JP2023502779A

JP2023502779A - 化合物のヒドロキシル化のための生体触媒および方法

Info

Publication number: JP2023502779A
Application number: JP2022530236A
Authority: JP
Inventors: ジョナサンブルーム，; ゲーラ，アルベルトオルテガ; ジャックリャン，; グレゴリーエー．コープ，; ニッキデラス，; クリストファーケルティプライア，
Original assignee: コデクシス，インコーポレイテッド
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2023-01-25
Also published as: IL293038A; CA3160437A1; EP4065704A1; US20230002744A1; CN115175997A; WO2021108209A1

Abstract

本発明は、ヒドロキシル化化合物の産生のための操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド、操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、操作されたプロリンヒドロキシラーゼを発現することができる宿主細胞、および操作されたプロリンヒドロキシラーゼを使用して、活性医薬剤の産生において有用な化合物を調製する方法を提供する。１種または複数の改善された特性を有する操作された酵素は、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼと比較して、１個または複数の残基差異を有し、残基差異は、前述の酵素特性のうち１種または複数に影響を与える残基位置において存在する。

Description

本願は、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれる、２０１９年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／９４０，６４７号に対する優先権を主張するものである。

技術分野
本発明は、化合物のヒドロキシル化のための生体触媒に関する。

配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の公式のコピーは、本明細書と同時に、ＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとして、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で、「ＣＸ２－１９３ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイル名、２０２０年１１月１７日の作成日および１．３９メガバイトのサイズで提出される。ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で出願された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景
プロリンの制約されたコンフォメーションのため、環炭素に官能基を有するプロリン誘導体は、医薬化合物の合成に有用な構成要素である。斯かる誘導体の１つであるヒドロキシル化プロリンは、カルバペネム系抗生物質（例えば、Ａｌｔａｍｕｒａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｃｈｅｍ．３８（２１）：４２４４－５６［１９９５］を参照）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤（例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７（８）：２７３０－３［２００２］；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００６，ＪＭｅｄＣｈｅｍ．４９（３）：９９５－１００５を参照）、核酸アナログ（例えば、Ｅｆｉｍｏｖｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３４（８）：２２４７－２２５７［２００６］を参照）、イソプレニルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４８（５）：７４０－７４２［２０００］）および薬物ライブラリー構築（Ｖｅｒｇｎｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，６（１）：９１－８［２００４］；およびＲｅｍｕｚｏｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ５２：１３８０３－１３８３５［１９９６］）を含む、様々な治療用化合物の合成のための出発材料である。

ヒドロキシプロリンは、植物材料およびコラーゲンの加水分解物等、天然の供給源から得ることができる。ヒドロキシプロリンは、出発材料、臭化アリルおよびジエチルアセトアミドマロン酸（ｄｉｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｏｍａｌｏｎｉｃａｃｉｄ）（ＫｙｕｎＬｅｅｅｔａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，４６：２９２４［１９７３］）、Ｄ－グルタミン酸（Ｅｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，４７：１７０４－０８［１９７４］）、グリオキサールおよびオキサロ酢酸（Ｒａｍａｓｗａｍｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４２（２１）：３４４０－３４４３［１９７７］）、ならびにα－アラニン（Ｓｉｎｈａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＥＣＳＯＣ－４，ＴｈｅＦｏｕｒｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＳｙｎｔｈｅｔｉｃＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＳＢＮ３－９０６９８０－０５－７［２０００］）等から、化学合成することもできる。

天然の供給源からの単離は、原材料の利用可能性によって限定され、相当量のバックグラウンド夾雑物からの精製を要求し、ある特定の所望のジアステレオマーを欠如する。化学合成方法は、複雑なステップを要求し、産業スケールレベルまでスケールアップすることが困難となり、複数のヒドロキシル化産物の形成が原因で追加的な精製ステップを要求する場合がある。

ヒドロキシル化プロリンを調製するための別のアプローチは、２－オキソグルタレート（α－ケトグルタレート）およびＯ_２を補助基質として、二価鉄イオンを補助因子として利用する２－オキソグルタレート依存性ジオキシゲナーゼである、プロリンヒドロキシラーゼを使用する（例えば、Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，３５３：１３７５－１３８３［２０１１］；米国特許第５，３６４，７７５号；およびＳｈｉｂａｓａｋｉｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５（９）：４０２８－４０３１［１９９９］を参照）。プロコラーゲンおよび関連ペプチドにおけるペプチジルプロリンを特異的に認識するプロリルヒドロキシラーゼとは異なり、プロリンヒドロキシラーゼは、遊離プロリンをヒドロキシプロリンに変換することができる。シス－３－、シス－４－またはトランス－４－ヒドロキシプロリンを産生するいくつかの微生物酵素は、当技術分野で公知であり（例えば、米国特許第５，９６２，２９２号、同第５，９６３，２５４号および同第５，８５４，０４０号；ＷＯ２００９１３９３６５；ならびにＥＰ２２９００６５を参照）、トランス－３－ヒドロキシプロリンを産生する酵素は、真菌の抽出物において同定された。プロリンヒドロキシラーゼの多くは、細菌および真菌において見出され、細菌および真菌において、これらはペプチド抗生物質の生合成に関連する。

トランス－３－ヒドロキシプロリンに対して選択的である天然のプロリンヒドロキシラーゼは、当技術分野で公知ではない。Ｇｌａｒｅａｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ由来の真菌プロリンヒドロキシラーゼであるＧｌｏＦは、主要異性体トランス－４－ヒドロキシプロリンと共に、微量異性体としてトランス－３－ヒドロキシプロリンを産生する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，６２，２６３；Ｈｏｕｗａａｒｔｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ２０１４，１５，２３６５）。ＧｌｏＦとおよそ６４％の配列同一性を共有する、ＥｍｅｒｉｃｅｌｌａｒｕｇｕｌｏｓａＮＲＲＬ１１４４０由来の別の真菌プロリンヒドロキシラーゼであるＨｔｙＥは、エキノキャンディンＢ生合成遺伝子クラスターの一部として報告された（Ｃａｃｈｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１６７８１）。ＨｔｙＥは、主要異性体トランス－４－ヒドロキシプロリンと共に、微量異性体としてトランス－３－ヒドロキシプロリンを産生することも見出された。近年、３種のヒドロキシラーゼ遺伝子を含む遺伝子クラスターが、真菌ｓｐ．１１２４３において同定されており（Ｍａｔｓｕｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１７，Ｆｅｂ；１２３（２）：１４７－１５３）、１種の遺伝子はその後、ＨｔｙＥに対する相同性を有すると同定された。
クローニングされたプロリンヒドロキシラーゼを発現する組換え細胞全体は、ラージスケールの産業プロセスにさらに適しているが、細胞全体の使用は、高い基質濃度等の反応条件の変動を限定し；使用することができる基質の型を、細胞に対して透過性である型に制限し；最終産物から分離しなければならない望ましくない副産物をもたらす。加えて、タンパク質加水分解物から調製された富栄養成長培地の使用は、プロリン以外の基質が標的とされる場合に競合的阻害剤となり得る遊離プロリンを含有するため、ｉｎｖｉｖｏ系は、最適でもなければ対費用効果が高くもない規定された成長培地を要求し得る。容易にスケールアップすることができ、かつ実質的に純粋な異性体産物をもたらすことができる、ヒドロキシル化形態のプロリンおよびプロリンアナログならびに他の化合物を合成するための代替方法が必要である。

米国特許第５，３６４，７７５号明細書米国特許第５，９６２，２９２号明細書米国特許第５，９６３，２５４号明細書米国特許第５，８５４，０４０号明細書

Ｃａｃｈｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１２）１３４、１６７８１Ｍａｔｓｕｉら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２０１７）１２３（２）：１４７～１５３

発明の概要
本発明は、操作されたプロリンヒドロキシラーゼ生体触媒、生体触媒をコードするポリヌクレオチド、それらの調製方法、およびこのような操作された生体触媒を使用してヒドロキシル化化合物を調製するためのプロセスを提供する。本発明のプロリンヒドロキシラーゼは、真菌種番号（ｓｐ．Ｎｏ．）１１２４３由来のＡＮＯ１１２４３の天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼ（Ｎ末端ｈｉｓタグが付加された配列番号２）と比べて、１種または複数の改善された特性を有するように操作された。操作されたプロリンヒドロキシラーゼの改善された生体触媒特性は、とりわけ、活性、基質許容範囲（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、立体選択性、位置選択性および熱安定性を含む。操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、アルファ－ケトグルタレートを補助基質として使用したＬ－プロリンのトランス－３－ヒドロキシプロリンへのヒドロキシル化を含む、種々の基質化合物をヒドロキシル化することも見出された。一部の実施形態では、プロセスは、酸素（すなわち、空気）および鉄（すなわち、Ｆｅ（ＩＩ））の存在下で行われる。
１種または複数の改善された特性を有する操作された酵素は、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼと比較して、１個または複数の残基差異を有し、残基差異は、前述の酵素特性のうち１種または複数に影響を与える残基位置において存在する。

したがって、一態様では、本発明は、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号６～６５８の範囲内の偶数番号の配列において示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。下記の詳細な説明は、所望の改善された生体触媒特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼの調製に使用することができる残基差異の選択に関するガイダンスを提供する。

本発明は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１、２８、５８／２４７、６５、８０、８５、９５、９８、１１７、１２０、１５９、１８５、１９４、１９９、２００、２３３、２３７、２４３、２５０、２６８、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３０、３３８、３４３、３４６および３４８から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１、２８、４５、６５、９５、１１２、１１７、１３９、１７７、１８５、１９９、２３３、２４３、２５０、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３５、３３８、３４３および３４６から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４８／６６／１８９／１９４、４８／６６／１９４および６６／８２／８５／１３５／１８９／１９４／２６７から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２０／５６／７６／１６８／１６９／２９６、２０／５６／２３２／２９４、２０／１１９／２９４／２９６、５６／７６／１１９／１２４／１４７／２３２、５６／７６／２９４、７６／１６８／２３２／２９４、７６／２９４／２９６、７６／２９６、１４７および２３２から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号４～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明は、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１２３、１８９、１９５、２３３および２９６から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２０／２１／５６、２０／２１／５６／７６／９５／２３２／２９４／３０７／３３５、２０／２１／５６／７６／１４７／２２５／２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７／３３５、２０／２１／５６／９５／１４７／２８１／２９４／３０７、２０／２１／５６／２８１／３０７、２０／２１／７６／２３２／２４３、２０／２１／９５／２３２／３０７、２０／２１／９５／２８１／２９４／２９６、２０／２１／１４７／１８９／２３３／２４３／２８１／３０７、２０／５６、２０／５６／７６／９５／２８１／３０７、２０／５６／７６／１４７／２９４／２９６／３０７、２０／５６／９５／１４７／２９４、２０／５６／２８１、２０／７６、２０／７６／９５／２８１／２９４／２９６、２０／７６／９５／２８１／２９６／３０７、２０／７６／２３３／２９４／３０７、２０／７６／２４３／２８１／２９４、２１／７６／１４７／２３３／２９４／３０７、２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、２１／９５／１８５／１８９／２３２／２８１／２９６、２１／９５／２３３／２４３／２８１／２９６、２１／９５／２９４／２９６／３０７／３３５、２１／９５／３０７、２１／２８１／３０７、２９／７６／２８１、５６／７６／９５／２３２／２４３／２８１、５６／７６／１４７／２８１／３０７、５６／７６／２４３／２９４、５６／７６／２８１／２９４、５６／７６／２９６、５６／７６／３０７、５６／９５／１４７／３０７／３３５／３４８、５６／９５／２３２／２３３／２８１／２９４／３０７、５６／９５／２４３／２８１、５６／１４７／２８１、５６／２３２／２４３／２８１、５６／２３２／２８１、５６／２３２／２８１／２９４／２９６、５６／２３３／２８１／２９４／２９６、５６／２８１／３０７、７６／９５／２３２／２４３／２８１／３０７、７６／９５／２４３／２８１／３０７／３３５、７６／９５／２９４／３０７、７６／１４７、７６／１４７／２３３／２４３／２９４、７６／１４７／２３３／２８１／２９４／３０７、７６／１４７／２４３／２９４／２９６／３０７／３３５、７６／１４７／２８１／３０７、７６／１８９／２９６、７６／２３２／２３３／２４３／２９４／２９６／３０７、７６／２８１、７６／２８１／２９４、７６／２９４／２９６、９５／１２０、９５／１４７／３３５、９５／２３２／２４３／２８１／２９４／３０７、９５／２３２／２８１／２９４／２９６、９５／２８１／２９４／２９６、９５／３３５、１４７、１４７／２２５／２３２／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、１４７／２３３／２４３／２８１／３０７、１４７／２３３／２８１／３０７／３３５、１４７／２４３／２８１、１４７／３０７、２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７、２３２／２８１、２３２／２８４／３０７、２３３／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、２３３／２８１／２９６／３０７、２４３／２８１／２９４／２９６、２８１、２８１／２９４、２８１／３０７、３０７および３３５から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、５６／７６／１４７／２８１／３０７および９５／１４７／３３５から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号４～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明は、配列番号１６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２／８５／１２３／２３７、２８／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７０／３４３／３４６／３４８、４５／１２３／３２６、６５／１１７／１２０／１２３／３４３／３４６、８５／１２３／２８１／２８２、１１４／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７１／３１３／３２６／３４３／３４６、１２３／１３９／２３３／２３７／２８１／２８２／２８９／３２４／３２６および１２３／１９９／２００／２４７／２５０／３３８から選択される残基位置における、配列番号１６２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明は、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２６、５４、６１、１２９、１３２、１４９、１５６、１７５、１８９、２０１、２０９、２２８、２３６、２４８、２６２、２７２、２７７、２９１および３４５から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２５、４３、５４、５８、６１、７９、１２９、１３２、１４３、１５６、１６３、１７５、１７９、２０１、２０９、２３６、２４８、２７８、２９１、３４５および３４７から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６、８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２８１／２８２／２８９、８５／１１７／１２０／２７０／２８１／２８９、８５／１１７／１３５／１３９／２０８および１１７／１２０／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明は、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７、４８、５６／１１８、８５、９５、９５／２８９、１１３、１１８、１１８／２４７、１５４、１６２、１６２／２０４、１６４、１６４／１９８／２７１、１６８、１６９、１８７、１９５、２４３、２７１、２７５、２８１、３１４、３３０および３４２から選択される残基位置における、配列番号４１２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２５／１２９／１６３／２３６／２６２／３４５／３４７、１２０／１５６／１７５／１７９／２０１、１２９／１８９／２３６／２６２／２７７／２７８、１２９／２３６／２６２、１５６／１７５／１７９／２２８および１６２から選択される残基位置における、配列番号４１２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明は、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５、１７、２８、２９、６５、１３５、１６７、１７７、１９９、２０８、２２８、２３５、２８７、２９４、３０７および３４３から選択される残基位置における、配列番号４９２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８５／１８７／２８１／３４７、８５／１８７／３４７、１１８／１２０／１６２／１７５／１７９／３３０、１１８／１２０／１６２／１７５／３３０、１６２／１７５／１７９／３３０、１７５／２２８／３３０、１９５／３４７および２７８／３１４／３４７から選択される残基位置における、配列番号４９２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明は、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５、４０、４３、４４、５９、７９、８２、１４９、１６４、１７９、３４５および３４７から選択される残基位置における、配列番号５６２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２９／８５／１７７／２０８／２２８／３４７、２９／８５／２０８／２２８／３４３／３４７、２９／１７７／１９５／２２８／３４３、２９／２０８／２２８／２７８／２９４／３４７、５６／１９５／２７８、８５／１８７／２０５／２０８／２７８、１１３／１７７／１８７／１９５／２０８／２７８／２９４／３４３／３４７および１７７／２０５／２０８／２２８から選択される残基位置における、配列番号５６２と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明は、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７、１６２、２０９、２１９、２２７および３４２から選択される残基位置における、配列番号５９８と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１７／４４／１７９／１９５／２５０／３１３／３４５、１７／４４／１９９／３１３、４３／４４／１９５／１９９、４４／１４９／１６４／１７１／１８７、４４／１７９／１９５／１９９、４４／１７９／１９５／１９９／３４５、７９／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２８６／２８８、８２／１６３／１６４、８２／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２０３／２０８／２８６／２８８／３２０、１４９／１６４／１７１／２８８および１８７／２８６から選択される残基位置における、配列番号５９８と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明は、配列番号６３０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号６３０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８２／１６４／１７１／２０３／２０８、１３５／１６３／１６４／２０１／２０３／２０８、１６２、１６２／２１９／２３６、１６２／２１９／３１３／３３８、１６２／２３６／３４２、１６２／３１３／３４２および１６４／１７１／２０１／２０３／２８２から選択される残基位置における、配列番号６３０と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。

