JP2023502779A - 化合物のヒドロキシル化のための生体触媒および方法 - Google Patents
化合物のヒドロキシル化のための生体触媒および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023502779A JP2023502779A JP2022530236A JP2022530236A JP2023502779A JP 2023502779 A JP2023502779 A JP 2023502779A JP 2022530236 A JP2022530236 A JP 2022530236A JP 2022530236 A JP2022530236 A JP 2022530236A JP 2023502779 A JP2023502779 A JP 2023502779A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- engineered
- polypeptide
- proline hydroxylase
- proline
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
- C12Y114/11002—Procollagen-proline dioxygenase (1.14.11.2), i.e. proline-hydroxylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、ヒドロキシル化化合物の産生のための操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド、操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、操作されたプロリンヒドロキシラーゼを発現することができる宿主細胞、および操作されたプロリンヒドロキシラーゼを使用して、活性医薬剤の産生において有用な化合物を調製する方法を提供する。1種または複数の改善された特性を有する操作された酵素は、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼと比較して、1個または複数の残基差異を有し、残基差異は、前述の酵素特性のうち1種または複数に影響を与える残基位置において存在する。
Description
本願は、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれる、2019年11月26日に出願された米国仮特許出願第62/940,647号に対する優先権を主張するものである。
技術分野
本発明は、化合物のヒドロキシル化のための生体触媒に関する。
本発明は、化合物のヒドロキシル化のための生体触媒に関する。
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の公式のコピーは、本明細書と同時に、ASCIIフォーマットのテキストファイルとして、EFS-Web経由で、「CX2-193WO1_ST25.txt」のファイル名、2020年11月17日の作成日および1.39メガバイトのサイズで提出される。EFS-Web経由で出願された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の公式のコピーは、本明細書と同時に、ASCIIフォーマットのテキストファイルとして、EFS-Web経由で、「CX2-193WO1_ST25.txt」のファイル名、2020年11月17日の作成日および1.39メガバイトのサイズで提出される。EFS-Web経由で出願された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
プロリンの制約されたコンフォメーションのため、環炭素に官能基を有するプロリン誘導体は、医薬化合物の合成に有用な構成要素である。斯かる誘導体の1つであるヒドロキシル化プロリンは、カルバペネム系抗生物質(例えば、Altamura et al., J. Med., Chem. 38(21):4244-56 [1995]を参照)、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤(例えば、Chen et al., J. Org. Chem., 67(8):2730-3 [2002];Chen et al., 2006, J Med Chem. 49(3):995-1005を参照)、核酸アナログ(例えば、Efimov et al., Nucleic Acids Res., 34(8):2247-2257 [2006]を参照)、イソプレニルトランスフェラーゼ阻害剤(O’Connell et al., Chem. Pharm. Bull., 48(5):740-742 [2000])および薬物ライブラリー構築(Vergnon et al., J. Comb. Chem., 6(1):91-8 [2004];およびRemuzon, Tetrahedron 52:13803-13835 [1996])を含む、様々な治療用化合物の合成のための出発材料である。
プロリンの制約されたコンフォメーションのため、環炭素に官能基を有するプロリン誘導体は、医薬化合物の合成に有用な構成要素である。斯かる誘導体の1つであるヒドロキシル化プロリンは、カルバペネム系抗生物質(例えば、Altamura et al., J. Med., Chem. 38(21):4244-56 [1995]を参照)、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤(例えば、Chen et al., J. Org. Chem., 67(8):2730-3 [2002];Chen et al., 2006, J Med Chem. 49(3):995-1005を参照)、核酸アナログ(例えば、Efimov et al., Nucleic Acids Res., 34(8):2247-2257 [2006]を参照)、イソプレニルトランスフェラーゼ阻害剤(O’Connell et al., Chem. Pharm. Bull., 48(5):740-742 [2000])および薬物ライブラリー構築(Vergnon et al., J. Comb. Chem., 6(1):91-8 [2004];およびRemuzon, Tetrahedron 52:13803-13835 [1996])を含む、様々な治療用化合物の合成のための出発材料である。
ヒドロキシプロリンは、植物材料およびコラーゲンの加水分解物等、天然の供給源から得ることができる。ヒドロキシプロリンは、出発材料、臭化アリルおよびジエチルアセトアミドマロン酸(diethylacetamidomalonic acid)(Kyun Lee et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 46:2924 [1973])、D-グルタミン酸(Eguchi et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 47:1704-08 [1974])、グリオキサールおよびオキサロ酢酸(Ramaswamy et al., J. Org. Chem., 42(21):3440-3443 [1977])、ならびにα-アラニン(Sinha et al., Proc. ECSOC-4, The Fourth International Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry, ISBN 3-906980-05-7 [2000])等から、化学合成することもできる。
天然の供給源からの単離は、原材料の利用可能性によって限定され、相当量のバックグラウンド夾雑物からの精製を要求し、ある特定の所望のジアステレオマーを欠如する。化学合成方法は、複雑なステップを要求し、産業スケールレベルまでスケールアップすることが困難となり、複数のヒドロキシル化産物の形成が原因で追加的な精製ステップを要求する場合がある。
ヒドロキシル化プロリンを調製するための別のアプローチは、2-オキソグルタレート(α-ケトグルタレート)およびO2を補助基質として、二価鉄イオンを補助因子として利用する2-オキソグルタレート依存性ジオキシゲナーゼである、プロリンヒドロキシラーゼを使用する(例えば、Klein et al., Adv. Synth. Catal., 353:1375-1383 [2011];米国特許第5,364,775号;およびShibasaki et al., Appl. Environ. Microbiol., 65(9):4028-4031 [1999]を参照)。プロコラーゲンおよび関連ペプチドにおけるペプチジルプロリンを特異的に認識するプロリルヒドロキシラーゼとは異なり、プロリンヒドロキシラーゼは、遊離プロリンをヒドロキシプロリンに変換することができる。シス-3-、シス-4-またはトランス-4-ヒドロキシプロリンを産生するいくつかの微生物酵素は、当技術分野で公知であり(例えば、米国特許第5,962,292号、同第5,963,254号および同第5,854,040号;WO2009139365;ならびにEP2290065を参照)、トランス-3-ヒドロキシプロリンを産生する酵素は、真菌の抽出物において同定された。プロリンヒドロキシラーゼの多くは、細菌および真菌において見出され、細菌および真菌において、これらはペプチド抗生物質の生合成に関連する。
トランス-3-ヒドロキシプロリンに対して選択的である天然のプロリンヒドロキシラーゼは、当技術分野で公知ではない。Glarea lozoyensis由来の真菌プロリンヒドロキシラーゼであるGloFは、主要異性体トランス-4-ヒドロキシプロリンと共に、微量異性体としてトランス-3-ヒドロキシプロリンを産生する(Petersen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 62, 263;Houwaart et al., ChemBioChem 2014, 15, 2365)。GloFとおよそ64%の配列同一性を共有する、Emericella rugulosa NRRL 11440由来の別の真菌プロリンヒドロキシラーゼであるHtyEは、エキノキャンディンB生合成遺伝子クラスターの一部として報告された(Cacho et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 16781)。HtyEは、主要異性体トランス-4-ヒドロキシプロリンと共に、微量異性体としてトランス-3-ヒドロキシプロリンを産生することも見出された。近年、3種のヒドロキシラーゼ遺伝子を含む遺伝子クラスターが、真菌sp.11243において同定されており(Matsui et al., J. Biosci. Bioeng. 2017, Feb; 123(2): 147-153)、1種の遺伝子はその後、HtyEに対する相同性を有すると同定された。
クローニングされたプロリンヒドロキシラーゼを発現する組換え細胞全体は、ラージスケールの産業プロセスにさらに適しているが、細胞全体の使用は、高い基質濃度等の反応条件の変動を限定し;使用することができる基質の型を、細胞に対して透過性である型に制限し;最終産物から分離しなければならない望ましくない副産物をもたらす。加えて、タンパク質加水分解物から調製された富栄養成長培地の使用は、プロリン以外の基質が標的とされる場合に競合的阻害剤となり得る遊離プロリンを含有するため、in vivo系は、最適でもなければ対費用効果が高くもない規定された成長培地を要求し得る。容易にスケールアップすることができ、かつ実質的に純粋な異性体産物をもたらすことができる、ヒドロキシル化形態のプロリンおよびプロリンアナログならびに他の化合物を合成するための代替方法が必要である。
クローニングされたプロリンヒドロキシラーゼを発現する組換え細胞全体は、ラージスケールの産業プロセスにさらに適しているが、細胞全体の使用は、高い基質濃度等の反応条件の変動を限定し;使用することができる基質の型を、細胞に対して透過性である型に制限し;最終産物から分離しなければならない望ましくない副産物をもたらす。加えて、タンパク質加水分解物から調製された富栄養成長培地の使用は、プロリン以外の基質が標的とされる場合に競合的阻害剤となり得る遊離プロリンを含有するため、in vivo系は、最適でもなければ対費用効果が高くもない規定された成長培地を要求し得る。容易にスケールアップすることができ、かつ実質的に純粋な異性体産物をもたらすことができる、ヒドロキシル化形態のプロリンおよびプロリンアナログならびに他の化合物を合成するための代替方法が必要である。
Cachoら、J.Am.Chem.Soc.(2012)134、16781
Matsuiら、J.Biosci.Bioeng.(2017)123(2):147~153
発明の概要
本発明は、操作されたプロリンヒドロキシラーゼ生体触媒、生体触媒をコードするポリヌクレオチド、それらの調製方法、およびこのような操作された生体触媒を使用してヒドロキシル化化合物を調製するためのプロセスを提供する。本発明のプロリンヒドロキシラーゼは、真菌種番号(sp. No.)11243由来のANO11243の天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼ(N末端hisタグが付加された配列番号2)と比べて、1種または複数の改善された特性を有するように操作された。操作されたプロリンヒドロキシラーゼの改善された生体触媒特性は、とりわけ、活性、基質許容範囲(substrate tolerance)、立体選択性、位置選択性および熱安定性を含む。操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、アルファ-ケトグルタレートを補助基質として使用したL-プロリンのトランス-3-ヒドロキシプロリンへのヒドロキシル化を含む、種々の基質化合物をヒドロキシル化することも見出された。一部の実施形態では、プロセスは、酸素(すなわち、空気)および鉄(すなわち、Fe(II))の存在下で行われる。
1種または複数の改善された特性を有する操作された酵素は、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼと比較して、1個または複数の残基差異を有し、残基差異は、前述の酵素特性のうち1種または複数に影響を与える残基位置において存在する。
本発明は、操作されたプロリンヒドロキシラーゼ生体触媒、生体触媒をコードするポリヌクレオチド、それらの調製方法、およびこのような操作された生体触媒を使用してヒドロキシル化化合物を調製するためのプロセスを提供する。本発明のプロリンヒドロキシラーゼは、真菌種番号(sp. No.)11243由来のANO11243の天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼ(N末端hisタグが付加された配列番号2)と比べて、1種または複数の改善された特性を有するように操作された。操作されたプロリンヒドロキシラーゼの改善された生体触媒特性は、とりわけ、活性、基質許容範囲(substrate tolerance)、立体選択性、位置選択性および熱安定性を含む。操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、アルファ-ケトグルタレートを補助基質として使用したL-プロリンのトランス-3-ヒドロキシプロリンへのヒドロキシル化を含む、種々の基質化合物をヒドロキシル化することも見出された。一部の実施形態では、プロセスは、酸素(すなわち、空気)および鉄(すなわち、Fe(II))の存在下で行われる。
1種または複数の改善された特性を有する操作された酵素は、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼと比較して、1個または複数の残基差異を有し、残基差異は、前述の酵素特性のうち1種または複数に影響を与える残基位置において存在する。
したがって、一態様では、本発明は、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号6~658の範囲内の偶数番号の配列において示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。下記の詳細な説明は、所望の改善された生体触媒特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼの調製に使用することができる残基差異の選択に関するガイダンスを提供する。
本発明は、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21、28、58/247、65、80、85、95、98、117、120、159、185、194、199、200、233、237、243、250、268、281、282、287、289、307、324、326、327、330、338、343、346および348から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21、28、45、65、95、112、117、139、177、185、199、233、243、250、281、282、287、289、307、324、326、327、335、338、343および346から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに48/66/189/194、48/66/194および66/82/85/135/189/194/267から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに20/56/76/168/169/296、20/56/232/294、20/119/294/296、56/76/119/124/147/232、56/76/294、76/168/232/294、76/294/296、76/296、147および232から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号4~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明は、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに123、189、195、233および296から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに20/21/56、20/21/56/76/95/232/294/307/335、20/21/56/76/147/225/232/233/281/294/296/307/335、20/21/56/95/147/281/294/307、20/21/56/281/307、20/21/76/232/243、20/21/95/232/307、20/21/95/281/294/296、20/21/147/189/233/243/281/307、20/56、20/56/76/95/281/307、20/56/76/147/294/296/307、20/56/95/147/294、20/56/281、20/76、20/76/95/281/294/296、20/76/95/281/296/307、20/76/233/294/307、20/76/243/281/294、21/76/147/233/294/307、21/76/147/243/296/307/335、21/95/185/189/232/281/296、21/95/233/243/281/296、21/95/294/296/307/335、21/95/307、21/281/307、29/76/281、56/76/95/232/243/281、56/76/147/281/307、56/76/243/294、56/76/281/294、56/76/296、56/76/307、56/95/147/307/335/348、56/95/232/233/281/294/307、56/95/243/281、56/147/281、56/232/243/281、56/232/281、56/232/281/294/296、56/233/281/294/296、56/281/307、76/95/232/243/281/307、76/95/243/281/307/335、76/95/294/307、76/147、76/147/233/243/294、76/147/233/281/294/307、76/147/243/294/296/307/335、76/147/281/307、76/189/296、76/232/233/243/294/296/307、76/281、76/281/294、76/294/296、95/120、95/147/335、95/232/243/281/294/307、95/232/281/294/296、95/281/294/296、95/335、147、147/225/232/243/281/296/307/335、147/233/243/281/307、147/233/281/307/335、147/243/281、147/307、232/233/281/294/296/307、232/281、232/284/307、233/243/281/296/307/335、233/281/296/307、243/281/294/296、281、281/294、281/307、307および335から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21/76/147/243/296/307/335、56/76/147/281/307および95/147/335から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号4~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明は、配列番号162に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号162に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに2/85/123/237、28/115/117/120/123/268/270/343/346/348、45/123/326、65/117/120/123/343/346、85/123/281/282、114/115/117/120/123/268/271/313/326/343/346、123/139/233/237/281/282/289/324/326および123/199/200/247/250/338から選択される残基位置における、配列番号162と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号6~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明は、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに26、54、61、129、132、149、156、175、189、201、209、228、236、248、262、272、277、291および345から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに25、43、54、58、61、79、129、132、143、156、163、175、179、201、209、236、248、278、291、345および347から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに85/117/120/135/208/270/324/343/346、85/117/120/135/208/281/282/289、85/117/120/270/281/289、85/117/135/139/208および117/120/208/270/324/343/346から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号6~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明は、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47、48、56/118、85、95、95/289、113、118、118/247、154、162、162/204、164、164/198/271、168、169、187、195、243、271、275、281、314、330および342から選択される残基位置における、配列番号412と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに25/129/163/236/262/345/347、120/156/175/179/201、129/189/236/262/277/278、129/236/262、156/175/179/228および162から選択される残基位置における、配列番号412と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号6~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明は、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15、17、28、29、65、135、167、177、199、208、228、235、287、294、307および343から選択される残基位置における、配列番号492と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに85/187/281/347、85/187/347、118/120/162/175/179/330、118/120/162/175/330、162/175/179/330、175/228/330、195/347および278/314/347から選択される残基位置における、配列番号492と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号6~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明は、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15、40、43、44、59、79、82、149、164、179、345および347から選択される残基位置における、配列番号562と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに29/85/177/208/228/347、29/85/208/228/343/347、29/177/195/228/343、29/208/228/278/294/347、56/195/278、85/187/205/208/278、113/177/187/195/208/278/294/343/347および177/205/208/228から選択される残基位置における、配列番号562と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号6~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明は、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47、162、209、219、227および342から選択される残基位置における、配列番号598と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに17/44/179/195/250/313/345、17/44/199/313、43/44/195/199、44/149/164/171/187、44/179/195/199、44/179/195/199/345、79/163/164/171/187/201/286/288、82/163/164、82/163/164/171/187/201/203/208/286/288/320、149/164/171/288および187/286から選択される残基位置における、配列番号598と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号6~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明は、配列番号630に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号630に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに82/164/171/203/208、135/163/164/201/203/208、162、162/219/236、162/219/313/338、162/236/342、162/313/342および164/171/201/203/282から選択される残基位置における、配列番号630と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号6~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。
本発明はまた、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、天然に存在する酵素の活性の少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍またはそれよりも高い活性で、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高いトランス-3-ヒドロキシプロリンの異性体過剰率(isomeric excess)で、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる。
本発明はまた、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、E.coliにおける発現のために最適化された核酸配列を含む。
本発明はさらに、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、少なくとも1種の制御配列を含む。
本発明はまた、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、E.coliである。
本発明はさらに、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを調製する方法であって、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチド(複数可)の発現に適した条件下で培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、操作されたポリペプチド(複数可)を単離するステップをさらに含む。
発明の説明
他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意義と同じ意義を有する。一般に、本明細書で使用されている命名法、ならびに後述する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の研究室手順は、当技術分野で周知かつ一般的に用いられているものである。斯かる技法は、周知であり、当業者にとって周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準技法またはその修正は、化学合成および化学分析に使用されている。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。
他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意義と同じ意義を有する。一般に、本明細書で使用されている命名法、ならびに後述する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の研究室手順は、当技術分野で周知かつ一般的に用いられているものである。斯かる技法は、周知であり、当業者にとって周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準技法またはその修正は、化学合成および化学分析に使用されている。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されている方法および材料と同様のまたは均等ないかなる適した方法および材料も、本発明の実施において用途を見出すが、一部の方法および材料が、本明細書に記載されている。記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は、当業者によって使用されている文脈に応じて変動し得るため、本発明が、これらに限定されないことを理解されたい。したがって、すぐ下で定義される用語は、全体として本発明を参照することによって、さらに十分に説明される。
前述の概説および下記の詳細な説明の両方が、単に例示的かつ説明的であり、本発明を制限するものではないことを理解されたい。
本明細書で使用されているセクションの見出しは、単なる組織化を目的としており、記載されている主題を限定するものとして解釈するべきではない。
数的範囲は、範囲を定義する数を包括する。よって、本明細書に開示されている全ての数値的範囲は、あたかもより狭い数値的範囲が全て本明細書に明確に書かれているかのように、当該のより広い数値的範囲内に納まる全ての斯かるより狭い数値的範囲を包含することが意図される。本明細書に開示されている全ての最大(または最小)の数値的限界が、あたかも数値的下限(または上限)が本明細書に明確に書かれているかのように、斯かる全ての数値的下限(または上限)を含むことも意図される。
3文字略語が使用される場合、「L」もしくは「D」が特に先行しなければ、またはこの略語が使用されている文脈から明らかでなければ、アミノ酸は、α-炭素(Cα)に関してL-またはD-立体配置のいずれかであり得る。例えば、「Ala」は、α-炭素に関して立体配置を指定することなくアラニンを指定する一方で、「D-Ala」および「L-Ala」は、それぞれD-アラニンおよびL-アラニンを指定する。1文字略語が使用される場合、大文字は、α-炭素に関してL-立体配置のアミノ酸を指定し、小文字は、α-炭素に関してD-立体配置のアミノ酸を指定する。例えば、「A」は、L-アラニンを指定し、「a」は、D-アラニンを指定する。ポリペプチド配列が、1文字または3文字略語(またはこれらの混合物)の列として提示される場合、配列は、一般的慣習に従ってアミノ(N)からカルボキシ(C)への方向で提示される。
遺伝的にコードするヌクレオシドのために使用されている略語は、従来通りであり、次の通りである:アデノシン(A);グアノシン(G);シチジン(C);チミジン(T);およびウリジン(U)。特に描写されていない限り、省略されたヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは2’-デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個々の基準または総計の基準で、リボヌクレオシドまたは2’-デオキシリボヌクレオシドのいずれかとして指定することができる。核酸配列が、1文字略語の列として提示される場合、配列は、一般的慣習に従って5’から3’への方向で提示され、リン酸は、指し示されない。
定義
本発明に関して、本明細書における記載に使用されている技術および科学用語は、他に特に規定がなければ、当業者によって一般的に理解されている意義を有するであろう。したがって、次の用語は、次の意義を有することが意図される。
本発明に関して、本明細書における記載に使用されている技術および科学用語は、他に特に規定がなければ、当業者によって一般的に理解されている意義を有するであろう。したがって、次の用語は、次の意義を有することが意図される。
本明細書で使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそれ以外のことを明らかに指し示さない限り、複数形の指示対象を含む。よって、例えば、「1つのポリペプチド(a polypeptide)」の参照は、1つより多くのポリペプチドを含む。
同様に、「を含む(comprise)」、「を含む(comprises)」、「を含む(comprising)」、「を含む(include)」、「を含む(includes)」および「を含む(including)」は、互換的であり、限定を意図するものではない。よって、本明細書で使用される場合、用語「を含む(comprising)」およびその同族語は、その包括的な意味で使用される(すなわち、用語「を含む(including)」およびその対応する同族語と同等である)。
様々な実施形態の記載が、用語「を含む(comprising)」を使用する場合、当業者であれば、一部の特異的な例では、実施形態を、その代わりに、言葉「から本質的になる」または「からなる」を使用して記載することができることを理解するであろうことをさらに理解されたい。
用語「約」は、特定の値に許容できる誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値範囲の0.05%、0.5%、1.0%または2.0%以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の1、2、3または4標準偏差以内を意味する。
「EC」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(NC-IUBMB)の酵素命名法を指す。IUBMB生化学的分類は、酵素のための数値的分類体系であり、それが触媒する化学反応に基づく。
「ATCC」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)を指し、そのバイオレポジトリー収集物は、遺伝子および株を含む。
「NCBI」は、アメリカ国立生物工学情報センター(National Center for Biological Information)およびそこで提供される配列データベースを指す。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)に関係なく、アミド結合によって共有結合により連結された少なくとも2個のアミノ酸のポリマーを表示するように本明細書で互換的に使用されている。この定義の内には、D-およびL-アミノ酸ならびにD-およびL-アミノ酸の混合物、ならびにD-およびL-アミノ酸ならびにD-およびL-アミノ酸の混合物を含むポリマーが含まれている。
「アミノ酸」は、IUPAC-IUB生化学命名法委員会(Biochemical Nomenclature Commission)によって推奨される、その一般的に公知の3文字記号または1文字記号のいずれかで本明細書において参照される。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に受け入れられる一文字コードで参照することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合により一体に連結された2個またはそれよりも多いヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチドで構成されていても(すなわち、RNA)、完全に2’デオキシリボヌクレオチドで構成されていても(すなわち、DNA)、またはリボ-および2’デオキシリボヌクレオチドで構成されている混合物であってもよい。ヌクレオシドは、典型的には、標準ホスホジエステル連結を介して一体に連結されるであろうが、ポリヌクレオチドは、1個または複数の非標準連結を含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得る、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含むことができる。さらに、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基(すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン)で構成されるであろうが、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン等、1個または複数の修飾されたおよび/または合成の核酸塩基を含むことができる。一部の実施形態では、斯かる修飾されたまたは合成の核酸塩基は、アミノ酸配列をコードする核酸塩基である。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸の部分(例えば、遺伝子)を指す。
プロリンヒドロキシラーゼが、プロリンとの前述の反応に限定されないが、他の基質をヒドロキシル化することができる、またはヒドロキシプロリンの様々な異性体、例えばトランス-3-ヒドロキシプロリンを産生することができることを理解されたい。プロリンヒドロキシラーゼは、本明細書で使用される場合、天然に存在する(野生型)プロリンヒドロキシラーゼと共に、ヒトによる操作によって生成された天然に存在しない操作されたポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本発明のプロリンヒドロキシラーゼバリアントは、下のスキーム1に示す通り、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる:
プロリンヒドロキシラーゼの「補助基質」は、α-ケトグルタレート、ならびにプロリンおよびプロリン基質アナログのヒドロキシル化においてα-ケトグルタレートに取って代わることができる、補助基質アナログを指す。補助基質アナログは、限定ではなく例として、2-オキソアジペート(oxoadipate)を含む(例えば、Majamaa et al., Biochem. J., 229:127-133 [1985]を参照)。
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、自然界で見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界における供給源から単離され得る、また、ヒトによる操作によって意図的に修飾されていない、生物に存在する配列である。
「組換え」または「操作された」または「天然に存在しない」は、細胞、核酸またはポリペプチドを参照して使用される場合、修飾されなければ自然界には存在しない様式で修飾された、材料、または材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸またはポリペプチドと同一であるが、合成材料からおよび/または組換え技法を使用した操作によって産生されるまたはこれに由来する。非限定的な例は、とりわけ、細胞のネイティブ(非組換え)形態の内には見出されない遺伝子を発現する、または他の点で異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する組換え細胞を含む。
