は、発現カセットを含む単離された核酸のヒトの操作（例えば、サムブルッ
ク(Sambrook)ら、「分子クローニング‐実験室マニュアル(Molecular Cloning-
A Laboratory Manual)」、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spri
ng Harbor Laboratory)、コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク（1989）または「分子生物学における現行のプロトコル(Current P
rotocols in Molecular Biology)」1-3巻、ジョンウィリー＆サンズ社(John Wil
ey & Sons Inc.) (1994-1998)に記載された方法による）の結果として、第２のポリヌクレオチドに異種のプロモーターを含むことができる。別の例では、組換
え発現カセットは、ポリヌクレオチドが天然に見出されることが著しくありそう
もないようなやり方で、結合されたポリヌクレオチドを含むことができる。例え
ば、ヒトの操作した制限部位またはプラスミドベクター配列は隣接することがで
きるか、またはプロモーターを第２のポリヌクレオチドから分離することができ
る。当業者は、ポリヌクレオチドが多くのやり方で操作されることができ、上記
の例に限定されないことを認識するであろう。

【００１８】個々の植物に対して「外因性」のポリヌクレオチドは、雌雄の交配による以外
の任意の手段によって植物に導入されるポリヌクレオチドである。これを達成す
ることができる手段の例は以下に記載されており、アグロバクテリウム(Agrobac
terium)媒介形質転換、生物分解(biolistic)法、エレクトロポレーション等を含
む。外因性核酸を含むそのような植物は、ここでは、Ｔ₁（例えば、アラビドプシス(Arabidopsis)においては、真空浸透）またはＲ₀（インビトロ(in vitro)
で形質転換された細胞から再生された植物について）世代トランスジェニック(t
ransgenic)植物と称する。雌雄の交配から、または自家受粉によって生じるトラ
ンスジェニック植物は、そのような植物の子孫である。

【００１９】２つの核酸配列またはポリヌクレオチドは、以下に述べるように最大の一致の
ために整列されたときに、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配
列がそれぞれ同じなら、「同一」であるといわれる。２つ以上の核酸またはポリ
ペプチド配列についての状況下で、「同一」またはパーセント「同一性」という
語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてまたはマニュアル整列および視覚的検分によって測定される、比較のウィンドウ(window) に対して、最大の一致のために比較され整列されたとき、同じであるかまたは、同じであるアミノ
酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列ま
たはサブ配列をいう。配列同一性のパーセンテージがタンパク質またはペプチド
に関して使用されるときには、同一でない残基の位置がしばしば保存的アミノ酸
置換（アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有す
る他のアミノ酸残基で置換され、したがって、分子の官能特性を変えない）によ
って異なることが認識される。

【００２０】保存的置換において配列が異なる場合には、パーセント配列同一性は、上方へ
調整されて、置換の保存性の性質について訂正し得る。この調整をする手段は当
業者によく知られている。典型的にはこれは、全部よりむしろ一部のミスマッチ
(mismatch)として保存的置換のスコアをつけ(score)、それによってパーセンテージ配列同一性を増加させることを含む。かくして、例えば同一アミノ酸が与え
られた場合、１のスコアであり、非保存的置換が与えられると、スコアゼロであ
り、保存的置換が与えられると、０〜１の間のスコアである。保存的置換のスコ
ア付けは、例えばプログラムPC/GENE（インテリジェネティックス(intelligenet
ics)、マウンテンビュー(Mountain View)、カリフォルニア、合衆国）において実行されるような、例えばメイヤー(Meyer)＆ミラー(Miller)、「Computer Appl
ic. Biol. Sci.」 4:11-17 (1988)のアルゴリズムに従って計算される。

【００２１】２つの核酸またはポリペプチド配列についての状況下で、「実質的に同一」と
いう句は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてまたはマニュアル整列および視覚的検分によって測定される、比較のウィンドウ(comparison window) に
対して、最大の一致のために整列されたとき、少なくとも60％、好ましくは80％
、最も好ましくは90〜95％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する配
列またはサブ配列をいう。この定義はまた、試験配列の相補物をいい、これは、
試験配列が参照配列と実質的同一性を有するときに、実質的な配列またはサブ配
列相補性(complementarity)を有する。

【００２２】当業者は、２つのポリペプチドが免疫学的に類似であるなら、２つのポリペプ
チドがまた「実質的に同一」であることができることを認識するであろう。かく
して、全部のタンパク質構造が類似であることができ、一方、２つのポリペプチ
ドの一次構造は有意の変化を示す。したがって、２つのポリペプチドが実質的に
同一であるかどうかを測定する方法は、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体の各ポリペプチドへの結合を測定することを含む。第１のポリペプチドに
ついて特異的な抗体が、第１のポリペプチドに対する親和性の少なくとも３分の
１の親和性を有する第２のポリペプチドに結合するなら、２つのポリペプチドは
実質的に同一である。

【００２３】配列の比較のために、典型的には１つの配列が参照配列として働き、試験配列
はこれと比べられる。配列比較アルゴリズムを用いて、試験配列および参照配列
をコンピュータにいれるとき、必要なら、サブ配列同格物(coordinate)が指定さ
れ、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。不履行(default) プログラムパラメーターを使用することができ、または代替のパラメーターを指
定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーター
に基づいて、参照配列に対して試験配列についてのパーセント配列同一性を計算
する。