本発明はまた、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、天然に存在する酵素の活性の少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれよりも高い活性で、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高いトランス－３－ヒドロキシプロリンの異性体過剰率（ｉｓｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓｓ）で、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる。

本発明はまた、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化された核酸配列を含む。

本発明はさらに、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、少なくとも１種の制御配列を含む。

本発明はまた、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。

本発明はさらに、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを調製する方法であって、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチド（複数可）の発現に適した条件下で培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、操作されたポリペプチド（複数可）を単離するステップをさらに含む。

発明の説明
他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意義と同じ意義を有する。一般に、本明細書で使用されている命名法、ならびに後述する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の研究室手順は、当技術分野で周知かつ一般的に用いられているものである。斯かる技法は、周知であり、当業者にとって周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準技法またはその修正は、化学合成および化学分析に使用されている。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載されている方法および材料と同様のまたは均等ないかなる適した方法および材料も、本発明の実施において用途を見出すが、一部の方法および材料が、本明細書に記載されている。記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は、当業者によって使用されている文脈に応じて変動し得るため、本発明が、これらに限定されないことを理解されたい。したがって、すぐ下で定義される用語は、全体として本発明を参照することによって、さらに十分に説明される。

前述の概説および下記の詳細な説明の両方が、単に例示的かつ説明的であり、本発明を制限するものではないことを理解されたい。

本明細書で使用されているセクションの見出しは、単なる組織化を目的としており、記載されている主題を限定するものとして解釈するべきではない。

数的範囲は、範囲を定義する数を包括する。よって、本明細書に開示されている全ての数値的範囲は、あたかもより狭い数値的範囲が全て本明細書に明確に書かれているかのように、当該のより広い数値的範囲内に納まる全ての斯かるより狭い数値的範囲を包含することが意図される。本明細書に開示されている全ての最大（または最小）の数値的限界が、あたかも数値的下限（または上限）が本明細書に明確に書かれているかのように、斯かる全ての数値的下限（または上限）を含むことも意図される。

略語
遺伝的にコードされたアミノ酸のために使用されている略語は、従来通りであり、次の通りである：

３文字略語が使用される場合、「Ｌ」もしくは「Ｄ」が特に先行しなければ、またはこの略語が使用されている文脈から明らかでなければ、アミノ酸は、α－炭素（Ｃ_α）に関してＬ－またはＤ－立体配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α－炭素に関して立体配置を指定することなくアラニンを指定する一方で、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」は、それぞれＤ－アラニンおよびＬ－アラニンを指定する。１文字略語が使用される場合、大文字は、α－炭素に関してＬ－立体配置のアミノ酸を指定し、小文字は、α－炭素に関してＤ－立体配置のアミノ酸を指定する。例えば、「Ａ」は、Ｌ－アラニンを指定し、「ａ」は、Ｄ－アラニンを指定する。ポリペプチド配列が、１文字または３文字略語（またはこれらの混合物）の列として提示される場合、配列は、一般的慣習に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で提示される。

遺伝的にコードするヌクレオシドのために使用されている略語は、従来通りであり、次の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に描写されていない限り、省略されたヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個々の基準または総計の基準で、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかとして指定することができる。核酸配列が、１文字略語の列として提示される場合、配列は、一般的慣習に従って５’から３’への方向で提示され、リン酸は、指し示されない。

定義
本発明に関して、本明細書における記載に使用されている技術および科学用語は、他に特に規定がなければ、当業者によって一般的に理解されている意義を有するであろう。したがって、次の用語は、次の意義を有することが意図される。

本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそれ以外のことを明らかに指し示さない限り、複数形の指示対象を含む。よって、例えば、「１つのポリペプチド（ａｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」の参照は、１つより多くのポリペプチドを含む。

同様に、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換的であり、限定を意図するものではない。よって、本明細書で使用される場合、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同族語は、その包括的な意味で使用される（すなわち、用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同族語と同等である）。

様々な実施形態の記載が、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者であれば、一部の特異的な例では、実施形態を、その代わりに、言葉「から本質的になる」または「からなる」を使用して記載することができることを理解するであろうことをさらに理解されたい。

用語「約」は、特定の値に許容できる誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の１、２、３または４標準偏差以内を意味する。

「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学的分類は、酵素のための数値的分類体系であり、それが触媒する化学反応に基づく。

「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指し、そのバイオレポジトリー収集物は、遺伝子および株を含む。

「ＮＣＢＩ」は、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）およびそこで提供される配列データベースを指す。

「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、アミド結合によって共有結合により連結された少なくとも２個のアミノ酸のポリマーを表示するように本明細書で互換的に使用されている。この定義の内には、Ｄ－およびＬ－アミノ酸ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物を含むポリマーが含まれている。

「アミノ酸」は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される、その一般的に公知の３文字記号または１文字記号のいずれかで本明細書において参照される。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に受け入れられる一文字コードで参照することができる。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合により一体に連結された２個またはそれよりも多いヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチドで構成されていても（すなわち、ＲＮＡ）、完全に２’デオキシリボヌクレオチドで構成されていても（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボ－および２’デオキシリボヌクレオチドで構成されている混合物であってもよい。ヌクレオシドは、典型的には、標準ホスホジエステル連結を介して一体に連結されるであろうが、ポリヌクレオチドは、１個または複数の非標準連結を含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得る、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含むことができる。さらに、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）で構成されるであろうが、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン等、１個または複数の修飾されたおよび／または合成の核酸塩基を含むことができる。一部の実施形態では、斯かる修飾されたまたは合成の核酸塩基は、アミノ酸配列をコードする核酸塩基である。

「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸の部分（例えば、遺伝子）を指す。

「プロリンヒドロキシラーゼ」は、下に説明する通り、補助基質α－ケトグルタレートおよび二原子酸素の存在下で、遊離プロリンをヒドロキシプロリンに変換する酵素としての能力を有するポリペプチドを指す：

プロリンヒドロキシラーゼが、プロリンとの前述の反応に限定されないが、他の基質をヒドロキシル化することができる、またはヒドロキシプロリンの様々な異性体、例えばトランス－３－ヒドロキシプロリンを産生することができることを理解されたい。プロリンヒドロキシラーゼは、本明細書で使用される場合、天然に存在する（野生型）プロリンヒドロキシラーゼと共に、ヒトによる操作によって生成された天然に存在しない操作されたポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本発明のプロリンヒドロキシラーゼバリアントは、下のスキーム１に示す通り、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる：

プロリンヒドロキシラーゼの「補助基質」は、α－ケトグルタレート、ならびにプロリンおよびプロリン基質アナログのヒドロキシル化においてα－ケトグルタレートに取って代わることができる、補助基質アナログを指す。補助基質アナログは、限定ではなく例として、２－オキソアジペート（ｏｘｏａｄｉｐａｔｅ）を含む（例えば、Ｍａｊａｍａａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２９：１２７－１３３［１９８５］を参照）。

本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、自然界で見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界における供給源から単離され得る、また、ヒトによる操作によって意図的に修飾されていない、生物に存在する配列である。

「組換え」または「操作された」または「天然に存在しない」は、細胞、核酸またはポリペプチドを参照して使用される場合、修飾されなければ自然界には存在しない様式で修飾された、材料、または材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸またはポリペプチドと同一であるが、合成材料からおよび／または組換え技法を使用した操作によって産生されるまたはこれに由来する。非限定的な例は、とりわけ、細胞のネイティブ（非組換え）形態の内には見出されない遺伝子を発現する、または他の点で異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する組換え細胞を含む。

用語「パーセント（％）配列同一性」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の比較を指すように本明細書で使用されており、２種の最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたり比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２種の配列の最適な整列のために、参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。その代わりに、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップありで整列される場合の当該位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。当業者は、２種の配列の整列に利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認める。比較のための配列の最適な整列は、当技術分野で公知の通り、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４［１９８８］）、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理されたインプリメンテーション（例えば、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査を含むがこれらに限定されない、いずれか適した方法によって行うことができる。パーセントの配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらによって記載されたＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含むがこれらに限定されない（それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３３８９－３４０２［１９７７］を参照）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立バイオテクノロジー情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイト経由で公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列されたときにある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を先ず同定するステップを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、上記を参照）。このような初期近隣ワードヒットは、これを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次に、ワードヒットは、累積的整列スコアが増加し得る限りにおいて、各配列に沿って両方向に伸長される。累積的スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチする残基のペアのためのスコアを与える；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積的スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、次の場合に停止される：累積的整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ下落する；累積的スコアが、１または複数の負のスコアリング残基整列の蓄積により、ゼロもしくはそれ未満になる；またはどちらかの配列の終わりに達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５［１９８９］を参照）。配列整列および％配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用した、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｏｆｔｗａｒｅｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。

「参照配列」は、配列および／または活性比較のための基準として使用される、定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、少なくとも１００残基の長さ、または全長の核酸もしくはポリペプチドである。２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２種の配列の間で同様である配列（すなわち、完全配列の部分）を含むことができ、（２）２種の配列の間で多岐にわたる配列をさらに含むことができるため、２種の（またはそれよりも多い）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は典型的に、「比較ウィンドウ」にわたる２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことができ、参照配列は、一次配列に１個または複数の変化を有することができる配列である。

本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の近接ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも２０個の近接ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウにおける配列の部分は、２種の配列の最適な整列のために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の近接残基よりも長くなることができ、必要に応じて３０、４０、５０、１００個またはそれよりも長いウィンドウを含む。

「に対応する」、「を参照して」または「と比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの文脈において使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される際の、指定の参照配列の残基のナンバリングを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によるのではなく、参照配列に関して指定される。例えば、操作されたプロリンヒドロキシラーゼのもの等、所与のアミノ酸配列は、２種の配列の間の残基マッチを最適化するためのギャップを導入することにより、参照配列と整列することができる。このような場合、ギャップが存在するものの、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基のナンバリングは、これが整列された参照配列に関して為すことができる。

「実質的同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウにわたり、高頻度で、少なくとも３０～５０残基のウィンドウにわたり参照配列と比較して、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、少なくとも８９～９５パーセントの配列同一性の間、またはより通常は、少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性のパーセンテージは、比較のウィンドウにわたり参照配列の総計で２０パーセントまたはそれ未満になる欠失または付加を含む配列と参照配列とを比較することにより計算される。ポリペプチドに適用される一部の特異的な実施形態では、用語「実質的同一性」は、２種のポリペプチド配列が、デフォルトギャップウエイトを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ等により最適に整列された場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性または少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれよりも多く（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の実施形態では、比較されている配列における同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸差異」および「残基差異」は、参照配列の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差異の位置は一般に、「Ｘｎ」と本明細書で称され、ｎは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比較したＸ９３位における残基差異」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。よって、配列番号４の参照ポリペプチドが、９３位にセリンを有する場合、「配列番号４と比較したＸ９３位における残基差異」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置におけるセリン以外のいずれかの残基のアミノ酸置換を指す。本明細書における大部分の例では、ある位置における具体的なアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」として指し示され、「Ｘｎ」は、上に記載されている通りの対応する位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見出されるアミノ酸の一文字識別子（すなわち、参照ポリペプチドにおける残基とは異なる残基）である。一部の例では（例えば、表４．１、４．２、４．３、４．４、５．１、５．２、５．３、６．１、７．１、７．２、７．３、８．１、８．２、９．１、９．２、１０．１、１０．２、１１．１、１１．２および／または１２．１における）、本発明はまた、従来の表記法「ＡｎＢ」によって表示される具体的なアミノ酸差異を提供し、Ａは、参照配列における残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列における残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の一文字識別子である。一部の例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比べた残基差異が存在する指定の位置のリストによって指し示される、参照配列と比べた１個または複数のアミノ酸残基差異を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドの特異的な残基位置において１個より多くのアミノ酸を使用することができる場合、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「／」によって分離される（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。スラッシュを使用して、所与のバリアント内の複数の置換を指し示すこともできる（すなわち、コンビナトリアルバリアントなどの所与の配列に１個より多くの置換が存在する）。一部の実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む１個または複数のアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。一部の追加的な実施形態では、本発明は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、残基の、同様の側鎖を有する異なる残基による置換を指し、よって、典型的には、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、アミノ酸の同じまたは同様の定義されたクラス内のアミノ酸による置換を含む。限定ではなく例として、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）に置換される；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）に置換される；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）に置換される；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性（ｂａｓｉｓ）側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）に置換される；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）に置換される；および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性アミノ酸に置き換えられる。

本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく定義された群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンに代えたプロリン）（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさに影響を与える。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸に置換された酸性アミノ酸；小型のアミノ酸に置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸に置換された親水性アミノ酸であり得る。

本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドに対する修飾を指す。欠失は、操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素の酵素活性を保持したままおよび／または改善された特性を保持したままでの、１個もしくは複数のアミノ酸、２個もしくはそれよりも多いアミノ酸、５個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多いアミノ酸または２０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大で１０％、またはアミノ酸の総数の最大で２０％の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内側部分および／または末端部分へと方向付けることができる。様々な実施形態では、欠失は、連続したセグメントを含むことができる、または不連続であり得る。

本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドからの、１個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドに対する修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内側部分において、またはカルボキシもしくはアミノ末端へと為すことができる。挿入は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の通り、融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の近接セグメントであり得る、または天然に存在するポリペプチドにおけるアミノ酸の１個もしくは複数によって分離されていてよい。

本明細書で互換的に使用される「機能的断片」または「生物学的活性断片」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端欠失（複数可）ならびに／または内側欠失を有するが、残っているアミノ酸配列が、これが比較されている配列（例えば、本発明の全長の操作されたプロリンヒドロキシラーゼ）における対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持する、ポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然ではこれに付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞内のまたはｉｎｖｉｔｒｏ合成による）から除去または精製されたポリペプチドを包括する。組換えプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、細胞内に存在することができる、細胞培地中に存在することができる、またはライセートもしくは単離された調製物などの様々な形態で調製することができる。したがって、一部の実施形態では、組換えプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢種である（すなわち、モル濃度または重量基準で、組成物中の他のいずれかの個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、目標の種が、モルまたは％重量で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。しかし、一部の実施形態では、プロリンヒドロキシラーゼを含む組成物は、５０％未満純粋（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％）であるプロリンヒドロキシラーゼを含む。一般に、実質的に純粋なプロリンヒドロキシラーゼ組成物は、組成物中に存在するモルまたは％重量で全高分子種の約６０％またはそれよりも高く、約７０％またはそれよりも高く、約８０％またはそれよりも高く、約９０％またはそれよりも高く、約９５％またはそれよりも高く、および約９８％またはそれよりも高くを構成する。一部の実施形態では、目標の種は、本質的な均一性となるまで精製され（すなわち、夾雑物種は、従来の検出方法によって組成物において検出することができない）、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種と考慮されない。一部の実施形態では、単離された組換えプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。

