KR20010034731A

KR20010034731A - 유전자 서열 중에 유전자 병변이 있는 식물을 얻는 방법

Info

Publication number: KR20010034731A
Application number: KR1020007011001A
Authority: KR
Inventors: 장유엘린
Original assignee: 텔루스 제너틱 리소시즈, 인크.
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2001-04-25
Also published as: JP2002510506A; EP1068351A2; WO1999051774A2; CA2326835A1; WO1999051774A3; US6484105B2; US20020064879A1; IL138800A0; AU3221699A

Abstract

본 발명은 야생형 염색체에 인접해있는 유전자 서열 중에 병변을 포함하는 식물을 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 근원 식물로부터 핵산 수집물을 얻는 단계, 각 핵산을 근원 식물과 연결하는 데이터베이스를 제공하는 단계, 핵산 수집물을 증폭시켜 병변을 측정하는 단계, 그 다음 데이터베이스를 사용하여 병변을 보유하는 근원 식물을 동정하는 단계를 포함한다.

Description

유전자 서열 중에 유전자 병변이 있는 식물을 얻는 방법{A METHOD FOR OBTAINING A PLANT WITH A GENETIC LESION IN A GENE SEQUENCE}

관련 출원에 대한 참조 설명

본 출원은 명세서의 전 내용이 본 발명에 참고 인용되는 미국 가출원 일련번호 60/080,401호(1998.4.2)에 대한 우선권을 주장한다.

연방 정부의 지원 연구 및 개발 하에 이루어진 발명의 권리에 관한 진술

해당 사항 없음.

최근, 몇몇 유기체의 게놈 서열 분석은 완전히 종료되었으나, 기타 다른 다수의 유기체가 보유한 게놈의 서열 분석은 이제 시작되고 있다. 또한, 인간과, 경제적으로 중요한 작물 및 동물뿐만 아니라 C.엘레강스(C.elegans), 드로소필라(Drosophila) 및 아라비돕시스(Arabidopsis)와 같은 일부 모델 유기체를 비롯한 다수의 유기체가 보유한 게놈의 완전한 서열이 이후 수십년 내에 공지될 것이다. 하지만, 이러한 연구로부터 동정된 다수의 유전자는 그 기능에 대해서 알려지지 않을 수 있다.

유전자 기능을 연구하는 1가지 방법은 유기체 유전자를 녹아웃(knock out)시키고, 돌연변이 유기체에 일어나는 변화를 규명하는 것이다. 돌연변이 유기체에 대한 연구는 종종 유전자 기능의 이해를 돕는 역할을 한다. 또한, 유전자 녹아웃은 바람직하지 않은 특성을 특이적으로 제거하거나 또는 변화시키기도 한다.

현재 사용되고 있는 녹아웃 방법은 상동성 재조합을 통하여 녹아웃 동물을 창제하는데 유용한 기법이다. 예컨대, 문헌[Galli-Taliadoros et al., J. Immunol. Methods 181(1):1-15(1995); Buerstedde et al., Cell, 67:179-88(1991); Jasin et al, Genes and Devel., 2:1353-63(1988); Sedivy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:227-31(1989)]을 참조하라. 이러한 기법은 비용이 많이 들고 비효율적이다. 하지만, 그 이유는 밝혀지지 않았지만, 식물에 있어서의 상동성 재조합의 빈도는 매우 낮아서 상동성 재조합을 통해 녹아웃 식물을 창제하는 것은 불가능한 일이다. 몇몇 연구자들은 돌연변이 식물이 특정 식물 유전자의 안티센스 RNA를 발현하게 만들어 그 유전자의 발현률을 낮추는데 성공하기는 하였지만, 그 유전자의 발현과 기능을 완전히 제거하지는 못하였다. 하지만, 대부분의 경우에 요구되는 일은, 유전자의 기능을 완전히 제거하는 것이다. 또한, 현재 많은 작물 종의 돌연변이 식물을 제조하는 일은 매우 어렵거나 불가능한 일이다.

벤슨 등[Bensen et al., Plant Cell 7(1):75-84(1995)]은 트란스포손 서열과 특정 유전자 서열 간의 영역을 증폭시켜 공지의 옥수수 유전자 서열 중에 존재하는 트란스포손 삽입 돌연변이체를 동정하는 방법에 대하여 교시하고 있다. 하지만, 이 방법은 트란스포손 시스템이 특징적인 몇몇 식물계에만 제한되거나 이종 식물에 상기 시스템을 도입시키는 단계를 필요로 한다. 따라서, 이 방법은 모든 식물 종이 보유하는 공지 서열 중의 돌연변이를 동정할 수 있는 보편적 방법을 제공한다.

따라서, 공지 식물 유전자 서열 중의 유전자 병변을 얻어 측정하는 방법이 절실히 요구되며, 특히 이 방법은 가능한 한 다양한 식물에 유용해야 하고, 형질전환 방법의 유용성과 같은 기준에 좌우되지 않아야 하는 것이 이상적이다.

본 발명은 야생형 염색체에 인접해 있는 유전자 서열 중의 병변을 포함하는 식물을 공지의 폴리뉴클레오티드 서열로 동정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 유전자 서열 중에 병변을 포함하는 식물을 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 각 식물로부터 수집한 각 핵산 샘플들의 수집물 또는 푸울을 제공하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이 방법에 사용되는 각 식물은 근원 식물의 돌연변이화된 개체에서 유래되는 것으로, 그 개체내에 유전자 다양성을 보증하는 역할을 한다.

또한, 본 발명의 방법은 핵산 샘플이 유래된 근원 식물과 각 핵산 샘플을 연관시킨 데이터베이스를 제공한다.

또, 본 발명의 방법은 야생형 염색체 중의 유전자 서열의 측면에 위치시킨 공지된 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드하는 프라이머를 사용하여 핵산 수집물을 증폭시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 증폭은 병변이 있는 핵산을 선택적으로 증폭시키는 단축된 신장 단계를 포함한다. 예를 들어, 신장 시간은 72 ℃에서 0.5 내지 2분 사이일 수 있다. 일 양태에 있어, 신장 시간은 1.5분이다.

핵산 증폭후, 샘플 중 하나의 유전자 서열내에 있는 유전자 병변을 측정한다. 예컨대, 병변은 증폭 생성물 크기의 변화로서 측정할 수 있다. 병변을 포함하는 핵산 샘플을 일단 동정하면, 데이터베이스를 사용하여 핵산 샘플이 유래된 근원 식물을 동정한다.

일 양태에서, 병변은 결실이다.

다른 일 양태에서, 병변을 측정하기 전에 핵산 수집물을 서브세트 푸울로 나누기도 한다. 예컨대, 푸울은 약 100 내지 약 3000가지의 상이한 근원 식물 유래의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 푸울은 최소한 약 1500가지의 근원 식물을 포함할 수도 있다.

복수의 근원 식물 또는 근원 식물의 자손들은 예컨대 돌연변이원과 접촉할 수 있다. 일 양태에서, 돌연변이원은 고속 중성자이다.

일 양태에서, 야생형 식물에 존재하는 공지의 뉴클레오티드 서열 간의 거리는 약 3 kb 내지 7 kb 사이이다.