用語「パーセント(%)配列同一性」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の比較を指すように本明細書で使用されており、2種の最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたり比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2種の配列の最適な整列のために、参照配列と比較して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に100を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。その代わりに、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップありで整列される場合の当該位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に100を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。当業者は、2種の配列の整列に利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認める。比較のための配列の最適な整列は、当技術分野で公知の通り、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981])、NeedlemanおよびWunschの相同性整列アルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970])、PearsonおよびLipmanの類似性検索方法(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988])、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理されたインプリメンテーション(例えば、GCG Wisconsin Software PackageにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)、または目視検査を含むがこれらに限定されない、いずれか適した方法によって行うことができる。パーセントの配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例は、Altschulらによって記載されたBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムを含むがこれらに限定されない(それぞれAltschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990];およびAltschul et al., Nucl. Acids Res., 3389-3402 [1977]を参照)。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)ウェブサイト経由で公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列されたときにある正の値の閾値スコアTにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列における長さWの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア(HSP)を先ず同定するステップを含む。Tは、近隣ワードスコア閾値と称される(Altschul et al.、上記を参照)。このような初期近隣ワードヒットは、これを含有するより長いHSPを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次に、ワードヒットは、累積的整列スコアが増加し得る限りにおいて、各配列に沿って両方向に伸長される。累積的スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターM(マッチする残基のペアのためのスコアを与える;常に>0)およびN(ミスマッチする残基のためのペナルティスコア;常に<0)を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積的スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、次の場合に停止される:累積的整列スコアが、その最大達成値から量Xだけ下落する;累積的スコアが、1または複数の負のスコアリング残基整列の蓄積により、ゼロもしくはそれ未満になる;またはどちらかの配列の終わりに達する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、整列の感度およびスピードを決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとして、11のワード長さ(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長さ(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]を参照)。配列整列および%配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用した、GCG Wisconsin Software package(Accelrys、Madison WI)におけるBESTFITまたはGAPプログラムを用いることができる。
「参照配列」は、配列および/または活性比較のための基準として使用される、定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも20ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも25残基の長さ、少なくとも50残基の長さ、少なくとも100残基の長さ、または全長の核酸もしくはポリペプチドである。2種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、(1)2種の配列の間で同様である配列(すなわち、完全配列の部分)を含むことができ、(2)2種の配列の間で多岐にわたる配列をさらに含むことができるため、2種の(またはそれよりも多い)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は典型的に、「比較ウィンドウ」にわたる2種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことができ、参照配列は、一次配列に1個または複数の変化を有することができる配列である。
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約20個の近接ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも20個の近接ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウにおける配列の部分は、2種の配列の最適な整列のために、参照配列(付加も欠失も含まない)と比較して、20パーセントまたはそれ未満の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。比較ウィンドウは、20個の近接残基よりも長くなることができ、必要に応じて30、40、50、100個またはそれよりも長いウィンドウを含む。
「に対応する」、「を参照して」または「と比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの文脈において使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される際の、指定の参照配列の残基のナンバリングを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によるのではなく、参照配列に関して指定される。例えば、操作されたプロリンヒドロキシラーゼのもの等、所与のアミノ酸配列は、2種の配列の間の残基マッチを最適化するためのギャップを導入することにより、参照配列と整列することができる。このような場合、ギャップが存在するものの、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基のナンバリングは、これが整列された参照配列に関して為すことができる。
「実質的同一性」は、少なくとも20残基位置の比較ウィンドウにわたり、高頻度で、少なくとも30~50残基のウィンドウにわたり参照配列と比較して、少なくとも80パーセントの配列同一性、少なくとも85パーセントの同一性、少なくとも89~95パーセントの配列同一性の間、またはより通常は、少なくとも99パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性のパーセンテージは、比較のウィンドウにわたり参照配列の総計で20パーセントまたはそれ未満になる欠失または付加を含む配列と参照配列とを比較することにより計算される。ポリペプチドに適用される一部の特異的な実施形態では、用語「実質的同一性」は、2種のポリペプチド配列が、デフォルトギャップウエイトを使用したプログラムGAPまたはBESTFIT等により最適に整列された場合に、少なくとも80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも89パーセントの配列同一性または少なくとも95パーセントの配列同一性またはそれよりも多く(例えば、99パーセントの配列同一性)を共有することを意味する。一部の実施形態では、比較されている配列における同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸差異」および「残基差異」は、参照配列の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差異の位置は一般に、「Xn」と本明細書で称され、nは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す。例えば、「配列番号4と比較したX93位における残基差異」は、配列番号4の93位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。よって、配列番号4の参照ポリペプチドが、93位にセリンを有する場合、「配列番号4と比較したX93位における残基差異」は、配列番号4の93位に対応するポリペプチドの位置におけるセリン以外のいずれかの残基のアミノ酸置換を指す。本明細書における大部分の例では、ある位置における具体的なアミノ酸残基差異は、「XnY」として指し示され、「Xn」は、上に記載されている通りの対応する位置を指定し、「Y」は、操作されたポリペプチドに見出されるアミノ酸の一文字識別子(すなわち、参照ポリペプチドにおける残基とは異なる残基)である。一部の例では(例えば、表4.1、4.2、4.3、4.4、5.1、5.2、5.3、6.1、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、9.1、9.2、10.1、10.2、11.1、11.2および/または12.1における)、本発明はまた、従来の表記法「AnB」によって表示される具体的なアミノ酸差異を提供し、Aは、参照配列における残基の一文字識別子であり、「n」は、参照配列における残基位置の番号であり、Bは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の一文字識別子である。一部の例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比べた残基差異が存在する指定の位置のリストによって指し示される、参照配列と比べた1個または複数のアミノ酸残基差異を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドの特異的な残基位置において1個より多くのアミノ酸を使用することができる場合、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「/」によって分離される(例えば、X307H/X307PまたはX307H/P)。スラッシュを使用して、所与のバリアント内の複数の置換を指し示すこともできる(すなわち、コンビナトリアルバリアントなどの所与の配列に1個より多くの置換が存在する)。一部の実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む1個または複数のアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。一部の追加的な実施形態では、本発明は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、残基の、同様の側鎖を有する異なる残基による置換を指し、よって、典型的には、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、アミノ酸の同じまたは同様の定義されたクラス内のアミノ酸による置換を含む。限定ではなく例として、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン)に置換される;ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、セリンおよびスレオニン)に置換される;芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン)に置換される;塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性(basis)側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、リシンおよびアルギニン)に置換される;酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)に置換される;および/または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性アミノ酸に置き換えられる。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく定義された群間のアミノ酸を使用することができ、(a)置換の領域におけるペプチド骨格の構造(例えば、グリシンに代えたプロリン)(b)電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のかさに影響を与える。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸に置換された酸性アミノ酸;小型のアミノ酸に置換された芳香族アミノ酸;および疎水性アミノ酸に置換された親水性アミノ酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの1個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドに対する修飾を指す。欠失は、操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素の酵素活性を保持したままおよび/または改善された特性を保持したままでの、1個もしくは複数のアミノ酸、2個もしくはそれよりも多いアミノ酸、5個もしくはそれよりも多いアミノ酸、10個もしくはそれよりも多いアミノ酸、15個もしくはそれよりも多いアミノ酸または20個もしくはそれよりも多いアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大で10%、またはアミノ酸の総数の最大で20%の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内側部分および/または末端部分へと方向付けることができる。様々な実施形態では、欠失は、連続したセグメントを含むことができる、または不連続であり得る。
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドからの、1個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドに対する修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内側部分において、またはカルボキシもしくはアミノ末端へと為すことができる。挿入は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の通り、融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の近接セグメントであり得る、または天然に存在するポリペプチドにおけるアミノ酸の1個もしくは複数によって分離されていてよい。
本明細書で互換的に使用される「機能的断片」または「生物学的活性断片」は、アミノ末端および/もしくはカルボキシ末端欠失(複数可)ならびに/または内側欠失を有するが、残っているアミノ酸配列が、これが比較されている配列(例えば、本発明の全長の操作されたプロリンヒドロキシラーゼ)における対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持する、ポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然ではこれに付随する他の夾雑物(例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド)から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系(例えば、宿主細胞内のまたはin vitro合成による)から除去または精製されたポリペプチドを包括する。組換えプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、細胞内に存在することができる、細胞培地中に存在することができる、またはライセートもしくは単離された調製物などの様々な形態で調製することができる。したがって、一部の実施形態では、組換えプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢種である(すなわち、モル濃度または重量基準で、組成物中の他のいずれかの個々の高分子種よりも豊富である)組成物を指し、一般に、目標の種が、モルまたは%重量で、存在する高分子種の少なくとも約50パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。しかし、一部の実施形態では、プロリンヒドロキシラーゼを含む組成物は、50%未満純粋(例えば、約10%、約20%、約30%、約40%または約50%)であるプロリンヒドロキシラーゼを含む。一般に、実質的に純粋なプロリンヒドロキシラーゼ組成物は、組成物中に存在するモルまたは%重量で全高分子種の約60%またはそれよりも高く、約70%またはそれよりも高く、約80%またはそれよりも高く、約90%またはそれよりも高く、約95%またはそれよりも高く、および約98%またはそれよりも高くを構成する。一部の実施形態では、目標の種は、本質的な均一性となるまで精製され(すなわち、夾雑物種は、従来の検出方法によって組成物において検出することができない)、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子(<500ダルトン)および元素イオン種は、高分子種と考慮されない。一部の実施形態では、単離された組換えプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、酵素の少なくとも1種の改善された特性を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドおよび/または野生型プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドおよび/または別の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドと比較して、いずれかの酵素特性における改善を示す、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを提供する。よって、「改善」のレベルを決定し、野生型と共に操作されたプロリンヒドロキシラーゼを含む様々なプロリンヒドロキシラーゼ酵素の間で比較することができる。改善された特性は、増加したタンパク質発現、増加した熱活性(thermoactivity)、増加した熱安定性、増加したpH活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、基質または最終生成物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学的安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性pHに対する増加した耐性、塩基性pHに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性(すなわち、タンパク質分解に対する低下した感受性)、低下した凝集、増加した溶解度、および変更された温度プロファイル等の特性を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、参照プロリンヒドロキシラーゼ酵素と比較した、比活性(例えば、産生された産物/時間/重量タンパク質)の増加または基質から産物へのパーセント変換(例えば、指定の量のプロリンヒドロキシラーゼを使用した、指定の期間における基質の出発量から産物のパーセント変換)の増加によって表すことができる、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供されている。Km、Vmaxまたはkcatの古典的酵素特性を含む、酵素活性に関するいずれかの特性が影響され得、それらの変化は、増加した酵素活性をもたらし得る。酵素活性における改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約1.1倍から、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドが由来する天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼまたは別の操作されたプロリンヒドロキシラーゼの2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍またはそれよりも高い酵素活性もの大きさであり得る。
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質(複数可)から対応する産物(複数可)への酵素変換(または生体内変換)を指す。「パーセント変換」は、指定の条件下である期間内に産物に変換された基質のパーセントを指す。よって、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間における基質から産物への「パーセント変換」として表現することができる。
「ゼネラリスト(generalist)特性」を有する酵素(または「ゼネラリスト酵素」)は、親配列と比較して、広範囲の基質に対して改善された活性を示す酵素を指す。ゼネラリスト酵素は、全ての可能な基質に対して改善された活性を必ずしも実証しない。一部の実施形態では、本発明は、広範囲の立体的におよび電子的に多様な基質に対して親遺伝子と比べて同様のまたは改善された活性を実証するという点において、ゼネラリスト特性を有するプロリンヒドロキシラーゼバリアントを提供する。加えて、本明細書に提供されるゼネラリスト酵素を、広範囲の多様なAPI様分子にわたり改善されるように操作して、代謝物/産物の産生を増加させた。
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸ハイブリッドが安定である条件を指すように本明細書で使用されている。当業者にとって公知の通り、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度(Tm)において反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、G/C含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのTm値は、融解温度を予測するための公知方法を使用して計算することができる(例えば、Baldino et al., Meth. Enzymol., 168:761-777 [1989];Bolton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390 [1962];Bresslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8893-8897 [1986];Freier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-9377 [1986];Kierzek et al., Biochem., 25:7840-7846 [1986];Rychlik et al., Nucl. Acids Res., 18:6409-6412 [1990](誤植、Nucl. Acids Res., 19:698 [1991]);Sambrook et al.、上記);Suggs et al., 1981, in Developmental Biology Using Purified Genes, Brown et al. [eds.], pp. 683-693, Academic Press, Cambridge, MA [1981];およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259 [1991]を参照)。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているポリペプチドをコードし、中程度にストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件等の定義された条件下で、本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードする配列の相補体にハイブリダイズする。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件等のハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて変化するがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的DNAが、標的DNAに対して約60%の同一性、好ましくは約75%の同一性、約85%の同一性を有する、標的ポリヌクレオチドに対する約90%超の同一性を有する、相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2%SDSにおける42℃でのハイブリダイゼーションと、続く、0.2×SSPE、0.2%SDSにおける42℃での洗浄と同等な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は一般に、定義されたポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定される、熱的融解温度Tmから約10℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、65℃で0.018M NaClにおいて安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す(すなわち、ハイブリッドが、65℃で0.018M NaClにおいて安定していない場合、本明細書に企図される通り、高ストリンジェンシー条件下で安定しないであろう)。高ストリンジェンシー条件は、例えば、50%ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2%SDSと同等な条件における42℃でのハイブリダイゼーションと、続く、0.1×SSPEおよび0.1%SDSにおける65℃での洗浄によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、0.1%(w:v)SDSを含有する5×SSCにおける65℃でのハイブリダイズと、0.1%SDSを含有する0.1×SSCにおける65℃での洗浄と同等な条件におけるハイブリダイズである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、中程度にストリンジェントな条件と共に、上に引用されている参考文献に記載されている。
「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において、遺伝暗号は縮重であるが、特定の生物によるコドン使用が、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用バイアスは、所与の遺伝子、共通機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質 対 低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コード領域に関してより高くなることができる。一部の実施形態では、プロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物における最適な産生のためにコドン最適化されていてよい。
「好まれる、最適な、高いコドン使用バイアスのコドン」は、タンパク質コード領域において、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも高い頻度で使用されるコドンを互換的に指す。好まれるコドンは、単一の遺伝子、共通機能もしくは起源の遺伝子のセット、高度に発現される遺伝子におけるコドン使用、生物全体の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、近縁生物の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはこれらの組合せに関して決定することができる。遺伝子発現のレベルに伴いその頻度が増加するコドンは典型的に、発現に最適なコドンである。例えば、クラスター解析または対応解析、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を使用した多変量解析を含む、特定の生物におけるコドン頻度(例えば、コドン使用、相対的同義コドン使用)およびコドン優先度を決定するための種々の方法が公知である(例えば、GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package;CodonW, Peden, University of Nottingham;McInerney, Bioinform., 14:372-73 [1998];Stenico et al., Nucl. Acids Res., 222437-46 [1994];Wright, Gene 87:23-29 [1990]を参照)。多くの異なる生物についてコドン使用表を利用することができる(例えば、Wada et al., Nucl. Acids Res., 20:2111-2118 [1992];Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28:292 [2000];Duret, et al., 上記; Henaut and Danchin, in Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, et al. (eds.), ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066 [1996]を参照)。コドン使用を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができるいずれかの利用できるヌクレオチド配列に頼ることができる。これらのデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列(例えば、完全タンパク質コード配列 - CDS)、発現される配列タグ(ESTS)、またはゲノム配列の予測されるコード領域を含む(例えば、Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Chapter 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [2001];Uberbacher, Meth. Enzymol., 266:259-281 [1996];およびTiwari et al., Comput. Appl. Biosci., 13:263-270 [1997]を参照)。
「制御配列」は、本明細書において、本発明のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現に必要または有利なあらゆる構成成分を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブまたは外来性であり得る。斯かる制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターを含むがこれらに限定されない。最小でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的でリンカーとともに提供され得る。
「作動可能に連結された」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を方向付けるまたは調節するような、目的のポリヌクレオチドに対する位置において制御配列が適切に配置された(すなわち、機能的な関係性で)構成として本明細書に定義される。
「プロモーター配列」は、コード配列等の目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、選択宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、宿主細胞にとって同種または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
「適した反応条件」は、酵素変換反応溶液における条件(例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、pH、緩衝液、共溶媒の範囲等)を指し、その条件下で、本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、基質を所望の産物化合物に変換することができる。一部の例示的な「適した反応条件」が、本明細書に提供される。
本明細書で使用される場合、「化合物負荷」または「酵素負荷」等における「負荷」は、反応開始時の反応混合物中の構成成分の濃度または量を指す。
本明細書で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドによる作用を受ける化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における「産物」は、基質におけるプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの作用に起因する化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「培養すること」は、いずれか適した条件下で(例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用して)微生物細胞の集団を育成することを指す。
組換えポリペプチドは、当技術分野で公知のいずれか適した方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミド等のベクターにおいてクローニングし、E.coli等の所望の宿主において発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の様々な方法によって生成することができる。実際に、当業者にとって周知の多種多様な異なる変異誘発技法が存在する。加えて、多くの商業的分子生物学サプライヤーから変異誘発キットも入手できる。定義されたアミノ酸における特異的な置換(部位特異的)、遺伝子の局在化された領域における特異的もしくはランダムな変異(位置特異的)、または遺伝子全体にわたるランダムな変異誘発(例えば、飽和変異誘発)を作製するための方法を利用できる。PCRを使用した一本鎖DNAもしくは二本鎖DNAの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンPCR、シャッフリングおよび化学的飽和変異誘発、または当技術分野で公知の他のいずれかの適した方法を含むがこれらに限定されない、酵素バリアントを生成するための多数の適した方法が、当業者にとって公知である。DNAおよびタンパク質操作に使用される方法の非限定的な例は、次の特許に提供されている:米国特許第6,117,679号;米国特許第6,420,175号;米国特許第6,376,246号;米国特許第6,586,182号;米国特許第7,747,391号;米国特許第7,747,393号;米国特許第7,783,428号;および米国特許第8,383,346号。バリアントが産生された後に、バリアントをいずれか所望の特性(例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低下した活性、増加した熱的活性、増加した熱的安定性、および/または酸性pH安定性等)についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド」(「操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド」、「バリアントプロリンヒドロキシラーゼ酵素」および「プロリンヒドロキシラーゼバリアント」とも本明細書で称される)は、用途を見出す。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、DNA配列を細胞に導入するためのDNA構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、DNA配列にコードされたポリペプチドの、適した宿主における発現をもたらすことができる適した制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するための、DNA配列(例えば、導入遺伝子)に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および/または他の化合物の産生を指す。この用語が、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを包含することが意図される。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列(例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列等)が、それが作動可能に連結されている別の配列に対して「異種」であるのは、この2種の配列が、自然界で会合されていない場合である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、研究室の技法によって宿主細胞に導入されるいずれかのポリヌクレオチドであり、宿主細胞から取り出され、研究室の操作に供され、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書に提供されるDNA(例えば、プロリンヒドロキシラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド)を含む発現ベクターに適した宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の通りに組換えDNA技法を使用して構築されたベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞である。
用語「アナログ」は、参照ポリペプチドと70%超の配列同一性かつ100%未満の配列同一性(例えば、75%、78%、80%、83%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%超の配列同一性)を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない1個または複数の天然に存在しないアミノ酸残基を、天然に存在するアミノ酸と共に含有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、1個または複数のD-アミノ酸残基、および2個またはそれよりも多いアミノ酸残基の間の非ペプチド連結も含む。
用語「有効量」は、所望の結果を生じるのに十分な量を意味する。当業者は、慣例的な実験法を使用することにより有効量を決定することができる。
用語「単離された」および「精製された」は、それが天然に会合されていた少なくとも1種の他の構成成分から取り出された分子(例えば、単離された核酸、ポリペプチド等)または他の構成成分を指すように使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を要求せず、むしろこれは、相対的な定義として意図される。
「立体選択性」は、化学または酵素反応における、ある1種の立体異性体の、別の立体異性体よりも優先的な形成を指す。立体選択性は、部分的であり得、この場合、ある1種の立体異性体の形成が他の立体異性体よりも有利になるか、または完全であり得、この場合、ある1種の立体異性体のみが形成される。立体異性体が鏡像異性体である場合、立体選択性は、両者の和におけるある1種の鏡像異性体の分率(典型的にパーセンテージとして報告)である、エナンチオ選択性と称される。これは一般的にその代わりに、式[主要鏡像異性体 - 微量鏡像異性体]/[主要鏡像異性体 + 微量鏡像異性体]に従ってそれから計算される鏡像体過剰率(e.e.)として当技術分野で報告される(典型的にパーセンテージとして)。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、2種のジアステレオマーの混合物におけるある1種のジアステレオマーの分率(典型的にパーセンテージとして報告される)である、ジアステレオ選択性と称され、一般的にその代わりに、ジアステレオマー過剰率(d.e.)として報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、ある種の立体異性体過剰率(stereomeric excess)である。