本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、酵素の少なくとも１種の改善された特性を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドおよび／または野生型プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドおよび／または別の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドと比較して、いずれかの酵素特性における改善を示す、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを提供する。よって、「改善」のレベルを決定し、野生型と共に操作されたプロリンヒドロキシラーゼを含む様々なプロリンヒドロキシラーゼ酵素の間で比較することができる。改善された特性は、増加したタンパク質発現、増加した熱活性（ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、基質または最終生成物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学的安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、塩基性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する低下した感受性）、低下した凝集、増加した溶解度、および変更された温度プロファイル等の特性を含むがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、参照プロリンヒドロキシラーゼ酵素と比較した、比活性（例えば、産生された産物／時間／重量タンパク質）の増加または基質から産物へのパーセント変換（例えば、指定の量のプロリンヒドロキシラーゼを使用した、指定の期間における基質の出発量から産物のパーセント変換）の増加によって表すことができる、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供されている。Ｋ_ｍ、Ｖ_ｍａｘまたはｋ_ｃａｔの古典的酵素特性を含む、酵素活性に関するいずれかの特性が影響され得、それらの変化は、増加した酵素活性をもたらし得る。酵素活性における改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドが由来する天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼまたは別の操作されたプロリンヒドロキシラーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれよりも高い酵素活性もの大きさであり得る。

本明細書で使用される場合、「変換」は、基質（複数可）から対応する産物（複数可）への酵素変換（または生体内変換）を指す。「パーセント変換」は、指定の条件下である期間内に産物に変換された基質のパーセントを指す。よって、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間における基質から産物への「パーセント変換」として表現することができる。

「ゼネラリスト（ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ）特性」を有する酵素（または「ゼネラリスト酵素」）は、親配列と比較して、広範囲の基質に対して改善された活性を示す酵素を指す。ゼネラリスト酵素は、全ての可能な基質に対して改善された活性を必ずしも実証しない。一部の実施形態では、本発明は、広範囲の立体的におよび電子的に多様な基質に対して親遺伝子と比べて同様のまたは改善された活性を実証するという点において、ゼネラリスト特性を有するプロリンヒドロキシラーゼバリアントを提供する。加えて、本明細書に提供されるゼネラリスト酵素を、広範囲の多様なＡＰＩ様分子にわたり改善されるように操作して、代謝物／産物の産生を増加させた。

用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸ハイブリッドが安定である条件を指すように本明細書で使用されている。当業者にとって公知の通り、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）において反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴ_ｍ値は、融解温度を予測するための公知方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１６８：７６１－７７７［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：１３９０［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８８９３－８８９７［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９３７３－９３７７［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５：７８４０－７８４６［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８：６４０９－６４１２［１９９０］（誤植、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９：６９８［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、上記）；Ｓｕｇｇｓｅｔａｌ．，１９８１，ｉｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙＵｓｉｎｇＰｕｒｉｆｉｅｄＧｅｎｅｓ，Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．［ｅｄｓ．］，ｐｐ．６８３－６９３，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７－２５９［１９９１］を参照）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているポリペプチドをコードし、中程度にストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件等の定義された条件下で、本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードする配列の相補体にハイブリダイズする。

「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件等のハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて変化するがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する、標的ポリヌクレオチドに対する約９０％超の同一性を有する、相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおける４２℃でのハイブリダイゼーションと、続く、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおける４２℃での洗浄と同等な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は一般に、定義されたポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定される、熱的融解温度Ｔ_ｍから約１０℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８ＭＮａＣｌにおいて安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、６５℃で０．０１８ＭＮａＣｌにおいて安定していない場合、本明細書に企図される通り、高ストリンジェンシー条件下で安定しないであろう）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳと同等な条件における４２℃でのハイブリダイゼーションと、続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにおける６５℃での洗浄によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣにおける６５℃でのハイブリダイズと、０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣにおける６５℃での洗浄と同等な条件におけるハイブリダイズである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、中程度にストリンジェントな条件と共に、上に引用されている参考文献に記載されている。

「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において、遺伝暗号は縮重であるが、特定の生物によるコドン使用が、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用バイアスは、所与の遺伝子、共通機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質対低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コード領域に関してより高くなることができる。一部の実施形態では、プロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物における最適な産生のためにコドン最適化されていてよい。

「好まれる、最適な、高いコドン使用バイアスのコドン」は、タンパク質コード領域において、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも高い頻度で使用されるコドンを互換的に指す。好まれるコドンは、単一の遺伝子、共通機能もしくは起源の遺伝子のセット、高度に発現される遺伝子におけるコドン使用、生物全体の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、近縁生物の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはこれらの組合せに関して決定することができる。遺伝子発現のレベルに伴いその頻度が増加するコドンは典型的に、発現に最適なコドンである。例えば、クラスター解析または対応解析、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を使用した多変量解析を含む、特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用、相対的同義コドン使用）およびコドン優先度を決定するための種々の方法が公知である（例えば、ＧＣＧＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｐｅｄｅｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，１４：３７２－７３［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２２４３７－４６［１９９４］；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇｅｎｅ８７：２３－２９［１９９０］を参照）。多くの異なる生物についてコドン使用表を利用することができる（例えば、Ｗａｄａｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０：２１１１－２１１８［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８：２９２［２０００］；Ｄｕｒｅｔ，ｅｔａｌ．，上記；ＨｅｎａｕｔａｎｄＤａｎｃｈｉｎ，ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ＡＳＭＰｒｅｓｓ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，ｐ．２０４７－２０６６［１９９６］を参照）。コドン使用を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができるいずれかの利用できるヌクレオチド配列に頼ることができる。これらのデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全タンパク質コード配列－ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ８，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：２５９－２８１［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉｅｔａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１３：２６３－２７０［１９９７］を参照）。

「制御配列」は、本明細書において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利なあらゆる構成成分を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブまたは外来性であり得る。斯かる制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターを含むがこれらに限定されない。最小でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的でリンカーとともに提供され得る。

「作動可能に連結された」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を方向付けるまたは調節するような、目的のポリヌクレオチドに対する位置において制御配列が適切に配置された（すなわち、機能的な関係性で）構成として本明細書に定義される。

「プロモーター配列」は、コード配列等の目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、選択宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、宿主細胞にとって同種または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

「適した反応条件」は、酵素変換反応溶液における条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲等）を指し、その条件下で、本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、基質を所望の産物化合物に変換することができる。一部の例示的な「適した反応条件」が、本明細書に提供される。

本明細書で使用される場合、「化合物負荷」または「酵素負荷」等における「負荷」は、反応開始時の反応混合物中の構成成分の濃度または量を指す。

本明細書で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドによる作用を受ける化合物または分子を指す。

本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における「産物」は、基質におけるプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの作用に起因する化合物または分子を指す。

本明細書で使用される場合、用語「培養すること」は、いずれか適した条件下で（例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用して）微生物細胞の集団を育成することを指す。

組換えポリペプチドは、当技術分野で公知のいずれか適した方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミド等のベクターにおいてクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ等の所望の宿主において発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の様々な方法によって生成することができる。実際に、当業者にとって周知の多種多様な異なる変異誘発技法が存在する。加えて、多くの商業的分子生物学サプライヤーから変異誘発キットも入手できる。定義されたアミノ酸における特異的な置換（部位特異的）、遺伝子の局在化された領域における特異的もしくはランダムな変異（位置特異的）、または遺伝子全体にわたるランダムな変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を作製するための方法を利用できる。ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリングおよび化学的飽和変異誘発、または当技術分野で公知の他のいずれかの適した方法を含むがこれらに限定されない、酵素バリアントを生成するための多数の適した方法が、当業者にとって公知である。ＤＮＡおよびタンパク質操作に使用される方法の非限定的な例は、次の特許に提供されている：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号。バリアントが産生された後に、バリアントをいずれか所望の特性（例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低下した活性、増加した熱的活性、増加した熱的安定性、および／または酸性ｐＨ安定性等）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド」（「操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド」、「バリアントプロリンヒドロキシラーゼ酵素」および「プロリンヒドロキシラーゼバリアント」とも本明細書で称される）は、用途を見出す。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドの、適した宿主における発現をもたらすことができる適した制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するための、ＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語が、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを包含することが意図される。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列等）が、それが作動可能に連結されている別の配列に対して「異種」であるのは、この２種の配列が、自然界で会合されていない場合である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、研究室の技法によって宿主細胞に導入されるいずれかのポリヌクレオチドであり、宿主細胞から取り出され、研究室の操作に供され、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書に提供されるＤＮＡ（例えば、プロリンヒドロキシラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターに適した宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の通りに組換えＤＮＡ技法を使用して構築されたベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞である。

用語「アナログ」は、参照ポリペプチドと７０％超の配列同一性かつ１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない１個または複数の天然に存在しないアミノ酸残基を、天然に存在するアミノ酸と共に含有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、１個または複数のＤ－アミノ酸残基、および２個またはそれよりも多いアミノ酸残基の間の非ペプチド連結も含む。

用語「有効量」は、所望の結果を生じるのに十分な量を意味する。当業者は、慣例的な実験法を使用することにより有効量を決定することができる。

用語「単離された」および「精製された」は、それが天然に会合されていた少なくとも１種の他の構成成分から取り出された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチド等）または他の構成成分を指すように使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を要求せず、むしろこれは、相対的な定義として意図される。

「立体選択性」は、化学または酵素反応における、ある１種の立体異性体の、別の立体異性体よりも優先的な形成を指す。立体選択性は、部分的であり得、この場合、ある１種の立体異性体の形成が他の立体異性体よりも有利になるか、または完全であり得、この場合、ある１種の立体異性体のみが形成される。立体異性体が鏡像異性体である場合、立体選択性は、両者の和におけるある１種の鏡像異性体の分率（典型的にパーセンテージとして報告）である、エナンチオ選択性と称される。これは一般的にその代わりに、式［主要鏡像異性体－微量鏡像異性体］／［主要鏡像異性体＋微量鏡像異性体］に従ってそれから計算される鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）として当技術分野で報告される（典型的にパーセンテージとして）。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、２種のジアステレオマーの混合物におけるある１種のジアステレオマーの分率（典型的にパーセンテージとして報告される）である、ジアステレオ選択性と称され、一般的にその代わりに、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、ある種の立体異性体過剰率（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓｓ）である。

「高度に立体選択的」は、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で、基質（例えば、Ｌ－プロリン）をその対応するヒドロキシル化産物（例えば、トランス－３－ヒドロキシプロリン）に変換することができる化学または酵素反応を指す。

「位置選択性」または「位置選択的反応」は、ある一方向の結合作製または切断が、他のあらゆる可能な方向よりも優先的に発生する反応を指す。反応は、区別が完全である場合、完全に（１００％）位置選択的であり得る、実質的に位置選択的（少なくとも７５％）であり得る、またはある１部位における反応の産物が他の部位における反応の産物よりも優勢である場合、例えば、産物化合物（すなわち、望まれない産物のトランス－４－ヒドロキシプロリンを上回るトランス－３－ヒドロキシプロリン）の優先的な形成の場合、部分的に位置選択的（ｘ％、この場合、パーセンテージは、目的の反応に依存して設定される）であり得る。

「選択的」または「選択性」は、上に定義される通り、立体選択的もしくは位置選択的のどちらかを指すことができる、または立体選択的および位置選択的の両方を指すことができる。

「異性体過剰率」は、式［主要異性体－微量異性体］／［主要異性体＋微量異性体］に従って計算されたパーセンテージを指す。このパーセンテージは、化学または酵素反応におけるある１種の異性体の、他の異性体よりも優先的な形成を表す。鏡像体過剰率は、異性体過剰率の一形態である。

本明細書で使用される場合、「熱安定性の（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）」は、同じ上昇された温度に曝露された野生型酵素と比較して、ある期間（例えば、０．５～２４ｈ）にわたる上昇された温度（例えば、４０～８０℃）への曝露後に同様の活性（例えば６０％～８０％超）を維持するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「溶媒安定な（ｓｏｌｖｅｎｔｓｔａｂｌｅ）」は、同じ濃度の同じ溶媒に曝露された野生型酵素と比較して、ある期間（例えば、０．５～２４ｈ）にわたる変動する濃度（例えば、５～９９％）の溶媒（例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル等）への曝露後に同様の活性（例えば、６０％～８０％超）を維持するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「熱安定性かつ溶媒安定な（ｔｈｅｒｍｏ－ａｎｄｓｏｌｖｅｎｔｓｔａｂｌｅ）」は、熱安定性かつ溶媒安定の両方であるプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「還元剤」は、Ｆｅ^＋３をＦｅ^＋２に変換することができる化合物または作用物質を指す。例示的な還元剤は、アスコルビン酸であり、これは一般に、Ｌ－アスコルビン酸の形態である。

「アルキル」は、直鎖または分枝状のいずれかである、１～１８個（両端の値を含む）の炭素原子、より好ましくは、１～８個（両端の値を含む）の炭素原子、最も好ましくは、１～６個（両端の値を含む）の炭素原子の飽和炭化水素基を指す。指定の数の炭素原子を有するアルキルは、括弧内に表示される（例えば、（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルは、１～６個の炭素原子のアルキルを指す）。

「アルケニル」は、少なくとも１個の二重結合を含有する、ただし、必要に応じて１個より多くの二重結合を含有する、直鎖または分枝状のいずれかである、２～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の炭化水素基を指す。

「アルキニル」は、少なくとも１個の三重結合を含有する、ただし、必要に応じて１個より多くの三重結合を含有し、その上、必要に応じて１個または複数の二重結合された部分を含有する、直鎖または分枝状のいずれかである、２～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の炭化水素基を指す。

「アルキレン」は、１個または複数の適した置換基で必要に応じて置換された、１～１８個（両端の値を含む）の炭素原子、より好ましくは、１～８個（両端の値を含む）の炭素原子、最も好ましくは、１～６個（両端の値を含む）の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖二価炭化水素ラジカルを指す。例示的な「アルキレン」は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンその他を含むがこれらに限定されない。

「アルケニレン」は、１個または複数の適した置換基で必要に応じて置換された、２～１２個（両端の値を含む）の炭素原子および１個または複数の炭素－炭素二重結合、より好ましくは、２～８個（両端の値を含む）の炭素原子、最も好ましくは、２～６個（両端の値を含む）の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖二価炭化水素ラジカルを指す。

「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」はそれぞれ、炭素原子のうち１個または複数がそれぞれ独立して、同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基に置き換えられた、本明細書に定義されているアルキル、アルケニルおよびアルキニルを指す。炭素原子に取って代わることができるヘテロ原子および／またはヘテロ原子基は、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｏ－、－ＮＲ^γ－、－ＰＨ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ（Ｏ）ＮＲ^γ－、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ^γ－、その他を、これらの組合せを含めて含むがこれらに限定されない（式中、各Ｒ^γは独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択される）。

「アリール」は、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する、６～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を指す。例示的なアリールは、フェニル、ピリジル、ナフチルその他を含む。

「アリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に１～６個（両端の値を含む）の炭素原子を、アリール部分に６～１２個（両端の値を含む）の炭素原子を有する、アリールで置換されたアルキル（すなわち、アリール－アルキル基）を指す。斯かるアリールアルキル基は、ベンジル、フェネチルその他によって例証される。