【００２４】ここで使用される「比較の窓(comparison window)」は、２つの配列が最適に整列された後、配列が、同じ数の隣接する位置を有する参照配列と比較し得る、
20〜600、通常約50〜約200、より通常には約100〜約150からなる群より選ばれる
隣接する位置の数のうちの任意の１つのセグメントに対する参照を含む。比較の
ための配列の整列方法は、当分野でよく知られている。比較のための配列の最適
整列を、例えば、スミス(Smith)＆ウォーターマン(Waterman)「Adv. Appl. Math
.」 2:482 (1981)の局所的相同アルゴリズムによって、ニードルマン(Needleman
)＆ワンシュ(Wunsch)「J. Mol. Biol.」 48:443 (1970)の相同整列アルゴリズム
によって、ピアソン(Pearson)＆リップマン(Lipman)「Proc. Nat'l. Acad. Sci.
USA」 85:2444 (1988)の類似性の方法の探求によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ウィスコンシンジェネチックスソフトウェア
パッケージ(Wisconsin Genetics Software Package)、ジェネティックスコン
ピュータグループ(Genetics Computer Group)、575 Science Dr. マジソン(Madi
son)、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）によって、またはマニュアル整列および視覚的検分によって行うことができる。

【００２５】通常のアルゴリズムの１つの例は、PILEUPである。PILEUPは、漸進的対を作る
方式の整列(progressive pairwise alighnment)を用いて、一群の関連する配列からの多配列整列を作って、関係およびパーセント配列同一性を示す。それはま
た、整列を作るのに使用される群生関係(clustering relationship)を示すトリー(tree)またはデンドグラム(dendogram)をプロットする。PILEUPは、フェン(Fe
ng)＆ドゥリトル(Doolittle)「J. Mol. Evol.」 35:351-360 (1987)の漸進的整列(progressive alignment)法の単純化を使用する。使用される方法は、ヒギンス(Higgins)＆シャープ(Sharp)「CABIOS」 5:151-153 (1989)により記載された方法に類似している。プログラムは、300配列まで整列することができ、それぞれ、5,000個のヌクレオチドまたはアミノ酸の最大長さを有する。

【００２６】多整列(multiple alignment)の手順は、２つの最も似ている配列の対を作る方
式の整列(pairwise alighnment)で始まり、２つの整列した配列のクラスター(cl
uster)を生成する。このクラスターは、次に、次の最も関連する配列または整列
した配列のクラスターに対して整列される。配列の２つのクラスターが、２つの
個々の配列の対を作る方式の整列の単純伸長(sinple extension)によって整列さ
れる。最終的な整列は、一連の漸進的な対を作る方式の整列によって達成される
。配列比較の領域のために特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチ
ド同格物を指定することによって、かつプログラムパラメーターを指定すること
によってプログラムを走らせる。例えば、参照配列を、他の試験配列と比べて、
以下のパラメーターを用いてパーセント配列同一性の関係を決定することができ
る：不履行ギャップ重量(default gap weight) (3.00)、不履行ギャップ長さ重量(default gap length weight) (0.10)および秤量されたエンドギャップ(end g
ap)。

【００２７】パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズム
の他の例はBLASTアルゴリズムであり、これはアルトシュール(Altschul)ら「J.
Mol. Biol.」 215:403-410 (1990)に記載されている。BLAST分析を行うためのソ
フトウェアは、バイオテクノロジー情報のための国立センター(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)によって公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列において同
じ長さを有するワードを用いて整列されるときに、ある正の値の限界のスコアT と合うかまたはTを満足する、疑問(query)配列中に長さWを有する短いワードを同定することによって、高いスコアを付けられる配列対(HSP)を同定することを含む。Tは近傍ワードスコア限界(neighborhood word score threshold)と称され
る（アルトシュール(Altschul)ら、前出）。

【００２８】これらの初期の近傍ワードヒット(word hit)は、それらを含む、より長いHSP を見出すための捜索を始めるための種子として働く。ワードヒットは、累積整列
スコアが増加し得る限りの間、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向での
ワードヒットの伸長は、その最大の達成された値から量Xだけ累積整列スコアが落ち込むとき、１以上の負にスコア付けされる残基整列の蓄積のために、累積ス
コアがゼロ以下になるとき、またはいずれかの配列の端に到達するときに、停止
される。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、整列の感度および速度
を決定する。BLASTプログラムは、不履行(default)として、ワード長さ(W)11、B
LOSUM62スコア付けマトリックス（ヘニコフ(Henikoff)＆ヘニコフ(Henikoff)「P
roc. Natl. Acad. Sci. USA」 89:10915 (1989)参照）整列(B)50、期待値(E)10 、M=5、N=4および両方の鎖の比較を使用する。

【００２９】 BLASTアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、カーリン(Karlin)＆アルトシュール(Altschul)「Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA」 90:5873-5787 (1993)参照）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))であり、こ
れは、それによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチ(match) が偶然によって生じる確率の表示を与える。例えば、試験核酸の参照核酸との比
較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であるなら、核酸は、参照配列と類似であると考えられる。

【００３０】「保存的に変性された変異体」は、アミノ酸および核酸の配列の両方に当ては
まる。特定の核酸配列に関しては、保存的に変性された変異体は、同一のまたは
本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、または、核酸がアミノ
酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列をいう。遺伝暗号の縮重の
故に、非常に多数の機能的に同一の核酸が任意の与えられたタンパク質をコード
する。たとえば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべて、アミノ酸のアラニン
をコードする。かくして、アラニンがコドンによって特定されたあらゆる位置で
、コドンはコードされたポリペプチドを変えることなしに記載された対応するコ
ドンの任意のものに変えられることができる。そのような核酸の変異(variation
)は、「無症状の変異」であり、これは、保存的に変性された変異の１つの種である。ここでポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列がまた、核酸のあらゆ
る可能な無症状の変異を記載する。当業者は、核酸中の各コドン（AUGを除く。これは通常、メチオニンのための唯一のコドンである）は変性されて、機能的に
同一の分子を生じることができることを認識するであろう。したがって、ポリペ
プチドをコードする核酸のそれぞれの無症状の変異は、それぞれの記載された配
列に内在する。