「高度に立体選択的」は、少なくとも約85%の立体異性体過剰率で、基質(例えば、L-プロリン)をその対応するヒドロキシル化産物(例えば、トランス-3-ヒドロキシプロリン)に変換することができる化学または酵素反応を指す。
「位置選択性」または「位置選択的反応」は、ある一方向の結合作製または切断が、他のあらゆる可能な方向よりも優先的に発生する反応を指す。反応は、区別が完全である場合、完全に(100%)位置選択的であり得る、実質的に位置選択的(少なくとも75%)であり得る、またはある1部位における反応の産物が他の部位における反応の産物よりも優勢である場合、例えば、産物化合物(すなわち、望まれない産物のトランス-4-ヒドロキシプロリンを上回るトランス-3-ヒドロキシプロリン)の優先的な形成の場合、部分的に位置選択的(x%、この場合、パーセンテージは、目的の反応に依存して設定される)であり得る。
「選択的」または「選択性」は、上に定義される通り、立体選択的もしくは位置選択的のどちらかを指すことができる、または立体選択的および位置選択的の両方を指すことができる。
「異性体過剰率」は、式[主要異性体 - 微量異性体]/[主要異性体 + 微量異性体]に従って計算されたパーセンテージを指す。このパーセンテージは、化学または酵素反応におけるある1種の異性体の、他の異性体よりも優先的な形成を表す。鏡像体過剰率は、異性体過剰率の一形態である。
本明細書で使用される場合、「熱安定性の(thermostable)」は、同じ上昇された温度に曝露された野生型酵素と比較して、ある期間(例えば、0.5~24h)にわたる上昇された温度(例えば、40~80℃)への曝露後に同様の活性(例えば60%~80%超)を維持するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「溶媒安定な(solvent stable)」は、同じ濃度の同じ溶媒に曝露された野生型酵素と比較して、ある期間(例えば、0.5~24h)にわたる変動する濃度(例えば、5~99%)の溶媒(例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド[DMSO]、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルtert-ブチルエーテル等)への曝露後に同様の活性(例えば、60%~80%超)を維持するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「熱安定性かつ溶媒安定な(thermo- and solvent stable)」は、熱安定性かつ溶媒安定の両方であるプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「還元剤」は、Fe+3をFe+2に変換することができる化合物または作用物質を指す。例示的な還元剤は、アスコルビン酸であり、これは一般に、L-アスコルビン酸の形態である。
「アルキル」は、直鎖または分枝状のいずれかである、1~18個(両端の値を含む)の炭素原子、より好ましくは、1~8個(両端の値を含む)の炭素原子、最も好ましくは、1~6個(両端の値を含む)の炭素原子の飽和炭化水素基を指す。指定の数の炭素原子を有するアルキルは、括弧内に表示される(例えば、(C1~C6)アルキルは、1~6個の炭素原子のアルキルを指す)。
「アルケニル」は、少なくとも1個の二重結合を含有する、ただし、必要に応じて1個より多くの二重結合を含有する、直鎖または分枝状のいずれかである、2~12個(両端の値を含む)の炭素原子の炭化水素基を指す。
「アルキニル」は、少なくとも1個の三重結合を含有する、ただし、必要に応じて1個より多くの三重結合を含有し、その上、必要に応じて1個または複数の二重結合された部分を含有する、直鎖または分枝状のいずれかである、2~12個(両端の値を含む)の炭素原子の炭化水素基を指す。
「アルキレン」は、1個または複数の適した置換基で必要に応じて置換された、1~18個(両端の値を含む)の炭素原子、より好ましくは、1~8個(両端の値を含む)の炭素原子、最も好ましくは、1~6個(両端の値を含む)の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖二価炭化水素ラジカルを指す。例示的な「アルキレン」は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンその他を含むがこれらに限定されない。
「アルケニレン」は、1個または複数の適した置換基で必要に応じて置換された、2~12個(両端の値を含む)の炭素原子および1個または複数の炭素-炭素二重結合、より好ましくは、2~8個(両端の値を含む)の炭素原子、最も好ましくは、2~6個(両端の値を含む)の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖二価炭化水素ラジカルを指す。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」はそれぞれ、炭素原子のうち1個または複数がそれぞれ独立して、同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基に置き換えられた、本明細書に定義されているアルキル、アルケニルおよびアルキニルを指す。炭素原子に取って代わることができるヘテロ原子および/またはヘテロ原子基は、-O-、-S-、-S-O-、-NRγ-、-PH-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)NRγ-、-S(O)2NRγ-、その他を、これらの組合せを含めて含むがこれらに限定されない(式中、各Rγは独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択される)。
「アリール」は、単一の環(例えば、フェニル)または複数の縮合環(例えば、ナフチルまたはアントリル)を有する、6~12個(両端の値を含む)の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を指す。例示的なアリールは、フェニル、ピリジル、ナフチルその他を含む。
「アリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に1~6個(両端の値を含む)の炭素原子を、アリール部分に6~12個(両端の値を含む)の炭素原子を有する、アリールで置換されたアルキル(すなわち、アリール-アルキル基)を指す。斯かるアリールアルキル基は、ベンジル、フェネチルその他によって例証される。
「アリールオキシ」は、-ORλ基(式中、Rλは、必要に応じて置換されていてよいアリール基である)を指す。
「シクロアルキル」は、1~3個のアルキル基で必要に応じて置換されていてよい、単一の環式の環または複数の縮合環を有する3~12個(両端の値を含む)の炭素原子の環式アルキル基を指す。例示的なシクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、1-メチルシクロプロピル、2-メチルシクロペンチル、2-メチルシクロオクチルその他の単一の環構造、またはアダマンチルその他の架橋された環系を含む複数の環構造を含むがこれらに限定されない。
「シクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に1~6個(両端の値を含む)の炭素原子を、シクロアルキル部分に3~12個(両端の値を含む)の炭素原子を有する、シクロアルキルで置換されたアルキル(すなわち、シクロアルキル-アルキル基)を指す。斯かるシクロアルキルアルキル基は、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチルその他によって例証される。
「アミノ」は、基-NH2を指す。置換アミノは、基-NHRη、NRηRηおよびNRηRηRη(式中、各Rηは独立して、置換または未置換アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル(sulfanyl)、スルフィニル、スルホニルその他から選択される)を指す。典型的なアミノ基は、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチル(methyly)スルホニルアミノ、フラニル-オキシ-スルファミノ(sulfamino)その他を含むがこれらに限定されない。
「アミノアルキル」は、水素原子のうち1個または複数が、置換アミノ基を含む1個または複数のアミノ基に置き換えられた、アルキル基を指す。
「アミノカルボニル」は、-C(O)NH2を指す。置換アミノカルボニルは、-C(O)NRηRη(式中、アミノ基NRηRηは、本明細書に定義されている通りである)を指す。
「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成するための様々な置換基を有することができる、二価基-O-を指す。
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は、基-ORζ(式中、Rζは、必要に応じて置換アルキル基を含むアルキル基である)を指すように本明細書で互換的に使用される。
「カルボキシ」は、-COOHを指す。
「カルボニル」は、酸、酸ハライド、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む、異なるカルボニル基を形成するための種々の置換基を有することができる-C(O)-を指す。
「カルボキシアルキル」は、水素原子のうち1個または複数が、1個または複数のカルボキシ基に置き換えられた、アルキルを指す。
「アミノカルボニルアルキル」は、本明細書に定義されている通りのアミノカルボニル基で置換されたアルキルを指す。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
「ハロアルキル」は、水素原子のうち1個または複数が、ハロゲンに置き換えられた、アルキル基を指す。よって、用語「ハロアルキル」は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキル等、ペルハロアルキル(perhaloalkyl)までを含むことを意味する。例えば、表現「(C1~C2)ハロアルキル」は、1-フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、1-フルオロエチル、1,1-ジフルオロエチル、1,2-ジフルオロエチル、1,1,1 トリフルオロエチル、ペルフルオロエチル等を含む。
「ヒドロキシ」は、-OHを指す。
「ヒドロキシアルキル」は、水素原子のうち1個または複数が、1個または複数のヒドロキシ基に置き換えられた、アルキル基を指す。
「チオール」または「スルファニル」は、-SHを指す。置換チオールまたはスルファニルは、-S-Rη(式中、Rηは、アルキル、アリールまたは他の適した置換基である)を指す。
「アルキルチオ」は、-SRζ(式中、Rζは、必要に応じて置換されていてよいアルキルである)を指す。典型的なアルキルチオ基は、メチルチオ、エチルチオ、n-プロピルチオその他を含むがこれらに限定されない。
「アルキルチオアルキル」は、アルキルチオ基、-SRζ(式中、Rζは、必要に応じて置換されていてよいアルキルである)で置換されたアルキルを指す。
「スルホニル」は、-SO2-を指す。置換スルホニルは、-SO2-Rη(式中、Rηは、アルキル、アリールまたは他の適した置換基である)を指す。
「アルキルスルホニル」は、-SO2-Rζ(式中、Rζは、必要に応じて置換されていてよいアルキルである)を指す。典型的なアルキルスルホニル基は、メチルスルホニル、エチルスルホニル、n-プロピルスルホニルその他を含むがこれらに限定されない。
「アルキルスルホニルアルキル」は、アルキルスルホニル基、-SO2-Rζ(式中、Rζは、必要に応じて置換されていてよいアルキルである)で置換されたアルキルを指す。
「ヘテロアリール」は、1~10個(両端の値を含む)の炭素原子、ならびに環内の酸素、窒素および硫黄から選択される1~4個(両端の値を含む)のヘテロ原子の芳香族複素環式基を指す。斯かるヘテロアリール基は、単一の環(例えば、ピリジルまたはフリル)または複数の縮合環(例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル)を有することができる。
「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に1~6個(両端の値を含む)の炭素原子を、ヘテロアリール部分に5~12個(両端の値を含む)の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキル(すなわち、ヘテロアリール-アルキル基)を指す。斯かるヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルその他によって例証される。
「複素環」、「複素環式」および互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、2~10個(両端の値を含む)の炭素環原子、および環内の窒素、硫黄または酸素から選択される1~4個(両端の値を含む)のヘテロ環原子の、単一の環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和基を指す。斯かる複素環式基は、単一の環(例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル)または複数の縮合環(例えば、インドリニル(indolinyl)、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル)を有することができる。複素環の例は、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンその他を含むがこれらに限定されない。
「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に1~6個(両端の値を含む)の炭素原子を、ヘテロシクロアルキル部分に3~12個(両端の値を含む)の環原子を有する、ヘテロシクロアルキルで置換されたアルキル(すなわち、ヘテロシクロアルキル-アルキル基)を指す。
「員環」は、いかなる環状構造体も包括することを意味する。用語「員」に先行する数は、環を構成する骨格原子の数を表示する。よって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは、6員環であり、シクロペンチル、ピロール、フランおよびチオフェンは、5員環である。
「融合二環式環」は、本明細書で使用される場合、各環に5~8個の原子を有する、未置換および置換炭素環式および/または複素環式環部分の両方を指し、環は、2個の共通原子を有する。
他に指定がなければ、前述の基における水素によって占有される位置は、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ(amidoximo)、ヒドロキサモイル(hydroxamoyl)、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、(複素環)オキシおよび(複素環)アルキルによって例証されるがこれらに限定されない置換基でさらに置換されていてよく;好まれるヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。オープンな原子価(open valence)が、これらの置換基に存在する場合、これらは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび/または複素環基でさらに置換されていてよいこと、これらのオープンな原子価が、炭素に存在する場合、これらは、ハロゲンによって、および酸素、窒素または硫黄結合置換基によってさらに置換されていてよいこと、ならびに複数の斯かるオープンな原子価が存在する場合、結合の直接的な形成によって、または新たなヘテロ原子、好ましくは、酸素、窒素または硫黄への結合の形成によって、これらの基が連結されて環を形成してよいことが理解される。水素を置換基に置き換えることが、本発明の分子に許容できない不安定性を導入せず、その他の点で化学的に合理的であることを条件に、上述の置換を為すことができることがさらに理解される。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載されている事象または状況が発生してもしなくてもよいこと、また、記載が、事象または状況が発生する場合と、発生しない場合とを含むことを意味する。当業者であれば、1個または複数の必要に応じた置換基を含有するものとして記載されているいずれかの分子に関して、立体的に実際的なおよび/または合成的に実現可能な化合物のみが、含まれることが意図されることを理解するであろう。「必要に応じて置換された」は、用語または一連の化学基におけるあらゆるその後の修飾語句(modifier)を指す。例えば、用語「必要に応じて置換されたアリールアルキルにおいて、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されていても置換されていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」について、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、その他から独立して、置換されていても置換されていなくてもよい。
操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド
本発明は、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチドを調製する方法、および当該ポリペプチドを使用するための方法を提供する。記載が、ポリペプチドに関する場合、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて記載する場合があることを理解されたい。
本発明は、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチドを調製する方法、および当該ポリペプチドを使用するための方法を提供する。記載が、ポリペプチドに関する場合、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて記載する場合があることを理解されたい。
プロリンヒドロキシラーゼは、アルファ-ケトグルタレートおよび酸素(O2)の存在下でプロリンのヒドロキシル化を触媒するジオキシゲナーゼ(diooxygenase)酵素のクラスに属する。アルファ-ケトグルタレートは、ヒドロキシル化において化学量論的に脱炭酸され、O2分子の一方の原子は、スクシネートに取り込まれ、他方の原子は、プロリン残基に形成されたヒドロキシル基に取り込まれる。上に記す通り、プロリンヒドロキシラーゼは、遊離プロリンをヒドロキシル化するその能力によって、プロリルヒドロキシラーゼから識別される。
いくつかの種類のプロリンヒドロキシラーゼが、酵素反応において形成される主要なジアステレオマー産物に基づき同定された:シス-3-プロリンヒドロキシラーゼ(シス-P3H)、シス-4-プロリンヒドロキシラーゼ(シス-P4H)、トランス-3-プロリンヒドロキシラーゼ(トランス-P3H)およびトランス-4-プロリンヒドロキシラーゼ(トランス-P4H)。シス-P3H酵素は、Streptomyces sp.TH1、Streptomyces canusならびにBacillus sp.TH2およびTH3において同定された(Mori et al., Appl. Environ. Microbiol., 62 (6):1903-1907 [1996])。シス-P4H酵素は、Lotus corniculatus rhizobia、Mesorhibozium loti、Sinorhizobium melilotiおよびMedicago sativa rhizobiaにおいて同定された(Hara and Kino, Biochem. Biophys. Res. Commun., 379(4):882-6 [2009];米国特許出願公開第2011/0091942号)。トランス-P4Hは、Dactylosporangium sp.、Amycolatopsis sp.、Streptomyces griseoviridus、Streptomyces sp.、Glarea lozoyensisおよびEmericella rugulosa NRRL 11440において同定された(Shibasaki et al., Appl. Environ. Microbiol., 65(9):4028-31 [1999];Petersen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 62(2-3):263-7 [2003];Mori et al., Appl. Environ. Microbiol., 62:1903-1907 [1996];Lawrence et al., Biochem. J., 313:185-191 [1996];およびEP0641862;Cacho et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 16781)。
近年、3種のヒドロキシラーゼ遺伝子を含む遺伝子クラスターが、真菌種(sp.)11243において同定された(Matsui et al., J. Biosci. Bioeng. 2017, Feb; 123(2): 147-153)。その後、これらの遺伝子のうち1種は、プロリンヒドロキシラーゼとして同定され、トランス選択的プロリンヒドロキシラーゼとして特徴付けされた。真菌種番号11243由来のプロリンヒドロキシラーゼ(ANO11243またはANOと称される)は、遊離プロリンを、トランス-4-ヒドロキシプロリンおよびトランス-3-ヒドロキシプロリンの両方に変換し、トランス-3-ヒドロキシプロリン異性体が僅かに濃縮される。しかし、天然に存在するANO11243プロリンヒドロキシラーゼは、低い比活性、低い熱安定性、および所望のトランス-3-ヒドロキシプロリン異性体に対する低い選択性を含む、ラージスケールの産業プロセスにおいて有用となるであろう特性を欠如する。
真菌種番号11243由来の野生型プロリンヒドロキシラーゼの欠陥を克服する操作されたプロリンヒドロキシラーゼが、本明細書に記載されている。真菌種番号11243由来の野生型酵素ANOに由来する操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに効率的に変換することができる。本発明は、とりわけ、活性、安定性、発現、位置選択性および立体選択性を含む、天然に存在する酵素と比較して酵素特性を改善する、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチド配列におけるアミノ酸残基位置および対応する変異を同定する。特に、本発明は、補助基質(例えば、アルファ-ケトグルタレート)の存在下、適した反応条件下(例えば、酸素およびFe(II)の存在下)で、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに効率的に変換することができる操作されたポリペプチドを提供する(上のスキーム1に説明される通り)。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号4のポリペプチドと比較して、規定された時間で、同じ量の酵素により、L-プロリンからトランス-3-ヒドロキシプロリンへのヒドロキシル化において増加した活性を示す。一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630によって表されるポリペプチドと比較して、適した反応条件下で、少なくとも約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍またはそれよりも高い活性を有する。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、野生型プロリンヒドロキシラーゼと比較して、増加した位置選択性を有する。具体的には、天然に存在する酵素は、プロリンを、排他的ではないにせよ主に、トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換する。一部の実施形態では、本明細書における操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、トランス-4-ヒドロキシプロリンを上回ってトランス-3-ヒドロキシプロリンを選択的に形成することができる。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、トランス-4-ヒドロキシプロリンを上回ってトランス-3-ヒドロキシプロリンを選択的に形成することができ、適した反応条件下における形成されたトランス-3-ヒドロキシプロリンの化合物トランス-4-ヒドロキシプロリンに対する比は、少なくとも1.5、2、3、4、5、10、15、20、25、30またはそれよりも大きい。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、少なくとも約10g/L、約20g/L、約30g/L、約40g/L、約50g/L、約70g/L、約100g/L、約125g/L、約150g/L、約175g/Lもしくは約200g/Lまたはそれよりも多い基質負荷濃度で、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%または少なくとも約99%のパーセント変換により、約120hもしくはそれ未満、72hもしくはそれ未満、約48hもしくはそれ未満、約36hもしくはそれ未満または約24hもしくはそれ未満の反応時間において、適した反応条件下で、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる。
上述の改善された特性の操作されたポリペプチドがヒドロキシル化反応を実行する適した反応条件は、下および実施例にさらに記載される通り、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、補助基質、遷移金属補助因子、還元剤、緩衝液、共溶媒、pH、温度および反応時間を含む条件、ならびに/または固体支持体に固定化されたポリペプチドによる条件に関して決定することができる。
一部の実施形態では、特に、L-プロリンからトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換において改善された特性を有する例示的なプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、表4.1、4.2、4.3、4.4、5.1、5.2、5.3、6.1、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、9.1、9.2、10.1、10.2、11.1、11.2および/または12.1に指し示される残基位置において配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較した1個または複数の残基差異を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の例示的な天然に存在しない(または操作された)プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの構造および機能情報は、L-プロリンからトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換に基づき、その結果は、下の表4.1、4.2、4.3、4.4、5.1、5.2、5.3、6.1、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、9.1、9.2、10.1、10.2、11.1、11.2および/または12.1に示される。奇数番号の配列識別子(すなわち、配列番号)は、偶数番号の配列番号によって提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。例示的な配列は、これにより参照により本明細書に組み込まれる、本発明に添付する電子配列表ファイルに提供される。アミノ酸の残基差異は、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の参照配列との比較に基づく。真菌種番号11243由来のプロリンヒドロキシラーゼANOの天然に存在するアミノ酸配列は、本明細書において配列番号2として提供される(対応するポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される通り、配列番号1である)。配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の参照ポリペプチドと比べた各操作されたポリペプチドの活性は、本明細書における実施例に記載されている基質の変換として決定された。一部の実施形態では、振盪フラスコ粉末(SFP)または下流加工(DSP)粉末アッセイは、二次スクリーニングとして使用して、操作されたプロリンヒドロキシラーゼの特性を評価し、その結果は、表4.1、4.2、4.3、4.4、5.1、5.2、5.3、6.1、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、9.1、9.2、10.1、10.2、11.1、11.2および/または12.1に提供される。SFP形態は、操作されたポリペプチドのより精製された粉末調製物を提供し、総タンパク質の最大で約30%である操作されたポリペプチドを含有することができる。DSP調製物は、総タンパク質の最大で約80%である操作されたプロリンヒドロキシラーゼを含有することができるため、DSP調製物は、さらにより精製された形態の操作されたポリペプチドを提供することができる。
一部の実施形態では、本明細書に指し示される残基位置における配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較した残基差異に関連する特異的酵素特性は、とりわけ、酵素活性、基質許容範囲、熱安定性、位置選択性および立体選択性を含む。酵素活性における改善は、本明細書における実施例に指し示される残基位置における残基差異に関連する。選択性における改善は、本明細書における実施例に指し示される残基位置における残基差異に関連する。熱安定性における改善は、本明細書における実施例に指し示される残基位置における残基差異に関連する。したがって、これらの残基位置における残基差異を個々にまたは様々な組合せにおいて使用して、とりわけ、酵素活性、基質許容範囲、位置選択性、立体選択性および熱安定性を含む所望の改善された特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを産生することができる。ポリペプチド発現に影響を与える他の残基差異を使用して、操作されたプロリンヒドロキシラーゼの発現を増加させることができる。
本明細書に提供されるガイダンスを踏まえると、配列番号4~658の偶数番号の配列を含む例示的な操作されたポリペプチドのいずれかが、例えば、表4.1、4.2、4.3、4.4、5.1、5.2、5.3、6.1、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、9.1、9.2、10.1、10.2、11.1、11.2および/または12.1における他のポリペプチド由来の様々なアミノ酸差異、ならびに本明細書に記載されている他の残基位置の新たな組合せを組み込む進化のその後のラウンドによって、他の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列としての用途を見出すことがさらに企図される。さらなる改善は、進化のより早期のラウンドを通して未変化として維持されてきた残基位置におけるアミノ酸差異を含むことにより生成することができる。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21、28、58/247、65、80、85、95、98、117、120、159、185、194、199、200、233、237、243、250、268、281、282、287、289、307、324、326、327、330、338、343、346および348から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21Q、28A、58V/247V、65A、80H、85L、95P、95R、98L、117E、117L、117R、117S、117T、120F、159G、185D、194L、194T、199A、200V、233A、233R、237E、243A、243V、250Q、268H、281S、282E、282S、287E、289D、307I、324D、326G、326H、326K、327Q、330G、338I、343N、343P、346Sおよび348Sから選択される1個または複数の残基差異(配列番号4と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにR21Q、P28A、E58V/P247V、S65A、K80H、E85L、G95P、G95R、Q98L、A117E、A117L、A117R、A117S、A117T、L120F、Q159G、A185D、N194L、N194T、T199A、P200V、V233A、V233R、Q237E、L243A、L243V、V250Q、R268H、R281S、L282E、L282S、D287E、M289D、V307I、A324D、R326G、R326H、R326K、W327Q、L330G、M338I、V343N、V343P、A346SおよびQ348Sから選択される1個または複数の残基差異(配列番号4と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21、28、45、65、95、112、117、139、177、185、199、233、243、250、281、282、287、289、307、324、326、327、335、338、343および346から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21Q、28A、45S、65A、95R、112L、117S、139F、177P、185D、199A、233A、243V、250Q、250T、281S、281T、282E、282S、287E、289D、307I、324D、326G、326H、326K、327Q、335A、335M、338I、343N、343Pおよび346Sから選択される1個または複数の残基差異(配列番号4と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにR21Q、P28A、Y45S、S65A、G95R、R112L、A117S、M139F、S177P、A185D、T199A、V233A、L243V、V250Q、V250T、R281S、R281T、L282E、L282S、D287E、M289D、V307I、A324D、R326G、R326H、R326K、W327Q、S335A、S335M、M338I、V343N、V343PおよびA346Sから選択される1個または複数の残基差異(配列番号4と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに48/66/189/194、48/66/194および66/82/85/135/189/194/267から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに48V/66W/189N/194L、48V/66W/194Lおよび66W/82P/85P/135P/189N/194L/267Dから選択される1個または複数の残基差異(配列番号4と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにA48V/Y66W/A189N/N194L、A48V/Y66W/N194LおよびY66W/K82P/E85P/A135P/A189N/N194L/G267Dから選択される1個または複数の残基差異(配列番号4と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに20/56/76/168/169/296、20/56/232/294、20/119/294/296、56/76/119/124/147/232、56/76/294、76/168/232/294、76/294/296、76/296、147および232から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに20F/56P/76E/168A/169L/296I、20F/56P/232E/294Y、20F/119D/294Y/296I、56P/76E/119D/124F/147F/232E、56P/76E/294Y、76E/168A/232E/294Y、76E/294Y/296I、76E/296I、147Fおよび232Eから選択される1個または複数の残基差異(配列番号4と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにY20F/S56P/H76E/C168A/I169L/L296I、Y20F/S56P/Q232E/H294Y、Y20F/E119D/H294Y/L296I、S56P/H76E/E119D/W124F/Y147F/Q232E、S56P/H76E/H294Y、H76E/C168A/Q232E/H294Y、H76E/H294Y/L296I、H76E/L296I、Y147FおよびQ232Eから選択される1個または複数の残基差異(配列番号4と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに123、189、195、233および296から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに123T、189A、189S、195Y、233A、233Mおよび296Vから選択される1個または複数の残基差異(配列番号116と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにS123T、N189A、N189S、H195Y、V233A、V233MおよびL296Vから選択される1個または複数の残基差異(配列番号116と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに20/21/56、20/21/56/76/95/232/294/307/335、20/21/56/76/147/225/232/233/281/294/296/307/335、20/21/56/95/147/281/294/307、20/21/56/281/307、20/21/76/232/243、20/21/95/232/307、20/21/95/281/294/296、20/21/147/189/233/243/281/307、20/56、20/56/76/95/281/307、20/56/76/147/294/296/307、20/56/95/147/294、20/56/281、20/76、20/76/95/281/294/296、20/76/95/281/296/307、20/76/233/294/307、20/76/243/281/294、21/76/147/233/294/307、21/76/147/243/296/307/335、21/95/185/189/232/281/296、21/95/233/243/281/296、21/95/294/296/307/335、21/95/307、21/281/307、29/76/281、56/76/95/232/243/281、56/76/147/281/307、56/76/243/294、56/76/281/294、56/76/296、56/76/307、56/95/147/307/335/348、56/95/232/233/281/294/307、56/95/243/281、56/147/281、56/232/243/281、56/232/281、56/232/281/294/296、56/233/281/294/296、56/281/307、76/95/232/243/281/307、76/95/243/281/307/335、76/95/294/307、76/147、76/147/233/243/294、76/147/233/281/294/307、76/147/243/294/296/307/335、76/147/281/307、76/189/296、76/232/233/243/294/296/307、76/281、76/281/294、76/294/296、95/120、95/147/335、95/232/243/281/294/307、95/232/281/294/296、95/281/294/296、95/335、147、147/225/232/243/281/296/307/335、147/233/243/281/307、147/233/281/307/335、147/243/281、147/307、232/233/281/294/296/307、232/281、232/284/307、233/243/281/296/307/335、233/281/296/307、243/281/294/296、281、281/294、281/307、307および335、117、139、177、185、199、233、243、250、281、282、287、289、307、324、326、327、335、338、343および346から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに20F/21Q/56P、20F/21Q/56P/76E/95R/232E/294Y/307I/335M、20F/21Q/56P/76E/147F/225R/232E/233A/281S/294Y/296I/307L/335M、20F/21Q/56P/95R/147F/281T/294Y/307I、20F/21Q/56P/281T/307L、20F/21Q/76E/232E/243V、20F/21Q/95R/232E/307I、20F/21Q/95R/281T/294Y/296I、20F/21Q/147F/189A/233R/243V/281T/307I、20F/56P、20F/56P/76E/95R/281S/307I、20F/56P/76E/147F/294Y/296I/307L、20F/56P/95P/147F/294Y、20F/56P/281S、20F/76E、20F/76E/95R/281S/294Y/296I、20F/76E/95R/281T/296I/307I、20F/76E/233A/294Y/307I、20F/76E/243V/281T/294Y、21Q/76E/147F/233R/294Y/307I、21Q/76E/147F/243V/296I/307I/335M、21Q/95R/185L/189A/232E/281T/296I、21Q/95R/233A/243V/281T/296I、21Q/95R/294Y/296I/307I/335M、21Q/95R/307I、21Q/281T/307L、29T/76E/281T、56P/76E/95R/232E/243V/281T、56P/76E/147F/281T/307I、56P/76E/243V/294Y、56P/76E/281T/294Y、56P/76E/296I、56P/76E/307I、56P/95P/147F/307I/335M/348K、56P/95R/232E/233R/281S/294Y/307L、56P/95R/243V/281T、56P/147F/281T、56P/232E/243V/281S、56P/232E/281S、56P/232E/281S/294Y/296I、56P/233R/281S/294Y/296I、56P/281T/307I、76E/95P/232E/243V/281S/307L、76E/95R/243V/281S/307I/335M、76E/95R/294Y/307L、76E/147F、76E/147F/233A/243V/294Y、76E/147F/233R/281T/294Y/307L、76E/147F/243V/294Y/296I/307L/335M、76E/147F/281S/307L、76E/189A/296I、76E/232E/233R/243V/294Y/296I/307I、76E/281S、76E/281T/294Y、76E/294Y/296I、95P/232E/281T/294Y/296I、95P/335M、95R/120P、95R/147F/335M、95R/232E/243V/281T/294Y/307I、95R/281T/294Y/296I、95R/335M、147F、147F/225R/232E/243V/281S/296I/307L/335M、147F/233A/243V/281S/307L、147F/233R/281T/307L/335M、147F/243V/281S、147F/307I、232E/233A/281T/294Y/296I/307I、232E/281T、232E/284R/307I、233A/243V/281S/296I/307I/335M、233A/281T/296I/307I、243V/281S/294Y/296I、281T、281T/294Y、281T/307I、281T/307L、307Iおよび335Mから選択される1個または複数の残基差異(配列番号116と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにY20F/R21Q/S56P、Y20F/R21Q/S56P/H76E/G95R/Q232E/H294Y/V307I/S335M、Y20F/R21Q/S56P/H76E/Y147F/Q225R/Q232E/V233A/R281S/H294Y/L296I/V307L/S335M、Y20F/R21Q/S56P/G95R/Y147F/R281T/H294Y/V307I、Y20F/R21Q/S56P/R281T/V307L、Y20F/R21Q/H76E/Q232E/L243V、Y20F/R21Q/G95R/Q232E/V307I、Y20F/R21Q/G95R/R281T/H294Y/L296I、Y20F/R21Q/Y147F/N189A/V233R/L243V/R281T/V307I、Y20F/S56P、Y20F/S56P/H76E/G95R/R281S/V307I、Y20F/S56P/H76E/Y147F/H294Y/L296I/V307L、Y20F/S56P/G95P/Y147F/H294Y、Y20F/S56P/R281S、Y20F/H76E、Y20F/H76E/G95R/R281S/H294Y/L296I、Y20F/H76E/G95R/R281T/L296I/V307I、Y20F/H76E/V233A/H294Y/V307I、Y20F/H76E/L243V/R281T/H294Y、R21Q/H76E/Y147F/V233R/H294Y/V307I、R21Q/H76E/Y147F/L243V/L296I/V307I/S335M、R21Q/G95R/A185L/N189A/Q232E/R281T/L296I、R21Q/G95R/V233A/L243V/R281T/L296I、R21Q/G95R/H294Y/L296I/V307I/S335M、R21Q/G95R/V307I、R21Q/R281T/V307L、A29T/H76E/R281T、S56P/H76E/G95R/Q232E/L243V/R281T、S56P/H76E/Y147F/R281T/V307I、S56P/H76E/L243V/H294Y、S56P/H76E/R281T/H294Y、S56P/H76E/L296I、S56P/H76E/V307I、S56P/G95P/Y147F/V307I/S335M/Q348K、S56P/G95R/Q232E/V233R/R281S/H294Y/V307L、S56P/G95R/L243V/R281T、S56P/Y147F/R281T、S56P/Q232E/L243V/R281S、S56P/Q232E/R281S、S56P/Q232E/R281S/H294Y/L296I、S56P/V233R/R281S/H294Y/L296I、S56P/R281T/V307I、H76E/G95P/Q232E/L243V/R281S/V307L、H76E/G95R/L243V/R281S/V307I/S335M、H76E/G95R/H294Y/V307L、H76E/Y147F、H76E/Y147F/V233A/L243V/H294Y、H76E/Y147F/V233R/R281T/H294Y/V307L、H76E/Y147F/L243V/H294Y/