본 발명의 방법은, 일 예로 쌀, 토마토 또는 아라비돕시스와 같은 복수의 근원 식물에 대하여 실시할 수 있다. 일 양태로서, 근원 식물의 수는 약 10,000 내지 약 50,000이다.

본 발명에는 전술한 방법에 의해 동정되는 식물이 포함되기도 한다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 유전자 서열 중에 결실을 보유하는 근원 식물이 동정된다. 일 양태에서, 유전자 서열 중에 결실을 보유하는 식물이 최소한 하나인 복수의 돌연변이 식물 유래의 핵산 수집물을 제공한다. 또한, 핵산 수집물 중의 각 핵산과 그 핵산의 근원 식물을 연결시킨 데이터베이스도 제공한다. 그 다음, 핵산 수집물을 증폭시킨다. 이 증폭 과정은 야생형 염색체 중에서 약 3 kb 내지 약 7 kb 떨어진 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드하고, 그 유전자 서열내에 존재하거나 그 유전자 서열에 인접하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드하는 프라이머를 제공하는 단계를 포함한다. 증폭은 또한 72 ℃에서 약 0.5 분 내지 약 2 분간 실시되는 신장 단계를 포함하여, 결실이 있는 핵산을 우선적으로 증폭시킨다. 이와 같이 증폭된 증폭 생성물과 야생형 식물 유래의 증폭 생성물을 비교하여 결실이 있는 핵산의 존재를 확인한다. 그 다음, 데이터베이스를 사용하여 결실이 있는 근원 식물을 동정하고, 이 유전자 서열 중에 결실이 있는 식물을 제공하여 결실과 관련있는 돌연변이체 표현형을 평가한다.

정의

"유전자 서열"은 게놈 DNA 또는 cDNA 중에 존재하는 조절 서열 및/또는 오픈 리딩 프레임 유래의 서열 또는 준서열을 포함하는 핵산 서열을 의미한다.

"야생형 염색체"는 인간 유래의 돌연변이유발의 실시 이전에 식물 중에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. "인간 유래의 돌연변이유발"은 예컨대 선택적 육종을 통하여 농경적으로 중요한 특성을 선택하는 단계가 아닌, 개체 중의 유전자 다양성을 향상시키기 위한 돌연변이 화합물 또는 인자의 도입 단계를 포함한다. 이러한 돌연변이 화합물로는, 예컨대 트란스포손이 있다.

"근원 식물"이란, 핵산을 수거하는 특정 식물 또는 식물의 유전자 등가물이다. 본 발명의 목적상, 유전자적 등가 식물이란 동일한 특정 유전자 병변이 회수되는 식물이다. 유전자적 등가 식물로는 당해 식물 유래의 자손 또는 자매 식물이 있다. 즉, M1 종자가 돌연변이유발되고, M1 식물로 성장시킨 후, 이들의 M2 종자를 수거한 경우, 동일한 양친 유래의 수집된 M2 종자는 동일한 "근원 식물"이 되는데, 그 이유는 M1 양친으로부터 유래되는 한 M2 식물의 특이적인 돌연변이가 동일한 M1 양친 유래의 M2 자매 푸울에서도 발견될 가능성이 있기 때문이다. 이와 마찬가지로, M2 식물이 특정한 유전자 병변을 갖고 있다면, M2 식물 유래의 M3 자손의 푸울 역시 그 병변을 보유할 가능성이 크다.

"병변"이란 야생형 식물 핵산에 상대적인 핵산의 모든 분자적 변화일 수 있다. 예를 들어, 병변은 핵산 서열 중의 결실, 역위, 삽입, 중복 또는 재배열일 수 있다. 병변은 결실인 것이 바람직하다.

"복수의 근원 식물의 선조"란 특정 근원 식물 수집물의 조상이다. 예를 들어, M1 종자가 돌연변이되고, M1 식물로 성장된 후, M1 식물에서 M2 종자를 수집한다면, M1 식물은 M2 식물의 선조이다.

"돌연변이체 표현형의 평가"란 야생형 식물의 특성과 다른 유전자 병변을 보유하는 식물의 물리적 특성을 동정하는 것을 의미한다. 이러한 특성의 현시는 식물의 유전자 구성에 따라 달라질 수 있는데, 예컨대 식물이 전체 유전자의 바탕 뿐만 아니라 병변을 포함하는 대립유전자를 비롯한 특정 대립유전자에 대하여 동형접합성인지 또는 이형접합성인지에 따라 달라질 수 있다. 병변이 동형접합성의 치사 표현형을 유발시키는 것이라면, 병변은 이형접합성 상태에서 후속 세대들에 유지될 수 있다.

"핵산 서열"이란 5' 또는 3' 말단으로부터 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 1본쇄 또는 2본쇄 중합체를 의미한다. 그 예로는, 염색체 DNA, 자가 복제성 플라스미드, DNA 또는 RNA의 감염성 중합체 및 기본 구조적 역할을 하는 DNA 또는 RNA가 있다.

"프로모터"라는 용어는 전사 개시점으로부터 상류 및/또는 하류에 위치하고, 전사를 개시시키는 RNA 폴리머라제와 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여하는 영역 또는 서열을 의미한다. "식물 프로모터"란 식물 세포에서 전사를 개시시킬 수 있는 프로모터이다.

"식물"이란 용어는 전체 식물, 지맥 영양성 기관/구조(예, 잎, 줄기 및 괴경), 뿌리, 꽃 및 꽃기관/구조(예, 포엽, 악판, 꽃잎, 수술, 암술잎, 꽃밥 및 배주), 종자(배아, 배유, 종피 포함) 및 열매(성숙 씨방), 식물 조직(예, 도관 조직, 지반 조직 등) 및 세포(예, 가드(guard) 세포, 난세포, 돌기꼴구조 등) 및 이들의 자손을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 식물류는 일반적으로 속씨 식물(단자엽 및 쌍자엽 식물), 겉씨 식물, 양치류 및 다세포 조류를 비롯하여 형질전환 기법에 사용하기 쉬운 하등 식물에서 고등 식물까지 다양하다. 배수성 레벨은 이수성(異數性), 다중배수성, 2수성, 반수성 및 반접합성을 비롯한 다양한 레벨의 식물을 포함한다.

폴리뉴클레오티드 서열은 유기체와 "이종성"이거나, 또는 이종 유래인 경우에는 제2 폴리뉴클레오티드 서열이거나 또는 동종 유래인 경우에는 본래 형태를 변형시킨 것이다. 예를 들어, 이종 암호 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터는 이 프로모터가 유래되는 종과 상이한 종 유래의 암호 서열을 의미하거나, 또는 프로모터가 동종에서 유래되는 경우에는 그 프로모터와 천연적으로는 관련이 없는 암호 서열(예, 유전자 조작된 암호 서열 또는 다른 생태형이나 변형체 유래의 대립유전자)을 의미한다.

"재조합체"란 인간에 의해 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 이 폴리뉴클레오티드의 복사체 또는 보체를 의미한다. 예를 들어, 제2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함하는 재조합체 발현 카세트는 이 발현 카세트를 포함하는 분리된 핵산을 인간의 조작[예컨대, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley ＆ Sons, Inc.(1994-1998)]을 통해 제2 폴리뉴클레오티드에 이종성인 프로모터를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 재조합체 발현 카세트는 자연에서는 발견하기 매우 힘든 것으로 결합된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간에 의해 조작된 제한 부위 또는 플라스미드 벡터 서열은 제2 폴리뉴클레오티드 유래의 프로모터에 근접 배치하거나 이격되어 배치할 수 있다. 당업자라면, 폴리뉴클레오티드를 다양한 방식으로 조작할 수 있고, 전술한 구체예에만 국한되지 않는다.