【００３１】アミノ酸配列に関しては、当業者は、単一のアミノ酸またはコードされた配列
における少しのパーセンテージのアミノ酸を変える、核酸、ペプチド、ポリペプ
チドまたはタンパク質配列における個々の置換が、変化がアミノ酸の化学的に類
似のアミノ酸での置換をもたらす「保存的に変性された変異体」であることを認
識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換目録は、当分野
でよく知られている。

【００３２】以下の6つの群はそれぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む： 1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)； 2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)； 3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)； 4)アルギニン(R)、リジン(K)； 5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；および 6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。（例えば、クレイトン(Creighton)「Proteins」(1984)参照）。

【００３３】 2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの指摘は、第１の核酸によってコードされたポリペプチドが、第２の核酸によってコードされた
ポリペプチドに対して出現した抗体と免疫学的に交差反応性であることである。
かくして、ポリペプチドは典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換に
よってのみ異なる第２のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指摘は、２つの分子またはそれらの相補物が、以
下に記載するようにストリンジェント条件下で互いに対してハイブリッド形成す
ることである。

【００３４】「選択的に（または特異的に）ハイブリッド形成する」という句は、その配列
が、複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーDNAもしくはRNA）に存在す
るときに、ストリンジェントハイブリッド形成条件下で特定のヌクレオチド配列
に対してのみの、分子の結合、重複またはハイブリッド形成をいう。「ストリンジェントハイブリッド形成条件」という句は、プローブが、典型的
には核酸の複合混合物において、他の配列でなく、それの標的サブ配列に対して
ハイブリッド形成する条件をいう。ストリンジェント条件は、配列依存性であり
、異なる環境では異なる。より長い配列が、より高い温度で特異的にハイブリッ
ド形成する。核酸のハイブリッド形成についての広範囲の案内は、チーセン(Tij
ssen)、「生化学および分子生物学における技術‐核プローブを用いたハイブリッド形成(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization
with Nucleic Probes)」における『ハイブリッド形成の原理のあらましおよび核酸アッセイの戦法(Overview of principles of hybridization and the strat
egy of nucleic acid assays)』(1993)において見出される。一般に、高ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度(pH)で、特定の配列について熱的融点
（Ｔ_m）より約５〜10℃下であるように選択される。低ストリンジェント条件は一般に、Ｔ_mより約15〜30℃下であるように選択される。Ｔ_mは、標的に相補的な
プローブの50％が、平衡で（標的配列は、Ｔ_mで過剰に存在するので、50％のプローブが平衡状態でふさがれる）標的配列に対してハイブリッド形成する温度（
規定されたイオン強度（pH）および核酸濃度下）である。ストリンジェント条件
は、pH7.0〜8.3で、塩濃度が約1.0Mのナトリウムイオン未満、典型的には約0.01
〜1.0Mのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ
（例えば、10〜50個のヌクレオチド）について少なくとも約30℃、長いプローブ
（例えば、50個より多いヌクレオチド）について少なくとも約60℃である条件で
ある。ストリンジェント条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加で
達成することができる。選択的または特異的ハイブリッド形成のために、正の信
号は背景レベルの少なくとも２倍、好ましくは背景レベルの10倍のハイブリッド
形成である。

【００３５】ストリンジェント条件下で互いにハイブリッド形成しない核酸は、それらがコ
ードするポリペプチドが実質的に同一なら、なお実質的に同一である。これは、
例えば、遺伝暗号によって可能にされる最大コドン縮重を用いて核酸の複製が作
られるときに生じる。そのような場合には、核酸は典型的には、中位のストリン
ジェントハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する。

【００３６】本発明においては、本発明のANT核酸を含むゲノムDNAまたはcDNAが、ストリン
ジェント条件下で、ここに開示された核酸配列を用いて、標準のサザンブロット
法(Southern blot)で同定することができる。この開示の目的のために、そのようなハイブリッド形成のために適当なストリンジェント条件は、40％ホルムアミ
ド、1MのＮａＣｌ、1％のSDSの緩衝液中37℃でのハイブリッド形成および、少な
くとも約50℃、通常約55℃〜約60℃で20分間の0.2X SSC中での少なくとも１回の
洗浄を含む条件または同等条件である。正のハイブリッド形成は、背景レベルの
少なくとも２倍である。当業者は、類似のストリンジェント条件を提供するため
に、代替のハイブリッド形成および洗浄の条件を使用することができることを容
易に認識するであろう。

【００３７】ストリンジェント条件下で互いにハイブリッド形成しない核酸は、それらがコ
ードするポリペプチドが実質的に同一なら、なお実質的に同一である。これは、
例えば、遺伝暗号によって可能にされる最大コドン縮重を用いて核酸の複製が作
られるときに生じる。そのような場合には、核酸は典型的には、中位のストリン
ジェントハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する。典型的な「中位のス
トリンジェントハイブリッド形成条件」は、40％ホルムアミド、1MのＮａＣｌ、
1％のSDSの緩衝液中37℃でのハイブリッド形成および45℃での1 X SSC中での洗浄を含む。正のハイブリッド形成は、背景レベルの少なくとも２倍である。当業
者は、類似のストリンジェント条件を提供するために、代替のハイブリッド形成
および洗浄の条件を使用することができることを容易に認識するであろう。