L296I/V307L/S335M、H76E/Y147F/R281S/V307L、H76E/N189A/L296I、H76E/Q232E/V233R/L243V/H294Y/L296I/V307I、H76E/R281S、H76E/R281T/H294Y、H76E/H294Y/L296I、G95P/Q232E/R281T/H294Y/L296I、G95P/S335M、G95R/L120P、G95R/Y147F/S335M、G95R/Q232E/L243V/R281T/H294Y/V307I、G95R/R281T/H294Y/L296I、G95R/S335M、Y147F、Y147F/Q225R/Q232E/L243V/R281S/L296I/V307L/S335M、Y147F/V233A/L243V/R281S/V307L、Y147F/V233R/R281T/V307L/S335M、Y147F/L243V/R281S、Y147F/V307I、Q232E/V233A/R281T/H294Y/L296I/V307I、Q232E/R281T、Q232E/G284R/V307I、V233A/L243V/R281S/L296I/V307I/S335M、V233A/R281T/L296I/V307I、L243V/R281S/H294Y/L296I、R281T、R281T/H294Y、R281T/V307I、R281T/V307L、V307IおよびS335Mから選択される1個または複数の残基差異(配列番号116と比べて)を含む。
L296I/V307L/S335M、H76E/Y147F/R281S/V307L、H76E/N189A/L296I、H76E/Q232E/V233R/L243V/H294Y/L296I/V307I、H76E/R281S、H76E/R281T/H294Y、H76E/H294Y/L296I、G95P/Q232E/R281T/H294Y/L296I、G95P/S335M、G95R/L120P、G95R/Y147F/S335M、G95R/Q232E/L243V/R281T/H294Y/V307I、G95R/R281T/H294Y/L296I、G95R/S335M、Y147F、Y147F/Q225R/Q232E/L243V/R281S/L296I/V307L/S335M、Y147F/V233A/L243V/R281S/V307L、Y147F/V233R/R281T/V307L/S335M、Y147F/L243V/R281S、Y147F/V307I、Q232E/V233A/R281T/H294Y/L296I/V307I、Q232E/R281T、Q232E/G284R/V307I、V233A/L243V/R281S/L296I/V307I/S335M、V233A/R281T/L296I/V307I、L243V/R281S/H294Y/L296I、R281T、R281T/H294Y、R281T/V307I、R281T/V307L、V307IおよびS335Mから選択される1個または複数の残基差異(配列番号116と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21/76/147/243/296/307/335、56/76/147/281/307および95/147/335から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21Q/76E/147F/243V/296I/307I/335M、56P/76E/147F/281T/307Iおよび95R/147F/335Mから選択される1個または複数の残基差異(配列番号116と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにR21Q/H76E/Y147F/L243V/L296I/V307I/S335M、S56P/H76E/Y147F/R281T/V307IおよびG95R/Y147F/S335Mから選択される1個または複数の残基差異(配列番号116と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号162に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに2/85/123/237、28/115/117/120/123/268/270/343/346/348、45/123/326、65/117/120/123/343/346、85/123/281/282、114/115/117/120/123/268/271/313/326/343/346、123/139/233/237/281/282/289/324/326および123/199/200/247/250/338から選択される残基位置における、配列番号162と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号162に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに2L/85L/123T/237E、28A/115T/117V/120I/123T/268T/270L/343N/346S/348S、45S/123T/326G、65R/117V/120I/123T/343N/346G、85L/123T/281T/282S、114G/115T/117T/120P/123T/268T/271A/313F/326G/343N/346S、123T/139F/233A/237E/281M/282S/289D/324Q/326Gおよび123T/199A/200V/247L/250Q/338Iから選択される1個または複数の残基差異(配列番号162と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号162に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにG2L/E85L/S123T/Q237E、P28A/V115T/A117V/L120I/S123T/R268T/R270L/V343N/A346S/Q348S、Y45S/S123T/R326G、S65R/A117V/L120I/S123T/V343N/A346G、E85L/S123T/R281T/L282S、E114G/V115T/A117T/L120P/S123T/R268T/S271A/L313F/R326G/V343N/A346S、S123T/M139F/V233A/Q237E/R281M/L282S/M289D/A324Q/R326GおよびS123T/T199A/P200V/P247L/V250Q/M338Iから選択される1個または複数の残基差異(配列番号162と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに26、54、61、129、132、149、156、175、189、201、209、228、236、248、262、272、277、291および345から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに26N、54P、61H、129I、132P、149G、156S、175S、175V、189S、201C、201G、201T、209S、228T、236T、248R、262V、272S、277A、291Gおよび345Rから選択される1個または複数の残基差異(配列番号322と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにG26N、G54P、D61H、A129I、E132P、S149G、V156S、L175S、L175V、N189S、A201C、A201G、A201T、C209S、V228T、Q236T、D248R、S262V、V272S、V277A、P291GおよびT345Rから選択される1個または複数の残基差異(配列番号322と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに25、43、54、58、61、79、129、132、143、156、163、175、179、201、209、236、248、278、291、345および347から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに25K、43T、54P、54S、58T、61H、79T、129I、132N、143L、156D、156S、163L、175V、179L、201C、209S、236T、248R、278N、291G、345Rおよび347Eから選択される1個または複数の残基差異(配列番号322と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにH25K、A43T、G54P、G54S、E58T、D61H、Q79T、A129I、E132N、D143L、V156D、V156S、Q163L、L175V、E179L、A201C、C209S、Q236T、D248R、S278N、P291G、T345RおよびA347Eから選択される1個または複数の残基差異(配列番号322と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに85/117/120/135/208/270/324/343/346、85/117/120/135/208/281/282/289、85/117/120/270/281/289、85/117/135/139/208および117/120/208/270/324/343/346から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに85L/117T/120P/135S/208E/281R/282L/289M、85L/117T/135S/139M/208E、85L/117V/120I/135S/208E/270L/324A/343N/346G、85L/117V/120P/270L/281R/289Mおよび117T/120I/208E/270L/324A/343N/346Gから選択される1個または複数の残基差異(配列番号322と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにE85L/A117T/L120P/A135S/A208E/M281R/S282L/D289M、E85L/A117T/A135S/F139M/A208E、E85L/A117V/L120I/A135S/A208E/R270L/Q324A/V343N/A346G、E85L/A117V/L120P/R270L/M281R/D289MおよびA117T/L120I/A208E/R270L/Q324A/V343N/A346Gから選択される1個または複数の残基差異(配列番号322と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47、48、56/118、85、95、95/289、113、118、118/247、154、162、162/204、164、164/198/271、168、169、187、195、243、271、275、281、314、330および342から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47M、48G、56P/118W、85P、95A/289V、95W、113H、113N、113P、113R、118D、118P/247A、118V、118W、154L、162A、162L、162M、162V、162V/204S、164D/198V/271V、164T、168V、169C、169T、169V、187P、195Y、243Y、271V、275K、281L、314A、314S、314T、330G、330Hおよび342Rから選択される1個または複数の残基差異(配列番号412と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにF47M、V48G、S56P/A118W、L85P、G95A/M289V、G95W、S113H、S113N、S113P、S113R、A118D、A118P/P247A、A118V、A118W、F154L、H162A、H162L、H162M、H162V、H162V/L204S、S164D/A198V/S271V、S164T、C168V、I169C、I169T、I169V、C187P、H195Y、V243Y、S271V、R275K、R281L、F314A、F314S、F314T、L330G、L330HおよびN342Rから選択される1個または複数の残基差異(配列番号412と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに25/129/163/236/262/345/347、120/156/175/179/201、129/189/236/262/277/278、129/236/262、156/175/179/228および162から選択される残基位置における、配列番号412と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに25K/129I/163L/236T/262V/345R/347E、120V/156S/175V/179L/201G、129I/189S/236T/262V/277A/278N、129I/236T/262V、156S/175V/179L/228A、162Lおよび162Vから選択される1個または複数の残基差異(配列番号412と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにH25K/A129I/Q163L/Q236T/S262V/T345R/A347E、P120V/V156S/L175V/E179L/A201G、A129I/N189S/Q236T/S262V/V277A/S278N、A129I/Q236T/S262V、V156S/L175V/E179L/V228A、H162LおよびH162Vから選択される1個または複数の残基差異(配列番号412と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15、17、28、29、65、135、167、177、199、208、228、235、287、294、307および343から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15V、17C、28I、29S、65V、135G、135N、135T、167G、177A、177L、177P、199C、208L、208M、208S、228T、235E、287E、294T、307L、343Sおよび343Tから選択される1個または複数の残基差異(配列番号492と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにI15V、S17C、P28I、A29S、S65V、S135G、S135N、S135T、Q167G、S177A、S177L、S177P、T199C、E208L、E208M、E208S、V228T、D235E、D287E、H294T、I307L、V343SおよびV343Tから選択される1個または複数の残基差異(配列番号492と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに85/187/281/347、85/187/347、118/120/162/175/179/330、118/120/162/175/330、162/175/179/330、175/228/330、195/347および278/314/347から選択される残基位置における、配列番号492と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに85P/187P/281L/347E、85P/187P/347E、118V/120V/162V/175V/179L/330H、118V/120V/162V/175V/330H、162V/175V/179L/330H、175V/228A/330H、195Y/347Eおよび278S/314A/347Eから選択される1個または複数の残基差異(配列番号492と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにL85P/C187P/R281L/A347E、L85P/C187P/A347E、A118V/P120V/H162V/L175V/E179L/L330H、A118V/P120V/H162V/L175V/L330H、H162V/L175V/E179L/L330H、L175V/V228A/L330H、H195Y/A347EおよびN278S/F314A/A347Eから選択される1個または複数の残基差異(配列番号492と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15、40、43、44、59、79、82、149、164、179、345および347から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15F、40A、43S、44R、44V、59L、79E、82A、149N、164Q、179T、345Dおよび347Kから選択される1個または複数の残基差異(配列番号562と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにI15F、K40A、A43S、G44R、G44V、R59L、Q79E、K82A、S149N、S164Q、L179T、T345DおよびA347Kから選択される1個または複数の残基差異(配列番号562と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに29/85/177/208/228/347、29/85/208/228/343/347、29/177/195/228/343、29/208/228/278/294/347、56/195/278、85/187/205/208/278、113/177/187/195/208/278/294/343/347および177/205/208/228から選択される残基位置における、配列番号562と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに29S/85P/177A/208S/228T/347E、29S/85P/208L/228T/343T/347E、29S/177P/195Y/228T/343T、29S/208S/228T/278S/294T/347E、56P/195Y/278S、85P/187P/205S/208L/278S、113N/177P/187P/195Y/208S/278S/294Y/343T/347Eおよび177A/205S/208L/228Tから選択される1個または複数の残基差異(配列番号562と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにA29S/L85P/S177A/E208S/V228T/A347E、A29S/L85P/E208L/V228T/V343T/A347E、A29S/S177P/H195Y/V228T/V343T、A29S/E208S/V228T/N278S/H294T/A347E、S56P/H195Y/N278S、L85P/C187P/A205S/E208L/N278S、S113N/S177P/C187P/H195Y/E208S/N278S/H294Y/V343T/A347EおよびS177A/A205S/E208L/V228Tから選択される1個または複数の残基差異(配列番号562と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47、162、209、219、227および342から選択される残基位置における1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47Q、162S、209H、219V、227R、342Lおよび342Mから選択される1個または複数の残基差異(配列番号598と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにF47Q、V162S、C209H、T219V、S227R、N342LおよびN342Mから選択される1個または複数の残基差異(配列番号598と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに17/44/179/195/250/313/345、17/44/199/313、43/44/195/199、44/149/164/171/187、44/179/195/199、44/179/195/199/345、79/163/164/171/187/201/286/288、82/163/164、82/163/164/171/187/201/203/208/286/288/320、149/164/171/288および187/286から選択される残基位置における、配列番号598と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに17V/44R/199C/313C、17V/44V/179T/195Y/250P/313C/345D、43S/44V/195Y/199C、44R/179T/195Y/199C、44R/179T/195Y/199C/345D、44V/149N/164Q/171M/187P、44V/179T/195Y/199C/345D、79E/163D/164Q/171M/187N/201V/286P/288T、82A/163D/164Q、82A/163D/164Q/171M/187P/201V/203Q/208I/286P/288T/320V、149N/164Q/171M/288Tおよび187P/286Pから選択される1個または複数の残基差異(配列番号598と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにS17V/G44R/T199C/L313C、S17V/G44V/L179T/H195Y/V250P/L313C/T345D、A43S/G44V/H195Y/T199C、G44R/L179T/H195Y/T199C、G44R/L179T/H195Y/T199C/T345D、G44V/S149N/S164Q/T171M/C187P、G44V/L179T/H195Y/T199C/T345D、Q79E/Q163D/S164Q/T171M/C187N/A201V/A286P/V288T、K82A/Q163D/S164Q、K82A/Q163D/S164Q/T171M/C187P/A201V/S203Q/L208I/A286P/V288T/K320V、S149N/S164Q/T171M/V288TおよびC187P/A286Pから選択される1個または複数の残基差異(配列番号598と比べて)を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号630に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに82/164/171/203/208、135/163/164/201/203/208、162、162/219/236、162/219/313/338、162/236/342、162/313/342および164/171/201/203/282から選択される残基位置における、配列番号630と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号630に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに82A/164T/171M/203Q/208I、135P/163D/164Q/201V/203Q/208I、162S、162S/219V/236L、162S/219V/313C/338I、162S/236L/342M、162S/313C/342Mおよび164Q/171M/201V/203Q/282Vから選択される1個または複数の残基差異(配列番号630と比べて)を含む。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号630に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにK82A/S164T/T171M/S203Q/L208I、S135P/Q163D/S164Q/A201V/S203Q/L208I、V162S、V162S/T219V/T236L、V162S/T219V/L313C/M338I、V162S/T236L/N342M、V162S/L313C/N342MおよびS164Q/T171M/A201V/S203Q/L282Vから選択される1個または複数の残基差異(配列番号630と比べて)を含む。
当業者によって認められる通り、一部の実施形態では、選択される上述の残基差異の1個または組合せは、コア特色として操作されたプロリンヒドロキシラーゼにおいて一定に保つ(すなわち、維持する)ことができ、他の残基位置における追加的な残基差異を配列に組み込んで、改善された特性を有する追加的な操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを生成することができる。したがって、上述の残基差異の1個またはサブセットを含有するいずれかの操作されたプロリンヒドロキシラーゼのために、本発明は、残基差異の1個またはサブセットと、その上、本明細書に開示されている他の残基位置における1個または複数の残基差異を含む他の操作されたプロリンヒドロキシラーゼを企図することを理解されたい。
上に記す通り、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドはまた、基質化合物L-プロリンを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる。一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の参照ポリペプチドの活性と比べて、少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍またはそれよりも高い活性で、基質化合物L-プロリンを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる。一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の参照ポリペプチドの活性と比べて、少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍またはそれよりも高い活性で、基質化合物L-プロリンを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、改善された位置選択性、改善された活性、改善された比活性および/または改善された熱安定性から選択される1種または複数の特色を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比べて少なくとも1.2倍の活性で、基質化合物L-プロリンを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができ、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比べて少なくとも2倍の活性で、基質化合物L-プロリンを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができ、本明細書に提供される1個または複数の残基差異(適用可能であれば、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して)を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比べて少なくとも2倍の活性で、基質化合物L-プロリンを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、120hもしくはそれ未満、72hもしくはそれ未満、48hもしくはそれ未満または24hもしくはそれ未満において、約100g/L、約50g/Lまたは約20g/Lの基質負荷で、HTPアッセイ条件下、SFPアッセイ条件下またはDSPアッセイ条件下、化合物L-プロリンの少なくとも50%もしくはそれよりも多く、60%もしくはそれよりも多く、70%もしくはそれよりも多く、89%もしくはそれよりも多く、90%もしくはそれよりも多く、91%もしくはそれよりも多く、92%もしくはそれよりも多く、93%もしくはそれよりも多く、94%もしくはそれよりも多くまたは95%もしくはそれよりも多くを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる。一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、24hまたはそれ未満において、約20g/Lの基質負荷で、DSPアッセイ条件下、約25℃にて、化合物L-プロリンの少なくとも50%またはそれよりも高くを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、細菌宿主細胞、特に、E.coliにおける操作されたプロリンヒドロキシラーゼ活性の発現を増加させる、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較した1個または複数の残基差異を含むアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、化合物L-プロリンから産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換において改善された特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、表4.1、4.2、4.3、4.4、5.1、5.2、5.3、6.1、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、9.1、9.2、10.1、10.2、11.1、11.2および/または12.1に提供される通り、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列のうち1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列、ならびに次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列のうちいずれか1種に存在する、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較したアミノ酸残基差異を含む。
上に指定されている残基位置に加えて、本明細書に開示されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのいずれかは、他の残基位置(すなわち、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列のいずれかに含まれる位置以外の残基位置)に、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比べた他の残基差異をさらに含むことができる。これらの他の残基位置における残基差異は、プロリンからシス-4-ヒドロキシプロリンへの変換と共に化合物L-プロリンから産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換を実行するポリペプチドの能力に有害な影響を与えることなく、アミノ酸配列における追加の変動を提供することができる。したがって、一部の実施形態では、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列から選択される操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのいずれか1種に存在するアミノ酸残基差異に加えて、配列は、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して、他のアミノ酸残基位置に1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~11、1~12、1~14、1~15、1~16、1~18、1~20、1~22、1~24、1~26、1~30、1~35、1~40、1~45または1~50個の残基差異をさらに含むことができる。一部の実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基差異の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45または50個の残基位置であり得る。一部の実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基差異の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25個の残基位置であり得る。これらの他の位置における残基差異は、保存的変化または非保存的変化であり得る。一部の実施形態では、残基差異は、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドと比較して、保存的置換および非保存的置換を含むことができる。
一部の実施形態では、本発明はまた、操作されたプロリンヒドロキシラーゼの機能的活性および/または改善された特性を保持する、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのいずれかの断片を含む操作されたポリペプチドを提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、適した反応条件下で化合物L-プロリンを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができるポリペプチド断片であって、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列から選択される例示的な操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド等の本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%を含む断片を提供する。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチド等の本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド配列のうちいずれか1種に欠失を含むアミノ酸配列を有することができる。よって、本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのありとあらゆる実施形態で、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼの関連する機能的活性および/または改善された特性が維持される場合、アミノ酸配列は、1個もしくは複数のアミノ酸、2個もしくはそれよりも多いアミノ酸、3個もしくはそれよりも多いアミノ酸、4個もしくはそれよりも多いアミノ酸、5個もしくはそれよりも多いアミノ酸、6個もしくはそれよりも多いアミノ酸、8個もしくはそれよりも多いアミノ酸、10個もしくはそれよりも多いアミノ酸、15個もしくはそれよりも多いアミノ酸または20個もしくはそれよりも多いアミノ酸、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノ酸の総数の最大で10%、アミノ酸の総数の最大で20%、またはアミノ酸の総数の最大で30%の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、欠失は、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45または1~50個のアミノ酸残基を含むことができる。一部の実施形態では、欠失の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45または50個のアミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、欠失は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25個のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書における操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチド等の本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのうちいずれか1種と比較して挿入を含むアミノ酸配列を有することができる。よって、本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのありとあらゆる実施形態で、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼの関連する機能的活性および/または改善された特性が維持される場合、挿入は、1個もしくは複数のアミノ酸、2個もしくはそれよりも多いアミノ酸、3個もしくはそれよりも多いアミノ酸、4個もしくはそれよりも多いアミノ酸、5個もしくはそれよりも多いアミノ酸、6個もしくはそれよりも多いアミノ酸、8個もしくはそれよりも多いアミノ酸、10個もしくはそれよりも多いアミノ酸、15個もしくはそれよりも多いアミノ酸、20個もしくはそれよりも多いアミノ酸、30個もしくはそれよりも多いアミノ酸、40個もしくはそれよりも多いアミノ酸または50個もしくはそれよりも多いアミノ酸を含むことができる。挿入は、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端または内側部分に対するものであり得る。