각 식물에 대해 "외인성"인 폴리뉴클레오티드란 자웅 교배 이외의 다른 방법에 의해 식물로 도입되는 폴리뉴클레오티드이다. 이를 수행할 수 있는 방법의 예로는 아그로박테리움 매개의 형질전환법, 바이오리스틱법, 전기침투법 등이 있다. 이러한 외인성 핵산 함유 식물은 이하 T₁(예, 진공 침입에 의한 아라비돕시스의 경우) 또는 R₀(시험관내에서 형질전환된 세포로부터 재생된 식물의 경우) 세대의 돌연변이 식물이라 부른다. 자웅 교배 또는 셀핑(selfing)에 의해 발생하는 돌연변이 식물은 상기 식물의 자손이다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열 중의 각 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 서열이 하기 기재된 바와 같이 최대의 상응도로 정렬시켰을 때 그 서열이 동일한 경우, 그 핵산 서열이나 폴리펩티드는 동일하다고 말한다. 2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 관한 설명에서 "동일한" 또는 "동일성"%란 용어는 다음에 설명되는 서열 비교 알고리듬 중 하나를 사용하거나 또는 수작업으로 정렬한 뒤 육안 조사하여 측정하였을 때 비교 윈도우 상에서 최대 상응성에 대하여 비교하고 정렬시켰을 때 동일하거나 또는 특정 비율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 보유하는 2 이상의 서열 또는 준서열을 의미한다. 단백질이나 펩티드에 대하여 서열 동일성의 비율을 사용하는 경우에는, 동일하지 않은 잔기 위치는, 아미노산 잔기가 화학적 성질(예컨대, 전하 또는 소수성)이 유사한 다른 아미노산 잔기로 치환되어 분자의 기능적 성질은 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환으로 흔히 변화되는 것으로 확인된다. 보존적 치환으로 서열이 변화되는 경우, 서열의 동일성 비율은 치환의 보존적 성질을 수정하기 위해 상향 조정할 수도 있다. 이와 같이 조정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 전체 부정합 보다는 부분 부정합으로 보존적 치환을 채점하는 단계를 포함하여 서열 동일성 비율을 증가시킨다. 즉, 예컨대 동일한 아미노산을 1점으로 매기고, 비보전적 치환을 0점으로 매긴다면 보전적 치환은 0 내지 1 사이의 점수가 된다. 보전적 치환의 채점은 예컨대 프로그램 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California, USA)으로 수행되듯이, 문헌[Meyers ＆ Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17(1988)]의 알고리듬에 따라 계산한다.

두 핵산 또는 폴리펩티드에 관한 설명에서 "실질상 동일한"이란 용어는, 다음에 설명되는 서열 비교 알고리듬 중 하나를 사용하거나 또는 수작업으로 정렬한 뒤 육안 조사하여 측정하였을 때 비교 윈도우 상에서 최대 상응성에 대하여 비교하고 정렬시켰을 때 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 동일성이 60% 이상, 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 90 내지 95%인 서열 또는 준서열을 의미한다. 또한, 이 정의는 시험 서열이 대조 서열과 실질상 동일성인 경우 실질상 서열 또는 준서열의 상보성이 있는 시험 서열의 보체를 의미하기도 한다.

또한, 당업자라면 2개의 폴리펩티드가 면역학적으로 유사하다면 "실질상 동일한" 것이라는 사실을 잘 알고 있다. 즉, 2개의 폴리펩티드의 1차 구조가 상당히 상이하더라도 전체 단백질 구조는 유사할 수 있다. 따라서, 2개의 폴리펩티드가 실질상 동일한지를 측정하는 방법은 각 폴리펩티드에 대한 모노클로널 또는 폴리클로널 항체의 결합을 측정하는 단계를 포함한다. 제1 폴리펩티드에 특이적인 항체가 제1 폴리펩티드에 대한 친화성의 최소 1/3의 친화성으로 제2 폴리펩티드에 결합한다면 두 폴리펩티드는 실질상 동일한 것이다.

서열 비교시에는 일반적으로 한 서열을 대조 서열로 사용하고, 이 서열에 대하여 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리듬을 사용하는 경우에는, 시험 서열과 대조 서열을 컴퓨터에 등록하고, 필요하다면 준서열의 좌표를 표시하고, 서열 알고리듬 프로그램 변수를 표시한다. 디폴트 프로그램 변수를 사용하거나, 또는 기타 다른 변수를 표시할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리듬으로 프로그램 변수에 기초하여 대조 서열에 상대적인 시험 서열에 대한 서열 동일성%를 계산한다.

본 명세서에 사용된 "비교 윈도우"란 용어는 2개의 서열을 적당하게 정렬한 후 동일한 수의 근접 위치의 대조 서열과 비교할 수 있는 서열의 근접 위치의 수가 20 내지 600, 일반적으로 약 50 내지 약 200, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150으로 구성된 군 중에서 선택되는 수 중 어느 하나인 분절에 대한 의미를 포함한다. 비교용 서열을 정렬하는 방법에 대해서는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 비교용 서열을 정렬하는 최적의 방법은, 예컨대 문헌[Smith ＆ Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)]의 국소 상동성 알고리듬, 문헌[Needleman ＆ Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)]의 상동성 정렬 알고리듬, 문헌[Pearson ＆ Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)]의 유사성 방법에 대한 조사, 이들 알고리듬(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 중의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 전산 수행, 또는 수동 정렬과 육안 조사를 통해 수행할 수 있다.

유용한 알고리듬의 일예는 PILEUP이다. PILEUP은 진행적 쌍 정렬을 사용하여 일군의 관련 서열 유래의 복수의 서열을 정렬시켜 관련성 및 서열 동일성 %를 규명한다. 또한, 정렬 형성시 사용한 클러스터링 관련성을 나타내는 트리 또는 댄도그람을 플롯팅한 것이다. PILEUP은 문헌[Feng ＆ Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360(1987)]에 기재된 진행적 정렬 방법의 단순화된 방법을 사용한다. 사용된 방법은 문헌[Higgins ＆ Sharp, CABIOS 5:151-153(1989)]에 기재된 방법과 유사하다. 이 프로그램은 각각 뉴클레오티드 또는 아미노산의 최대 길이가 5000개인 300개 이상의 서열을 정렬시킬 수 있다. 복수의 정렬 절차는 가장 유사한 2개의 서열을 쌍 정렬시키는 것을 필두로 하여 2개의 정렬된 서열의 클러스터를 만든다. 이 클러스터를, 그 다음으로 가장 관련있는 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터에 정렬시킨다. 이러한 서열의 2개의 클러스터는 2개의 각 서열의 쌍 정렬을 단순히 신장시켜 정렬시킨다. 최종 정렬은 일련의 진행적 쌍 정렬에 의해 달성된다. 이 프로그램은 특정 서열 및 이들의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 서열 비교 영역에 대하여 표시하고, 프로그램 변수를 표시하여 진행시킨다. 예를 들어, 대조 서열은 다른 시험 서열과 비교하여, 다음과 같은 변수, 즉 디폴트 갭 중량(3.00), 디폴트 갭 길이 중량(0.10) 및 중량부가된 말단 갭을 이용하는 서열 동일성% 관계를 측정할 수 있다.