「アリールオキシ」は、－ＯＲ^λ基（式中、Ｒ^λは、必要に応じて置換されていてよいアリール基である）を指す。

「シクロアルキル」は、１～３個のアルキル基で必要に応じて置換されていてよい、単一の環式の環または複数の縮合環を有する３～１２個（両端の値を含む）の炭素原子の環式アルキル基を指す。例示的なシクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、１－メチルシクロプロピル、２－メチルシクロペンチル、２－メチルシクロオクチルその他の単一の環構造、またはアダマンチルその他の架橋された環系を含む複数の環構造を含むがこれらに限定されない。

「シクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に１～６個（両端の値を含む）の炭素原子を、シクロアルキル部分に３～１２個（両端の値を含む）の炭素原子を有する、シクロアルキルで置換されたアルキル（すなわち、シクロアルキル－アルキル基）を指す。斯かるシクロアルキルアルキル基は、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチルその他によって例証される。

「アミノ」は、基－ＮＨ_２を指す。置換アミノは、基－ＮＨＲ^η、ＮＲ^ηＲ^ηおよびＮＲ^ηＲ^ηＲ^η（式中、各Ｒ^ηは独立して、置換または未置換アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル（ｓｕｌｆａｎｙｌ）、スルフィニル、スルホニルその他から選択される）を指す。典型的なアミノ基は、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチル（ｍｅｔｈｙｌｙ）スルホニルアミノ、フラニル－オキシ－スルファミノ（ｓｕｌｆａｍｉｎｏ）その他を含むがこれらに限定されない。

「アミノアルキル」は、水素原子のうち１個または複数が、置換アミノ基を含む１個または複数のアミノ基に置き換えられた、アルキル基を指す。

「アミノカルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２を指す。置換アミノカルボニルは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ηＲ^η（式中、アミノ基ＮＲ^ηＲ^ηは、本明細書に定義されている通りである）を指す。

「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成するための様々な置換基を有することができる、二価基－Ｏ－を指す。

「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は、基－ＯＲ^ζ（式中、Ｒ^ζは、必要に応じて置換アルキル基を含むアルキル基である）を指すように本明細書で互換的に使用される。

「カルボキシ」は、－ＣＯＯＨを指す。

「カルボニル」は、酸、酸ハライド、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む、異なるカルボニル基を形成するための種々の置換基を有することができる－Ｃ（Ｏ）－を指す。

「カルボキシアルキル」は、水素原子のうち１個または複数が、１個または複数のカルボキシ基に置き換えられた、アルキルを指す。

「アミノカルボニルアルキル」は、本明細書に定義されている通りのアミノカルボニル基で置換されたアルキルを指す。

「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。

「ハロアルキル」は、水素原子のうち１個または複数が、ハロゲンに置き換えられた、アルキル基を指す。よって、用語「ハロアルキル」は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキル等、ペルハロアルキル（ｐｅｒｈａｌｏａｌｋｙｌ）までを含むことを意味する。例えば、表現「（Ｃ_１～Ｃ_２）ハロアルキル」は、１－フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１－フルオロエチル、１，１－ジフルオロエチル、１，２－ジフルオロエチル、１，１，１トリフルオロエチル、ペルフルオロエチル等を含む。

「ヒドロキシ」は、－ＯＨを指す。

「ヒドロキシアルキル」は、水素原子のうち１個または複数が、１個または複数のヒドロキシ基に置き換えられた、アルキル基を指す。

「チオール」または「スルファニル」は、－ＳＨを指す。置換チオールまたはスルファニルは、－Ｓ－Ｒ^η（式中、Ｒ^ηは、アルキル、アリールまたは他の適した置換基である）を指す。

「アルキルチオ」は、－ＳＲ^ζ（式中、Ｒ^ζは、必要に応じて置換されていてよいアルキルである）を指す。典型的なアルキルチオ基は、メチルチオ、エチルチオ、ｎ－プロピルチオその他を含むがこれらに限定されない。

「アルキルチオアルキル」は、アルキルチオ基、－ＳＲ^ζ（式中、Ｒ^ζは、必要に応じて置換されていてよいアルキルである）で置換されたアルキルを指す。

「スルホニル」は、－ＳＯ_２－を指す。置換スルホニルは、－ＳＯ_２－Ｒ^η（式中、Ｒ^ηは、アルキル、アリールまたは他の適した置換基である）を指す。

「アルキルスルホニル」は、－ＳＯ_２－Ｒ^ζ（式中、Ｒ^ζは、必要に応じて置換されていてよいアルキルである）を指す。典型的なアルキルスルホニル基は、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ－プロピルスルホニルその他を含むがこれらに限定されない。

「アルキルスルホニルアルキル」は、アルキルスルホニル基、－ＳＯ_２－Ｒ^ζ（式中、Ｒ^ζは、必要に応じて置換されていてよいアルキルである）で置換されたアルキルを指す。

「ヘテロアリール」は、１～１０個（両端の値を含む）の炭素原子、ならびに環内の酸素、窒素および硫黄から選択される１～４個（両端の値を含む）のヘテロ原子の芳香族複素環式基を指す。斯かるヘテロアリール基は、単一の環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有することができる。

「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に１～６個（両端の値を含む）の炭素原子を、ヘテロアリール部分に５～１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール－アルキル基）を指す。斯かるヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルその他によって例証される。

「複素環」、「複素環式」および互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、２～１０個（両端の値を含む）の炭素環原子、および環内の窒素、硫黄または酸素から選択される１～４個（両端の値を含む）のヘテロ環原子の、単一の環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和基を指す。斯かる複素環式基は、単一の環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル（ｉｎｄｏｌｉｎｙｌ）、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル）を有することができる。複素環の例は、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンその他を含むがこれらに限定されない。

「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に１～６個（両端の値を含む）の炭素原子を、ヘテロシクロアルキル部分に３～１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロシクロアルキルで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロシクロアルキル－アルキル基）を指す。

「員環」は、いかなる環状構造体も包括することを意味する。用語「員」に先行する数は、環を構成する骨格原子の数を表示する。よって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは、６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フランおよびチオフェンは、５員環である。

「融合二環式環」は、本明細書で使用される場合、各環に５～８個の原子を有する、未置換および置換炭素環式および／または複素環式環部分の両方を指し、環は、２個の共通原子を有する。

他に指定がなければ、前述の基における水素によって占有される位置は、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル（ｈｙｄｒｏｘａｍｏｙｌ）、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシおよび（複素環）アルキルによって例証されるがこれらに限定されない置換基でさらに置換されていてよく；好まれるヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。オープンな原子価（ｏｐｅｎｖａｌｅｎｃｅ）が、これらの置換基に存在する場合、これらは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび／または複素環基でさらに置換されていてよいこと、これらのオープンな原子価が、炭素に存在する場合、これらは、ハロゲンによって、および酸素、窒素または硫黄結合置換基によってさらに置換されていてよいこと、ならびに複数の斯かるオープンな原子価が存在する場合、結合の直接的な形成によって、または新たなヘテロ原子、好ましくは、酸素、窒素または硫黄への結合の形成によって、これらの基が連結されて環を形成してよいことが理解される。水素を置換基に置き換えることが、本発明の分子に許容できない不安定性を導入せず、その他の点で化学的に合理的であることを条件に、上述の置換を為すことができることがさらに理解される。

「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載されている事象または状況が発生してもしなくてもよいこと、また、記載が、事象または状況が発生する場合と、発生しない場合とを含むことを意味する。当業者であれば、１個または複数の必要に応じた置換基を含有するものとして記載されているいずれかの分子に関して、立体的に実際的なおよび／または合成的に実現可能な化合物のみが、含まれることが意図されることを理解するであろう。「必要に応じて置換された」は、用語または一連の化学基におけるあらゆるその後の修飾語句（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を指す。例えば、用語「必要に応じて置換されたアリールアルキルにおいて、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されていても置換されていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」について、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、その他から独立して、置換されていても置換されていなくてもよい。

操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド
本発明は、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチドを調製する方法、および当該ポリペプチドを使用するための方法を提供する。記載が、ポリペプチドに関する場合、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて記載する場合があることを理解されたい。

プロリンヒドロキシラーゼは、アルファ－ケトグルタレートおよび酸素（Ｏ_２）の存在下でプロリンのヒドロキシル化を触媒するジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）酵素のクラスに属する。アルファ－ケトグルタレートは、ヒドロキシル化において化学量論的に脱炭酸され、Ｏ_２分子の一方の原子は、スクシネートに取り込まれ、他方の原子は、プロリン残基に形成されたヒドロキシル基に取り込まれる。上に記す通り、プロリンヒドロキシラーゼは、遊離プロリンをヒドロキシル化するその能力によって、プロリルヒドロキシラーゼから識別される。

いくつかの種類のプロリンヒドロキシラーゼが、酵素反応において形成される主要なジアステレオマー産物に基づき同定された：シス－３－プロリンヒドロキシラーゼ（シス－Ｐ３Ｈ）、シス－４－プロリンヒドロキシラーゼ（シス－Ｐ４Ｈ）、トランス－３－プロリンヒドロキシラーゼ（トランス－Ｐ３Ｈ）およびトランス－４－プロリンヒドロキシラーゼ（トランス－Ｐ４Ｈ）。シス－Ｐ３Ｈ酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．ＴＨ１、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｎｕｓならびにＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＴＨ２およびＴＨ３において同定された（Ｍｏｒｉｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２（６）：１９０３－１９０７［１９９６］）。シス－Ｐ４Ｈ酵素は、Ｌｏｔｕｓｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｂｏｚｉｕｍｌｏｔｉ、ＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉおよびＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａｒｈｉｚｏｂｉａにおいて同定された（ＨａｒａａｎｄＫｉｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３７９（４）：８８２－６［２００９］；米国特許出願公開第２０１１／００９１９４２号）。トランス－Ｐ４Ｈは、Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｓｐ．、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．、ＧｌａｒｅａｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓおよびＥｍｅｒｉｃｅｌｌａｒｕｇｕｌｏｓａＮＲＲＬ１１４４０において同定された（Ｓｈｉｂａｓａｋｉｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５（９）：４０２８－３１［１９９９］；Ｐｅｔｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６２（２－３）：２６３－７［２００３］；Ｍｏｒｉｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２：１９０３－１９０７［１９９６］；Ｌａｗｒｅｎｃｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１３：１８５－１９１［１９９６］；およびＥＰ０６４１８６２；Ｃａｃｈｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１６７８１）。

近年、３種のヒドロキシラーゼ遺伝子を含む遺伝子クラスターが、真菌種（ｓｐ．）１１２４３において同定された（Ｍａｔｓｕｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１７，Ｆｅｂ；１２３（２）：１４７－１５３）。その後、これらの遺伝子のうち１種は、プロリンヒドロキシラーゼとして同定され、トランス選択的プロリンヒドロキシラーゼとして特徴付けされた。真菌種番号１１２４３由来のプロリンヒドロキシラーゼ（ＡＮＯ１１２４３またはＡＮＯと称される）は、遊離プロリンを、トランス－４－ヒドロキシプロリンおよびトランス－３－ヒドロキシプロリンの両方に変換し、トランス－３－ヒドロキシプロリン異性体が僅かに濃縮される。しかし、天然に存在するＡＮＯ１１２４３プロリンヒドロキシラーゼは、低い比活性、低い熱安定性、および所望のトランス－３－ヒドロキシプロリン異性体に対する低い選択性を含む、ラージスケールの産業プロセスにおいて有用となるであろう特性を欠如する。

真菌種番号１１２４３由来の野生型プロリンヒドロキシラーゼの欠陥を克服する操作されたプロリンヒドロキシラーゼが、本明細書に記載されている。真菌種番号１１２４３由来の野生型酵素ＡＮＯに由来する操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに効率的に変換することができる。本発明は、とりわけ、活性、安定性、発現、位置選択性および立体選択性を含む、天然に存在する酵素と比較して酵素特性を改善する、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチド配列におけるアミノ酸残基位置および対応する変異を同定する。特に、本発明は、補助基質（例えば、アルファ－ケトグルタレート）の存在下、適した反応条件下（例えば、酸素およびＦｅ（ＩＩ）の存在下）で、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに効率的に変換することができる操作されたポリペプチドを提供する（上のスキーム１に説明される通り）。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号４のポリペプチドと比較して、規定された時間で、同じ量の酵素により、Ｌ－プロリンからトランス－３－ヒドロキシプロリンへのヒドロキシル化において増加した活性を示す。一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０によって表されるポリペプチドと比較して、適した反応条件下で、少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれよりも高い活性を有する。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、野生型プロリンヒドロキシラーゼと比較して、増加した位置選択性を有する。具体的には、天然に存在する酵素は、プロリンを、排他的ではないにせよ主に、トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換する。一部の実施形態では、本明細書における操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、トランス－４－ヒドロキシプロリンを上回ってトランス－３－ヒドロキシプロリンを選択的に形成することができる。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、トランス－４－ヒドロキシプロリンを上回ってトランス－３－ヒドロキシプロリンを選択的に形成することができ、適した反応条件下における形成されたトランス－３－ヒドロキシプロリンの化合物トランス－４－ヒドロキシプロリンに対する比は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０またはそれよりも大きい。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１２５ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ、約１７５ｇ／Ｌもしくは約２００ｇ／Ｌまたはそれよりも多い基質負荷濃度で、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のパーセント変換により、約１２０ｈもしくはそれ未満、７２ｈもしくはそれ未満、約４８ｈもしくはそれ未満、約３６ｈもしくはそれ未満または約２４ｈもしくはそれ未満の反応時間において、適した反応条件下で、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる。

上述の改善された特性の操作されたポリペプチドがヒドロキシル化反応を実行する適した反応条件は、下および実施例にさらに記載される通り、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、補助基質、遷移金属補助因子、還元剤、緩衝液、共溶媒、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または固体支持体に固定化されたポリペプチドによる条件に関して決定することができる。

一部の実施形態では、特に、Ｌ－プロリンからトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換において改善された特性を有する例示的なプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、表４．１、４．２、４．３、４．４、５．１、５．２、５．３、６．１、７．１、７．２、７．３、８．１、８．２、９．１、９．２、１０．１、１０．２、１１．１、１１．２および／または１２．１に指し示される残基位置において配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較した１個または複数の残基差異を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の例示的な天然に存在しない（または操作された）プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの構造および機能情報は、Ｌ－プロリンからトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換に基づき、その結果は、下の表４．１、４．２、４．３、４．４、５．１、５．２、５．３、６．１、７．１、７．２、７．３、８．１、８．２、９．１、９．２、１０．１、１０．２、１１．１、１１．２および／または１２．１に示される。奇数番号の配列識別子（すなわち、配列番号）は、偶数番号の配列番号によって提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。例示的な配列は、これにより参照により本明細書に組み込まれる、本発明に添付する電子配列表ファイルに提供される。アミノ酸の残基差異は、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の参照配列との比較に基づく。真菌種番号１１２４３由来のプロリンヒドロキシラーゼＡＮＯの天然に存在するアミノ酸配列は、本明細書において配列番号２として提供される（対応するポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される通り、配列番号１である）。配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の参照ポリペプチドと比べた各操作されたポリペプチドの活性は、本明細書における実施例に記載されている基質の変換として決定された。一部の実施形態では、振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）または下流加工（ＤＳＰ）粉末アッセイは、二次スクリーニングとして使用して、操作されたプロリンヒドロキシラーゼの特性を評価し、その結果は、表４．１、４．２、４．３、４．４、５．１、５．２、５．３、６．１、７．１、７．２、７．３、８．１、８．２、９．１、９．２、１０．１、１０．２、１１．１、１１．２および／または１２．１に提供される。ＳＦＰ形態は、操作されたポリペプチドのより精製された粉末調製物を提供し、総タンパク質の最大で約３０％である操作されたポリペプチドを含有することができる。ＤＳＰ調製物は、総タンパク質の最大で約８０％である操作されたプロリンヒドロキシラーゼを含有することができるため、ＤＳＰ調製物は、さらにより精製された形態の操作されたポリペプチドを提供することができる。