一部の実施形態では、本明細書における操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列から選択される配列を含むアミノ酸配列、および必要に応じて、1個またはいくつかの(例えば、最大で3、4、5または最大で10個の)アミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有することができる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45または1~50個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45または50個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換であり得る。
上述の実施形態では、操作されたポリペプチドに適した反応条件は、実施例に記載されている通りに提供される。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが、限定ではなく例として、抗体タグ(例えば、mycエピトープ)、精製配列(例えば、金属に結合するためのHisタグ)および細胞局在化シグナル(例えば、分泌シグナル)等の他のポリペプチドに融合されている、融合ポリペプチドである。よって、本明細書に記載されている操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合ありまたはなしで使用することができる。
本明細書に記載されているポリペプチドが、遺伝的にコードされたアミノ酸に制限されないことを理解されたい。遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書に記載されているポリペプチドは、全体的にまたは部分的に、天然に存在するおよび/または合成のコードされていないアミノ酸で構成されていてよい。本明細書に記載されているポリペプチドを構成し得る、ある特定の一般的に遭遇されるコードされていないアミノ酸は、遺伝的にコードされたアミノ酸のD-立体異性体(stereomer);2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr);α-アミノイソ酪酸(Aib);ε-アミノヘキサン酸(Aha);δ-アミノ吉草酸(Ava);N-メチルグリシンまたはサルコシン(MeGlyまたはSar);オルニチン(Orn);シトルリン(Cit);t-ブチルアラニン(Bua);t-ブチルグリシン(Bug);N-メチルイソロイシン(MeIle);フェニルグリシン(Phg);シクロヘキシルアラニン(Cha);ノルロイシン(Nle);ナフチルアラニン(Nal);2-クロロフェニルアラニン(Ocf);3-クロロフェニルアラニン(Mcf);4-クロロフェニルアラニン(Pcf);2-フルオロフェニルアラニン(Off);3-フルオロフェニルアラニン(Mff);4-フルオロフェニルアラニン(Pff);2-ブロモフェニルアラニン(Obf);3-ブロモフェニルアラニン(Mbf);4-ブロモフェニルアラニン(Pbf);2-メチルフェニルアラニン(Omf);3-メチルフェニルアラニン(Mmf);4-メチルフェニルアラニン(Pmf);2-ニトロフェニルアラニン(Onf);3-ニトロフェニルアラニン(Mnf);4-ニトロフェニルアラニン(Pnf);2-シアノフェニルアラニン(Ocf);3-シアノフェニルアラニン(Mcf);4-シアノフェニルアラニン(Pcf);2-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Otf);3-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Mtf);4-トリフルオロメチルフェニルアラニン(Ptf);4-アミノフェニルアラニン(Paf);4-ヨードフェニルアラニン(Pif);4-アミノメチルフェニルアラニン(Pamf);2,4-ジクロロフェニルアラニン(Opef);3,4-ジクロロフェニルアラニン(Mpcf);2,4-ジフルオロフェニルアラニン(Opff);3,4-ジフルオロフェニルアラニン(Mpff);ピリド(pyrid)-2-イルアラニン(2pAla);ピリド-3-イルアラニン(3pAla);ピリド-4-イルアラニン(4pAla);ナフト(naphth)-1-イルアラニン(1nAla);ナフト-2-イルアラニン(2nAla);チアゾリルアラニン(taAla);ベンゾチエニルアラニン(bAla);チエニルアラニン(tAla);フリルアラニン(fAla);ホモフェニルアラニン(hPhe);ホモチロシン(hTyr);ホモトリプトファン(hTrp);ペンタフルオロフェニルアラニン(5ff);スチリル(styrylk)アラニン(sAla);アントリル(authryl)アラニン(aAla);3,3-ジフェニルアラニン(Dfa);3-アミノ-5-フェニル(pheny)ペンタン酸(Afp);ペニシラミン(Pen);1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(Tic);β-2-チエニルアラニン(Thi);メチオニンスルホキシド(Mso);N(w)-ニトロアルギニン(nArg);ホモリシン(hLys);ホスホノメチルフェニルアラニン(pmPhe);ホスホセリン(pSer);ホスホスレオニン(pThr);ホモアスパラギン酸(hAsp);ホモグルタミン酸(glutanic acid)(hGlu);1-アミノシクロペンタ-(2または3)-エン-4カルボン酸;ピペコリン酸(PA)、アゼチジン-3-カルボン酸(ACA);1-アミノシクロペンタン-3-カルボン酸;アリルグリシン(aGly);プロパルギルグリシン(pgGly);ホモアラニン(hAla);ノルバリン(nVal);ホモロイシン(hLeu)、ホモバリン(hVal);ホモイソロイシン(hIle);ホモアルギニン(hArg);N-アセチルリシン(AcLys);2,4-ジアミノ酪酸(Dbu);2,3-ジアミノ酪酸(Dab);N-メチルバリン(MeVal);ホモシステイン(hCys);ホモセリン(hSer);ヒドロキシプロリン(Hyp)およびホモプロリン(hPro)を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載されているポリペプチドを構成し得る追加的なコードされていないアミノ酸は、当業者には明らかであろう(例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるFasman, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 3-70 [1989]およびその中で引用されている参考文献に提示されている様々なアミノ酸を参照)。これらのアミノ酸は、L-またはD-立体配置のいずれかであり得る。
当業者であれば、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基が、本明細書に記載されているポリペプチドを構成することもできることを認識するであろう。この場合は芳香族カテゴリーに属する、斯かる保護されたアミノ酸の非限定的な例は、Arg(tos)、Cys(メチルベンジル)、Cys(ニトロピリジンスルフェニル)、Glu(δ-ベンジルエステル)、Gln(キサンチル(xanthyl))、Asn(N-δ-キサンチル)、His(bom)、His(ベンジル)、His(tos)、Lys(fmoc)、Lys(tos)、Ser(O-ベンジル)、Thr(O-ベンジル)およびTyr(O-ベンジル)を含む(保護基は括弧内に収載)がこれらに限定されない。
本明細書に記載されているポリペプチドを構成することができるコンフォメーション的に制約された非コードアミノ酸は、N-メチルアミノ酸(L-立体配置);1-アミノシクロペンタ-(2または3)-エン-4-カルボン酸;ピペコリン酸;アゼチジン-3-カルボン酸;ホモプロリン(hPro);および1-アミノシクロペンタン-3-カルボン酸を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、例えば、単離された調製物、実質的に精製された酵素、酵素をコードする遺伝子(複数可)で形質転換された細胞全体、ならびに/または斯かる細胞の細胞抽出物および/もしくはライセート等、様々な形態であり得る。酵素は、下でさらに記述する通り、凍結乾燥されていてよい、噴霧乾燥されていてよい、沈殿されていてよい、または粗ペーストの形態であってよい。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、膜、樹脂、固体担体または他の固相材料等、固体支持体に提供することができる。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド等の有機ポリマー、ならびにこれらのコポリマーおよびグラフトで構成され得る。固体支持体は、ガラス、シリカ、細孔制御ガラス(controlled pore glass;CPG)、逆相シリカ等の無機、または金もしくは白金等の金属であってもよい。固体支持体の構成は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面状、実質的に平面状または非平面状であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤または非膨潤特徴を有することができる。固体支持体は、ウェル、窪み、または他のコンテナ、容器、特色もしくは場所の形態で構成され得る。
一部の実施形態では、本発明のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の参照ポリペプチドと比べてその改善された活性、選択性および/または他の改善された特性を保持するように、固体支持体に固定化することができる。斯かる実施形態では、固定化されたポリペプチドは、基質化合物または他の適した基質から産物への生体触媒変換を容易にすることができ、反応が完了した後に、容易に保持され(例えば、ポリペプチドが固定化されたビーズを保持することにより)、次いでその後の反応において再利用またはリサイクルされる。斯かる固定化された酵素のプロセスは、さらなる効率と、コスト削減を可能にする。したがって、本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用する方法のいずれも、固体支持体に結合または固定化された同じプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用して実行することができることがさらに企図される。
酵素固定化方法は、当技術分野で周知である。操作されたポリペプチドは、非共有結合または共有結合により結合され得る。固体支持体(例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラス等)への酵素のコンジュゲーションおよび固定化のための様々な方法は、当技術分野で周知である(例えば、Yi et al., Proc. Biochem., 42(5): 895-898 [2007];Martin et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 76(4): 843-851 [2007];Koszelewski et al., J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 63: 39-44 [2010];Truppo et al., Org. Proc. Res. Dev., published online: dx.doi.org/10.1021/op200157c;Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2nd ed., Academic Press, Cambridge, MA [2008];Mateo et al., Biotechnol. Prog., 18(3):629-34 [2002];および”Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods,” In Methods in Molecular Biology, Niemeyer (ed.), Humana Press, New York, NY [2004]を参照;これらそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)。本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼの固定化に有用な固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン/DVBコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂を含むがこれらに限定されない。本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの固定化に有用な例示的な固体支持体は、キトサンビーズ、Eupergit C、ならびに次の異なる型のSEPABEAD:EC-EP、EC-HFA/S、EXA252、EXE119およびEXE120を含むSEPABEAD(Mitsubishi)を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチドは、キットの形態で提供される。キットにおける酵素は、個々にまたは複数の酵素として存在することができる。キットは、酵素反応を実行するための試薬、酵素の活性を評価するための基質、および産物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットは、試薬ディスペンサー、およびキットの使用のための指示を含むこともできる。
一部の実施形態では、本発明のキットは、異なるアドレス可能な位置に複数の異なるプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドは、少なくとも1種の異なる改善された酵素特性をそれぞれ有する参照配列の異なるバリアントである。一部の実施形態では、固体支持体に固定化された複数のポリペプチドは、ロボットによる試薬送達のためにまたは検出方法および/もしくは機器によってアドレス可能な、様々な場所におけるアレイで構成される。アレイを使用して、ポリペプチドによる変換について種々の基質化合物を検査することができる。複数の操作されたポリペプチドを含む斯かるアレイおよびその使用方法は、当技術分野で公知である(例えば、WO2009/008908A2を参照)。
操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を制御する1個または複数の異種調節配列に作動可能に連結して、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを創出することができる。操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を制御する1個または複数の異種調節配列に作動可能に連結して、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを創出することができる。操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させる。
当業者には明らかな通り、タンパク質配列の利用可能性、および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドの記載を提供する。代替または同義コドンによって同じアミノ酸がコードされるという遺伝暗号の縮重は、全て改善されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードする極めて多数の核酸の作製を可能にする。よって、特定のアミノ酸配列の知識を有するため、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない仕方で1種または複数のコドンの配列を単純に修飾することにより、いくつもの異なる核酸を作製することができる。この点について、本発明は特に、可能なコドン選択に基づき組合せを選択することにより、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする、作製することができるポリヌクレオチドのありとあらゆる可能なバリエーションを具体的に企図し、あらゆる斯かるバリエーションは、表4.1、4.2、4.3、4.4、5.1、5.2、5.3、6.1、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、9.1、9.2、10.1、10.2、11.1、11.2および/または12.1に提示されており、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列として参照により本明細書に組み込まれる配列表に開示されているアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチドのために具体的に開示されていると考慮されるべきである。
様々な実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生される宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において遺伝子を発現させるために、細菌において使用される好まれるコドンが使用され;酵母において使用される好まれるコドンが、酵母における発現に使用され;哺乳動物において使用される好まれるコドンが、哺乳動物細胞における発現に使用される。一部の実施形態では、天然の配列は、好まれるコドンを含むであろうことから、また、全てのアミノ酸残基に対して好まれるコドンの使用が要求されない場合があるため、プロリンヒドロキシラーゼのコドン使用を最適化するために、全てのコドンが置き換えられる必要はない。結果的に、プロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約40%、50%、60%、70%、80%または90%超において、好まれるコドンを含有することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630によって表される天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドアミノ酸配列をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列をコードするコドン最適化された核酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を含む核酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、次の範囲:配列番号5~657における奇数番号の配列におけるコドン最適化された核酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を含む核酸配列を有する。次の範囲:配列番号5~657における奇数番号の配列のコドン最適化された配列は、コードされた野生型プロリンヒドロキシラーゼの発現を増強し、ミニDSPアッセイ(mini-DSP Assay)条件下で化合物L-プロリンの80%超を産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンにin vitroで変換し、DSPアッセイ条件下で化合物L-プロリンの45%超を産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる酵素の調製物を提供する。一部の実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、真菌種番号11243由来のANOの天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも1.2倍、1.5倍もしくは2倍またはそれよりも多く、プロリンヒドロキシラーゼの発現を増強することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号3~657における奇数番号の配列から選択される参照配列またはその相補体にハイブリダイズすることができ、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、上に記載されている通り、ポリヌクレオチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較して1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630から選択される参照配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列から選択される配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較した1個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列から選択される。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号4である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号116である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号162である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号322である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号412である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号492である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号562である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号598である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号630である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の参照ポリペプチドと比較して改善された酵素特性を有する、基質化合物L-プロリンを産物化合物トランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列のうちいずれか1種から選択される参照ポリペプチドに対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、アミノ酸配列が、表4.1、4.2、4.3、4.4、5.1、5.2、5.3、6.1、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、9.1、9.2、10.1、10.2、11.1、11.2および/または12.1に収載される通り、次の範囲:配列番号6~658における偶数番号の配列由来のポリペプチド配列のうちいずれか1種に含有される配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較した残基差異のセットのうちいずれか1種を含むことを条件とする。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、次の範囲:配列番号5~657における奇数番号の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、次の範囲:配列番号5~657における奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズすることができ、本明細書に記載されている改善された特性のうち1種または複数を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21、28、58/247、65、80、85、95、98、117、120、159、185、194、199、200、233、237、243、250、268、281、282、287、289、307、324、326、327、330、338、343、346および348から選択される残基位置における、または21、28、45、65、95、112、117、139、177、185、199、233、243、250、281、282、287、289、307、324、326、327、335、338、343および346から選択される残基位置における、または48/66/189/194、48/66/194および66/82/85/135/189/194/267から選択される残基位置における、または20/56/76/168/169/296、20/56/232/294、20/119/294/296、56/76/119/124/147/232、56/76/294、76/168/232/294、76/294/296、76/296、147および232から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに123、189、195、233および296から選択される残基位置における、または20/21/56、20/21/56/76/95/232/294/307/335、20/21/56/76/147/225/232/233/281/294/296/307/335、20/21/56/95/147/281/294/307、20/21/56/281/307、20/21/76/232/243、20/21/95/232/307、20/21/95/281/294/296、20/21/147/189/233/243/281/307、20/56、20/56/76/95/281/307、20/56/76/147/294/296/307、20/56/95/147/294、20/56/281、20/76、20/76/95/281/294/296、20/76/95/281/296/307、20/76/233/294/307、20/76/243/281/294、21/76/147/233/294/307、21/76/147/243/296/307/335、21/95/185/189/232/281/296、21/95/233/243/281/296、21/95/294/296/307/335、21/95/307、21/281/307、29/76/281、56/76/95/232/243/281、56/76/147/281/307、56/76/243/294、56/76/281/294、56/76/296、56/76/307、56/95/147/307/335/348、56/95/232/233/281/294/307、56/95/243/281、56/147/281、56/232/243/281、56/232/281、56/232/281/294/296、56/233/281/294/296、56/281/307、76/95/232/243/281/307、76/95/243/281/307/335、76/95/294/307、76/147、76/147/233/243/294、76/147/233/281/294/307、76/147/243/294/296/307/335、76/147/281/307、76/189/296、76/232/233/243/294/296/307、76/281、76/281/294、76/294/296、95/120、95/147/335、95/232/243/281/294/307、95/232/281/294/296、95/281/294/296、95/335、147、147/225/232/243/281/296/307/335、147/233/243/281/307、147/233/281/307/335、147/243/281、147/307、232/233/281/294/296/307、232/281、232/284/307、233/243/281/296/307/335、233/281/296/307、243/281/294/296、281、281/294、281/307、307および335から選択される残基位置における、または21/76/147/243/296/307/335、56/76/147/281/307および95/147/335から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号162に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに2/85/123/237、28/115/117/120/123/268/270/343/346/348、45/123/326、65/117/120/123/343/346、85/123/281/282、114/115/117/120/123/268/271/313/326/343/346、123/139/233/237/281/282/289/324/326および123/199/200/247/250/338から選択される残基位置における、配列番号162と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに26、54、61、129、132、149、156、175、189、201、209、228、236、248、262、272、277、291および345から選択される残基位置における、または25、43、54、58、61、79、129、132、143、156、163、175、179、201、209、236、248、278、291、345および347から選択される残基位置における、または85/117/120/135/208/270/324/343/346、85/117/120/135/208/281/282/289、85/117/120/270/281/289、85/117/135/139/208および117/120/208/270/324/343/346から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47、48、56/118、85、95、95/289、113、118、118/247、154、162、162/204、164、164/198/271、168、169、187、195、243、271、275、281、314、330および342から選択される残基位置における、または25/129/163/236/262/345/347、120/156/175/179/201、129/189/236/262/277/278、129/236/262、156/175/179/228および162から選択される残基位置における、配列番号412と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15、17、28、29、65、135、167、177、199、208、228、235、287、294、307および343から選択される残基位置における、または85/187/281/347、85/187/347、118/120/162/175/179/330、118/120/162/175/330、162/175/179/330、175/228/330、195/347および278/314/347から選択される残基位置における、配列番号492と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15、40、43、44、59、79、82、149、164、179、345および347から選択される残基位置における、または29/85/177/208/228/347、29/85/208/228/343/347、29/177/195/228/343、29/208/228/278/294/347、56/195/278、85/187/205/208/278、113/177/187/195/208/278/294/343/347および177/205/208/228から選択される残基位置における、配列番号562と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47、162、209、219、227および342から選択される残基位置における、または17/44/179/195/250/313/345、17/44/199/313、43/44/195/199、44/149/164/171/187、44/179/195/199、44/179/195/199/345、79/163/164/171/187/201/286/288、82/163/164、82/163/164/171/187/201/203/208/286/288/320、149/164/171/288および187/286から選択される残基位置における、配列番号598と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号630に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに82/164/171/203/208、135/163/164/201/203/208、162、162/219/236、162/219/313/338、162/236/342、162/313/342および164/171/201/203/282から選択される残基位置における、配列番号630と比較した1個または複数の残基差異を含む、1種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているポリペプチドをコードするが、ヌクレオチドレベルで、操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、範囲、配列番号3~657における奇数番号の配列から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に提供される操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすように種々の仕方で操作される。一部の実施形態では、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を調節するために1種または複数の制御配列が存在する、発現ベクターとして提供される。単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に操作することが、発現ベクターに応じて望ましくなるまたは必要となる場合がある。組換えDNA法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技法は、当技術分野で周知である。
一部の実施形態では、制御配列は、配列の中でもとりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターを含む。当技術分野で公知の通り、適したプロモーターは、使用される宿主細胞に基づき選択することができる。細菌宿主細胞のため、本願の核酸構築物の転写を方向付けるのに適したプロモーターは、E.coli lacオペロン、Streptomyces coelicolorアガラーゼ(agarase)遺伝子(dagA)、Bacillus subtilisレバンスクラーゼ(levansucrase)遺伝子(sacB)、Bacillus licheniformisアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、Bacillus stearothermophilusマルトース生成(maltogenic)アミラーゼ遺伝子(amyM)、Bacillus amyloliquefaciensアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、Bacillus licheniformisペニシリナーゼ遺伝子(penP)、Bacillus subtilis xylAおよびxylB遺伝子ならびに原核生物ベータ-ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター(例えば、Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978]を参照)、ならびにtacプロモーター(例えば、DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]を参照)を含むがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性アルファ-アミラーゼ、Aspergillus niger酸安定性アルファ-アミラーゼ、Aspergillus nigerまたはAspergillus awamoriグルコアミラーゼ(glaA)、Rhizomucor mieheiリパーゼ、Aspergillus oryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、Aspergillus nidulansアセトアミダーゼ(acetamidase)およびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター(例えば、WO96/00787を参照)ならびにNA2-tpiプロモーター(Aspergillus niger中性アルファ-アミラーゼおよびAspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド)、ならびにこれらの変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む。例示的な酵母細胞プロモーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiaeガラクトキナーゼ(GAL1)、Saccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)およびSaccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野で公知である(例えば、Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]を参照)。
一部の実施形態では、制御配列は、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列である、適した転写ターミネーター配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に作動可能に連結される。選択宿主細胞において機能的であるいかなるターミネーターも、本発明における用途を見出す。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Aspergillus nigerアルファ-グルコシダーゼおよびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ、Saccharomyces cerevisiaeチトクロムC(CYC1)およびSaccharomyces cerevisiaeグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野で公知である(例えば、Romanos et al.、上記を参照)。
一部の実施形態では、制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要なmRNAの非翻訳領域である、適したリーダー配列である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に作動可能に連結される。選択宿主細胞において機能的であるいかなるリーダー配列も使用されてもよい。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼおよびAspergillus nidulansトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適したリーダーは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、Saccharomyces cerevisiaeアルファ-因子およびSaccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)の遺伝子から得られるリーダーを含むがこれらに限定されない。
制御配列は、核酸配列の3’末端に作動可能に連結した配列であり、転写されるときに、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される、ポリアデニル化配列であってもよい。選択宿主細胞において機能的であるいかなるポリアデニル化配列も、本発明において使用されてもよい。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼおよびAspergillus nigerアルファ-グルコシダーゼの遺伝子由来のポリアデニル化配列を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列もまた、当技術分野で公知である(例えば、Guo and Sherman, Mol. Cell. Bio., 15:5983-5990 [1995]を参照)。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付ける、シグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、翻訳読み枠において天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含有することができる。その代わりに、コード配列の5’末端は、コード配列にとって外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有することができる。発現されたポリペプチドを選択宿主細胞の分泌経路に方向付けるいかなるシグナルペプチドコード領域も、本明細書に提供される操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの発現のための用途を見出す。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Bacillus NClB 11837マルトース生成アミラーゼ、Bacillus stearothermophilusアルファ-アミラーゼ、Bacillus licheniformisスブチリシン、Bacillus licheniformisベータ-ラクタマーゼ、Bacillus stearothermophilus中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)およびBacillus subtilis prsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域を含むがこれらに限定されない。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野で公知である(例えば、Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]を参照)。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼおよびHumicola lanuginosaリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Saccharomyces cerevisiaeアルファ-因子およびSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼの遺伝子由来のシグナルペプチドを含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。結果として得られるポリペプチドは、場合により「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒的切断によって、成熟した活性ポリペプチドへと変換され得る。プロペプチドコード領域は、Bacillus subtilisアルカリプロテアーゼ(aprE)、Bacillus subtilis中性プロテアーゼ(nprT)、Saccharomyces cerevisiaeアルファ-因子、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼおよびMyceliophthora thermophilaラクターゼの遺伝子を含むがこれらに限定されない(例えば、WO95/33836を参照)。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