서열 동일성% 및 서열 유사성% 측정에 적합한 알고리듬의 또 다른 예는 BLAST 알고리듬으로서, 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)]에 개시되어 있다. BLAST 분석용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 입수용이하다. 이 알고리듬은 먼저 데이터베이스 서열 중에서 동일한 길이의 단어와 정렬시켰을 때 한계 스코어 T가 약간 양성 값에 일치하거나 충족되는 당해 서열 중의 길이 W인 짧은 단어를 동정하여 고득점의 서열쌍(HSP)을 동정하는 단계를 포함한다. T는 이웃 단어 스코어 한계값으로 불리는 것이다(Altschul et al. 상기 문헌 참조). 이와 같이 적중된 초기 이웃 단어는 이것을 포함하는 보다 긴 HSP에 대한 연구를 개시할 수 있는 종자로서 작용한다. 이 적중 단어는 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 때까지 각 서열을 따라 양 방향으로 신장시킨다. 적중 단어의 각 방향으로의 신장은 누적 정렬 스코어가 최대값 보다 X만큼 떨어진 경우, 누적 스코어가 1 또는 그 이상의 음성값의 잔기 정렬이 축적되어 0 또는 그 이하로 떨어진 경우, 또는 어느 한 서열의 말단에 도달한 경우에 중지한다. BLAST 알고리듬 변수 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 측정하는 것이다. BLAST 프로그램은 단어길이(W) 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스[Henikoff ＆ Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)] 정렬(B) 50, 기대치(E) 10, M=5, N=-4 및 양가닥의 비교값을 디폴트값으로서 사용한다.

또한, BLAST 알고리듬은 두 서열간의 유사성을 통계학적으로 분석한다[예컨대 Karlin ＆ Altschul, Proc.Nat'l.Acad.Sci. USA 90:5873-5787(1993)]. BLAST 알고리듬에 의해 제공되는 유사성의 1가지 측정값은, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간의 정합이 우연히 일어날 수 있는 확률의 표시를 제공하는 최소 총합 확률(P(N))이다. 예를 들어, 대조 핵산과 시험 핵산을 비교할 때 총 확률의 최소값이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이라면 그 핵산은 대조 서열과 유사한 것으로 간주한다.

"보존적으로 변화된 변형체"는 아미노산 서열과 핵산 서열에 모두 마찬가지이다. 특정 핵산 서열의 경우에, 보전적으로 변화된 변형체란 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호하는 핵산을 의미하거나 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호하지 않는 경우에는 실질상 동일한 서열을 의미한다. 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, 소정의 단백질을 암호하는 기능적으로 동일한 핵산의 수는 많다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호한다. 즉, 하나의 코돈으로 알라닌이 특정화된 모든 위치에서 그 코돈은 암호된 폴리펩티드를 변화시킴이 없이 상기 임의의 대응 코돈으로 변화시킬 수 있다. 이러한 핵산 변형을 "침묵 변형"이라 하는 것으로, 보존적으로 변화되는 변형의 한 종류이다. 따라서, 본원 명세서에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 모든 핵산 서열은 가능한 모든 침묵 변형 핵산을 의미한다. 당업자라면 핵산 중의 각 코돈(보통 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG는 제외)은 기능적으로 동일한 분자를 산출하는 코돈으로 변형시킬 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호하는 핵산의 각 침묵 변형은 개시된 각 서열 중에 함축된 것이다.

또한, 아미노산 서열과 관련하여 암호된 서열 중에서 하나의 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변화시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열 중의 각 치환도, 그 변화가 한 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 "보존적으로 변화된 변형체"임을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

다음 6군은 각각 서로 보존적 치환인 아미노산을 포함하는 것이다.

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소로이신(I), 로이신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

[예컨대, Creighton, Proteins(1984)를 참조하라].

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질상 동일하다는 표시는 제1 핵산에 의해 암호된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 암호된 폴리펩티드에 대하여 유발된 항체와 면역학적으로 교차반응하는 것이다. 즉, 2개의 펩티드가 단지 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 실질상 동일한 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질상 동일한 또 다른 표시는 하기 기재되는 바와 같이 엄중 조건하에서 두 분자 또는 이들의 보체가 서로 하이브리드하는 것이다.

"선택적(또는 특이적)으로 하이브리드하는"이란 용어는 서열이 복합 혼합물(예컨대 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)로 존재하는 경우 엄중 하이브리드 조건하에서 분자가 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합, 2본쇄화 또는 하이브리드화하는 것을 의미한다.

"엄중 하이브리드 조건"이란 보통 다른 서열은 없고 핵산의 복합 혼합물내에서만 프로브가 표적 준서열에 하이브리드하는 조건을 의미한다. 엄중 조건은 서열 의존적이고 환경마다 달라진다. 긴 서열은 보다 고온에서 특이적으로 하이브리드한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 안내는 문헌[Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)]에 충분히 설명되어 있다. 일반적으로, 고도의 엄중 조건은 소정의 이온 강도 pH에서 특정 서열의 열융점(T_m) 보다 약 5 내지 10℃ 낮게 선택한다. 저엄중 조건은 일반적으로 T_m보다 약 15 내지 30 ℃ 낮게 선택한다. T_m은 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형시(표적 서열이 과량으로 존재할 때 T_m이 되면 프로브의 50%가 평형 상태가 됨) 표적 서열에 하이브리드하는 온도(소정의 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서)이다. 엄중 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 이하, 일반적으로 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예컨대, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해서는 약 30 ℃ 이상이고, 긴 프로브(예컨대, 50개 보다 많은 뉴클레오티드)에 대해서 약 60 ℃ 이상인 것이다. 또한, 엄중 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 얻을 수도 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화시 양성 시그널은 배경 하이브리드화 보다 2배 이상, 바람직하게는 배경 하이브리드화의 10배인 시그널이다.

엄중 조건하에서 서로 하이브리드하지 않는 핵산도, 이들이 암호하는 폴리펩티드가 실질상 동일한 것이라면 실질상 동일한 것이다. 이러한 경우는, 예를 들어 유전자 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 이용하여 핵산 복사체를 제조한 경우이다. 이 경우에, 핵산은 일반적으로 중간 엄중성의 하이브리드화 조건하에 하이브리드한다.

본 발명에서, 본 발명의 ANT 핵산을 포함하는 게놈 DNA 또는 cDNA는 개시된 핵산 서열을 사용하여 엄중 조건하에서 표준 서던 블롯법으로 동정할 수 있다. 예컨대, 이러한 하이브리드화에 적합한 엄중 조건은 40% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충액에서 37 ℃하에 하이브리드하고, 0.2X SSC로 약 50℃ 이상, 일반적으로 약 55℃ 내지 약 60℃에서 20 분 동안 1회 이상 세척하는 것이거나 이의 등가 조건이다. 양성 하이브리드화는 배경 하이브리드화의 2배 이상인 것이다. 당업자라면 대안적인 하이브리드화 조건 및 세척 조건이 유사한 엄중도 조건을 제공하는데 이용될 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다.