【００３８】２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であることのさらなる指摘は、１対の
オリゴヌクレオチドプライマーによって増幅された参照配列が次に、ストリンジ
ェントハイブリッド形成条件下でプローブとして使用されて、cDNAまたはゲノム
ライブラリーから試験配列を分離するか、または、例えばRNAゲルもしくはDNAゲ
ルブロット(blot)ハイブリッド形成分析において試験配列を同定するかというこ
とである。図面の簡単な説明特定の態様の記載本発明は、まず、遺伝子配列中の遺伝障害についてスクリーニングすることに
よる、遺伝子配列の機能を決定する方法を提供する。この方法は、遺伝子配列を
含むポリヌクレオチド配列を増幅することによって、非常に多数の植物から遺伝
障害を有する植物を同定することおよび、次いで増幅生成物を野生型の植物から
の増幅生成物と比較することを含む。好ましい態様においては、複数の供給源植
物からの核酸をプールし、増幅する。好ましい態様においては、増幅条件は、特
定の遺伝子配列に遺伝障害を有する核酸を優先的に増幅するように与えられる。
本発明の植物供給源本発明は、任意の植物の種で使用することができる。本発明は、以下の属から
の種を含む広い範囲の植物にわたって使用できる：アナカルディウム(Anacardiu
m)、アラキス(Arachis)、アスパラガス(Asparagus)、アトロパ(Atropa)、アベナ
(Avena)、ブラッシカ(Brassica)、シトラス(Citrus)、シトルラス(Citrullus)、
カプシカム(Capsicum)、カルタマス(Carthamus)、ココス(Cocos)、コフェア(Cof
fea)、ククミス(Cucumis)、ククルビタ(Cucurbita)、ダウカス(Daucus)、エレイ
ス(Elaeis)、フラガリア(Fragaria)、グリシネ(Glycine)、ゴシッピウム(Gossyp
ium)、ヘリアンサス(Helianthus)、ヘテロカリス(Heterocallis)、ホルデウム(H
ordeum)、ヒオスシアマス(Hyoscyamus)、ラクツカ(Lactuca)、リナム(Linum)、ロリウム(Lolium)、ルピナス(Lupinus)、リコペルシコン(Lycopersicon)、マラス(Malus)、マニホット(Manihot)、マジョラナ(Majorana)、メディカゴ(Medicag
o)、ニコチアナ(Nicotiana)、オレア(Olea)、オリザ(Oryza)、パニエウム(Panie
um)、パネセタム(Pannesetum)、ペルセア(Persea)、ファセオラス(Phaseolus)、
ピスタチア(Pistachia)、ピサム(Pisum)、ピラス(Pyrus)、プルナス(Prunus)、ラファナス(Raphanus)、リシナス(Ricinus)、セカレ(Secale)、セネシオ(Seneci
o)、シナピス(Sinapis)、ソラナム(Solanum)、ソルガム(Sorghum)、セオブロマス(Theobromus)、トリゴネラ(Trigonella)、トリチカム(Triticum)、ビシア(Vic
ia)、ビティス(Vitis)、ビグナ(Vigna)およびゼア(Zea)。好ましい態様において
は、オリザ(Oryza)（コメ）、リコペルシコン(Lycopersicon)（トマト）またはアラビドプシス(Arabidopsis)が使用される。

【００３９】本発明は、複数の植物からの核酸のコレクションを提供する。複数の植物は、
遺伝的変異を有する植物の任意のコレクションであることができる。本発明の好
ましい態様においては、複数の植物またはその植物の先祖が変異原にさらされて
、遺伝障害を引き起こし、それによって、個体群内で遺伝的変異を促進させるよ
うである。変異原は好ましくは、高いパーセンテージの欠失を生じるように選ば
れる。植物変異誘発［sp?］種子の変異誘発された個体群を得るかまたは作ることができる。例えば、植物
の存在する変異誘発された個体群は、営利または非営利の供給者〔例えば、レー
ルシード(Lehle Seed)、ラウンドロック(Round Rock)、テキサス(Texas)および、変異誘発されたアラビドプシス種子のためのアラビドプシス生物学的資源セン
ター(the Arabidopsis Biological Resource Center for mutagenized Arabidop
sis seeds)参照〕に注文することができ、またはそこから得ることができる。あ
るいは、変異誘発された個体群は、任意の植物種について開発することができる
。例えば、種子または他の植物材料を、標準の技術にしたがって、変異原化学物
質を用いて処理することができる。そのような化学物質としては次のものを含む
が、これらに限定されることはない：ジエポキシブタン、硫酸ジエチル、エチレ
ンイミン、メタンスルホン酸エチルおよびN-ニトロソ-N-エチル尿素。あるいは、照射源からのイオン化照射、例えばX-線、ガンマ線または高速中性子衝撃を使
用することができる。