一部の実施形態では、調節配列も利用される。このような配列は、宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにする調節系である。原核宿主細胞において、適した調節配列は、lac、tacおよびtrpオペレーター系を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞において、適した調節系は、ADH2系またはGAL1系を含むがこれらに限定されない。糸状菌において、適した調節配列は、TAKAアルファ-アミラーゼプロモーター、Aspergillus nigerグルコアミラーゼプロモーターおよびAspergillus oryzaeグルコアミラーゼプロモーターを含むがこれらに限定されない。
別の態様では、本発明はまた、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれが導入される宿主の型に応じて、プロモーターおよびターミネーター等の1種または複数の発現調節領域、複製起点等を含む組換え発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、上に記載されている様々な核酸および制御配列を、互いに組み合わせて、当該部位におけるバリアントプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする、1個または複数の便利な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生する。その代わりに、本発明のポリヌクレオチド配列(複数可)は、ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することにより発現される。発現ベクターの創出において、コード配列が、発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列は、ベクターに配置される。
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に便利に供することができ、バリアントプロリンヒドロキシラーゼポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、いずれかのベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入されるべき宿主細胞とベクターの適合性に依存するであろう。ベクターは、直鎖状または閉環状プラスミドであり得る。
一部の実施形態では、発現ベクターは、自律的に複製するベクター(すなわち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体等、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外の実体として存在するベクター)である。ベクターは、自己複製を保証するためのいずれかの手段を含有することができる。一部の代替実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体(複数可)と共に複製される、ベクターであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入されるべき総DNAを一緒に含有する2種もしくはそれよりも多いベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
一部の実施形態では、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする、1種または複数の選択可能マーカーを含有する。「選択可能マーカー」は、その産物が、殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性、その他を提供する、遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例は、Bacillus subtilisもしくはBacillus licheniformis由来のdal遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン抵抗性等の抗生物質抵抗性を付与するマーカーを含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための適したマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3を含むがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞における使用のための選択可能マーカーは、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、ならびにこれらの等価物を含むがこれらに限定されない。別の態様では、本発明は、本願の少なくとも1種の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞における操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素(複数可)の発現のための1種または複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、E. coli、Vibrio fluvialis、StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞等の細菌細胞;酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastoris[ATCC受託番号201178])等の真菌細胞;Drosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞等の昆虫細胞;CHO、COS、BHK、293およびBowes黒色腫細胞等の動物細胞;ならびに植物細胞を含むがこれらに限定されない。例示的な宿主細胞は、Escherichia coli株(例えば、W3110(ΔfhuA)およびBL21)である。
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを産生するための方法であって、ポリペプチドの発現に適した条件下で、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されている通りにプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを単離および/または精製するステップをさらに含む。
上述の宿主細胞のための適切な培養培地および育成条件は、当技術分野で周知である。プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法によって細胞に導入することができる。技法は、とりわけ、電気穿孔、微粒子銃(biolistic particle bombardment)、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合を含む。
本明細書に開示されている特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、天然に存在するまたは操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知であり本明細書に記載されている変異誘発および/または定向進化方法に供することにより得ることができる。例示的な定向進化技法は、変異誘発および/またはDNAシャッフリング(例えば、Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994];WO95/22625;WO97/0078;WO97/35966;WO98/27230;WO00/42651;WO01/75767および米国特許第6,537,746号を参照)である。使用することができる他の定向進化手順は、とりわけ、ずらした伸長プロセス(staggered extension process)(StEP)、in vitro組換え(例えば、Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998]を参照)、変異原性PCR(例えば、Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994]を参照)およびカセット変異誘発(例えば、Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996]を参照)を含む。
一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを、上に記述されている通りに、変異誘発および/または定向進化方法に供することによって得られる。変異誘発は、ランダムなおよび部位特異的な変異誘発を含む、当技術分野で公知の技法のいずれかに従って行うことができる。定向進化は、シャッフリングを含む、改善されたプロモーターバリアントについてスクリーニングするための当技術分野で公知の技法のいずれかにより行うことができる。変異誘発および定向進化方法は、当技術分野で周知である(例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,605,793号、同第5,811,238号、同第5,830,721号、同第5,834,252号、同第5,837,458号、同第5,928,905号、同第6,096,548号、同第6,117,679号、同第6,132,970号、同第6,165,793号、同第6,180,406号、同第6,251,674号、同第6,265,201号、同第6,277,638号、同第6,287,861号、同第6,287,862号、同第6,291,242号、同第6,297,053号、同第6,303,344号、同第6,309,883号、同第6,319,713号、同第6,319,714号、同第6,323,030号、同第6,326,204号、同第6,335,160号、同第6,335,198号、同第6,344,356号、同第6,352,859号、同第6,355,484号、同第6,358,740号、同第6,358,742号、同第6,365,377号、同第6,365,408号、同第6,368,861号、同第6,372,497号、同第6,337,186号、同第6,376,246号、同第6,379,964号、同第6,387,702号、同第6,391,552号、同第6,391,640号、同第6,395,547号、同第6,406,855号、同第6,406,910号、同第6,413,745号、同第6,413,774号、同第6,420,175号、同第6,423,542号、同第6,426,224号、同第6,436,675号、同第6,444,468号、同第6,455,253号、同第6,479,652号、同第6,482,647号、同第6,483,011号、同第6,484,105号、同第6,489,146号、同第6,500,617号、同第6,500,639号、同第6,506,602号、同第6,506,603号、同第6,518,065号、同第6,519,065号、同第6,521,453号、同第6,528,311号、同第6,537,746号、同第6,573,098号、同第6,576,467号、同第6,579,678号、同第6,586,182号、同第6,602,986号、同第6,605,430号、同第6,613,514号、同第6,653,072号、同第6,686,515号、同第6,703,240号、同第6,716,631号、同第6,825,001号、同第6,902,922号、同第6,917,882号、同第6,946,296号、同第6,961,664号、同第6,995,017号、同第7,024,312号、同第7,058,515号、同第7,105,297号、同第7,148,054号、同第7,220,566号、同第7,288,375号、同第7,384,387号、同第7,421,347号、同第7,430,477号、同第7,462,469号、同第7,534,564号、同第7,620,500号、同第7,620,502号、同第7,629,170号、同第7,702,464号、同第7,747,391号、同第7,747,393号、同第7,751,986号、同第7,776,598号、同第7,783,428号、同第7,795,030号、同第7,853,410号、同第7,868,138号、同第7,783,428号、同第7,873,477号、同第7,873,499号、同第7,904,249号、同第7,957,912号、同第7,981,614号、同第8,014,961号、同第8,029,988号、同第8,048,674号、同第8,058,001号、同第8,076,138号、同第8,108,150号、同第8,170,806号、同第8,224,580号、同第8,377,681号、同第8,383,346号、同第8,457,903号、同第8,504,498号、同第8,589,085号、同第8,762,066号、同第8,768,871号、同第9,593,326号、ならびにあらゆる関連非US対応物;Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997];Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996];Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985];Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985];Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986];Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984];Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985];Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3: 284-290 [1999];Christians et al., Nat. Biotechnol., 17: 259-264 [1999];Crameri et al., Nature, 391: 288-291 [1998];Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997];Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997];Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996];Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994];Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994];WO95/22625;WO97/0078;WO97/35966;WO98/27230;WO00/42651;WO01/75767;およびWO2009/152336を参照)。
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られる酵素クローンは、酵素を規定された温度(または広範囲の基質にわたる酵素の活性の検査等、他のアッセイ条件)に付し、熱処理または他のアッセイ条件後に残っている酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次に、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを配列決定して、ヌクレオチド配列変化(あるとすれば)を同定し、宿主細胞における酵素の発現に使用する。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当技術分野で公知のいずれか適した方法(例えば、HPLC解析等、標準生化学技法)を使用して行うことができる。
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られるクローンは、1種または複数の所望の改善された酵素特性(例えば、改善された位置選択性)を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼについてスクリーニングすることができる。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、例えば、塩化ダンシルまたはOPAを使用した、産物のHPLC解析および/または誘導体化(分離前または後)等、標準生化学技法を使用して行うことができる(例えば、Yaegaki et al., J Chromatogr. 356(1):163-70 [1986]を参照)。
操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知合成方法に従って標準固相方法によって調製することができる。一部の実施形態では、最大で約100塩基の断片を個々に合成し、次いで連結して(例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション(litigation)方法、またはポリメラーゼ媒介性方法によって)、いずれか所望の連続した配列を形成することができる。例えば、プロリンヒドロキシラーゼの部分をコードするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、自動化された合成方法において典型的に実施される通り、当技術分野で公知の化学合成(例えば、Beaucage et al., Tet. Lett. 22:1859-69 [1981]の古典的ホスホルアミダイト方法、またはMatthes et al., EMBO J. 3:801-05 [1984]によって記載された方法)によって調製することができる。ホスホルアミダイト方法に従い、オリゴヌクレオチドが合成され(例えば、自動DNA合成機において)、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローニングされる。加えて、本質的にいかなる核酸も、種々の商業的供給源のいずれから得ることもできる。一部の実施形態では、欠失、挿入および/または置換を含有するオリゴヌクレオチドを合成し、様々な並べ替えでオリゴヌクレオチドを組み合わせて、1種または複数の改善された特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼを創出することによって、追加的なバリエーションを創出することができる。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、21、28、58/247、65、80、85、95、98、117、120、159、185、194、199、200、233、237、243、250、268、281、282、287、289、307、324、326、327、330、338、343、346および348から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、21、28、45、65、95、112、117、139、177、185、199、233、243、250、281、282、287、289、307、324、326、327、335、338、343および346から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、48/66/189/194、48/66/194および66/82/85/135/189/194/267から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、20/56/76/168/169/296、20/56/232/294、20/119/294/296、56/76/119/124/147/232、56/76/294、76/168/232/294、76/294/296、76/296、147および232から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、123、189、195、233および296から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、20/21/56、20/21/56/76/95/232/294/307/335、20/21/56/76/147/225/232/233/281/294/296/307/335、20/21/56/95/147/281/294/307、20/21/56/281/307、20/21/76/232/243、20/21/95/232/307、20/21/95/281/294/296、20/21/147/189/233/243/281/307、20/56、20/56/76/95/281/307、20/56/76/147/294/296/307、20/56/95/147/294、20/56/281、20/76、20/76/95/281/294/296、20/76/95/281/296/307、20/76/233/294/307、20/76/243/281/294、21/76/147/233/294/307、21/76/147/243/296/307/335、21/95/185/189/232/281/296、21/95/233/243/281/296、21/95/294/296/307/335、21/95/307、21/281/307、29/76/281、56/76/95/232/243/281、56/76/147/281/307、56/76/243/294、56/76/281/294、56/76/296、56/76/307、56/95/147/307/335/348、56/95/232/233/281/294/307、56/95/243/281、56/147/281、56/232/243/281、56/232/281、56/232/281/294/296、56/233/281/294/296、56/281/307、76/95/232/243/281/307、76/95/243/281/307/335、76/95/294/307、76/147、76/147/233/243/294、76/147/233/281/294/307、76/147/243/294/296/307/335、76/147/281/307、76/189/296、76/232/233/243/294/296/307、76/281、76/281/294、76/294/296、95/120、95/147/335、95/232/243/281/294/307、95/232/281/294/296、95/281/294/296、95/335、147、147/225/232/243/281/296/307/335、147/233/243/281/307、147/233/281/307/335、147/243/281、147/307、232/233/281/294/296/307、232/281、232/284/307、233/243/281/296/307/335、233/281/296/307、243/281/294/296、281、281/294、281/307、307および335から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、21/76/147/243/296/307/335、56/76/147/281/307および95/147/335から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、2/85/123/237、28/115/117/120/123/268/270/343/346/348、45/123/326、65/117/120/123/343/346、85/123/281/282、114/115/117/120/123/268/271/313/326/343/346、123/139/233/237/281/282/289/324/326および123/199/200/247/250/338から選択される残基位置における、配列番号162と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、26、54、61、129、132、149、156、175、189、201、209、228、236、248、262、272、277、291および345から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、25、43、54、58、61、79、129、132、143、156、163、175、179、201、209、236、248、278、291、345および347から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、85/117/120/135/208/270/324/343/346、85/117/120/135/208/281/282/289、85/117/120/270/281/289、85/117/135/139/208および117/120/208/270/324/343/346から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、47、48、56/118、85、95、95/289、113、118、118/247、154、162、162/204、164、164/198/271、168、169、187、195、243、271、275、281、314、330および342から選択される残基位置における、配列番号412と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、25/129/163/236/262/345/347、120/156/175/179/201、129/189/236/262/277/278、129/236/262、156/175/179/228および162から選択される残基位置における、配列番号412と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、15、17、28、29、65、135、167、177、199、208、228、235、287、294、307および343から選択される残基位置における、配列番号492と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、85/187/281/347、85/187/347、118/120/162/175/179/330、118/120/162/175/330、162/175/179/330、175/228/330、195/347および278/314/347から選択される残基位置における、配列番号492と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、15、40、43、44、59、79、82、149、164、179、345および347から選択される残基位置における、配列番号562と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、29/85/177/208/228/347、29/85/208/228/343/347、29/177/195/228/343、29/208/228/278/294/347、56/195/278、85/187/205/208/278、113/177/187/195/208/278/294/343/347および177/205/208/228から選択される残基位置における、配列番号562と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、47、162、209、219、227および342から選択される残基位置における、配列番号598と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、17/44/179/195/250/313/345、17/44/199/313、43/44/195/199、44/149/164/171/187、44/179/195/199、44/179/195/199/345、79/163/164/171/187/201/286/288、82/163/164、82/163/164/171/187/201/203/208/286/288/320、149/164/171/288および187/286から選択される残基位置における、配列番号598と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)配列番号4~658の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、82/164/171/203/208、135/163/164/201/203/208、162、162/219/236、162/219/313/338、162/236/342、162/313/342および164/171/201/203/282から選択される残基位置における、配列番号630と比較した1個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、(b)ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。
方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、必要に応じて1個またはいくつかの(例えば、最大で3、4、5または最大で10個の)アミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードする。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45または1~50個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45または50個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換であり得る。
一部の実施形態では、宿主細胞において発現された操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素のいずれかは、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知技法のうちいずれか1種または複数を使用して、細胞および/または培養培地から回収することができる。E.coli等の細菌の溶解およびE.coli等の細菌からのタンパク質の高効率抽出のための適した溶液は、市販されている(例えば、CelLytic B(商標)、Sigma-Aldrich、St.Louis MO)。
プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法は、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および親和性クロマトグラフィーを含む。特定の酵素を精製するための条件は、部分的に、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等の因子に依存し、当業者には明らかとなるであろう。
一部の実施形態では、親和性技法を使用して、改善されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素を単離することができる。親和性クロマトグラフィー精製のため、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合するいずれかの抗体を使用することができる。抗体の産生のため、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはその断片による注射によって、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない、様々な宿主動物を免疫化することができる。プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に取り付けられたリンカーを用いて、BSA等の適した担体に取り付けることができる。一部の実施形態では、親和性精製は、ポリ(L-プロリン)または色素親和性カラム等、プロリンヒドロキシラーゼによって結合された特異的リガンドを使用することができる(例えば、EP0641862;Stellwagen, ”Dye Affinity Chromatography,” In Current Protocols in Protein Science, Unit 9.2-9.2.16 [2001]を参照)。
操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素を使用する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載されているプロリンヒドロキシラーゼは、適した基質をそのヒドロキシル化産物に変換するためのプロセスにおいて用途を見出す。一般に、ヒドロキシル化反応を行うためのプロセスは、上のスキーム1に示す通り、ヒドロキシル化産物の形成に適した反応条件下で、α-ケトグルタレート等の補助基質の存在下で基質化合物を本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドと接触させるまたはインキュベートするステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているプロリンヒドロキシラーゼは、適した基質をそのヒドロキシル化産物に変換するためのプロセスにおいて用途を見出す。一般に、ヒドロキシル化反応を行うためのプロセスは、上のスキーム1に示す通り、ヒドロキシル化産物の形成に適した反応条件下で、α-ケトグルタレート等の補助基質の存在下で基質化合物を本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドと接触させるまたはインキュベートするステップを含む。
本明細書に提供され、実施例において説明される実施形態では、プロセスにおいて使用することができる様々な範囲の適した反応条件は、基質負荷、補助基質負荷、還元剤、二価遷移金属、pH、温度、緩衝液、溶媒系、ポリペプチド負荷および反応時間を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用した基質化合物から産物化合物への生体触媒変換のためのプロセスを実行するためのさらに適した反応条件は、濃度、pH、温度および溶媒条件の実験的反応条件下で操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドおよび基質化合物を接触させるステップと、産物化合物を検出するステップを含むがこれらに限定されない、慣例的な実験法によって、本明細書に提供されるガイダンスを考慮して容易に最適化することができる。
操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用した適した反応条件は典型的に、ヒドロキシル化反応において化学量論的に使用される補助基質を含む。一般に、プロリンヒドロキシラーゼのための補助基質は、α-ケトグルタル酸および2-オキソグルタル酸とも称されるα-ケトグルタレートである。プロリンヒドロキシラーゼのための補助基質として働くことができるα-ケトグルタレートの他のアナログを使用することができる。補助基質として働くことができる例示的なアナログは、α-オキソアジペートである。補助基質は、化学量論的に使用されるため、補助基質は、基質化合物と等モル濃度またはそれよりも多い量で存在する(すなわち、補助基質のモル濃度は、基質化合物のモル濃度に等しいまたはそれよりも高い)。一部の実施形態では、適した反応条件は、基質化合物のモル濃度の少なくとも1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍もしくは5倍またはそれよりも多い補助基質モル濃度を含むことができる。一部の実施形態では、適した反応条件は、約0.001M~約2M、0.01M~約2M、0.1M~約2M、0.2M~約2M、約0.5M~約2Mまたは約1M~約2Mの補助基質濃度、特に、アルファ-ケトグルタレートを含むことができる。一部の実施形態では、反応条件は、約0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1、1.5または2Mの補助基質濃度を含む。一部の実施形態では、反応中に追加的な補助基質を添加することができる。
反応混合物中の基質化合物は、例えば、産物化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の効果、反応条件下での酵素の安定性、および基質から産物へのパーセント変換を考慮に入れつつ変動させることができる。一部の実施形態では、適した反応条件は、少なくとも約0.5~約200g/L、1~約200g/L、5~約150g/L、約10~約100g/L、20~約100g/Lまたは約50~約100g/Lの基質化合物負荷を含む。一部の実施形態では、適した反応条件は、少なくとも約0.5g/L、少なくとも約1g/L、少なくとも約5g/L、少なくとも約10g/L、少なくとも約15g/L、少なくとも約20g/L、少なくとも約30g/L、少なくとも約50g/L、少なくとも約75g/L、少なくとも約100g/L、少なくとも約150g/Lもしくは少なくとも約200g/Lまたはそれよりもさらに多い基質化合物負荷を含む。本明細書に提供される基質負荷の値は、L-プロリンの分子量に基づくが、L-プロリンの等モル濃度量の様々な水和物および塩をプロセスにおいて使用することもできることも企図される。
本明細書に記載されているプロリンヒドロキシラーゼ媒介性プロセスの実行において、操作されたポリペプチドは、精製された酵素、部分的に精製された酵素、酵素をコードする遺伝子(複数可)で形質転換された細胞全体の形態で、斯かる細胞の細胞抽出物および/もしくはライセートとして、ならびに/または固体支持体に固定化された酵素として、反応混合物に添加することができる。操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードする遺伝子(複数可)で形質転換された細胞全体、またはその細胞抽出物、ライセート、および単離された酵素は、固体(例えば、凍結乾燥された、噴霧乾燥された、その他)または半固体(例えば、粗ペースト)を含む種々の異なる形態で用いることができる。細胞抽出物または細胞ライセートは、沈殿(硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理その他と、それに続く、凍結乾燥に先立つ脱塩手順(例えば、限外濾過、透析等)によって部分的に精製することができる。酵素調製物(細胞全体の調製物を含む)のいずれかは、例えば、グルタルアルデヒド等の公知架橋剤を使用した架橋、または固相(例えば、Eupergit Cその他)への固定化によって安定化することができる。
操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子(複数可)は、宿主細胞へと、別々に、または同じ宿主細胞に一緒に形質転換することができる。例えば、一部の実施形態では、1セットの宿主細胞は、1種の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子(複数可)で形質転換することができ、別のセットは、別の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子(複数可)で形質転換することができる。両方のセットの形質転換細胞は、細胞全体の形態で、またはそれから得られるライセートもしくは抽出物の形態で、反応混合物において一緒に利用することができる。他の実施形態では、宿主細胞は、複数の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子(複数可)で形質転換することができる。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、分泌ポリペプチドの形態で発現させることができ、分泌ポリペプチドを含有する培養培地は、プロリンヒドロキシラーゼ反応に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの改善された活性および/または選択性は、より高いパーセンテージ変換がより低い濃度の操作されたポリペプチドにより達成され得る、プロセスを提供する。プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、基質化合物負荷の約1%(w/w)、2%(w/w)、5%(w/w)、10%(w/w)、20%(w/w)、30%(w/w)、40%(w/w)、50%(w/w)、75%(w/w)、100%(w/w)またはそれよりも多い操作されたポリペプチド量を含む。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、約0.01g/L~約50g/L;約0.05g/L~約50g/L;約0.1g/L~約40g/L;約1g/L~約40g/L;約2g/L~約40g/L;約5g/L~約40g/L;約5g/L~約30g/L;約0.1g/L~約10g/L;約0.5g/L~約10g/L;約1g/L~約10g/L;約0.1g/L~約5g/L;約0.5g/L~約5g/L;または約0.1g/L~約2g/Lで存在する。一部の実施形態では、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、約0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、1、2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/Lまたは50g/Lで存在する。