엄중 조건하에 서로 하이브리드하지 않는 핵산은 이들이 암호하는 폴리펩티드가 실질상 동일하다면 그 핵산 역시 실질상 동일한 것이다. 그 예로는, 유전자 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 핵산 복사체를 작제한 경우이다. 이 경우에, 핵산은 일반적으로 중간 엄중 하이브리드 조건하에 하이브리드한다. "중간 엄중 하이브리드 조건"이란 40% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충액에서 37 ℃하에 하이브리드하고, 1X SSC로 약 45℃에서 세척하는 것을 포함한다. 양성 하이브리드화는 배경 하이브리드화의 2배 이상인 것이다. 당업자라면 대안적인 하이브리드화 조건 및 세척 조건이 유사한 엄중도 조건을 제공하는데 이용될 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다.

2개의 폴리뉴클레오티드가 실질상 동일한 또 다른 표시는 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭시킨 대조 서열이, cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 시험 서열을 분리하거나 또는 예컨대 RNA 겔 또는 DNA 겔 블롯 하이브리드 분석에서 시험 서열을 동정하기 위한 엄중 하이브리드화 조건하에서 프로브로서 사용될 수 있다는 것이다.

구체적인 양태에 대한 설명

본 발명은 먼저 유전자 서열 중의 유전자 병변을 선발하여 유전자 서열의 기능을 측정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 다수의 식물로부터 얻은 상기 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키고, 그 다음 증폭 생성물과 야생형 식물의 유래의 증폭 생성물을 비교하여 유전자 병변을 보유하는 식물을 동정하는 단계를 포함한다. 바람직한 양태에서는 복수의 근원 식물 유래의 핵산을 수집하여 증폭시킨다. 바람직한 양태에서는, 특정 유전자 서열 중에 유전자 병변이 있는 핵산이 우선적으로 증폭되도록 증폭 조건을 제공한다.

본 발명의 근원 식물

본 발명에는 모든 종류의 식물을 사용할 수 있다. 본 발명은 다양한 범위의 식물, 예컨대 아나카듐(Anacardium), 아라키스(Arachis), 아스파라거스(Asparagus), 아트로파(Atropa), 아베나(Avena), 브라시카(Brassica), 시트루스(Citrus), 시트룰스(Citrullus), 캡시컴(Capsicum), 카르타무스(Carthamus), 코코스(Cocos), 커피(Coffea), 큐커미스(Cucumis), 큐커비타(Cucurbita), 다우쿠스(Daucus), 엘라에이스(Elaeis), 프라가리아(Fragaria), 글리신(Glycine), 고시피움(Gossypium), 헬리안투스(Helianthus), 헤테로칼리스(Heterocallis), 호르듐(Hordeum), 히오시아무스(Hyoscyamus), 락투카(Lactuca), 리넘(Linum), 롤리움(Lolium), 루피너스(Lupinus), 리코퍼시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 만니호트(Manihot), 마저라나(Majorana), 메디카고(Medicago), 니코티아나(Nicotiana), 올레아(Olea), 오리자(Oryza), 파니엄(Panieum), 판네세텀(Pannesetum), 페르세아(Persea), 파세올러스(Phaseolus), 피스타키아(Pistachia), 피섬(Pisum), 피루스(Pyrus), 프루너스(Prunus), 라파누스(Raphanus), 리시누스(Ricinus), 세칼(Secale), 세네시오(Senecio), 시나피스(Sinapis), 솔라넘(Solanum), 소르검(Sorghum), 테오브로무스(Theobromus), 트리고넬라(Trigonella), 트리티컴(Triticum), 비시아(Vicia), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna) 및 제아(Zea) 속 유래의 종들을 포함한다.

본 발명은 복수의 식물 유래의 핵산 수집물을 제공한다. 복수의 식물은 유전자 변형을 보유하는 식물의 임의의 수집물일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 복수의 식물 또는 식물의 선조를 유전자 병변을 유발하기 쉬운 돌연변이원에 노출시켜 개체내 유전자 변화를 촉진시킨다. 돌연변이원은 결실을 다량으로 생성하는 것으로 선택하는 것이 바람직하다.

식물 돌연변이유발법[sp?]

종자의 돌연변이 개체를 얻거나 작제할 수 있다. 예컨대, 기존의 식물의 돌연변이 개체는 상업적 또는 비상업적 공급자[예, Lehle Seed, Round Rock, Texas and the Arabidopsis Biological Resource Center (돌연변이 아라비돕시스 종자 공급)]로부터 구입하거나 얻을 수 있다. 또는, 모든 식물 종에 대하여 돌연변이 개체를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 표준 기법에 따라 종자 또는 다른 식물 재료를 돌연변이원성 화학 물질로 처리할 수 있다. 이러한 화학 물질에는, 디에폭시부탄, 디에틸 설페이트, 에틸렌 이민, 에틸 메탄설포네이트 및 N-니트로소-N-에틸우레아가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 또는, X선, 감마선 또는 고속 중성자 충격과 같은 근원 유래의 이온화 방사선을 사용할 수도 있다.

돌연변이 개체는 일반적으로 다수의 종자(∼50,000)를 만들고 이 종자를 돌연변이원에 노출시켜 제조한다. 당업자라면 일련의 농도와 노출 시간을 사용하여 돌연변이유발의 최적 레벨을 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 이러한 시험 개체는 토양에 심거나 또는 고체 성장 배지에 평판배양한다. 발아하지 않는 종자의 수는 돌연변이유발 정도의 유용한 지표인자이다. 돌연변이 개체는 일반적으로 돌연변이율이 충분히 높아서, 가능한 한 소수의 식물에서 목적 돌연변이를 동정할 수 있으면서, 일반 식물이 복수의 상이한 유전자 병변을 보유하고 돌연변이된 종자에서 성장한 대부분의 식물이 다음 세대의 종자를 생성할 수 있도록 개체가 과잉 돌연변이유발되지 않도록 한다. 이론적으로, 이상적 투여량은 멸균된 처리 종자로부터 성장된 식물이 약 37%가 되는 양이다.

일 양태로서, 종자(M1로 표시)를 돌연변이한 후, 식물로 성장시킨 다음, 이 식물로부터 M2 종자를 수확한다. 유전자 병변에 대해 동형접합성 및 이형접합성인 식물을 보유한 식물 개체(예, M2 개체)가 본 발명의 핵산 근원으로서 바람직하게 사용된다. 일반적으로, M2 식물은 성장한 뒤, 그 잎이나 뿌리 조직을 수거하여 핵산 분리에 사용한다. M2 식물로부터 M3 종자를 수거하여 양친 M2 식물내 모든 유전자 병변을 규명하기 위해 이후 사용할 수 있는 근원 식물 개체를 만든다. 또는, M2 식물의 자매(종자 또는 식물)를 모아 근원 식물 개체를 제공한다. 이러한 제2 양태는 식물 성장 공간을 절감해주나, 목적하는 유전자 병변을 얻기 위한 추가 단계를 이후에 필요로 한다.