【００４０】変異誘発された個体群は典型的には、非常に多数の種子（約50,000）を発生さ
せ、変異原に種子をさらすことによって発生させる。当業者は、一連の濃度およ
び暴露時間を使用して変異誘発の適当なレベルが決定されることを認識するであ
ろう。典型的にはそのような試験個体群は、土壌中に植えられ、または固体の成
長培地で培養される。発芽しない種子の数は、変異誘発の程度の良い指標である
。好ましくは、変異誘発された個体群は典型的には、典型的な植物が、多数の異
なる遺伝障害を有するように、個体群の過度の変異誘発を避けながら、できるだ
け小数の植物において所望の変異誘発を同定し、かつ変異誘発された種子から成
長したほとんどの植物が次の世代のために種子を生じることを保証するのに十分
高い頻度の変異誘発を有する。理論的には、理想的投与量は、処理した種子から
成長した植物の約37％を発芽しないようにする量である。

【００４１】 1つの態様においては、種子（設計されたM1）を変異誘発し、植物に成長させ、M2種子をそれから収集する。遺伝障害についてホモ接合およびヘテロ接合であ
る植物を有する植物個体群（例えば、M2個体群）は好ましくは、本発明のために
核酸供給源として使用される。典型的には、M2植物を成長させ、葉または根の組
織を、核酸分離のために収集する。M2植物からM3種子を集めることができ、それ
によって、後に、親であるM2植物における任意の遺伝障害を回収するために使用
することができる供給源植物個体群を生成できる。あるいは、M2植物のきょうだ
い（種子または植物として）が、供給源植物個体群を提供するために蓄えられる
。この第２の態様は、植物の成長空間を節約するが、所望の遺伝障害を回収する
ためにあとで更なる段階を加える。遺伝障害のタイプ変異原は、とりわけ局部の変異(point mutation)、欠失、反転、挿入、重複お
よび転位を生じることができる。遺伝障害は大または小であり得る。本発明のた
めに、好ましい障害は、２つの既知のポリヌクレオチド配列に対してハイブリッ
ド形成するプライマー間の距離を有意に変える。そのような障害は、欠失、挿入
および重複を含む。有意の変化は、核酸を特異的に検出するための標準の手順、
例えばPCRを用いて容易に検出できるものである。典型的には、２つの既知のポリヌクレオチドに対してハイブリッド形成するプライマー間の距離の少なくとも
30％より大きい変化が好ましい。特に好ましい態様においては、遺伝障害は、プ
ライマー間の距離の少なくとも約10％〜約85％を除去する欠失である。例えば、
典型的な場合には、プライマーは、約7kb離れるように選択され、欠失は、約0.5
kb〜約6kbである。複数の植物から核酸の調製一般に、以下に記載する組換えDNA技術における名称および実験室の手順は、当分野で良く知られていて、普通に使用されるものである。クローン化、DNAおよびRNAの分離、増幅および精製のために、標準の技術が使用される。一般に、D
NAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素反応は、製造者の仕様書に従って行われる。これらの技術および種々の他の技術は一般に
、サムブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング‐実験室マニュアル(Molecul
ar Cloning- A Laboratory Manual)」コールドスプリングハーバーラボラトリー
(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールドスプリングハーバー(Cold Spring
Harbor)、ニューヨーク（1989）または「分子生物学における現行のプロトコル(
Current Protocols in Molecular Biology)」1-3巻、ジョンウィリー＆サンズ社
(John Wiley & Sons Inc.) (1994-1998)にしたがって行われる。本発明のデータベース本発明の好ましい態様においては、核酸が個々の植物から分離し、次いでプー
ルして、本発明の方法を行う。それぞれの個々の植物からの核酸調製物のために
唯1つの数またはコードを提供し、各供給源植物の個体群を追跡し、維持するために、同じ名前またはコードを使用する。

【００４２】１つの態様においては、本発明のアッセイは、アッセイの結果を記録するため
にデータベースを使用することによって容易にされる。大規模なスクリーニング
系を使用する場合（例えば、植物の大きな個体群をスクリーニングする場合）に
特に、データの取り扱いが非常に有用であり得る。そのようなライブラリーのス
クリーニングによって得られる情報の維持および取り扱いは、自動化された情報
回収の方法、例えばコンピュータのデータベースによって手助けされる。

【００４３】そのようなデータベースは、ライブラリー登録、ライブラリーまたは結果の表
示、ライブラリーおよび／または結果の明細、考証およびデータの回収ならびに
予備的データ分析を含む（これらに限定されない）種々の機能のために有用であ
る。データベースの登録機能は、植物および核酸供給源の記録／登録を提供する
。ライブラリーおよびスクリーニングの結果表示機能は、関連したアッセイデー
タの再検討および／または類別のために有効な手段を提供する。データベースは
また、スクリーニング結果の考証および、アッセイデータを直ちに回収し、相関
させ（または統計的分析）かつ評価する能力を提供する。