一部の実施形態では、反応条件は、酸化反応における補助因子として働くことができる二価遷移金属も含む。一般に、二価遷移金属補助因子は、二価鉄イオン(すなわち、Fe+2)である。二価鉄イオンは、硫酸第一鉄(FeSO4)、塩化第一鉄(FeCl2)、炭酸第一鉄(FeCO3)、ならびにクエン酸塩、乳酸塩およびフマル酸塩等の有機酸の塩等、様々な形態で提供することができる。硫酸第一鉄の例示的な供給源は、モール塩であり、これは、硫酸第一鉄アンモニウム(NH4)2Fe(SO4)2であり、無水物および水和(すなわち、六水和物)形態で利用できる。二価鉄イオンは、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼにおいて見出される遷移金属補助因子であり、操作された酵素において効率的に機能するが、補助因子として作用することができる他の二価遷移金属をプロセスにおいて使用することができることを理解されたい。一部の実施形態では、二価遷移金属補助因子は、Mn+2およびCr+2を含むことができる。一部の実施形態では、反応条件は、約0.1mM~10mM、0.1mM~約5mM、0.5mM~約5mM、約0.5mM~約3mMまたは約1mM~約2mMの濃度で、二価遷移金属補助因子、特にFe+2を含むことができる。一部の実施形態では、反応条件は、約0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM、7.5mMまたは10mMの二価遷移金属補助因子濃度を含む。一部の実施形態では、より高濃度の二価遷移金属補助因子、例えば、最大で50mMまたは最大で100mMを使用することができる。
一部の実施形態では、反応条件は、三価鉄(ferric)イオン、Fe+3を二価鉄イオン、Fe+2に還元することができる還元剤をさらに含むことができる。一部の実施形態では、還元剤は、アスコルビン酸、典型的には、L-アスコルビン酸を含む。アスコルビン酸は、ヒドロキシル化反応に要求されないが、酵素活性は、その存在下で増強される。理論に制約されることなく、アスコルビン酸塩は、ヒドロキシル化反応を媒介する活性形態である酵素-Fe+2形態を維持または再生すると考えられる。一般に、反応条件は、基質負荷に比例して対応するアスコルビン酸濃度を含むことができる。一部の実施形態では、アスコルビン酸は、基質のモル濃度量の少なくとも約0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.5倍、0.75倍、1倍、1.5倍または少なくとも2倍で存在する。一部の実施形態では、還元剤、特に、L-アスコルビン酸は、約0.001M~約0.5M、約0.01M~約0.5M、約0.01M~約0.4M、約0.1~約0.4Mまたは約0.1~約0.3Mの濃度である。一部の実施形態では、還元剤、特に、アスコルビン酸は、約0.001M、0.005M、0.01M、0.02M、0.03M、0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.3M、0.4Mまたは0.5Mの濃度である。
一部の実施形態では、反応条件は、分子状酸素(すなわち、O2)を含む。理論に制約されることなく、分子状酸素の一方の酸素原子は、基質化合物に取り込まれて、ヒドロキシル化産物化合物が形成される。O2は、反応溶液中に天然に存在することができる、または反応物中に人為的に導入および/または補充され得る。一部の実施形態では、反応条件は、空気、O2ガスまたは他のO2含有ガスによる強制通気(例えば、散布)を含むことができる。一部の実施形態では、O2またはO2含有ガスにより反応物の圧力を増加させることにより、反応物中のO2を増加させることができる。これは、O2ガスにより加圧され得る容器内で反応を実行することにより行うことができる。一部の実施形態では、O2ガスは、1時間当たり少なくとも1リットル(L/h)、少なくとも2L/h、少なくとも3L/h、少なくとも4L/h、少なくとも5L/hまたはそれよりも速い速度で、反応溶液を通して散布することができる。一部の実施形態では、O2ガスは、約1L/h~10L/hの間、約2L/h~7L/hの間または約3L/h~5L/hの間の速度で、反応溶液を通して散布することができる。
反応の経過中に、反応混合物のpHは変化し得る。反応混合物のpHは、所望のpHにまたは所望のpH範囲内に維持することができる。これは、反応の経過前および/または経過中における、酸または塩基の添加によって行うことができる。その代わりに、pHは、緩衝剤を使用することにより制御することができる。したがって、一部の実施形態では、反応条件は、緩衝剤を含む。所望のpH範囲を維持するための適した緩衝剤は、当技術分野で公知であり、限定ではなく例として、ホウ酸塩、リン酸塩、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、酢酸塩、トリエタノールアミンおよび2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール(Tris)その他を含む。一部の実施形態では、緩衝剤は、リン酸塩である。プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、約0.01~約0.4M、0.05~約0.4M、0.1~約0.3Mまたは約0.1~約0.2Mの緩衝剤(例えば、リン酸塩)濃度を含む。一部の実施形態では、反応条件は、約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.07、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.3または0.4Mの緩衝剤(例えば、リン酸塩)濃度を含む。一部の実施形態では、反応条件は、適した溶媒として水を含み、緩衝剤は存在しない。
プロセスの実施形態では、反応条件は、適したpHを含むことができる。所望のpHまたは所望のpH範囲は、酸もしくは塩基、適切な緩衝剤、または緩衝および酸もしくは塩基添加の組合せの使用によって維持することができる。反応混合物のpHは、反応の経過前および/または経過中に制御することができる。一部の実施形態では、適した反応条件は、約4~約10の溶液pH、約5~約10のpH、約5~約9のpH、約6~約9のpH、約6~約8のpHを含む。一部の実施形態では、反応条件は、約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5または10の溶液pHを含む。
本明細書におけるプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度における反応速度の増加、および反応期間中の酵素の活性を考慮に入れつつ、反応条件のために適した温度を使用することができる。したがって、一部の実施形態では、適した反応条件は、約10℃~約60℃、約10℃~約55℃、約15℃~約60℃、約20℃~約60℃、約20℃~約55℃、約25℃~約55℃または約30℃~約50℃の温度を含む。一部の実施形態では、適した反応条件は、約10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃または60℃の温度を含む。一部の実施形態では、酵素反応中の温度は、反応の経過を通して特定の温度で維持することができる。一部の実施形態では、酵素反応中の温度は、反応の経過中に温度プロファイルにわたり調整することができる。
本発明のプロセスは一般に、溶媒中で実行される。適した溶媒は、水、水性緩衝溶液、有機溶媒、ポリマー溶媒、ならびに/または水性溶媒、有機溶媒および/もしくはポリマー溶媒を一般に含む共溶媒系を含む。水性溶媒(水または水性共溶媒系)は、pH緩衝されていても、緩衝されていなくてもよい。一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用したプロセスは、有機溶媒(例えば、エタノール、イソプロパノール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、酢酸エチル、酢酸ブチル、1-オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルtブチルエーテル(MTBE)、トルエンその他)、イオン性または極性溶媒(例えば、1-エチル4メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、1-ブチル3メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、ポリエチレングリコールその他)を含む水性共溶媒系中で実行することができる。一部の実施形態では、共溶媒は、ポリオール、ジメチルスルホキシド(DMSO)または低級アルコール等、極性溶媒であり得る。水性共溶媒系の非水性共溶媒構成成分は、水性構成成分と混和性であり、単一の液相をもたらすことも、または水性構成成分と部分的に混和性もしくは非混和性であり、2つの液相をもたらすこともある。例示的な水性共溶媒系は、水と、有機溶媒、極性溶媒およびポリオール溶媒から選択される1種または複数の共溶媒とを含むことができる。一般に、水性共溶媒系の共溶媒構成成分は、反応条件下でプロリンヒドロキシラーゼ酵素を有害に不活性化しないように選ばれる。適切な共溶媒系は、本明細書に記載されているもの等、酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系において、目的の、規定された基質を用いて、指定された、操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素の酵素活性を測定することにより容易に同定することができる。
プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、水性共溶媒を含み、共溶媒は、約1%~約50%(v/v)、約1~約40%(v/v)、約2%~約40%(v/v)、約5%~約30%(v/v)、約10%~約30%(v/v)または約10%~約20%(v/v)でDMSOを含む。プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、約1%(v/v)、約5%(v/v)、約10%(v/v)、約15%(v/v)、約20%(v/v)、約25%(v/v)、約30%(v/v)、約35%(v/v)、約40%(v/v)、約45%(v/v)または約50%(v/v)でDMSOを含む水性共溶媒を含むことができる。
一部の実施形態では、反応条件は、反応を安定化または増強するために界面活性物質を含むことができる。界面活性物質は、非イオン性、カチオン性、アニオン性および/または両親媒性界面活性物質を含むことができる。例示的な界面活性物質は、限定ではなく例として、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール(NP40)、Triton(登録商標) X-100、ポリオキシエチレン-ステアリルアミン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、オレイルアミド硫酸ナトリウム(sodium oleylamidosulfate)、ポリオキシエチレン-ソルビタンモノステアレート、ヘキサデシルジメチルアミン等を含む。反応を安定化または増強することができるいかなる界面活性物質を用いることもできる。反応において用いるべき界面活性物質の濃度は一般に、0.1~50mg/ml、特に、1~20mg/mlであり得る。
一部の実施形態では、反応条件は、反応溶液が混合または散布されるとき等に、反応溶液における気泡の形成の低下または防止を助ける消泡剤を含むことができる。消泡剤は、非極性油(例えば、鉱物、シリコーン等)、極性油(例えば、脂肪酸、アルキルアミン、アルキルアミド、硫酸アルキル等)および疎水性(例えば、処理シリカ、ポリプロピレン等)を含み、これらのいくつかは、界面活性物質としても機能する。例示的な消泡剤は、Y-30(登録商標)(Dow Corning)、ポリ-グリコールコポリマー、オキシ/エトキシ化アルコールおよびポリジメチルシロキサンを含む。一部の実施形態では、消泡剤は、約0.001%(v/v)~約5%(v/v)、約0.01%(v/v)~約5%(v/v)、約0.1%(v/v)~約5%(v/v)または約0.1%(v/v)~約2%(v/v)で存在することができる。一部の実施形態では、消泡剤は、反応を促進するのに望ましいように、約0.001%(v/v)、約0.01%(v/v)、約0.1%(v/v)、約0.5%(v/v)、約1%(v/v)、約2%(v/v)、約3%(v/v)、約4%(v/v)もしくは約5%(v/v)またはそれよりも高く存在することができる。
ヒドロキシラーゼ反応において使用される反応物の量は一般に、所望される産物の量に応じて、また、用いられるプロリンヒドロキシラーゼ基質の量に付随して変動するであろう。当業者であれば、これらの量を変動させて、生産性の所望のレベルおよび生産のスケールを調整する方法を容易に理解するであろう。
一部の実施形態では、反応物の添加の順序は、重要ではない。反応物は、溶媒(例えば、単相性溶媒、二相性水性共溶媒系その他)に同時に一緒に添加することができる、またはその代わりに、反応物の一部は、別々に、一部は一緒に、異なる時点で添加することができる。例えば、補助因子、補助基質、プロリンヒドロキシラーゼおよび基質は、溶媒に最初に添加することができる。
固体反応物(例えば、酵素、塩等)は、粉末(例えば、凍結乾燥した、噴霧乾燥したその他)、溶液、エマルション、懸濁液その他を含む種々の異なる形態で反応に提供することができる。反応物は、当業者にとって公知の方法および機器を使用して容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液を、少量のアリコートにおいて-80℃で凍結し、次いで、予め冷却された(pre-chilled)凍結乾燥チャンバーに添加し、続いて真空に引くことができる。
水性共溶媒系が使用される場合の改善された混合効率のため、プロリンヒドロキシラーゼおよび補助因子を、最初に水相に添加および混合することができる。次に、有機相を添加および混合し、続いて、プロリンヒドロキシラーゼ基質および補助基質を添加することができる。その代わりに、水相への添加に先立ち、プロリンヒドロキシラーゼ基質を有機相に予め混合することができる。
ヒドロキシル化プロセスは一般に、基質からヒドロキシル化産物へのさらなる変換が反応時間とともに著しく変化することがなくなるまで(例えば、基質の10%未満が変換される、または基質の5%未満が変換される)進められる。一部の実施形態では、反応は、基質から産物への完全なまたはほぼ完全な変換が生じるまで進められる。基質から産物への転換は、誘導体化ありまたはなしで、基質および/または産物を検出することによって公知方法を使用してモニターすることができる。適した分析方法は、ガスクロマトグラフィー、HPLC、MSその他を含む。
プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、少なくとも約5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/Lまたはそれよりも多い基質負荷を含み、方法は、約48hもしくはそれ未満、約36hもしくはそれ未満または約24hもしくはそれ未満における、基質化合物から産物化合物への少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれよりも高い変換をもたらす。
適した反応条件下でプロセスにおいて使用される場合の本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い異性体過剰率において、トランス-4-ヒドロキシル化産物よりも過剰なトランス-3-ヒドロキシル化産物をもたらす。一部の実施形態では、検出可能な量の化合物トランス-4-ヒドロキシル化産物は形成されない。
操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用して基質化合物をヒドロキシル化産物化合物に変換するためのプロセスのさらなる実施形態では、適した反応条件は、反応溶液への初期基質負荷を含むことができ、これは次いで、ポリペプチドによって接触される。次に、この反応溶液は、少なくとも約1g/L/h、少なくとも約2g/L/h、少なくとも約4g/L/h、少なくとも約6g/L/hまたはそれよりも速い速度での時間をかけた連続したまたはバッチ式(batchwise)の添加として、追加的な基質化合物をさらに補充される。よって、これらの適した反応条件に従って、ポリペプチドは、少なくとも約20g/L、30g/Lまたは40g/Lの初期基質負荷を有する溶液に添加される。このポリペプチド添加に続いて、少なくとも約30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/L、150g/L、200g/Lまたはそれよりも多いはるかにより高い最終基質負荷に達するまで、約2g/L/h、4g/L/hまたは6g/L/hの速度で溶液へのさらなる基質の連続した添加が為される。したがって、プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、少なくとも約20g/L、30g/Lまたは40g/Lの初期基質負荷を有する溶液へのポリペプチドの添加と、それに続く、少なくとも約30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/Lまたはそれよりも多い最終基質負荷に達するまでの、約2g/L/h、4g/L/hまたは6g/L/hの速度での溶液へのさらなる基質の添加を含む。この基質補充反応条件は、基質の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%またはそれよりも高い変換の、基質からヒドロキシル化産物への変換の高い率を維持しつつ、より高い基質負荷が達成されることを可能にする。このプロセスの一部の実施形態では、添加される基質は、さらに添加される基質の等モル濃度またはより多い量でα-ケトグルタレートを含む溶液中に存在する。
プロセスの一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用した反応は、次の適した反応条件を含むことができる:(a)約60g/Lの基質負荷;(b)約6g/Lの操作されたポリペプチド;(c)基質化合物の約1.2モル当量のα-ケトグルタレート;(d)約10mMアスコルビン酸;(e)約4mM FeSO4;(f)約6.8のpH;(g)約20℃の温度;および(h)約24hの反応時間。
一部の実施形態では、追加的な反応構成成分または追加的な技法を実行して、反応条件を補う。これらは、酵素を安定化するまたはその不活性化を防止する、産物阻害を低下させる、反応平衡をヒドロキシル化産物形成へとシフトさせるための方策を講じることを含むことができる。
さらなる実施形態では、基質化合物から産物化合物への変換のための上述のプロセスのいずれかは、産物化合物の抽出;単離;精製;および結晶化から選択される1種または複数のステップをさらに含むことができる。上に開示されているプロセスによって産生された生体触媒反応混合物からヒドロキシル化産物を抽出、単離、精製および/または結晶化するための方法、技法およびプロトコールは、当業者にとって公知である、および/または慣例的な実験法によりアクセスされる。その上、説明のための方法が、下の実施例に提供される。
本発明の様々な特色および実施形態が、次の代表的な実施例において説明されるが、これらは、説明を意図するものであり、限定を意図するものではない。
実験
実験および達成された結果を含む、下記の実施例は、単なる説明目的で示されており、本発明を限定するものとして解釈するべきではない。
実験および達成された結果を含む、下記の実施例は、単なる説明目的で示されており、本発明を限定するものとして解釈するべきではない。
後述する実験の開示において、次の略語が適用される:ppm(百万分率);M(モル濃度);mM(ミリモル濃度)、uMおよびμM(マイクロモル濃度);nM(ナノモル濃度);mol(モル);gmおよびg(グラム);mg(ミリグラム);ugおよびμg(マイクログラム);Lおよびl(リットル);mlおよびmL(ミリリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);umおよびμm(マイクロメートル);sec.(秒);min(分);hおよびhr(時間);U(ユニット);MW(分子量);rpm(毎分回転数);℃(摂氏度);CDS(コード配列);DNA(デオキシリボ核酸);RNA(リボ核酸);NA(核酸;ポリヌクレオチド);AA(アミノ酸;ポリペプチド);E.coli W3110(Coli Genetic Stock Center[CGSC]、New Haven、CTから入手できる、一般的に使用されている研究室のE.coli株);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動);PES(ポリエーテルスルホン);CFSE(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル);IPTG(イソプロピルベータ-D-1-チオガラクトピラノシド);PMBS(硫酸ポリミキシンB);NADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸);GDH(グルコースデヒドロゲナーゼ);ポリエチレンイミン(PEI);FIOPC(陽性対照に対する倍数改善(fold improvement over positive control));DO(溶存酸素);ESI(エレクトロスプレーイオン化);LB(ルリアブロス(Luria broth));TB(テリフィックブロス(terrific broth));MeOH(メタノール);HTP(ハイスループット);SFP(振盪フラスコ粉末(shake flask powder));DSP(下流加工粉末(downstream process powder));Athens Research(Athens Research Technology、Athens、GA);ProSpec(ProSpec Tany Technogene、East Brunswick、NJ);Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO);Ram Scientific(Ram Scientific,Inc.、Yonkers、NY);Pall Corp.(Pall,Corp.、Pt.Washington、NY);Millipore(Millipore,Corp.、Billerica MA);Difco(Difco Laboratories、BD Diagnostic Systems、Detroit、MI);Molecular Devices(Molecular Devices,LLC、Sunnyvale、CA);Kuhner(Adolf Kuhner,AG、Basel、Switzerland);Cambridge Isotope Laboratories(Cambridge Isotope Laboratories,Inc.、Tewksbury、MA);Applied Biosystems(Applied Biosystems、Life Technologies,Corp.、Grand Island、NYの一部)、Agilent(Agilent Technologies,Inc.、Santa Clara、CA);Thermo Scientific(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MAの一部);Fisher(Fisher Scientific、Waltham、MA);Corning(Corning,Inc.、Palo Alto、CA);Waters(Waters Corp.、Milford、MA);GE Healthcare(GE Healthcare Bio-Sciences、Piscataway、NJ);Pierce(Pierce Biotechnology(現在、Thermo Fisher Scientificの一部)、Rockford、IL);Phenomenex(Phenomenex,Inc.、Torrance、CA);Optimal(Optimal Biotech Group、Belmont、CA);ならびにBio-Rad(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)。
(実施例1)
組換えプロリンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有するE.coli発現宿主
本発明のバリアントの産生に使用された初期プロリンヒドロキシラーゼ(PH)酵素は、真菌種番号11243(受託番号GAM84982)由来の野生型ANO配列から得た。野生型PHタンパク質配列を、E.coliにおける発現のためにコドン最適化し、DNAを、lacIリプレッサーの制御下でlacプロモーターに作動可能に連結された発現ベクターpCK110900(米国特許出願公開第2006/0195947号の図3を参照)へとクローニングした。発現ベクターは、P15a複製起点およびクロラムフェニコール抵抗性遺伝子も含有する。その結果得られるプラスミドを、当技術分野で公知の標準方法を使用してE.coli W3110へと形質転換した。当技術分野で公知の通りに細胞をクロラムフェニコール選択に供することにより、形質転換体を単離した(例えば、米国特許第8,383,346号およびWO2010/144103を参照)。
組換えプロリンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有するE.coli発現宿主
本発明のバリアントの産生に使用された初期プロリンヒドロキシラーゼ(PH)酵素は、真菌種番号11243(受託番号GAM84982)由来の野生型ANO配列から得た。野生型PHタンパク質配列を、E.coliにおける発現のためにコドン最適化し、DNAを、lacIリプレッサーの制御下でlacプロモーターに作動可能に連結された発現ベクターpCK110900(米国特許出願公開第2006/0195947号の図3を参照)へとクローニングした。発現ベクターは、P15a複製起点およびクロラムフェニコール抵抗性遺伝子も含有する。その結果得られるプラスミドを、当技術分野で公知の標準方法を使用してE.coli W3110へと形質転換した。当技術分野で公知の通りに細胞をクロラムフェニコール選択に供することにより、形質転換体を単離した(例えば、米国特許第8,383,346号およびWO2010/144103を参照)。
(実施例2)
HTP PHを含有する湿潤細胞ペレットおよびライセートの調製
モノクローナルコロニーから得た組換えPHコード遺伝子を含有するE.coli細胞を、96ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートのウェル内の1%グルコースおよび30μg/mLクロラムフェニコール(CAM)を含有する180μl LBに播種した。プレートをO2透過性シールで封着し、培養物を一晩、30℃、200rpmおよび85%湿度で育成した。次に、細胞培養物のそれぞれの10μlを、390mL TBおよび30μg/mL CAMを含有する96ウェルのディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをO2透過性シールで封着し、OD600が0.6~0.8に達するまで、30℃、250rpmおよび85%湿度でインキュベートした。次に、1mMまでの最終濃度のIPTGによって細胞培養物を誘導し、一晩20℃または30℃でインキュベートした。次に、4000rpmで10minの遠心分離を使用して、細胞をペレットにした。上清を廃棄し、溶解に先立ち、ペレットを-80℃で凍結した。
HTP PHを含有する湿潤細胞ペレットおよびライセートの調製
モノクローナルコロニーから得た組換えPHコード遺伝子を含有するE.coli細胞を、96ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートのウェル内の1%グルコースおよび30μg/mLクロラムフェニコール(CAM)を含有する180μl LBに播種した。プレートをO2透過性シールで封着し、培養物を一晩、30℃、200rpmおよび85%湿度で育成した。次に、細胞培養物のそれぞれの10μlを、390mL TBおよび30μg/mL CAMを含有する96ウェルのディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをO2透過性シールで封着し、OD600が0.6~0.8に達するまで、30℃、250rpmおよび85%湿度でインキュベートした。次に、1mMまでの最終濃度のIPTGによって細胞培養物を誘導し、一晩20℃または30℃でインキュベートした。次に、4000rpmで10minの遠心分離を使用して、細胞をペレットにした。上清を廃棄し、溶解に先立ち、ペレットを-80℃で凍結した。
溶解のため、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L硫酸ポリミキシンb(PMBS)を含有する400μl溶解緩衝液を、実施例2に記載されている通りに産生された各ウェル内の細胞ペーストに添加した。室温で2時間、卓上振盪機で振盪しつつ、細胞を溶解した。次に、15min、4000rpmおよび4℃でプレートを遠心分離した。次に、清澄な上清を生体触媒反応において使用して、その活性レベルを決定した。
(実施例3)
振盪フラスコ(SF)培養物からの凍結乾燥ライセートの調製
上に記載されている通りに育成された選択されたHTP培養物を、1%グルコースおよび30μg/ml CAMを有するLB寒天プレート上に蒔き、一晩37℃で育成した。各培養物から得た単一コロニーを、1%グルコースおよび30μg/ml CAMを有する6mlのLBに移した。培養物を18h、30℃、250rpmで育成し、30μg/ml CAMを含有する250mlのTBへとおよそ1:50で継代培養して、0.05の最終OD600にした。およそ195分間、30℃、250rpmで培養物を育成して、0.6~0.8の間のOD600にし、1mM IPTGで誘導した。次に、20h、20℃または30℃、250rpmで培養物を育成した。4000rpmで20min培養物を遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを30mlの20mMトリエタノールアミン、pH7.5に再懸濁し、18,000psiでMicrofluidizer(登録商標)プロセッサーシステム(Microfluidics)を使用して溶解させた。ライセートをペレットにし(10,000rpmで60min)、上清を凍結および凍結乾燥して、振盪フラスコ(SF)酵素を生成した。
振盪フラスコ(SF)培養物からの凍結乾燥ライセートの調製
上に記載されている通りに育成された選択されたHTP培養物を、1%グルコースおよび30μg/ml CAMを有するLB寒天プレート上に蒔き、一晩37℃で育成した。各培養物から得た単一コロニーを、1%グルコースおよび30μg/ml CAMを有する6mlのLBに移した。培養物を18h、30℃、250rpmで育成し、30μg/ml CAMを含有する250mlのTBへとおよそ1:50で継代培養して、0.05の最終OD600にした。およそ195分間、30℃、250rpmで培養物を育成して、0.6~0.8の間のOD600にし、1mM IPTGで誘導した。次に、20h、20℃または30℃、250rpmで培養物を育成した。4000rpmで20min培養物を遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを30mlの20mMトリエタノールアミン、pH7.5に再懸濁し、18,000psiでMicrofluidizer(登録商標)プロセッサーシステム(Microfluidics)を使用して溶解させた。ライセートをペレットにし(10,000rpmで60min)、上清を凍結および凍結乾燥して、振盪フラスコ(SF)酵素を生成した。
(実施例4)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号4を上回る改善
L-プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換についてのバリアントのスクリーニングの結果に基づき、親酵素として配列番号4を選択した。配列番号4は、配列番号2と同一である;どちらの配列も、N末端hisタグが付加された野生型プロリンヒドロキシラーゼであるが、配列番号3は、野生型プロリンヒドロキシラーゼをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドである。十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩20℃でのタンパク質発現による)、HTPで産生した。全バリアントのために、200μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号4を上回る改善
L-プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換についてのバリアントのスクリーニングの結果に基づき、親酵素として配列番号4を選択した。配列番号4は、配列番号2と同一である;どちらの配列も、N末端hisタグが付加された野生型プロリンヒドロキシラーゼであるが、配列番号3は、野生型プロリンヒドロキシラーゼをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドである。十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩20℃でのタンパク質発現による)、HTPで産生した。全バリアントのために、200μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの63g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および75μLの33g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することによって、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号4と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号4によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。配列番号4と比べた活性(活性FIOP)は、配列番号4によって産生されたトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算した。結果を表4.1および4.2に示す。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、実施例3に記載されている通りに(一晩20℃でのタンパク質発現による)振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:10g/L L-プロリン、50wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.5当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、0.15当量アスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.5、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号4と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号4によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表4.3に示す。
配列番号4によって産生されたプロリンヒドロキシラーゼタンパク質は、30℃における標準発現条件下で、十分には安定していなかった。上に記載されている通り、表4.1、4.2および4.3に示す全データについて、HTPおよび振盪フラスコタンパク質は、20℃での発現により産生された。より安定しかつ活性があるバリアントについて選択するために、配列番号4に由来する操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して産生し、各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、30℃における発現によりHTPで産生した。反応、誘導体化および解析を上に記載されている通りに行った。配列番号4と比べた安定性および活性(安定性/活性FIOP)は、配列番号4によって産生されたトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算し、両方の酵素を30℃で産生した。結果を表4.4に示す。
(実施例5)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号116を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号116のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号115)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩20℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、200μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号116を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号116のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号115)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩20℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、200μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの63g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および75μLの33g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号116と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号116によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表5.1に示す。
配列番号116によって産生されたプロリンヒドロキシラーゼタンパク質は、30℃における標準発現条件下で、十分には安定していなかった。より安定しかつ活性があるバリアントについて選択するために、十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号116に由来する操作された遺伝子のライブラリーを産生し、各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、30℃における発現によりHTPで産生した。反応、誘導体化および解析を上に記載されている通りに行った。配列番号116と比べた安定性および活性(安定性/活性FIOP)は、配列番号116によって産生されたトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算し、両方の酵素を30℃で産生した。結果を表5.2に示す。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、実施例3に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。配列番号116のためのSFPを20℃で産生し、配列番号116に由来するバリアントを30℃で産生した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:20g/L L-プロリン、5wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.5当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、0.15当量アスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.5、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号116と比べた安定性および活性(安定性/活性FIOP)は、配列番号116によって産生されたトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算し、配列番号116を20℃で産生し、配列番号116に由来するバリアントを30℃で産生した。結果を表5.3に示す。