유전자 병변의 종류

돌연변이원은 특히 점 돌연변이, 결실, 역위, 삽입, 중복 및 재배열을 생성할 수 있는 것이다. 유전자 병변은 크거나 작을 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직한 병변은 2개의 공지 폴리뉴클레오티드 서열에 하이브리드하는 프라이머 사이의 거리를 유의적으로 변화시키는 것이다. 이러한 병변으로는 결실, 삽입 및 중복이 있다. 유의적 변화는 PCR과 같이 핵산을 특이적으로 검출하기 위한 표준 절차를 사용하여 쉽게 측정할 수 있는 것이다. 일반적으로, 2개의 공지 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 프라이머 사이 거리의 약 30% 이상의 변화가 바람직하다. 특히 바람직한 양태에서, 유전자 병변은 프라이머간의 거리의 약 10% 이상 내지 약 85%가 제거된 결실이다. 예를 들어, 일반적으로 프라이머는 약 7 kb 거리이고 결실은 약 0.5 kb 내지 약 6 kb인 것으로 선택한다.

복수의 식물 유래의 핵산 제조

일반적으로, 하기 기재되는 재조합 DNA 기술의 명칭과 실험실 절차는 당해 기술 분야에 공지되고 흔히 사용되는 것이다. 클로닝, DNA 및 RNA 분리, 증폭 및 정제의 표준 기법을 사용한다. 일반적으로, DNA 리가제, DNA 폴리머라제, 제한 효소 등을 포함하는 효소 반응을 제조자의 지시에 따라 실시한다. 이러한 기법과 기타 다른 다양한 기법들에 대해서는 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley ＆ Sons, Inc. (1994-1998)]을 참조하라.

본 발명의 데이터베이스

본 발명의 바람직한 양태에서, 핵산은 각 식물에서 분리한 뒤, 본 발명의 방법에 사용하기 위하여 모아둔다. 각 식물로부터 핵산 제조물을 만들기 위하여 고유 번호 또는 코드를 부여하고, 이와 동일한 번호 또는 코드를 사용하여 각각의 근원 식물 개체를 이후 찾을 수 있도록 유지시킨다.

일 양태에서, 본 발명의 분석법은 분석 결과를 기록한 데이터베이스를 사용하여 용이하게 실시한다. 특히, 대규모 선별 시스템(예컨대, 대규모 식물 개체 선별)을 사용하는 경우, 데이터 운영이 매우 유용할 수 있다. 이러한 라이브러리를 선별하여 얻은 정보의 유지 및 운용은 자동화 정보 검색, 예컨대 컴퓨터 데이터베이스에 의해 지원될 수 있다.

이러한 데이터베이스는 라이브러리 등록, 라이브러리 또는 결과 디스플레이, 라이브러리 및/또는 결과 내역, 증거 서류 제출 및 데이터 검색과 답사 데이터 분석을 비롯한 다양한 기능에 유용하다. 데이터베이스의 등록 기능은 식물 및 핵산 근원의 기록/등록을 제공한다. 라이브러리 및 선별 결과의 디스플레이 기능은 관련 분석 데이터를 검토 및/또는 분류하는 효과적인 수단을 제공한다. 또한, 데이터베이스는 분석 데이터를 신속히 검색, 상관관련(또는 통계적 분석) 및 평가하는 성질과 선별 결과의 문서화에 사용될 수 있다.

데이터베이스는 본 발명의 분석법으로 얻어진 정보를 기록 및 검색하는데 편리한 모든 매체일 수 있다. 이러한 데이터베이스로는, 수작업에 의한 기록 및 인덱스화 시스템(예, 파일 카드 인덱스화 시스템)을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 하지만, 데이터베이스는 본 명세서의 데이터가 신속하고 용이하게 검색 및 조작(예컨대, 분할, 분류, 분석 및/또는 다른 조직화)될 수 있을 때 가장 유용하다. 즉, 바람직한 양태에서, 본 발명의 데이터베이스는 "자동화", 예컨대 전자(전산화된) 데이터베이스인 것이 가장 바람직하다. 이 데이터베이스는 각각의 "독립형" 컴퓨터 시스템으로 존재하는 것이거나, 또는 연결된 컴퓨터 시스템 상에 다중 "노드"(프로세서)의 한 성분 또는 그 노드를 따라 분포될 수 있다. 데이터베이스의 저장 및 조작에 사용되는 컴퓨터 시스템은 당해 기술 분야에 공지된 것으로, "퍼스널 컴퓨터 시스템", 메인프레임 시스템, 인터넷 또는 인트라넷 상의 분포된 노드, 특정 하드웨어(예컨대 마이크로칩)에 저장된 데이터 또는 데이터베이스 등이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.

증폭

본 발명은 병변을 보유하는 핵산과 야생형 핵산 간의 특정 서열에 차이를 규명하는데 적당한 양의 핵산을 만들기 위한 증폭 단계를 제공한다.

PCR

바람직한 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 저장된 샘플 중의 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA를 증폭시킨다. 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호(Mullis and Mullis et al.)에 개시된 PCR은 클로닝 또는 정제없이 게놈 DNA 혼합물 중에서 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. PCR은 표적의 농도를 용이하게 검출할 수 있는 레벨로 직접 증가시키는데 사용할 수 있다. 표적 서열을 증폭시키는 방법은 2본쇄 표적 서열의 각 가닥에 상보적인 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 몰 과량을, 바람직한 표적 서열을 포함하는 DNA 혼합물에 첨가하는 단계를 포함한다. 이 혼합물을 변성시키고, 그 다음 하이브리드화한다. 하이브리드화 후, 프라이머를 폴리머라제로 신장시켜 상보적 가닥을 만든다. 필요에 따라 변성, 하이브리드화 및 폴리머라제 신장 단계를 반복하여 바람직한 표적 서열의 분절을 비교적 고농도로 얻을 수 있다. PCR에 대한 개론적 내용은 문헌[PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,(Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. and White, T., eds.), Academic Press, San Diego(1990)]을 참조하라.

바람직한 표적 서열의 분절의 길이는 프라이머의 서로에 대한 상대적 위치, 뿐 아니라 폴리머라제가 DNA 가닥을 신장시키는데 걸리는 시간의 길이("신장 시간")에 따라 결정된다. 따라서, 이 길이는 조정가능한 변수이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 신장 시간은 유전자 병변을 포함하는 핵산이 우선적으로 증폭되도록 선택한다. 예를 들어, 유전자 병변이 결실인 것으로 추정되는 경우에는, 프라이머간의 거리가 야생형 식물에서 발견되는 것 보다 적다면 증폭이 적당하게 일어나도록 신장 시간을 짧게 한다. 당업자라면 추정되는 결실 크기, 프라이머간의 거리 등에 치료하여 증폭 조건을 디자인할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서 신장 시간은 72 ℃에서 약 1분 내지 약2분일 수 있다. 보다 바람직한 양태에서, 신장 시간은 72℃에서 1.5분인 것이 좋다.

프라이머 디자인

본 발명에 적당한 프라이머는 당해의 유전자 서열에 따라 달라진다. 프라이머 작제 및 사용에 대해서는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 바람직한 양태에서, 프라이머는 유전자 서열에 인접한 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 것으로 작제한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 당해 유전자의 암호 영역에 인접하거나, 또는 암호 서열과 조절 서열(예컨대, 프로모터와 유전자의 3' 영역)에 인접하는 것일 수 있다. 또는, 프라이머는 유전자의 조절 영역 또는 암호 영역에 하이브리드하도록 작제할 수 있다. 프라이머는 약 3 kb 내지 약 7 kb 거리의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 것이 바람직하다.