【００４４】データベースは、本発明のアッセイによって生じた情報を記録し、回収するの
に便利な任意の媒体であり得る。そのようなデータベースは、これに限定される
ことはないが、手動での記録および索引付けの系（例えば、ファイル‐カード索
引系）を含む。しかしながら、そこにあるデータが容易にかつ素早く回収され、
操作される（例えば、区分けされ、分類され、分析され、および／または別な方
法で組織化される）ときに、データベースが最も有用である。かくして、好まし
い態様においては、本発明のデータベース（の署名）は、最も好ましくは「自動
化された」、例えば電子的（例えばコンピュータに基づく）データベースである
。データベースは、個々の「独立型」コンピュータシステムに存在することがで
き、または分散形コンピュータシステムにおける多重「節点(node)」（プロセッ
サ(processor)）の構成要素またはそれに分配された構成要素であることができる。データベースの収納および操作において使用されるためのコンピュータシス
テムは、当業者に良く知られており、これらに限定されることはないが、「パー
ソナルコンピュータシステム(personal computer system)」、メインフレームシ
ステム(mainframe system)、インターターネットもしくはイントラネットにおけ
る分配節(distributed node)、特定のハードウェア（例えば、マイクロチップ）
に収納されたデータもしくはデータベース等を含む。増幅本発明は、障害を有する核酸と野生型の核酸との間の特定の配列における差異
を決定するために、適当な量の核酸を生じる増幅段階を提供する。PCR 好ましい態様においては、プールした試料内で野生型および変異体DNAの両方を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が使用される。マリス(Mullis
)＆マリス(Mullis)により、米国特許明細書第4,683,195号および4,683,202号に記載されたPCRは、クローン化または精製なしに、ゲノムDNAの混合物中の標的配
列のセグメントの濃度を増加させる方法を記載する。PCRは、標的の濃度を容易に検出できる濃度まで直接増加させるのに使用することができる。標的配列を増
幅する方法は、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に対して相補的であるモル過剰の
２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含むDNA混合物に導入することを含む。混合物を変性し、次いでハイブリッド形成させる。ハイブリ
ッド形成後、相補的鎖を形成するように、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸
長する。所望の標的配列のセグメントの比較的高い濃度を得るために、変性、ハ
イブリッド形成およびポリメラーゼ伸長の段階は、必要とされる限りたびたび繰
り返すことができる。PCRの一般的外観については、「PCRプロトコルズ(PCR Pro
tocols)：方法および応用への案内(A Guide to Methods and Applications)」（
イニス(Innis), M., ゲルファンド(Gelfand), D., スニンスキー(Sninsky), J. およびホワイト(White), T., 編）、アカデミックプレス(Academic Press)、サンディエゴ(1990)参照。

【００４５】所望の標的配列のセグメントの長さは、互いに関するプライマーの相対的な位
置ならびに、ポリメラーゼがDNA鎖を伸長することができる時間の長さ（「伸長時間」）によって決定される。したがって、この長さは、調節可能なパラメータ
ーである。本発明の好ましい態様においては、伸長時間は、遺伝障害を含む核酸が優先的
に増幅されるように選ばれる。例えば、遺伝障害が欠失であると推測されたなら
、より短い伸長時間が使用され、よってプライマー間の距離が野生型の植物にお
いて見出されるより少ないなら、適当な増幅のみが生じる。当業者は、期待され
る欠失の大きさ、プライマー間の距離等に基づいて増幅条件を設計することがで
きる。例えば、幾つかの態様においては、伸長時間は、72℃にて約１分間〜約２
分間であり得る。より好ましい態様においては、伸長時間は、72℃にて1.5分間である。プライマーの設計本発明のために適当なプライマーは、興味のある遺伝子配列に依存する。プラ
イマーの構成および使用は当業者によく知られている。好ましい態様においては
、プライマーは、遺伝子配列に隣接するポリヌクレオチドに対してハイブリッド
形成するように構成される。ポリヌクレオチド配列は、興味のある遺伝子のコー
ド領域に隣接することができ、またはそれらは、コード配列および調節配列に隣
接することができる（例えば、プロモーターおよび遺伝子の3'領域）。あるいは
、プライマーは、遺伝子の調節領域またはコード領域内でハイブリッド形成する
ように構成することができる。プライマーが、約3kb〜約7kb離れたポリヌクレオ
チドに対してハイブリッド形成するのが好ましい。

【００４６】広範囲のDNA配列決定が行われた種、例えばアラビドプシス(Arabidopsis)にお
いては、興味のある遺伝子配列に隣接するゲノム配列が知られているようである
。もしそうなら、プライマー配列は、存在する既知のゲノム配列から開発させる
ことができる。興味のある遺伝子配列に隣接するゲノム配列が入手可能でないな
ら、興味のある遺伝子配列に隣接する既知のポリヌクレオチド配列を開発させる
ことができる。例えば、ゲノムライブラリー（コスミド、BAC、YAC等）は、興味
ある遺伝子を含むクローンについてスクリーニングすることができ、そのような
クローン中の挿入物の末端を、配列決定することができる。あるいは、特定のゲ
ノム領域の制限酵素地図作製を行うことができ、次いで、興味のある遺伝子に隣
接する領域のヌクレオチド配列決定をすることができる。長領域PCR 本発明の1つの態様においては、核酸のコレクションは、長領域PCRを用いて増
幅される（例えば、５、17頁、13行、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」 9:2216-
2220 (1994)；「Blood」 88(3):985-994 (1996)参照）。近年、35kbまでDNA断片
を増幅することができる幾つかの熱安定性DNAポリメラーゼが、市販されて入手可能になってきた。35kbまでの長距離だけ離れたプライマー対を設計することに
よって、有意に大きい領域を増幅することができる。