一部の実施形態では、本明細書に指し示される残基位置における配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較した残基差異に関連する特異的酵素特性は、とりわけ、酵素活性、基質許容範囲、熱安定性、位置選択性および立体選択性を含む。酵素活性における改善は、本明細書における実施例に指し示される残基位置における残基差異に関連する。選択性における改善は、本明細書における実施例に指し示される残基位置における残基差異に関連する。熱安定性における改善は、本明細書における実施例に指し示される残基位置における残基差異に関連する。したがって、これらの残基位置における残基差異を個々にまたは様々な組合せにおいて使用して、とりわけ、酵素活性、基質許容範囲、位置選択性、立体選択性および熱安定性を含む所望の改善された特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを産生することができる。ポリペプチド発現に影響を与える他の残基差異を使用して、操作されたプロリンヒドロキシラーゼの発現を増加させることができる。

本明細書に提供されるガイダンスを踏まえると、配列番号４～６５８の偶数番号の配列を含む例示的な操作されたポリペプチドのいずれかが、例えば、表４．１、４．２、４．３、４．４、５．１、５．２、５．３、６．１、７．１、７．２、７．３、８．１、８．２、９．１、９．２、１０．１、１０．２、１１．１、１１．２および／または１２．１における他のポリペプチド由来の様々なアミノ酸差異、ならびに本明細書に記載されている他の残基位置の新たな組合せを組み込む進化のその後のラウンドによって、他の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列としての用途を見出すことがさらに企図される。さらなる改善は、進化のより早期のラウンドを通して未変化として維持されてきた残基位置におけるアミノ酸差異を含むことにより生成することができる。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１、２８、５８／２４７、６５、８０、８５、９５、９８、１１７、１２０、１５９、１８５、１９４、１９９、２００、２３３、２３７、２４３、２５０、２６８、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３０、３３８、３４３、３４６および３４８から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１Ｑ、２８Ａ、５８Ｖ／２４７Ｖ、６５Ａ、８０Ｈ、８５Ｌ、９５Ｐ、９５Ｒ、９８Ｌ、１１７Ｅ、１１７Ｌ、１１７Ｒ、１１７Ｓ、１１７Ｔ、１２０Ｆ、１５９Ｇ、１８５Ｄ、１９４Ｌ、１９４Ｔ、１９９Ａ、２００Ｖ、２３３Ａ、２３３Ｒ、２３７Ｅ、２４３Ａ、２４３Ｖ、２５０Ｑ、２６８Ｈ、２８１Ｓ、２８２Ｅ、２８２Ｓ、２８７Ｅ、２８９Ｄ、３０７Ｉ、３２４Ｄ、３２６Ｇ、３２６Ｈ、３２６Ｋ、３２７Ｑ、３３０Ｇ、３３８Ｉ、３４３Ｎ、３４３Ｐ、３４６Ｓおよび３４８Ｓから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＲ２１Ｑ、Ｐ２８Ａ、Ｅ５８Ｖ／Ｐ２４７Ｖ、Ｓ６５Ａ、Ｋ８０Ｈ、Ｅ８５Ｌ、Ｇ９５Ｐ、Ｇ９５Ｒ、Ｑ９８Ｌ、Ａ１１７Ｅ、Ａ１１７Ｌ、Ａ１１７Ｒ、Ａ１１７Ｓ、Ａ１１７Ｔ、Ｌ１２０Ｆ、Ｑ１５９Ｇ、Ａ１８５Ｄ、Ｎ１９４Ｌ、Ｎ１９４Ｔ、Ｔ１９９Ａ、Ｐ２００Ｖ、Ｖ２３３Ａ、Ｖ２３３Ｒ、Ｑ２３７Ｅ、Ｌ２４３Ａ、Ｌ２４３Ｖ、Ｖ２５０Ｑ、Ｒ２６８Ｈ、Ｒ２８１Ｓ、Ｌ２８２Ｅ、Ｌ２８２Ｓ、Ｄ２８７Ｅ、Ｍ２８９Ｄ、Ｖ３０７Ｉ、Ａ３２４Ｄ、Ｒ３２６Ｇ、Ｒ３２６Ｈ、Ｒ３２６Ｋ、Ｗ３２７Ｑ、Ｌ３３０Ｇ、Ｍ３３８Ｉ、Ｖ３４３Ｎ、Ｖ３４３Ｐ、Ａ３４６ＳおよびＱ３４８Ｓから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１、２８、４５、６５、９５、１１２、１１７、１３９、１７７、１８５、１９９、２３３、２４３、２５０、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３５、３３８、３４３および３４６から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１Ｑ、２８Ａ、４５Ｓ、６５Ａ、９５Ｒ、１１２Ｌ、１１７Ｓ、１３９Ｆ、１７７Ｐ、１８５Ｄ、１９９Ａ、２３３Ａ、２４３Ｖ、２５０Ｑ、２５０Ｔ、２８１Ｓ、２８１Ｔ、２８２Ｅ、２８２Ｓ、２８７Ｅ、２８９Ｄ、３０７Ｉ、３２４Ｄ、３２６Ｇ、３２６Ｈ、３２６Ｋ、３２７Ｑ、３３５Ａ、３３５Ｍ、３３８Ｉ、３４３Ｎ、３４３Ｐおよび３４６Ｓから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＲ２１Ｑ、Ｐ２８Ａ、Ｙ４５Ｓ、Ｓ６５Ａ、Ｇ９５Ｒ、Ｒ１１２Ｌ、Ａ１１７Ｓ、Ｍ１３９Ｆ、Ｓ１７７Ｐ、Ａ１８５Ｄ、Ｔ１９９Ａ、Ｖ２３３Ａ、Ｌ２４３Ｖ、Ｖ２５０Ｑ、Ｖ２５０Ｔ、Ｒ２８１Ｓ、Ｒ２８１Ｔ、Ｌ２８２Ｅ、Ｌ２８２Ｓ、Ｄ２８７Ｅ、Ｍ２８９Ｄ、Ｖ３０７Ｉ、Ａ３２４Ｄ、Ｒ３２６Ｇ、Ｒ３２６Ｈ、Ｒ３２６Ｋ、Ｗ３２７Ｑ、Ｓ３３５Ａ、Ｓ３３５Ｍ、Ｍ３３８Ｉ、Ｖ３４３Ｎ、Ｖ３４３ＰおよびＡ３４６Ｓから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４８／６６／１８９／１９４、４８／６６／１９４および６６／８２／８５／１３５／１８９／１９４／２６７から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４８Ｖ／６６Ｗ／１８９Ｎ／１９４Ｌ、４８Ｖ／６６Ｗ／１９４Ｌおよび６６Ｗ／８２Ｐ／８５Ｐ／１３５Ｐ／１８９Ｎ／１９４Ｌ／２６７Ｄから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＡ４８Ｖ／Ｙ６６Ｗ／Ａ１８９Ｎ／Ｎ１９４Ｌ、Ａ４８Ｖ／Ｙ６６Ｗ／Ｎ１９４ＬおよびＹ６６Ｗ／Ｋ８２Ｐ／Ｅ８５Ｐ／Ａ１３５Ｐ／Ａ１８９Ｎ／Ｎ１９４Ｌ／Ｇ２６７Ｄから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２０／５６／７６／１６８／１６９／２９６、２０／５６／２３２／２９４、２０／１１９／２９４／２９６、５６／７６／１１９／１２４／１４７／２３２、５６／７６／２９４、７６／１６８／２３２／２９４、７６／２９４／２９６、７６／２９６、１４７および２３２から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２０Ｆ／５６Ｐ／７６Ｅ／１６８Ａ／１６９Ｌ／２９６Ｉ、２０Ｆ／５６Ｐ／２３２Ｅ／２９４Ｙ、２０Ｆ／１１９Ｄ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、５６Ｐ／７６Ｅ／１１９Ｄ／１２４Ｆ／１４７Ｆ／２３２Ｅ、５６Ｐ／７６Ｅ／２９４Ｙ、７６Ｅ／１６８Ａ／２３２Ｅ／２９４Ｙ、７６Ｅ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、７６Ｅ／２９６Ｉ、１４７Ｆおよび２３２Ｅから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＹ２０Ｆ／Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｃ１６８Ａ／Ｉ１６９Ｌ／Ｌ２９６Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｓ５６Ｐ／Ｑ２３２Ｅ／Ｈ２９４Ｙ、Ｙ２０Ｆ／Ｅ１１９Ｄ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｅ１１９Ｄ／Ｗ１２４Ｆ／Ｙ１４７Ｆ／Ｑ２３２Ｅ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｈ２９４Ｙ、Ｈ７６Ｅ／Ｃ１６８Ａ／Ｑ２３２Ｅ／Ｈ２９４Ｙ、Ｈ７６Ｅ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｈ７６Ｅ／Ｌ２９６Ｉ、Ｙ１４７ＦおよびＱ２３２Ｅから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１２３、１８９、１９５、２３３および２９６から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１２３Ｔ、１８９Ａ、１８９Ｓ、１９５Ｙ、２３３Ａ、２３３Ｍおよび２９６Ｖから選択される１個または複数の残基差異（配列番号１１６と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＳ１２３Ｔ、Ｎ１８９Ａ、Ｎ１８９Ｓ、Ｈ１９５Ｙ、Ｖ２３３Ａ、Ｖ２３３ＭおよびＬ２９６Ｖから選択される１個または複数の残基差異（配列番号１１６と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２０／２１／５６、２０／２１／５６／７６／９５／２３２／２９４／３０７／３３５、２０／２１／５６／７６／１４７／２２５／２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７／３３５、２０／２１／５６／９５／１４７／２８１／２９４／３０７、２０／２１／５６／２８１／３０７、２０／２１／７６／２３２／２４３、２０／２１／９５／２３２／３０７、２０／２１／９５／２８１／２９４／２９６、２０／２１／１４７／１８９／２３３／２４３／２８１／３０７、２０／５６、２０／５６／７６／９５／２８１／３０７、２０／５６／７６／１４７／２９４／２９６／３０７、２０／５６／９５／１４７／２９４、２０／５６／２８１、２０／７６、２０／７６／９５／２８１／２９４／２９６、２０／７６／９５／２８１／２９６／３０７、２０／７６／２３３／２９４／３０７、２０／７６／２４３／２８１／２９４、２１／７６／１４７／２３３／２９４／３０７、２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、２１／９５／１８５／１８９／２３２／２８１／２９６、２１／９５／２３３／２４３／２８１／２９６、２１／９５／２９４／２９６／３０７／３３５、２１／９５／３０７、２１／２８１／３０７、２９／７６／２８１、５６／７６／９５／２３２／２４３／２８１、５６／７６／１４７／２８１／３０７、５６／７６／２４３／２９４、５６／７６／２８１／２９４、５６／７６／２９６、５６／７６／３０７、５６／９５／１４７／３０７／３３５／３４８、５６／９５／２３２／２３３／２８１／２９４／３０７、５６／９５／２４３／２８１、５６／１４７／２８１、５６／２３２／２４３／２８１、５６／２３２／２８１、５６／２３２／２８１／２９４／２９６、５６／２３３／２８１／２９４／２９６、５６／２８１／３０７、７６／９５／２３２／２４３／２８１／３０７、７６／９５／２４３／２８１／３０７／３３５、７６／９５／２９４／３０７、７６／１４７、７６／１４７／２３３／２４３／２９４、７６／１４７／２３３／２８１／２９４／３０７、７６／１４７／２４３／２９４／２９６／３０７／３３５、７６／１４７／２８１／３０７、７６／１８９／２９６、７６／２３２／２３３／２４３／２９４／２９６／３０７、７６／２８１、７６／２８１／２９４、７６／２９４／２９６、９５／１２０、９５／１４７／３３５、９５／２３２／２４３／２８１／２９４／３０７、９５／２３２／２８１／２９４／２９６、９５／２８１／２９４／２９６、９５／３３５、１４７、１４７／２２５／２３２／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、１４７／２３３／２４３／２８１／３０７、１４７／２３３／２８１／３０７／３３５、１４７／２４３／２８１、１４７／３０７、２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７、２３２／２８１、２３２／２８４／３０７、２３３／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、２３３／２８１／２９６／３０７、２４３／２８１／２９４／２９６、２８１、２８１／２９４、２８１／３０７、３０７および３３５、１１７、１３９、１７７、１８５、１９９、２３３、２４３、２５０、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３５、３３８、３４３および３４６から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２０Ｆ／２１Ｑ／５６Ｐ、２０Ｆ／２１Ｑ／５６Ｐ／７６Ｅ／９５Ｒ／２３２Ｅ／２９４Ｙ／３０７Ｉ／３３５Ｍ、２０Ｆ／２１Ｑ／５６Ｐ／７６Ｅ／１４７Ｆ／２２５Ｒ／２３２Ｅ／２３３Ａ／２８１Ｓ／２９４Ｙ／２９６Ｉ／３０７Ｌ／３３５Ｍ、２０Ｆ／２１Ｑ／５６Ｐ／９５Ｒ／１４７Ｆ／２８１Ｔ／２９４Ｙ／３０７Ｉ、２０Ｆ／２１Ｑ／５６Ｐ／２８１Ｔ／３０７Ｌ、２０Ｆ／２１Ｑ／７６Ｅ／２３２Ｅ／２４３Ｖ、２０Ｆ／２１Ｑ／９５Ｒ／２３２Ｅ／３０７Ｉ、２０Ｆ／２１Ｑ／９５Ｒ／２８１Ｔ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、２０Ｆ／２１Ｑ／１４７Ｆ／１８９Ａ／２３３Ｒ／２４３Ｖ／２８１Ｔ／３０７Ｉ、２０Ｆ／５６Ｐ、２０Ｆ／５６Ｐ／７６Ｅ／９５Ｒ／２８１Ｓ／３０７Ｉ、２０Ｆ／５６Ｐ／７６Ｅ／１４７Ｆ／２９４Ｙ／２９６Ｉ／３０７Ｌ、２０Ｆ／５６Ｐ／９５Ｐ／１４７Ｆ／２９４Ｙ、２０Ｆ／５６Ｐ／２８１Ｓ、２０Ｆ／７６Ｅ、２０Ｆ／７６Ｅ／９５Ｒ／２８１Ｓ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、２０Ｆ／７６Ｅ／９５Ｒ／２８１Ｔ／２９６Ｉ／３０７Ｉ、２０Ｆ／７６Ｅ／２３３Ａ／２９４Ｙ／３０７Ｉ、２０Ｆ／７６Ｅ／２４３Ｖ／２８１Ｔ／２９４Ｙ、２１Ｑ／７６Ｅ／１４７Ｆ／２３３Ｒ／２９４Ｙ／３０７Ｉ、２１Ｑ／７６Ｅ／１４７Ｆ／２４３Ｖ／２９６Ｉ／３０７Ｉ／３３５Ｍ、２１Ｑ／９５Ｒ／１８５Ｌ／１８９Ａ／２３２Ｅ／２８１Ｔ／２９６Ｉ、２１Ｑ／９５Ｒ／２３３Ａ／２４３Ｖ／２８１Ｔ／２９６Ｉ、２１Ｑ／９５Ｒ／２９４Ｙ／２９６Ｉ／３０７Ｉ／３３５Ｍ、２１Ｑ／９５Ｒ／３０７Ｉ、２１Ｑ／２８１Ｔ／３０７Ｌ、２９Ｔ／７６Ｅ／２８１Ｔ、５６Ｐ／７６Ｅ／９５Ｒ／２３２Ｅ／２４３Ｖ／２８１Ｔ、５６Ｐ／７６Ｅ／１４７Ｆ／２８１Ｔ／３０７Ｉ、５６Ｐ／７６Ｅ／２４３Ｖ／２９４Ｙ、５６Ｐ／７６Ｅ／２８１Ｔ／２９４Ｙ、５６Ｐ／７６Ｅ／２９６Ｉ、５６Ｐ／７６Ｅ／３０７Ｉ、５６Ｐ／９５Ｐ／１４７Ｆ／３０７Ｉ／３３５Ｍ／３４８Ｋ、５６Ｐ／９５Ｒ／２３２Ｅ／２３３Ｒ／２８１Ｓ／２９４Ｙ／３０７Ｌ、５６Ｐ／９５Ｒ／２４３Ｖ／２８１Ｔ、５６Ｐ／１４７Ｆ／２８１Ｔ、５６Ｐ／２３２Ｅ／２４３Ｖ／２８１Ｓ、５６Ｐ／２３２Ｅ／２８１Ｓ、５６Ｐ／２３２Ｅ／２８１Ｓ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、５６Ｐ／２３３Ｒ／２８１Ｓ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、５６Ｐ／２８１Ｔ／３０７Ｉ、７６Ｅ／９５Ｐ／２３２Ｅ／２４３Ｖ／２８１Ｓ／３０７Ｌ、７６Ｅ／９５Ｒ／２４３Ｖ／２８１Ｓ／３０７Ｉ／３３５Ｍ、７６Ｅ／９５Ｒ／２９４Ｙ／３０７Ｌ、７６Ｅ／１４７Ｆ、７６Ｅ／１４７Ｆ／２３３Ａ／２４３Ｖ／２９４Ｙ、７６Ｅ／１４７Ｆ／２３３Ｒ／２８１Ｔ／２９４Ｙ／３０７Ｌ、７６Ｅ／１４７Ｆ／２４３Ｖ／２９４Ｙ／２９６Ｉ／３０７Ｌ／３３５Ｍ、７６Ｅ／１４７Ｆ／２８１Ｓ／３０７Ｌ、７６Ｅ／１８９Ａ／２９６Ｉ、７６Ｅ／２３２Ｅ／２３３Ｒ／２４３Ｖ／２９４Ｙ／２９６Ｉ／３０７Ｉ、７６Ｅ／２８１Ｓ、７６Ｅ／２８１Ｔ／２９４Ｙ、７６Ｅ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、９５Ｐ／２３２Ｅ／２８１Ｔ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、９５Ｐ／３３５Ｍ、９５Ｒ／１２０Ｐ、９５Ｒ／１４７Ｆ／３３５Ｍ、９５Ｒ／２３２Ｅ／２４３Ｖ／２８１Ｔ／２９４Ｙ／３０７Ｉ、９５Ｒ／２８１Ｔ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、９５Ｒ／３３５Ｍ、１４７Ｆ、１４７Ｆ／２２５Ｒ／２３２Ｅ／２４３Ｖ／２８１Ｓ／２９６Ｉ／３０７Ｌ／３３５Ｍ、１４７Ｆ／２３３Ａ／２４３Ｖ／２８１Ｓ／３０７Ｌ、１４７Ｆ／２３３Ｒ／２８１Ｔ／３０７Ｌ／３３５Ｍ、１４７Ｆ／２４３Ｖ／２８１Ｓ、１４７Ｆ／３０７Ｉ、２３２Ｅ／２３３Ａ／２８１Ｔ／２９４Ｙ／２９６Ｉ／３０７Ｉ、２３２Ｅ／２８１Ｔ、２３２Ｅ／２８４Ｒ／３０７Ｉ、２３３Ａ／２４３Ｖ／２８１Ｓ／２９６Ｉ／３０７Ｉ／３３５Ｍ、２３３Ａ／２８１Ｔ／２９６Ｉ／３０７Ｉ、２４３Ｖ／２８１Ｓ／２９４Ｙ／２９６Ｉ、２８１Ｔ、２８１Ｔ／２９４Ｙ、２８１Ｔ／３０７Ｉ、２８１Ｔ／３０７Ｌ、３０７Ｉおよび３３５Ｍから選択される１個または複数の残基差異（配列番号１１６と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＹ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｓ５６Ｐ、Ｙ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｇ９５Ｒ／Ｑ２３２Ｅ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３０７Ｉ／Ｓ３３５Ｍ、Ｙ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｑ２２５Ｒ／Ｑ２３２Ｅ／Ｖ２３３Ａ／Ｒ２８１Ｓ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｌ／Ｓ３３５Ｍ、Ｙ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｓ５６Ｐ／Ｇ９５Ｒ／Ｙ１４７Ｆ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３０７Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｓ５６Ｐ／Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７Ｌ、Ｙ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｈ７６Ｅ／Ｑ２３２Ｅ／Ｌ２４３Ｖ、Ｙ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｇ９５Ｒ／Ｑ２３２Ｅ／Ｖ３０７Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｇ９５Ｒ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｒ２１Ｑ／Ｙ１４７Ｆ／Ｎ１８９Ａ／Ｖ２３３Ｒ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｓ５６Ｐ、Ｙ２０Ｆ／Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｇ９５Ｒ／Ｒ２８１Ｓ／Ｖ３０７Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｌ、Ｙ２０Ｆ／Ｓ５６Ｐ／Ｇ９５Ｐ／Ｙ１４７Ｆ／Ｈ２９４Ｙ、Ｙ２０Ｆ／Ｓ５６Ｐ／Ｒ２８１Ｓ、Ｙ２０Ｆ／Ｈ７６Ｅ、Ｙ２０Ｆ／Ｈ７６Ｅ／Ｇ９５Ｒ／Ｒ２８１Ｓ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｈ７６Ｅ／Ｇ９５Ｒ／Ｒ２８１Ｔ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｈ７６Ｅ／Ｖ２３３Ａ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３０７Ｉ、Ｙ２０Ｆ／Ｈ７６Ｅ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ、Ｒ２１Ｑ／Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｖ２３３Ｒ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３０７Ｉ、Ｒ２１Ｑ／Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｌ２４３Ｖ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｉ／Ｓ３３５Ｍ、Ｒ２１Ｑ／Ｇ９５Ｒ／Ａ１８５Ｌ／Ｎ１８９Ａ／Ｑ２３２Ｅ／Ｒ２８１Ｔ／Ｌ２９６Ｉ、Ｒ２１Ｑ／Ｇ９５Ｒ／Ｖ２３３Ａ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｔ／Ｌ２９６Ｉ、Ｒ２１Ｑ／Ｇ９５Ｒ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｉ／Ｓ３３５Ｍ、Ｒ２１Ｑ／Ｇ９５Ｒ／Ｖ３０７Ｉ、Ｒ２１Ｑ／Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７Ｌ、Ａ２９Ｔ／Ｈ７６Ｅ／Ｒ２８１Ｔ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｇ９５Ｒ／Ｑ２３２Ｅ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｔ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７Ｉ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｌ２４３Ｖ／Ｈ２９４Ｙ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｌ２９６Ｉ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｖ３０７Ｉ、Ｓ５６Ｐ／Ｇ９５Ｐ／Ｙ１４７Ｆ／Ｖ３０７Ｉ／Ｓ３３５Ｍ／Ｑ３４８Ｋ、Ｓ５６Ｐ／Ｇ９５Ｒ／Ｑ２３２Ｅ／Ｖ２３３Ｒ／Ｒ２８１Ｓ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３０７Ｌ、Ｓ５６Ｐ／Ｇ９５Ｒ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｔ、Ｓ５６Ｐ／Ｙ１４７Ｆ／Ｒ２８１Ｔ、Ｓ５６Ｐ／Ｑ２３２Ｅ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｓ、Ｓ５６Ｐ／Ｑ２３２Ｅ／Ｒ２８１Ｓ、Ｓ５６Ｐ／Ｑ２３２Ｅ／Ｒ２８１Ｓ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｓ５６Ｐ／Ｖ２３３Ｒ／Ｒ２８１Ｓ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｓ５６Ｐ／Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７Ｉ、Ｈ７６Ｅ／Ｇ９５Ｐ／Ｑ２３２Ｅ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｓ／Ｖ３０７Ｌ、Ｈ７６Ｅ／Ｇ９５Ｒ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｓ／Ｖ３０７Ｉ／Ｓ３３５Ｍ、Ｈ７６Ｅ／Ｇ９５Ｒ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３０７Ｌ、Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ、Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｖ２３３Ａ／Ｌ２４３Ｖ／Ｈ２９４Ｙ、Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｖ２３３Ｒ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３０７Ｌ、Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｌ２４３Ｖ／Ｈ２９４Ｙ／

Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｌ／Ｓ３３５Ｍ、Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｒ２８１Ｓ／Ｖ３０７Ｌ、Ｈ７６Ｅ／Ｎ１８９Ａ／Ｌ２９６Ｉ、Ｈ７６Ｅ／Ｑ２３２Ｅ／Ｖ２３３Ｒ／Ｌ２４３Ｖ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｉ、Ｈ７６Ｅ／Ｒ２８１Ｓ、Ｈ７６Ｅ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ、Ｈ７６Ｅ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｇ９５Ｐ／Ｑ２３２Ｅ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｇ９５Ｐ／Ｓ３３５Ｍ、Ｇ９５Ｒ／Ｌ１２０Ｐ、Ｇ９５Ｒ／Ｙ１４７Ｆ／Ｓ３３５Ｍ、Ｇ９５Ｒ／Ｑ２３２Ｅ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３０７Ｉ、Ｇ９５Ｒ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｇ９５Ｒ／Ｓ３３５Ｍ、Ｙ１４７Ｆ、Ｙ１４７Ｆ／Ｑ２２５Ｒ／Ｑ２３２Ｅ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｓ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｌ／Ｓ３３５Ｍ、Ｙ１４７Ｆ／Ｖ２３３Ａ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｓ／Ｖ３０７Ｌ、Ｙ１４７Ｆ／Ｖ２３３Ｒ／Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７Ｌ／Ｓ３３５Ｍ、Ｙ１４７Ｆ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｓ、Ｙ１４７Ｆ／Ｖ３０７Ｉ、Ｑ２３２Ｅ／Ｖ２３３Ａ／Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｉ、Ｑ２３２Ｅ／Ｒ２８１Ｔ、Ｑ２３２Ｅ／Ｇ２８４Ｒ／Ｖ３０７Ｉ、Ｖ２３３Ａ／Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｓ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｉ／Ｓ３３５Ｍ、Ｖ２３３Ａ／Ｒ２８１Ｔ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｉ、Ｌ２４３Ｖ／Ｒ２８１Ｓ／Ｈ２９４Ｙ／Ｌ２９６Ｉ、Ｒ２８１Ｔ、Ｒ２８１Ｔ／Ｈ２９４Ｙ、Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７Ｉ、Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７Ｌ、Ｖ３０７ＩおよびＳ３３５Ｍから選択される１個または複数の残基差異（配列番号１１６と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、５６／７６／１４７／２８１／３０７および９５／１４７／３３５から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１Ｑ／７６Ｅ／１４７Ｆ／２４３Ｖ／２９６Ｉ／３０７Ｉ／３３５Ｍ、５６Ｐ／７６Ｅ／１４７Ｆ／２８１Ｔ／３０７Ｉおよび９５Ｒ／１４７Ｆ／３３５Ｍから選択される１個または複数の残基差異（配列番号１１６と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＲ２１Ｑ／Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｌ２４３Ｖ／Ｌ２９６Ｉ／Ｖ３０７Ｉ／Ｓ３３５Ｍ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ７６Ｅ／Ｙ１４７Ｆ／Ｒ２８１Ｔ／Ｖ３０７ＩおよびＧ９５Ｒ／Ｙ１４７Ｆ／Ｓ３３５Ｍから選択される１個または複数の残基差異（配列番号１１６と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２／８５／１２３／２３７、２８／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７０／３４３／３４６／３４８、４５／１２３／３２６、６５／１１７／１２０／１２３／３４３／３４６、８５／１２３／２８１／２８２、１１４／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７１／３１３／３２６／３４３／３４６、１２３／１３９／２３３／２３７／２８１／２８２／２８９／３２４／３２６および１２３／１９９／２００／２４７／２５０／３３８から選択される残基位置における、配列番号１６２と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２Ｌ／８５Ｌ／１２３Ｔ／２３７Ｅ、２８Ａ／１１５Ｔ／１１７Ｖ／１２０Ｉ／１２３Ｔ／２６８Ｔ／２７０Ｌ／３４３Ｎ／３４６Ｓ／３４８Ｓ、４５Ｓ／１２３Ｔ／３２６Ｇ、６５Ｒ／１１７Ｖ／１２０Ｉ／１２３Ｔ／３４３Ｎ／３４６Ｇ、８５Ｌ／１２３Ｔ／２８１Ｔ／２８２Ｓ、１１４Ｇ／１１５Ｔ／１１７Ｔ／１２０Ｐ／１２３Ｔ／２６８Ｔ／２７１Ａ／３１３Ｆ／３２６Ｇ／３４３Ｎ／３４６Ｓ、１２３Ｔ／１３９Ｆ／２３３Ａ／２３７Ｅ／２８１Ｍ／２８２Ｓ／２８９Ｄ／３２４Ｑ／３２６Ｇおよび１２３Ｔ／１９９Ａ／２００Ｖ／２４７Ｌ／２５０Ｑ／３３８Ｉから選択される１個または複数の残基差異（配列番号１６２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＧ２Ｌ／Ｅ８５Ｌ／Ｓ１２３Ｔ／Ｑ２３７Ｅ、Ｐ２８Ａ／Ｖ１１５Ｔ／Ａ１１７Ｖ／Ｌ１２０Ｉ／Ｓ１２３Ｔ／Ｒ２６８Ｔ／Ｒ２７０Ｌ／Ｖ３４３Ｎ／Ａ３４６Ｓ／Ｑ３４８Ｓ、Ｙ４５Ｓ／Ｓ１２３Ｔ／Ｒ３２６Ｇ、Ｓ６５Ｒ／Ａ１１７Ｖ／Ｌ１２０Ｉ／Ｓ１２３Ｔ／Ｖ３４３Ｎ／Ａ３４６Ｇ、Ｅ８５Ｌ／Ｓ１２３Ｔ／Ｒ２８１Ｔ／Ｌ２８２Ｓ、Ｅ１１４Ｇ／Ｖ１１５Ｔ／Ａ１１７Ｔ／Ｌ１２０Ｐ／Ｓ１２３Ｔ／Ｒ２６８Ｔ／Ｓ２７１Ａ／Ｌ３１３Ｆ／Ｒ３２６Ｇ／Ｖ３４３Ｎ／Ａ３４６Ｓ、Ｓ１２３Ｔ／Ｍ１３９Ｆ／Ｖ２３３Ａ／Ｑ２３７Ｅ／Ｒ２８１Ｍ／Ｌ２８２Ｓ／Ｍ２８９Ｄ／Ａ３２４Ｑ／Ｒ３２６ＧおよびＳ１２３Ｔ／Ｔ１９９Ａ／Ｐ２００Ｖ／Ｐ２４７Ｌ／Ｖ２５０Ｑ／Ｍ３３８Ｉから選択される１個または複数の残基差異（配列番号１６２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２６、５４、６１、１２９、１３２、１４９、１５６、１７５、１８９、２０１、２０９、２２８、２３６、２４８、２６２、２７２、２７７、２９１および３４５から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２６Ｎ、５４Ｐ、６１Ｈ、１２９Ｉ、１３２Ｐ、１４９Ｇ、１５６Ｓ、１７５Ｓ、１７５Ｖ、１８９Ｓ、２０１Ｃ、２０１Ｇ、２０１Ｔ、２０９Ｓ、２２８Ｔ、２３６Ｔ、２４８Ｒ、２６２Ｖ、２７２Ｓ、２７７Ａ、２９１Ｇおよび３４５Ｒから選択される１個または複数の残基差異（配列番号３２２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＧ２６Ｎ、Ｇ５４Ｐ、Ｄ６１Ｈ、Ａ１２９Ｉ、Ｅ１３２Ｐ、Ｓ１４９Ｇ、Ｖ１５６Ｓ、Ｌ１７５Ｓ、Ｌ１７５Ｖ、Ｎ１８９Ｓ、Ａ２０１Ｃ、Ａ２０１Ｇ、Ａ２０１Ｔ、Ｃ２０９Ｓ、Ｖ２２８Ｔ、Ｑ２３６Ｔ、Ｄ２４８Ｒ、Ｓ２６２Ｖ、Ｖ２７２Ｓ、Ｖ２７７Ａ、Ｐ２９１ＧおよびＴ３４５Ｒから選択される１個または複数の残基差異（配列番号３２２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２５、４３、５４、５８、６１、７９、１２９、１３２、１４３、１５６、１６３、１７５、１７９、２０１、２０９、２３６、２４８、２７８、２９１、３４５および３４７から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２５Ｋ、４３Ｔ、５４Ｐ、５４Ｓ、５８Ｔ、６１Ｈ、７９Ｔ、１２９Ｉ、１３２Ｎ、１４３Ｌ、１５６Ｄ、１５６Ｓ、１６３Ｌ、１７５Ｖ、１７９Ｌ、２０１Ｃ、２０９Ｓ、２３６Ｔ、２４８Ｒ、２７８Ｎ、２９１Ｇ、３４５Ｒおよび３４７Ｅから選択される１個または複数の残基差異（配列番号３２２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＨ２５Ｋ、Ａ４３Ｔ、Ｇ５４Ｐ、Ｇ５４Ｓ、Ｅ５８Ｔ、Ｄ６１Ｈ、Ｑ７９Ｔ、Ａ１２９Ｉ、Ｅ１３２Ｎ、Ｄ１４３Ｌ、Ｖ１５６Ｄ、Ｖ１５６Ｓ、Ｑ１６３Ｌ、Ｌ１７５Ｖ、Ｅ１７９Ｌ、Ａ２０１Ｃ、Ｃ２０９Ｓ、Ｑ２３６Ｔ、Ｄ２４８Ｒ、Ｓ２７８Ｎ、Ｐ２９１Ｇ、Ｔ３４５ＲおよびＡ３４７Ｅから選択される１個または複数の残基差異（配列番号３２２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６、８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２８１／２８２／２８９、８５／１１７／１２０／２７０／２８１／２８９、８５／１１７／１３５／１３９／２０８および１１７／１２０／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８５Ｌ／１１７Ｔ／１２０Ｐ／１３５Ｓ／２０８Ｅ／２８１Ｒ／２８２Ｌ／２８９Ｍ、８５Ｌ／１１７Ｔ／１３５Ｓ／１３９Ｍ／２０８Ｅ、８５Ｌ／１１７Ｖ／１２０Ｉ／１３５Ｓ／２０８Ｅ／２７０Ｌ／３２４Ａ／３４３Ｎ／３４６Ｇ、８５Ｌ／１１７Ｖ／１２０Ｐ／２７０Ｌ／２８１Ｒ／２８９Ｍおよび１１７Ｔ／１２０Ｉ／２０８Ｅ／２７０Ｌ／３２４Ａ／３４３Ｎ／３４６Ｇから選択される１個または複数の残基差異（配列番号３２２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＥ８５Ｌ／Ａ１１７Ｔ／Ｌ１２０Ｐ／Ａ１３５Ｓ／Ａ２０８Ｅ／Ｍ２８１Ｒ／Ｓ２８２Ｌ／Ｄ２８９Ｍ、Ｅ８５Ｌ／Ａ１１７Ｔ／Ａ１３５Ｓ／Ｆ１３９Ｍ／Ａ２０８Ｅ、Ｅ８５Ｌ／Ａ１１７Ｖ／Ｌ１２０Ｉ／Ａ１３５Ｓ／Ａ２０８Ｅ／Ｒ２７０Ｌ／Ｑ３２４Ａ／Ｖ３４３Ｎ／Ａ３４６Ｇ、Ｅ８５Ｌ／Ａ１１７Ｖ／Ｌ１２０Ｐ／Ｒ２７０Ｌ／Ｍ２８１Ｒ／Ｄ２８９ＭおよびＡ１１７Ｔ／Ｌ１２０Ｉ／Ａ２０８Ｅ／Ｒ２７０Ｌ／Ｑ３２４Ａ／Ｖ３４３Ｎ／Ａ３４６Ｇから選択される１個または複数の残基差異（配列番号３２２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７、４８、５６／１１８、８５、９５、９５／２８９、１１３、１１８、１１８／２４７、１５４、１６２、１６２／２０４、１６４、１６４／１９８／２７１、１６８、１６９、１８７、１９５、２４３、２７１、２７５、２８１、３１４、３３０および３４２から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７Ｍ、４８Ｇ、５６Ｐ／１１８Ｗ、８５Ｐ、９５Ａ／２８９Ｖ、９５Ｗ、１１３Ｈ、１１３Ｎ、１１３Ｐ、１１３Ｒ、１１８Ｄ、１１８Ｐ／２４７Ａ、１１８Ｖ、１１８Ｗ、１５４Ｌ、１６２Ａ、１６２Ｌ、１６２Ｍ、１６２Ｖ、１６２Ｖ／２０４Ｓ、１６４Ｄ／１９８Ｖ／２７１Ｖ、１６４Ｔ、１６８Ｖ、１６９Ｃ、１６９Ｔ、１６９Ｖ、１８７Ｐ、１９５Ｙ、２４３Ｙ、２７１Ｖ、２７５Ｋ、２８１Ｌ、３１４Ａ、３１４Ｓ、３１４Ｔ、３３０Ｇ、３３０Ｈおよび３４２Ｒから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４１２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＦ４７Ｍ、Ｖ４８Ｇ、Ｓ５６Ｐ／Ａ１１８Ｗ、Ｌ８５Ｐ、Ｇ９５Ａ／Ｍ２８９Ｖ、Ｇ９５Ｗ、Ｓ１１３Ｈ、Ｓ１１３Ｎ、Ｓ１１３Ｐ、Ｓ１１３Ｒ、Ａ１１８Ｄ、Ａ１１８Ｐ／Ｐ２４７Ａ、Ａ１１８Ｖ、Ａ１１８Ｗ、Ｆ１５４Ｌ、Ｈ１６２Ａ、Ｈ１６２Ｌ、Ｈ１６２Ｍ、Ｈ１６２Ｖ、Ｈ１６２Ｖ／Ｌ２０４Ｓ、Ｓ１６４Ｄ／Ａ１９８Ｖ／Ｓ２７１Ｖ、Ｓ１６４Ｔ、Ｃ１６８Ｖ、Ｉ１６９Ｃ、Ｉ１６９Ｔ、Ｉ１６９Ｖ、Ｃ１８７Ｐ、Ｈ１９５Ｙ、Ｖ２４３Ｙ、Ｓ２７１Ｖ、Ｒ２７５Ｋ、Ｒ２８１Ｌ、Ｆ３１４Ａ、Ｆ３１４Ｓ、Ｆ３１４Ｔ、Ｌ３３０Ｇ、Ｌ３３０ＨおよびＮ３４２Ｒから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４１２