아라비돕시스와 같이 충분한 DNA 서열분석이 실시된 종의 경우에, 당해의 유전자 서열에 인접한 게놈 서열은 공지된 것일 가능성이 높다. 그런 경우, 프라이머 서열은 기존의 공지 게놈 서열로부터 개발할 수 있다. 당해의 유전자 서열에 인접한 게놈 서열을 얻을 수 없다면, 당해의 유전자 서열에 인접한 공지 폴리뉴클레오티드 서열을 만들 수 있다. 예를 들어, 당해의 유전자를 포함하는 클론을 게놈 라이브러리(코스미드, BAC, YAC 등)에서 선별하고, 이 클론 중의 삽입체의 말단을 서열분석할 수 있다. 또는, 특정 게놈 영역의 제한 효소 지도화를 실시한 다음, 당해 유전자에 인접한 영역을 뉴클레오티드 서열분석할 수 있다. 그 후, 이 서열로부터 프라이머를 유도할 수 있다.

장범위 PCR(Long Range PCR)

본 발명의 일 양태로서, 장범위 PCR을 사용하여 핵산 수집물을 증폭시킨다[예컨대, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9:2216-2220(1994); Blood, 88(3):985-994(1996)]. 최근, 35 kb 이하의 DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 몇몇 열안정성 DNA 폴리머라제가 시판되고 있다. 최고 35 kb의 장거리만큼 이격된 프라이머상을 디자인하면 상당히 큰 영역을 증폭시킬 수 있다.

이러한 대형 핵산을 증폭시키기 위하여, 증폭된 DNA 단편을 제한 효소로 분해한 뒤, 겔 전기영동으로 분석한다. 이 DNA는 에티디움 브로마이드 또는 형광 염료로 겔을 염색하여 검출할 수 있다. 바람직하게는, 영역내 DNA 결실 또는 재배열은 야생형과 비교하여 볼 때, 추가적인 DNA 단편을 만들 수 있다. 장범위 PCR은 유전자 주위의 대형 결실을 검측하는데에도 유용하게 사용된다.

기타 증폭 방법

기타 공지의 증폭 기법을 사용하여 목적 핵산을 동정할 수 있다. 리가제 연쇄 반응(LCR), Qβ-레플리카제 증폭 및 다른 RNA 폴리머라제 매개 기법을 비롯한 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자가 실시하기에 충분한 프로토콜의 예에 대해서는 문헌[Berger, Sambrook, and Ausubel, 및 Arnheim ＆ Levinson(1990. 10.1) C＆EN 37-47; The Journal Of NIH Research(1991) 3: 81-94; (Kwoh et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al.(1989) J.Clin.Chem. 35:1826; Landegren et al.(1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt(1990) Biotechnology 8:291-294; Wu and Wallace(1989) Gene 4:560; and Barringer et al.,(1990) Gene 89:117]에 개시되어 있다. 시험관내 증폭된 핵산을 클로닝하는 개선된 방법에 대해서는 문헌[Wallace et al., 미국 특허 제5,426,039호]를 참조하라.

증폭 생성물의 분석

증폭 생성물의 분석은 샘플(예, 유전자 병변을 포함하는 식물 또는 병변을 포함하는 1 이상의 식물을 보유한 식물 푸울 유래의 생성물) 유래의 증폭 생성물을, 야생형 식물의 유사한 증폭 생성물과 비교하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 증폭 생성물을 길이에 기초하여 분류한다. 야생형 생성물과 비교하였을 때 샘플 증폭 생성물의 크기의 변화는 당해의 유전자 서열에 유전자 병변이 있는 핵산이 그 샘플 중에 존재한다는 것을 시사한다. 예를 들어, 야생형 보다 샘플의 보다 작은 DNA 단편의 증폭은 샘플 유래의 1 이상의 각 식물이 당해의 유전자 서열내에 결실을 보유한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 확인할 수 있는 것으로, 샘플이 핵산 푸울인 경우, 서브푸울 또는 푸울의 각 멤버를 각각 증폭시켜 병변을 보유하는 핵산을 확인할 수 있다. 핵산이 일단 확인되면, 데이터베이스를 사용하여 그 핵산과 관련있는 근원 식물을 동정한다.

증폭 생성물은 전기침투 및 하이브리드화를 비롯한 다수의 기법으로 분석할 수 있다. 증폭 생성물은 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색(예, Sambrook et al. 참조) 및 그 다음 육안 조사를 통해 분석한다.

또는, 겔 상에 존재하는 DNA 단편의 양을 검출 한계량을 증가시키기 위하여 DNA 단편을 서던 블롯팅을 통해 막으로 전이시키고 표적 유전자에 특이적인 방사능 또는 비방사능 프로브와 하이브리드시킨다. 하이브리드화 후, 극소량의 DNA(＜1 pg)는 자동방사능사진 또는 기타 다른 검출 방법을 통해 측정할 수 있다. 민감도의 증가를 위하여, 다수의 DNA 샘플을 하나의 샘플로서 함께 모아 결실 돌연변이를 점검한다. 이러한 양태는 에티디움 브로마이드를 사용하여 증폭 생성물을 명확하게 분리한 뒤 육안 조사하기가 어려운 경우에 특히 유용하다.

하이브리드화

야생형과 유전자의 돌연변이 대립유전자를 보유하는 푸을 간의 차이를 분석하는 또 다른 방법으로는 하이브리드화가 있다. 이 양태에서는, 돌연변이 식물 유래의 핵산 푸울을 제한 효소로 분해하고, 얻어지는 핵산 단편을 전기영동으로 분리한 뒤 블롯팅한다(예, 서던 블롯팅). 예컨대, Sambrook et al. 문헌을 참조하라. 얻어지는 블롯을 이어서 당해 유전자의 프로브로 탐침하고 야생형 핵산의 유사 샘플과 비교한다. 푸울 샘플 중의 프로브가 야생형과 크기가 다른 핵산 단편과 하이브리드한다는 것은 푸울 중에 유전자 병변이 존재한다는 것을 시사한다. 그 다음, 푸울의 각 멤버에 대하여 이 방법을 반복하면 병변을 보유하는 개체를 측정할 수 있다. 전술하였듯이, 핵산이 일단 동정되면 데이터베이스를 사용하여 핵산과 관련있는 근원 식물을 동정한다.

돌연변이체 표현형의 측정

본 발명의 방법에서 표적화된 특정 내인성 서열은 본 발명의 중요한 양태가 아니다. 본 발명을 사용하여 표적화할 수 있는 유전자의 예로는, 병원균(예컨대, 곤충, 진균, 박테리아 및 바이러스)에 대한 내성을 부여하는 유전자, 저장 단백질 유전자, 살충제 내성 유전자 및 오일 생성과 같은 생합성 경로에 관여하는 유전자가 있다. 기타 다른 예로는 사이토크롬 P450 및 관련 효소, 전사 인자, 식물 성장 및 개발에 필수적인 유전자 및 기능이 공지된 유전자의 동족체가 있다.