(実施例6)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号162を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号162のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号161)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、400μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号162を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号162のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号161)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、400μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの133g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および75μLの67g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号162と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号162によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、30℃における発現により、実施例3に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:40g/L L-プロリン、5wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.2当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、25mMアスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.5、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号162と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号162によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表6.1に示す。
(実施例7)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号322を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号322のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号321)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、400μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号322を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号322のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号321)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、400μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの266g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および75μLの133g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号322と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号322によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。配列番号322と比べた活性(活性FIOP)は、配列番号322によって産生されたトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス-3-ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算した。結果をそれぞれ表7.1および7.2に示す。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、30℃における発現により、実施例3に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:40g/L L-プロリン、5wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.2当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、10mMアスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.5、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号322と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号322によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表7.3に示す。
(実施例8)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号412を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号412のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号411)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、400μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号412を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号412のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号411)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、400μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの266g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および75μLの133g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号412と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号412によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表8.1に示す。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、30℃における発現により、実施例3に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:60g/L L-プロリン、5wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.2当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、10mMアスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.8、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号412と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号412によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表8.2に示す。
(実施例9)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号492を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号492のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号491)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、600μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号492を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号492のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号491)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、600μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの667g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および75μLの333g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号492と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号492によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表9.1に示す。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、30℃における発現により、実施例3に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:60g/L L-プロリン、5wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.2当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、10mMアスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.8、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号492と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号492によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表9.2に示す。
(実施例10)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号562を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号562のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号561)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、400μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号562を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号562のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号561)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、400μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの400g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および200μLの200g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号562と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号562によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表10.1に示す。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、30℃における発現により、実施例3に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:60g/L L-プロリン、5wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.2当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、10mMアスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.8、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号562と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号562によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表10.2に示す。
(実施例11)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号598を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号598のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号597)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、200μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号598を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号598のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号597)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、200μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの267g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および200μLの133g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号598と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号598によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表11.1に示す。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、30℃における発現により、実施例3に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:60g/L L-プロリン、5wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.2当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、10mMアスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.8、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号598と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号598によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表11.2に示す。
(実施例12)
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号630を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号630のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号629)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、200μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
プロリン基質のトランス-3-ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号630を上回る改善
十分に確立された技法(例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え)を使用して、配列番号630のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド(配列番号629)から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例2に記載されている通りに(一晩30℃でのタンパク質発現による)HTPで産生した。全バリアントのために、200μL溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、1g/Lリゾチームおよび0.5g/L PMBSを含有する)を添加し、室温で2時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを4000rpmで15分間、4℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。
300μL丸底プレートにおいて、50μLのE.coliライセートを、各ウェルにおける200μLの反応ミックス(75μLの267g/L α-ケトグルタル酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]、65mMアスコルビン酸[50mMリン酸ナトリウムpH6.5中]における50μLの20mMモール塩、および200μLの133g/L L-プロリンを含む)に添加した。プレートをAirPoreシール(Qiagen)で封着し、2”行程のKuhnerにおいて30℃、200rpmおよび85%相対湿度で一晩(ほぼ18時間)放置して反応を進めた。
一晩インキュベーション後に、25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。配列番号630と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号630によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。
HTP解析に加えて、HTPスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、30℃における発現により、実施例3に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末(SFP)を、次の条件下で、1mLスケール反応において検査した:60g/L L-プロリン、5wt%プロリンヒドロキシラーゼバリアントSFP、1.2当量a-KG(α-ケトグルタル酸)、10mMアスコルビン酸、4mM硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、50mMリン酸ナトリウムpH6.8、空気および室温。反応を一晩実行し、HTP反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号630と比べた選択性(選択性FIOP)は、配列番号630によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス-3-ヒドロキシプロリン:トランス-4-ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表12.1に示す。
(実施例13)
プロリンから産生されたトランス-3-ヒドロキシプロリンの分析的検出
実施例4~12に記載されているデータは、表13.1における分析方法を使用して収集された。本明細書に提供される方法は全て、本発明を使用して産生されたバリアントの解析において用途を見出す。しかし、本明細書に記載されている方法が、本明細書に提供されるバリアントおよび/または本明細書に提供される方法を使用して産生されたバリアントの解析に適用可能な唯一の方法であるとは意図されない。
プロリンから産生されたトランス-3-ヒドロキシプロリンの分析的検出
実施例4~12に記載されているデータは、表13.1における分析方法を使用して収集された。本明細書に提供される方法は全て、本発明を使用して産生されたバリアントの解析において用途を見出す。しかし、本明細書に記載されている方法が、本明細書に提供されるバリアントおよび/または本明細書に提供される方法を使用して産生されたバリアントの解析に適用可能な唯一の方法であるとは意図されない。
プロリン基質およびヒドロキシルプロリン産物を後述する通りに解析した。25μLの反応ミックスを、225μLの誘導体化溶液(ウェル当たり75μLの飽和炭酸水素ナトリウム、25μLの水および125μLの2.5mg/mL FmocCl[ACN中]を含む)を含有する96ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での1hrの振盪後に、プレートを1分間4000rpmで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の40μLを、160μLの1:1 ACN:0.5M HClと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表13.1に記載されている通りに解析した。
本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許、特許出願および他の文書は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書のそれぞれが、あらゆる目的のために参照により組み込まれると個々に指し示されるのと同じ程度まで、あらゆる目的のためにこれらの全体がこれにより参照により組み込まれる。
様々な具体的な実施形態について説明および記載してきたが、本発明(複数可)の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化が生じ得ることが認められるであろう。
Claims (36)
- 配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の参照配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630と比較した1個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに194、123、21、28、58/247、65、80、85、95、98、117、120、159、185、199、200、233、237、243、250、268、281、282、287、289、307、324、326、327、330、338、343、346および348から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21、28、45、65、95、112、117、139、177、185、199、233、243、250、281、282、287、289、307、324、326、327、335、338、343および346から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに48/66/189/194、48/66/194および66/82/85/135/189/194/267から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号4に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに20/56/76/168/169/296、20/56/232/294、20/119/294/296、56/76/119/124/147/232、56/76/294、76/168/232/294、76/294/296、76/296、147および232から選択される残基位置における、配列番号4と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに123、189、195、233および296から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに20/21/56、20/21/56/76/95/232/294/307/335、20/21/56/76/147/225/232/233/281/294/296/307/335、20/21/56/95/147/281/294/307、20/21/56/281/307、20/21/76/232/243、20/21/95/232/307、20/21/95/281/294/296、20/21/147/189/233/243/281/307、20/56、20/56/76/95/281/307、20/56/76/147/294/296/307、20/56/95/147/294、20/56/281、20/76、20/76/95/281/294/296、20/76/95/281/296/307、20/76/233/294/307、20/76/243/281/294、21/76/147/233/294/307、21/76/147/243/296/307/335、21/95/185/189/232/281/296、21/95/233/243/281/296、21/95/294/296/307/335、21/95/307、21/281/307、29/76/281、56/76/95/232/243/281、56/76/147/281/307、56/76/243/294、56/76/281/294、56/76/296、56/76/307、56/95/147/307/335/348、56/95/232/233/281/294/307、56/95/243/281、56/147/281、56/232/243/281、56/232/281、56/232/281/294/296、56/233/281/294/296、56/281/307、76/95/232/243/281/307、76/95/243/281/307/335、76/95/294/307、76/147、76/147/233/243/294、76/147/233/281/294/307、76/147/243/294/296/307/335、76/147/281/307、76/189/296、76/232/233/243/294/296/307、76/281、76/281/294、76/294/296、95/120、95/147/335、95/232/243/281/294/307、95/232/281/294/296、95/281/294/296、95/335、147、147/225/232/243/281/296/307/335、147/233/243/281/307、147/233/281/307/335、147/243/281、147/307、232/233/281/294/296/307、232/281、232/284/307、233/243/281/296/307/335、233/281/296/307、243/281/294/296、281、281/294、281/307、307、および335から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号116に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに21/76/147/243/296/307/335、56/76/147/281/307および95/147/335から選択される残基位置における、配列番号116と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号162に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに2/85/123/237、28/115/117/120/123/268/270/343/346/348、45/123/326、65/117/120/123/343/346、85/123/281/282、114/115/117/120/123/268/271/313/326/343/346、123/139/233/237/281/282/289/324/326および123/199/200/247/250/338から選択される残基位置における、配列番号162と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに26、54、61、129、132、149、156、175、189、201、209、228、236、248、262、272、277、291および345から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに25、43、54、58、61、79、129、132、143、156、163、175、179、201、209、236、248、278、291、345および347から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号322に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに85/117/120/135/208/270/324/343/346、85/117/120/135/208/281/282/289、85/117/120/270/281/289、85/117/135/139/208および117/120/208/270/324/343/346から選択される残基位置における、配列番号322と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47、48、56/118、85、95、95/289、113、118、118/247、154、162、162/204、164、164/198/271、168、169、187、195、243、271、275、281、314、330および342から選択される残基位置における、配列番号412と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号412に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに25/129/163/236/262/345/347、120/156/175/179/201、129/189/236/262/277/278、129/236/262、156/175/179/228および162から選択される残基位置における、配列番号412と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15、17、28、29、65、135、167、177、199、208、228、235、287、294、307および343から選択される残基位置における、配列番号492と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号492に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに85/187/281/347、85/187/347、118/120/162/175/179/330、118/120/162/175/330、162/175/179/330、175/228/330、195/347および278/314/347から選択される残基位置における、配列番号492と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに15、40、43、44、59、79、82、149、164、179、345および347から選択される残基位置における、配列番号562と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号562に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに29/85/177/208/228/347、29/85/208/228/343/347、29/177/195/228/343、29/208/228/278/294/347、56/195/278、85/187/205/208/278、113/177/187/195/208/278/294/343/347および177/205/208/228から選択される残基位置における、配列番号562と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに47、162、209、219、227および342から選択される残基位置における、配列番号598と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号598に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに17/44/179/195/250/313/345、17/44/199/313、43/44/195/199、44/149/164/171/187、44/179/195/199、44/179/195/199/345、79/163/164/171/187/201/286/288、82/163/164、82/163/164/171/187/201/203/208/286/288/320、149/164/171/288および187/286から選択される残基位置における、配列番号598と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 参照配列、配列番号630に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに82/164/171/203/208、135/163/164/201/203/208、162、162/219/236、162/219/313/338、162/236/342、162/313/342および164/171/201/203/282から選択される残基位置における、配列番号630と比較した1個または複数の残基差異を含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 配列番号6~658における偶数番号の配列のうち少なくとも1種に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い配列同一性を有する、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 天然に存在する酵素の活性の少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍またはそれよりも高い活性で、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる、請求項23に記載の操作されたポリペプチド。
- 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高いトランス-3-ヒドロキシプロリンのジアステレオマー過剰率(diasteromeric excess)で、L-プロリンをトランス-3-ヒドロキシプロリンに変換することができる、請求項23に記載の操作されたポリペプチド。
- 請求項1~25のいずれかに記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項22に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項24に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- E.coliにおける発現のために最適化された核酸配列を含む、請求項26~28のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項26~29のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含み、必要に応じて、少なくとも1種の制御配列をさらに含む発現ベクター。
- 配列番号4、116、162、322、412、492、562、598および/または630の操作されたポリペプチドを含む、請求項30に記載の発現ベクター。
- 請求項26~29のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項30または31に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- E.coliである、請求項32または33に記載の宿主細胞。
- 操作されたポリペプチドを調製する方法であって、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項32~34のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
- 前記操作されたポリペプチドを単離するステップをさらに含む、請求項35に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962940647P | 2019-11-26 | 2019-11-26 | |
US62/940,647 | 2019-11-26 | ||
PCT/US2020/061237 WO2021108209A1 (en) | 2019-11-26 | 2020-11-19 | Biocatalysts and methods for hydroxylation of chemical compounds |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023502779A true JP2023502779A (ja) | 2023-01-25 |
Family
ID=76130387
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022530236A Pending JP2023502779A (ja) | 2019-11-26 | 2020-11-19 | 化合物のヒドロキシル化のための生体触媒および方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230002744A1 (ja) |
EP (1) | EP4065704A1 (ja) |
JP (1) | JP2023502779A (ja) |
CN (1) | CN115175997A (ja) |
CA (1) | CA3160437A1 (ja) |
IL (1) | IL293038A (ja) |
WO (1) | WO2021108209A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024050501A2 (en) * | 2022-09-01 | 2024-03-07 | University Of Miami | Tyr peptide compositions and methods for use |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HUE042605T2 (hu) * | 2012-05-08 | 2019-07-29 | Codexis Inc | Biokatalizátorok és kémiai vegyületek hidroxilálására szolgáló eljárások |
-
2020
- 2020-11-19 EP EP20894402.5A patent/EP4065704A1/en active Pending
- 2020-11-19 CN CN202080082591.5A patent/CN115175997A/zh active Pending
- 2020-11-19 US US17/776,900 patent/US20230002744A1/en active Pending
- 2020-11-19 IL IL293038A patent/IL293038A/en unknown
- 2020-11-19 CA CA3160437A patent/CA3160437A1/en active Pending
- 2020-11-19 JP JP2022530236A patent/JP2023502779A/ja active Pending
- 2020-11-19 WO PCT/US2020/061237 patent/WO2021108209A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021108209A1 (en) | 2021-06-03 |
CN115175997A (zh) | 2022-10-11 |
EP4065704A1 (en) | 2022-10-05 |
US20230002744A1 (en) | 2023-01-05 |
CA3160437A1 (en) | 2021-06-03 |
IL293038A (en) | 2022-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10995349B2 (en) | Engineered proline hydroxylase polypeptides and methods | |
US11634695B2 (en) | Vectors for expression of biocatalysts | |
JP2022065092A (ja) | 操作されたイミンレダクターゼ、ならびにケトン化合物およびアミン化合物の還元的アミノ化のための方法 | |
US20220213518A1 (en) | Engineered imine reductases and methods for the reductive amination of ketone and amine compounds | |
JP2023502779A (ja) | 化合物のヒドロキシル化のための生体触媒および方法 | |
CA3137734A1 (en) | Engineered glucose dehydrogenases and methods for the reductive amination of ketone and amine compounds | |
CA3214975A1 (en) | Engineered cyclic gmp-amp synthase (cgas) variant enzymes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230904 |