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２５／１２９／１６３／２３６／２６２／３４５／３４７、１２０／１５６／１７５／１７９／２０１、１２９／１８９／２３６／２６２／２７７／２７８、１２９／２３６／２６２、１５６／１７５／１７９／２２８および１６２から選択される残基位置における、配列番号４１２と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２５Ｋ／１２９Ｉ／１６３Ｌ／２３６Ｔ／２６２Ｖ／３４５Ｒ／３４７Ｅ、１２０Ｖ／１５６Ｓ／１７５Ｖ／１７９Ｌ／２０１Ｇ、１２９Ｉ／１８９Ｓ／２３６Ｔ／２６２Ｖ／２７７Ａ／２７８Ｎ、１２９Ｉ／２３６Ｔ／２６２Ｖ、１５６Ｓ／１７５Ｖ／１７９Ｌ／２２８Ａ、１６２Ｌおよび１６２Ｖから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４１２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＨ２５Ｋ／Ａ１２９Ｉ／Ｑ１６３Ｌ／Ｑ２３６Ｔ／Ｓ２６２Ｖ／Ｔ３４５Ｒ／Ａ３４７Ｅ、Ｐ１２０Ｖ／Ｖ１５６Ｓ／Ｌ１７５Ｖ／Ｅ１７９Ｌ／Ａ２０１Ｇ、Ａ１２９Ｉ／Ｎ１８９Ｓ／Ｑ２３６Ｔ／Ｓ２６２Ｖ／Ｖ２７７Ａ／Ｓ２７８Ｎ、Ａ１２９Ｉ／Ｑ２３６Ｔ／Ｓ２６２Ｖ、Ｖ１５６Ｓ／Ｌ１７５Ｖ／Ｅ１７９Ｌ／Ｖ２２８Ａ、Ｈ１６２ＬおよびＨ１６２Ｖから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４１２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５、１７、２８、２９、６５、１３５、１６７、１７７、１９９、２０８、２２８、２３５、２８７、２９４、３０７および３４３から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５Ｖ、１７Ｃ、２８Ｉ、２９Ｓ、６５Ｖ、１３５Ｇ、１３５Ｎ、１３５Ｔ、１６７Ｇ、１７７Ａ、１７７Ｌ、１７７Ｐ、１９９Ｃ、２０８Ｌ、２０８Ｍ、２０８Ｓ、２２８Ｔ、２３５Ｅ、２８７Ｅ、２９４Ｔ、３０７Ｌ、３４３Ｓおよび３４３Ｔから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４９２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＩ１５Ｖ、Ｓ１７Ｃ、Ｐ２８Ｉ、Ａ２９Ｓ、Ｓ６５Ｖ、Ｓ１３５Ｇ、Ｓ１３５Ｎ、Ｓ１３５Ｔ、Ｑ１６７Ｇ、Ｓ１７７Ａ、Ｓ１７７Ｌ、Ｓ１７７Ｐ、Ｔ１９９Ｃ、Ｅ２０８Ｌ、Ｅ２０８Ｍ、Ｅ２０８Ｓ、Ｖ２２８Ｔ、Ｄ２３５Ｅ、Ｄ２８７Ｅ、Ｈ２９４Ｔ、Ｉ３０７Ｌ、Ｖ３４３ＳおよびＶ３４３Ｔから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４９２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８５／１８７／２８１／３４７、８５／１８７／３４７、１１８／１２０／１６２／１７５／１７９／３３０、１１８／１２０／１６２／１７５／３３０、１６２／１７５／１７９／３３０、１７５／２２８／３３０、１９５／３４７および２７８／３１４／３４７から選択される残基位置における、配列番号４９２と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８５Ｐ／１８７Ｐ／２８１Ｌ／３４７Ｅ、８５Ｐ／１８７Ｐ／３４７Ｅ、１１８Ｖ／１２０Ｖ／１６２Ｖ／１７５Ｖ／１７９Ｌ／３３０Ｈ、１１８Ｖ／１２０Ｖ／１６２Ｖ／１７５Ｖ／３３０Ｈ、１６２Ｖ／１７５Ｖ／１７９Ｌ／３３０Ｈ、１７５Ｖ／２２８Ａ／３３０Ｈ、１９５Ｙ／３４７Ｅおよび２７８Ｓ／３１４Ａ／３４７Ｅから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４９２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＬ８５Ｐ／Ｃ１８７Ｐ／Ｒ２８１Ｌ／Ａ３４７Ｅ、Ｌ８５Ｐ／Ｃ１８７Ｐ／Ａ３４７Ｅ、Ａ１１８Ｖ／Ｐ１２０Ｖ／Ｈ１６２Ｖ／Ｌ１７５Ｖ／Ｅ１７９Ｌ／Ｌ３３０Ｈ、Ａ１１８Ｖ／Ｐ１２０Ｖ／Ｈ１６２Ｖ／Ｌ１７５Ｖ／Ｌ３３０Ｈ、Ｈ１６２Ｖ／Ｌ１７５Ｖ／Ｅ１７９Ｌ／Ｌ３３０Ｈ、Ｌ１７５Ｖ／Ｖ２２８Ａ／Ｌ３３０Ｈ、Ｈ１９５Ｙ／Ａ３４７ＥおよびＮ２７８Ｓ／Ｆ３１４Ａ／Ａ３４７Ｅから選択される１個または複数の残基差異（配列番号４９２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５、４０、４３、４４、５９、７９、８２、１４９、１６４、１７９、３４５および３４７から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５Ｆ、４０Ａ、４３Ｓ、４４Ｒ、４４Ｖ、５９Ｌ、７９Ｅ、８２Ａ、１４９Ｎ、１６４Ｑ、１７９Ｔ、３４５Ｄおよび３４７Ｋから選択される１個または複数の残基差異（配列番号５６２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＩ１５Ｆ、Ｋ４０Ａ、Ａ４３Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｇ４４Ｖ、Ｒ５９Ｌ、Ｑ７９Ｅ、Ｋ８２Ａ、Ｓ１４９Ｎ、Ｓ１６４Ｑ、Ｌ１７９Ｔ、Ｔ３４５ＤおよびＡ３４７Ｋから選択される１個または複数の残基差異（配列番号５６２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２９／８５／１７７／２０８／２２８／３４７、２９／８５／２０８／２２８／３４３／３４７、２９／１７７／１９５／２２８／３４３、２９／２０８／２２８／２７８／２９４／３４７、５６／１９５／２７８、８５／１８７／２０５／２０８／２７８、１１３／１７７／１８７／１９５／２０８／２７８／２９４／３４３／３４７および１７７／２０５／２０８／２２８から選択される残基位置における、配列番号５６２と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２９Ｓ／８５Ｐ／１７７Ａ／２０８Ｓ／２２８Ｔ／３４７Ｅ、２９Ｓ／８５Ｐ／２０８Ｌ／２２８Ｔ／３４３Ｔ／３４７Ｅ、２９Ｓ／１７７Ｐ／１９５Ｙ／２２８Ｔ／３４３Ｔ、２９Ｓ／２０８Ｓ／２２８Ｔ／２７８Ｓ／２９４Ｔ／３４７Ｅ、５６Ｐ／１９５Ｙ／２７８Ｓ、８５Ｐ／１８７Ｐ／２０５Ｓ／２０８Ｌ／２７８Ｓ、１１３Ｎ／１７７Ｐ／１８７Ｐ／１９５Ｙ／２０８Ｓ／２７８Ｓ／２９４Ｙ／３４３Ｔ／３４７Ｅおよび１７７Ａ／２０５Ｓ／２０８Ｌ／２２８Ｔから選択される１個または複数の残基差異（配列番号５６２と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＡ２９Ｓ／Ｌ８５Ｐ／Ｓ１７７Ａ／Ｅ２０８Ｓ／Ｖ２２８Ｔ／Ａ３４７Ｅ、Ａ２９Ｓ／Ｌ８５Ｐ／Ｅ２０８Ｌ／Ｖ２２８Ｔ／Ｖ３４３Ｔ／Ａ３４７Ｅ、Ａ２９Ｓ／Ｓ１７７Ｐ／Ｈ１９５Ｙ／Ｖ２２８Ｔ／Ｖ３４３Ｔ、Ａ２９Ｓ／Ｅ２０８Ｓ／Ｖ２２８Ｔ／Ｎ２７８Ｓ／Ｈ２９４Ｔ／Ａ３４７Ｅ、Ｓ５６Ｐ／Ｈ１９５Ｙ／Ｎ２７８Ｓ、Ｌ８５Ｐ／Ｃ１８７Ｐ／Ａ２０５Ｓ／Ｅ２０８Ｌ／Ｎ２７８Ｓ、Ｓ１１３Ｎ／Ｓ１７７Ｐ／Ｃ１８７Ｐ／Ｈ１９５Ｙ／Ｅ２０８Ｓ／Ｎ２７８Ｓ／Ｈ２９４Ｙ／Ｖ３４３Ｔ／Ａ３４７ＥおよびＳ１７７Ａ／Ａ２０５Ｓ／Ｅ２０８Ｌ／Ｖ２２８Ｔから選択される１個または複数の残基差異（配列番号５６２と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７、１６２、２０９、２１９、２２７および３４２から選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７Ｑ、１６２Ｓ、２０９Ｈ、２１９Ｖ、２２７Ｒ、３４２Ｌおよび３４２Ｍから選択される１個または複数の残基差異（配列番号５９８と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＦ４７Ｑ、Ｖ１６２Ｓ、Ｃ２０９Ｈ、Ｔ２１９Ｖ、Ｓ２２７Ｒ、Ｎ３４２ＬおよびＮ３４２Ｍから選択される１個または複数の残基差異（配列番号５９８と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１７／４４／１７９／１９５／２５０／３１３／３４５、１７／４４／１９９／３１３、４３／４４／１９５／１９９、４４／１４９／１６４／１７１／１８７、４４／１７９／１９５／１９９、４４／１７９／１９５／１９９／３４５、７９／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２８６／２８８、８２／１６３／１６４、８２／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２０３／２０８／２８６／２８８／３２０、１４９／１６４／１７１／２８８および１８７／２８６から選択される残基位置における、配列番号５９８と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１７Ｖ／４４Ｒ／１９９Ｃ／３１３Ｃ、１７Ｖ／４４Ｖ／１７９Ｔ／１９５Ｙ／２５０Ｐ／３１３Ｃ／３４５Ｄ、４３Ｓ／４４Ｖ／１９５Ｙ／１９９Ｃ、４４Ｒ／１７９Ｔ／１９５Ｙ／１９９Ｃ、４４Ｒ／１７９Ｔ／１９５Ｙ／１９９Ｃ／３４５Ｄ、４４Ｖ／１４９Ｎ／１６４Ｑ／１７１Ｍ／１８７Ｐ、４４Ｖ／１７９Ｔ／１９５Ｙ／１９９Ｃ／３４５Ｄ、７９Ｅ／１６３Ｄ／１６４Ｑ／１７１Ｍ／１８７Ｎ／２０１Ｖ／２８６Ｐ／２８８Ｔ、８２Ａ／１６３Ｄ／１６４Ｑ、８２Ａ／１６３Ｄ／１６４Ｑ／１７１Ｍ／１８７Ｐ／２０１Ｖ／２０３Ｑ／２０８Ｉ／２８６Ｐ／２８８Ｔ／３２０Ｖ、１４９Ｎ／１６４Ｑ／１７１Ｍ／２８８Ｔおよび１８７Ｐ／２８６Ｐから選択される１個または複数の残基差異（配列番号５９８と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＳ１７Ｖ／Ｇ４４Ｒ／Ｔ１９９Ｃ／Ｌ３１３Ｃ、Ｓ１７Ｖ／Ｇ４４Ｖ／Ｌ１７９Ｔ／Ｈ１９５Ｙ／Ｖ２５０Ｐ／Ｌ３１３Ｃ／Ｔ３４５Ｄ、Ａ４３Ｓ／Ｇ４４Ｖ／Ｈ１９５Ｙ／Ｔ１９９Ｃ、Ｇ４４Ｒ／Ｌ１７９Ｔ／Ｈ１９５Ｙ／Ｔ１９９Ｃ、Ｇ４４Ｒ／Ｌ１７９Ｔ／Ｈ１９５Ｙ／Ｔ１９９Ｃ／Ｔ３４５Ｄ、Ｇ４４Ｖ／Ｓ１４９Ｎ／Ｓ１６４Ｑ／Ｔ１７１Ｍ／Ｃ１８７Ｐ、Ｇ４４Ｖ／Ｌ１７９Ｔ／Ｈ１９５Ｙ／Ｔ１９９Ｃ／Ｔ３４５Ｄ、Ｑ７９Ｅ／Ｑ１６３Ｄ／Ｓ１６４Ｑ／Ｔ１７１Ｍ／Ｃ１８７Ｎ／Ａ２０１Ｖ／Ａ２８６Ｐ／Ｖ２８８Ｔ、Ｋ８２Ａ／Ｑ１６３Ｄ／Ｓ１６４Ｑ、Ｋ８２Ａ／Ｑ１６３Ｄ／Ｓ１６４Ｑ／Ｔ１７１Ｍ／Ｃ１８７Ｐ／Ａ２０１Ｖ／Ｓ２０３Ｑ／Ｌ２０８Ｉ／Ａ２８６Ｐ／Ｖ２８８Ｔ／Ｋ３２０Ｖ、Ｓ１４９Ｎ／Ｓ１６４Ｑ／Ｔ１７１Ｍ／Ｖ２８８ＴおよびＣ１８７Ｐ／Ａ２８６Ｐから選択される１個または複数の残基差異（配列番号５９８と比べて）を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６３０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８２／１６４／１７１／２０３／２０８、１３５／１６３／１６４／２０１／２０３／２０８、１６２、１６２／２１９／２３６、１６２／２１９／３１３／３３８、１６２／２３６／３４２、１６２／３１３／３４２および１６４／１７１／２０１／２０３／２８２から選択される残基位置における、配列番号６３０と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６３０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８２Ａ／１６４Ｔ／１７１Ｍ／２０３Ｑ／２０８Ｉ、１３５Ｐ／１６３Ｄ／１６４Ｑ／２０１Ｖ／２０３Ｑ／２０８Ｉ、１６２Ｓ、１６２Ｓ／２１９Ｖ／２３６Ｌ、１６２Ｓ／２１９Ｖ／３１３Ｃ／３３８Ｉ、１６２Ｓ／２３６Ｌ／３４２Ｍ、１６２Ｓ／３１３Ｃ／３４２Ｍおよび１６４Ｑ／１７１Ｍ／２０１Ｖ／２０３Ｑ／２８２Ｖから選択される１個または複数の残基差異（配列番号６３０と比べて）を含む。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６３０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびにＫ８２Ａ／Ｓ１６４Ｔ／Ｔ１７１Ｍ／Ｓ２０３Ｑ／Ｌ２０８Ｉ、Ｓ１３５Ｐ／Ｑ１６３Ｄ／Ｓ１６４Ｑ／Ａ２０１Ｖ／Ｓ２０３Ｑ／Ｌ２０８Ｉ、Ｖ１６２Ｓ、Ｖ１６２Ｓ／Ｔ２１９Ｖ／Ｔ２３６Ｌ、Ｖ１６２Ｓ／Ｔ２１９Ｖ／Ｌ３１３Ｃ／Ｍ３３８Ｉ、Ｖ１６２Ｓ／Ｔ２３６Ｌ／Ｎ３４２Ｍ、Ｖ１６２Ｓ／Ｌ３１３Ｃ／Ｎ３４２ＭおよびＳ１６４Ｑ／Ｔ１７１Ｍ／Ａ２０１Ｖ／Ｓ２０３Ｑ／Ｌ２８２Ｖから選択される１個または複数の残基差異（配列番号６３０と比べて）を含む。