본 발명의 방법으로 동정되는 식물(예컨대, 돌연변이체)은 자신의 유용한 표현형을 보유할 수 있다. 예를 들어, 특정 생합성 경로 중의 돌연변이는 식물 대사의 유용한 변화를 유도할 수 있다. 또는, 돌연변이체의 표현형이 알려지면, 야생형 유전자의 비정규 또는 이종성 발현을 가정하여 시험한다. 특히, 식물의 표현형을 변화시키는 적당한 유전자 배경을 동정할 수 있다. 예를 들어, 특정 변이유전자의 표현형 발현은 야생형 동족체 또는 오르토로그(ortholog)에 의해 표현되지 않을 수 있다. 일단 돌연변이체 대립유전자의 표현형이 측정되면, 이러한 효과가 제한된 유전자 배경을 동정하는 일이 가능해진다.

다음 실시예는 한정하는 것이 아니라 예시적 목적으로 제공된 것이다.

실시예 1

본 실시예는 유전자 서열 중에 유전자 병변을 보유하는 식물을 샘플 푸울 중에서 동정할 수 있음을 예시한 것이다. 돌연변이 식물의 푸울 개체를 특정 유전자 중의 결실에 대하여 모의 선발하기 위하여, GA1의 gal-3 대립유전자를 보유하는 아라비돕시스 식물 유래의 소량의 DNA[Plant Cell 4:119-128(1992)]를 야생형 DNA와 혼합한 뒤 증폭시켰다. gal-3 대립유전자는 야생형 GA1에 비하여 5kb 결실부를 포함하고 있다. 야생형 아라비돕시스 중에서 약 6.4 kb 정도 떨어져 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 하이브리드하고, gal-3중의 5kb 결실부에 인접한 프라이머를 사용하였다. 5' 프라이머는 cggagaagcttcttctggagtcagag이고, 3' 프라이머는 gcaaacttgatctaccatatgtcatc이다.

야생형 아라비돕시스 DNA 2 ㎍을, 1.5U의 Taq 폴리머라제를 포함하는 25 ㎕ PCR 반응액 중에서 gal-3 DNA 1 ng, 2.5 ng, 5 ng 및 10 ng과 혼합하였다. 이샘플을 다음 조건하에서 증폭시켰다. 반응액을 94 ℃에서 2 분 동안 항온처리한 다음, 94℃ 30초, 65℃ 30초, 및 72℃ 1.5분간의 사이클을 40회 반복하였다. 이 사이클 이후, 72℃에서 7분간 마지막 단계를 처리한다.

얻어지는 생성물을 전기영동으로 분석하고, 그 다음 에티디움 브로마이드로 가시화한다. 매 희석시마다 점점 gal-3 유래의 1.4 kb 생성물이 야생형 6.4 kb DNA 단편이외에 뚜렷하게 검출되었다. 이러한 결과는 최소한 약 2000개의 야생형 식물 중의 하나의 결실이 검출될 수 있다는 것을 시사한다. 즉, 본 발명을 사용하면 최고 2000개 이상의 각 식물의 푸울을 선별하여 당해의 특정 유전자 서열에 병변을 보유하는 단일 개체를 성공적으로 동정할 수 있다.

전술한 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 당업자라면 이하 청구의 범위에 포함되는 본 발명의 기타 다른 변형체를 용이하게 제조할 수 있을 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본 발명의 목적상 본 발명에 참고 인용되었다.

Claims

(a) 유전자 서열 중에 병변이 있는 식물을 포함하는 복수의 근원 식물로부터 핵산 수집물을 제공하는 단계,

(b) 상기 수집물 중의 각 핵산과 상기 근원 식물을 연관짓는 데이터베이스를 제공하는 단계,

(c) 공지의 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드하는 프라이머를 사용하여 핵산 수집물을 증폭시켜, 병변을 보유하는 핵산의 존재를 수집물내에서 검출하는 단계, 및

(d) 상기 데이터베이스를 사용하여 유전자 서열에 병변이 있는 개체의 근원 식물을 동정하여, 결실과 관련된 돌연변이체 표현형이 평가되는 유전자 서열 중에 결실을 보유한 식물을 제공하는 단계를 포함하여,

야생형 염색체 중에 인접해 있는 유전자 서열에 병변을 포함하는 식물을 공지된 폴리뉴클레오티드 서열로 동정하는 방법.
제1항에 있어서, 병변이 결실인 것이 특징인 방법.
제2항에 있어서, 증폭 단계가 신장 단계를 포함하고, 이 신장 단계는 병변을 보유한 핵산을 선택적으로 증폭하도록 단축화된 것임이 특징인 방법.
제3항에 있어서, 신장 단계가 약 72℃에서 약 0.5 내지 약 2분간 실시되는 것이 특징인 방법.
제4항에 있어서, 신장 단계가 72℃에서 약 1.5분간 실시되는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 핵산 수집물이 측정 단계 이전에 푸울로 분할되는 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 각 푸울이 약 100개의 상이한 근원 식물 내지 약 3000개의 상이한 근원 식물 유래의 핵산을 포함하는 것이 특징인 방법.
제6항에 있어서, 각 푸울이 최소 약 1500개의 상이한 근원 식물 유래의 핵산을 포함하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 근원 식물 또는 복수의 근원 식물의 선조들을 돌연변이원과 접촉시키는 것이 특징인 방법.
제9항에 있어서, 돌연변이원이 고속 중성자인 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 야생형 식물 중에서 공지 뉴클레오티드 서열 간의 거리가 약 3 kb 내지 약 7 kb 사이인 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 근원 식물이 쌀, 토마토 및 아라비돕시스 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 복수의 근원 식물이 약 10,000 내지 약 50,000개의 근원 식물인 것이 특징인 방법.
제1항에 기재된 방법에 의해 동정되는 식물.
(a) 유전자 서열 중에 결실을 보유한 식물을 포함하는 복수의 돌연변이 식물 유래의 핵산 수집물을 제공하는 단계,

(b) 상기 수집물 중의 각 핵산과 그 핵산의 근원 식물을 연관짓는 데이터베이스를 제공하는 단계,

(c) (i) (1) 야생형 염색체 중에서 약 3 kb 내지 약 7 kb 떨어진 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드하는 프라이머 및

(2) 유전자 서열내에 존재하거나 유전자 서열에 인접해 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드하는 프라이머를 제공하고,

(ii) 72℃에서 약 0.5 내지 약 2분간의 신장 단계를 포함하여 결실을 포함하는 핵산을 우선적으로 증폭시키는, 핵산 수집물의 증폭 단계,

(d) 이 증폭 생성물과 야생형 식물 유래의 증폭 생성물을 비교하여 결실이 있는 핵산의 존재를 측정하는 단계,

(e) 상기 데이터베이스를 이용하여 유전자 서열 중에 결실을 보유한 복수의식물의 근원 식물을 동정하여, 유전자 서열 중에 결실을 보유한 식물을 얻어 결실과 관련된 돌연변이체의 표현형을 평가하는 단계를 포함하여,

야생형 염색체에 인접해있는 유전자 서열 중에 결실을 포함하는 식물을 공지의 폴리뉴클레오티드 서열로 동정하는 방법.