【００４７】そのような大きい核酸を分析するために、増幅されたDNA断片を次に、制限酵素で消化し、ゲル電気泳動によって分析する。臭化エチジウムまたは蛍光染料で
ゲルを染色することによって、DNAを検出することができる。好ましくは、領域内のDNA欠失または転位は、野生型と比べて追加のDNA断片を作る。遺伝子の周囲
の大きい欠失を検出するために、長領域PCRも有用である。他の増幅方法他の周知の増幅技術を用いて、所望の核酸も同定できる。インビトロ(in vi
tro)増幅法によって当業者に指示するのに十分なプロトコルの例（リガーゼ連鎖
反応(LCR)、Qβ‐リプリカーゼ増幅および他のRNAポリメラーゼが媒介する技術を含む）は、バーガー(Berger)、サムブルック(Sambrook)およびアウスベル(Aus
ubel)およびアーンハイム(Arnheim)＆レビンソン(Levinson)（1990年10月1日）「C&EN」 36-47; 「The Journal of NIH Research」(1991) 3:81-94; クウォー(
Kwoh)ら、(1989) 「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」86:1173; グアテリ(Guatelli
)ら、(1990) 「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」87:1874; ロメル(Lomell)ら、(19
89) 「J. Clin. Chem.」35:1826; ランデグレン(Landegren)ら、(1988) 「Scien
ce」241:1077-1080; ファンブルント(Van Brunt)(1990) 「Biotechnology」8:
291-294; ウーおよびウォールエイス(Wallace)(1989) 「Gene」4:560; ならびに
バリンガー(Barringer)ら、(1990) 「Gene」89:117において見出される。イン
ビトロ(in vitro)で増幅された核酸をクローン化する改善された方法が、ウォー
ルエイス(Wallace)ら、米国特許明細書第5,426,039号に記載されている。増幅生成物の分析増幅生成物の分析は、試料（例えば、遺伝障害を含む植物または、植物のプー
ルからの生成物であって、その１つ以上が障害を含むもの）からの増幅生成物を
、野生型植物の類似の増幅生成物と比較することを含む。好ましくは、増幅生成
物は、その長さに基づいて分離される。野生型の生成物と比べた試料の増幅生成
物の大きさの変化は、興味のある遺伝子配列に遺伝障害を有する核酸が試料中に
あることを示す。例えば、野生型より小さい、試料からのDNA断片の増幅は、試料からの少なくとも１つの個々の植物が、興味のある遺伝子配列内に欠失を有す
ることを示す。この結果は確認でき、試料が核酸のプールであるなら、次いで、
サブプールまたはプールの個々の構成要素を個別に増幅して、障害を有する核酸
を同定することができる。核酸が同定されたら、データベースを使用して、核酸
と関係のある供給源植物を同定することができる。

【００４８】増幅生成物は、電気泳動およびハイブリッド形成を含む多数の技術によって分
析することができる。好ましくは、増幅生成物は、電気泳動および臭化エチジウ
ム染色を用いて分析され（例えば、サムブルック(Sambrook)ら参照）、次いで視
覚的に検分される。あるいは、ゲル上のDNA断片の量の検出限界を上げるために、DNA断片をサザン
ブロット法によって膜に移し、標的遺伝子に特異的な、放射能活性なまたは放射
能不活性なプローブを用いてハイブリッド形成することができる。ハイブリッド
形成後、非常に少量のDNA（＜１pg）を、放射能写真または他の検出方法によって検出することができる。この大きい感度の故に、非常に多数のDNA試料を、１つの試料として一緒にプールし、欠失変異についてチェックすることができる。
この態様は、臭化エチジウム、次いで視覚的検分を用いて増幅生成物を明瞭に決
定するのが困難なら、特に役に立つ。ハイブリッド形成野生型と、遺伝子の変異体対立遺伝子を有するプールとの間の差異を決定する
代替方法は、ハイブリッド形成を含む。この態様においては、変異誘発した植物
からの核酸のプールは、制限酵素で消化され、得られる核酸断片は電気泳動で分
離され、ブロットされる（例えば、サザンブロット法）。例えばサムブルック(S
ambrook)ら参照。得られるブロットは次に、興味のある遺伝子のプローブを用い
て探られ、野生型の核酸の類似の試料と比べられる。プールした試料中のプロー
ブの、野生型と異なる大きさの核酸断片に対するハイブリッド形成は、遺伝障害
がプールに存在することを示す。この方法は次に、プールの個々の構成要素を用
いて繰り返されて、どの個体が障害を有するかを決定することができる。上記し
たように、核酸が同定されたら、データベースを使用して、核酸と関係のある供
給源植物を同定することができる。変異体表現型の決定本発明の方法において標的とされる特定の内因性の配列は、本発明の不可欠の
態様ではない。本発明を用いて標的にすることができる遺伝子の例は、病原体（
例えば、昆虫、真菌、細菌およびウィルス）に対する耐性を与える遺伝子、貯蔵
タンパク質遺伝子、殺草剤耐性遺伝子および、生合成経路（例えば油生産）に関
連する遺伝子を含む。他の例としては、チトクロームP450および関連する酵素、
転写因子、植物の成長および発育に必須の遺伝子ならびに、既知の機能を有する
遺伝子の相同物を包含する。

【００４９】本発明の方法により同定された植物（例えば、変異体）は、自らに有用な表現
型を有することがある。例えば、ある種の生合成経路における変異誘発は、植物
の代謝の有用な変更をもたらし得る。あるいは、変異体の表現型が知られている
なら、野生型遺伝子の異所性または異種性の発現が仮説として取り上げられ、試
験される。特に、植物の表現型を変えるために、適当な遺伝的背景レベルを同定
することができる。例えば、特定のトランスジーンの表現型の発現は、野生型の
相同物またはオルトログ(ortholog)によって隠されることがある。変異体の対立
遺伝子の表現型が決定されたら、そのような効果が限定される遺伝的背景レベル
を同定することが可能である。

【００５０】以下の実施例は、限定でなく説明のために提供する。実施例１この実施例は、遺伝子配列に遺伝障害を有する植物が、プールされた試料内で
同定できることを示す。s[a??]特異的遺伝子における欠失について変異誘発され
た植物のプールされた個体群のスクリーニングをシミュレーションする(simulat
e)ために、GA1のgal-3対立遺伝子を有するアラビドプシス(Arabidopsis)植物からの少量のDNA（Plant Cell 4:119-128 (1992））を野生型のDNAと混合し、次い
で増幅した。gal-3対立遺伝子は、野生型GA1に対して5kbの欠失を含む。野生型のアラビドプシス(Arabidopsis)において約6.4kb離れていて、gal-3の5kbの欠失
に隣接するポリヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成するプライマーを使
用した。5'プライマーは、cggagaagcttcttctggagtcagagであった。3'プライマー
は、gcaaacttgatctaccatatgtcatcであった。

【００５１】２マイクログラムの野生型のアラビドプシス(Arabidopsis)のDNAを、1.5UのTa
qポリメラーゼを含む、25μlのPCR反応物中の1ng、2.5ng、5ngおよび10ngのgal-
3DNAと混合した。試料を、以下の条件を用いて増幅した。反応は、94℃で２分間
、次いで94℃で30秒間の40周期；65℃で30秒間および72℃で1.5分間インキュベートした。この周期の次に、72℃で７分間の最終段階があった。

【００５２】得られる生成物を、電気泳動を用いて分析し、次いで臭化エチジウムを用いて
視覚化した。希釈するごとに、野生型の6.4kbのDNA断片の他に、より小さい1.4k
bのgal-3からの生成物がはっきりと検出可能であった。これらの結果は、少なく
とも約2000の野生型の植物における１つの欠失が検出できることを示す。このよ
うに、本発明の方法を使用すると、少なくとも約2000までの個々の植物のプール
がスクリーニングされて、興味のある特定の遺伝子配列中に障害を有する単一個
体を首尾よく同定することができる。

【００５３】上記実施例は、本発明を説明するために提供されたものであり、本発明の範囲
を限定するものではない。本発明の他の変形は、当業者には容易に明らかであり
、添付の請求の範囲に包含される。ここで引用したすべての出版物、特許および
特許出願は、あらゆる目的のために参照することによって本明細書に組入れられ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA08 4B024 AA08 AA11 CA01 CA20 DA01 HA08 HA11 HA14 4B063 QA01 QA08 QA17 QA18 QQ04 QQ42 QR08 QR62 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】野生型の染色体において既知のポリヌクレオチド配列が隣接
する遺伝子配列に障害を含む植物を同定する方法であって、 (a) 遺伝子配列に障害を有する植物を含む複数の供給源植物からの核酸のコレ
クションを提供すること； (b) コレクション中の各核酸を供給源植物と結びつけるデータベースを提供す
ること； (c) 既知のポリヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリッド形成するプラ
イマーを用いて核酸のコレクションを増幅し、それによってコレクション中で、
障害を有する核酸の存在を検出すること；および (d) データベースを使用して遺伝子配列に障害を有する個体群中の供給源植物
を同定し、それによって、欠失に関連する変異体表現型の評価のために、遺伝子
配列に欠失を有する植物を提供することを含む方法。
【請求項２】障害が欠失である請求項１記載の方法。
【請求項３】増幅段階が伸長段階を含み、伸長段階が、障害を有する核酸
を選択的に増幅するように短くされる請求項２記載の方法。
【請求項４】伸長段階が、約72℃で約0.5〜約２分間である請求項３記載の方法。
【請求項５】伸長段階が、約72℃で約1.5分間である請求項４記載の方法。
【請求項６】核酸のコレクションを、検出の段階の前にプールに分割する
請求項１記載の方法。
【請求項７】各プールが、約100の異なる供給源植物〜約3,000の異なる供
給源植物からの核酸を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】各プールが、少なくとも約1500の異なる供給源植物からの核
酸を含む請求項６記載の方法。
【請求項９】複数の供給源植物または複数の供給源植物の先祖を変異原と
接触させる請求項１記載の方法。
【請求項１０】変異原が高速中性子である請求項９記載の方法。
【請求項１１】野生型の植物における既知のヌクレオチド配列間の距離が
、約3kb〜約7kbである請求項１記載の方法。
【請求項１２】複数の供給源植物が、コメ、トマトおよびアラビドプシス
(Arabidopsis)から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項１３】複数の供給源植物が、約10,000〜約50,000の供給源植物で
ある請求項１記載の方法。
【請求項１４】請求項１記載の方法により同定される植物。
【請求項１５】野生型の染色体において既知のポリヌクレオチド配列が隣
接する遺伝子配列に欠失を含む植物を同定する方法であって、 (a) 複数の変異誘発された植物からの核酸のコレクションを提供し、ここで複
数の植物は遺伝子配列に欠失を有する植物を含むこと； (b) コレクション中の各核酸を、核酸の供給源植物と結びつけるデータベース
を提供すること； (c)核酸のコレクションを増幅することであって、ここで、増幅は、 (i)(1)野生型の染色体において約3kb〜約7kb離れたポリヌクレオチド配列に
対して特異的にハイブリッド形成し、かつ (2)遺伝子配列内または遺伝子配列に隣接するポリヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリッド形成するプライマーを提供すること；および (ii) 72℃で約0.5〜約２分間の伸長段階を含み、それによって欠失を含む核
酸を優先的に増幅することを含むこと； (d)増幅生成物を、野生型の植物からの増幅生成物と比較することによって、欠失を有する核酸の存在を検出すること；ならびに (e)データベースを使用して遺伝子配列に欠失を有する複数の植物中の供給原植物を同定し、それによって、欠失に関連する変異体表現型の評価のために、遺
伝子配列に欠失を有する植物を提供することを含む方法。