当業者によって認められる通り、一部の実施形態では、選択される上述の残基差異の１個または組合せは、コア特色として操作されたプロリンヒドロキシラーゼにおいて一定に保つ（すなわち、維持する）ことができ、他の残基位置における追加的な残基差異を配列に組み込んで、改善された特性を有する追加的な操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを生成することができる。したがって、上述の残基差異の１個またはサブセットを含有するいずれかの操作されたプロリンヒドロキシラーゼのために、本発明は、残基差異の１個またはサブセットと、その上、本明細書に開示されている他の残基位置における１個または複数の残基差異を含む他の操作されたプロリンヒドロキシラーゼを企図することを理解されたい。

上に記す通り、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドはまた、基質化合物Ｌ－プロリンを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる。一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の参照ポリペプチドの活性と比べて、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれよりも高い活性で、基質化合物Ｌ－プロリンを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる。一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の参照ポリペプチドの活性と比べて、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれよりも高い活性で、基質化合物Ｌ－プロリンを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、改善された位置選択性、改善された活性、改善された比活性および／または改善された熱安定性から選択される１種または複数の特色を有するアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比べて少なくとも１．２倍の活性で、基質化合物Ｌ－プロリンを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができ、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比べて少なくとも２倍の活性で、基質化合物Ｌ－プロリンを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができ、本明細書に提供される１個または複数の残基差異（適用可能であれば、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して）を有するアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比べて少なくとも２倍の活性で、基質化合物Ｌ－プロリンを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、１２０ｈもしくはそれ未満、７２ｈもしくはそれ未満、４８ｈもしくはそれ未満または２４ｈもしくはそれ未満において、約１００ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌまたは約２０ｇ／Ｌの基質負荷で、ＨＴＰアッセイ条件下、ＳＦＰアッセイ条件下またはＤＳＰアッセイ条件下、化合物Ｌ－プロリンの少なくとも５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８９％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多く、９１％もしくはそれよりも多く、９２％もしくはそれよりも多く、９３％もしくはそれよりも多く、９４％もしくはそれよりも多くまたは９５％もしくはそれよりも多くを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる。一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、２４ｈまたはそれ未満において、約２０ｇ／Ｌの基質負荷で、ＤＳＰアッセイ条件下、約２５℃にて、化合物Ｌ－プロリンの少なくとも５０％またはそれよりも高くを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、細菌宿主細胞、特に、Ｅ．ｃｏｌｉにおける操作されたプロリンヒドロキシラーゼ活性の発現を増加させる、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較した１個または複数の残基差異を含むアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態では、化合物Ｌ－プロリンから産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換において改善された特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態では、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、表４．１、４．２、４．３、４．４、５．１、５．２、５．３、６．１、７．１、７．２、７．３、８．１、８．２、９．１、９．２、１０．１、１０．２、１１．１、１１．２および／または１２．１に提供される通り、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、ならびに次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうちいずれか１種に存在する、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較したアミノ酸残基差異を含む。

上に指定されている残基位置に加えて、本明細書に開示されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのいずれかは、他の残基位置（すなわち、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列のいずれかに含まれる位置以外の残基位置）に、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比べた他の残基差異をさらに含むことができる。これらの他の残基位置における残基差異は、プロリンからシス－４－ヒドロキシプロリンへの変換と共に化合物Ｌ－プロリンから産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換を実行するポリペプチドの能力に有害な影響を与えることなく、アミノ酸配列における追加の変動を提供することができる。したがって、一部の実施形態では、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列から選択される操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのいずれか１種に存在するアミノ酸残基差異に加えて、配列は、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して、他のアミノ酸残基位置に１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、１～１２、１～１４、１～１５、１～１６、１～１８、１～２０、１～２２、１～２４、１～２６、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５または１～５０個の残基差異をさらに含むことができる。一部の実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基差異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個の残基位置であり得る。一部の実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基差異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の残基位置であり得る。これらの他の位置における残基差異は、保存的変化または非保存的変化であり得る。一部の実施形態では、残基差異は、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドと比較して、保存的置換および非保存的置換を含むことができる。

一部の実施形態では、本発明はまた、操作されたプロリンヒドロキシラーゼの機能的活性および／または改善された特性を保持する、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのいずれかの断片を含む操作されたポリペプチドを提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、適した反応条件下で化合物Ｌ－プロリンを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができるポリペプチド断片であって、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列から選択される例示的な操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド等の本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む断片を提供する。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチド等の本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチド配列のうちいずれか１種に欠失を含むアミノ酸配列を有することができる。よって、本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのありとあらゆる実施形態で、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼの関連する機能的活性および／または改善された特性が維持される場合、アミノ酸配列は、１個もしくは複数のアミノ酸、２個もしくはそれよりも多いアミノ酸、３個もしくはそれよりも多いアミノ酸、４個もしくはそれよりも多いアミノ酸、５個もしくはそれよりも多いアミノ酸、６個もしくはそれよりも多いアミノ酸、８個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多いアミノ酸または２０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノ酸の総数の最大で１０％、アミノ酸の総数の最大で２０％、またはアミノ酸の総数の最大で３０％の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、欠失は、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５または１～５０個のアミノ酸残基を含むことができる。一部の実施形態では、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。

一部の実施形態では、本明細書における操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチド等の本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのうちいずれか１種と比較して挿入を含むアミノ酸配列を有することができる。よって、本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのありとあらゆる実施形態で、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼの関連する機能的活性および／または改善された特性が維持される場合、挿入は、１個もしくは複数のアミノ酸、２個もしくはそれよりも多いアミノ酸、３個もしくはそれよりも多いアミノ酸、４個もしくはそれよりも多いアミノ酸、５個もしくはそれよりも多いアミノ酸、６個もしくはそれよりも多いアミノ酸、８個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多いアミノ酸、２０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、３０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、４０個もしくはそれよりも多いアミノ酸または５０個もしくはそれよりも多いアミノ酸を含むことができる。挿入は、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端または内側部分に対するものであり得る。

一部の実施形態では、本明細書における操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列から選択される配列を含むアミノ酸配列、および必要に応じて、１個またはいくつかの（例えば、最大で３、４、５または最大で１０個の）アミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有することができる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５または１～５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換であり得る。

上述の実施形態では、操作されたポリペプチドに適した反応条件は、実施例に記載されている通りに提供される。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが、限定ではなく例として、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属に結合するためのＨｉｓタグ）および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）等の他のポリペプチドに融合されている、融合ポリペプチドである。よって、本明細書に記載されている操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合ありまたはなしで使用することができる。

本明細書に記載されているポリペプチドが、遺伝的にコードされたアミノ酸に制限されないことを理解されたい。遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書に記載されているポリペプチドは、全体的にまたは部分的に、天然に存在するおよび／または合成のコードされていないアミノ酸で構成されていてよい。本明細書に記載されているポリペプチドを構成し得る、ある特定の一般的に遭遇されるコードされていないアミノ酸は、遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ－立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）；２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ－ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２－クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３－フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２－ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３－ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４－ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２－メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３－メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４－メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２－ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３－ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４－ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２－シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４－アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４－ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４－アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド（ｐｙｒｉｄ）－２－イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド－３－イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド－４－イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト（ｎａｐｈｔｈ）－１－イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト－２－イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリル（ｓｔｙｒｙｌｋ）アラニン（ｓＡｌａ）；アントリル（ａｕｔｈｒｙｌ）アラニン（ａＡｌａ）；３，３－ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３－アミノ－５－フェニル（ｐｈｅｎｙ）ペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）－ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリシン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホスレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｇｌｕｔａｎｉｃａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン－３－カルボン酸（ＡＣＡ）；１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸；アリルグリシン（ａＧｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載されているポリペプチドを構成し得る追加的なコードされていないアミノ酸は、当業者には明らかであろう（例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるＦａｓｍａｎ，ＣＲＣＰｒａｃｔｉｃａｌＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．３－７０［１９８９］およびその中で引用されている参考文献に提示されている様々なアミノ酸を参照）。これらのアミノ酸は、Ｌ－またはＤ－立体配置のいずれかであり得る。

当業者であれば、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基が、本明細書に記載されているポリペプチドを構成することもできることを認識するであろう。この場合は芳香族カテゴリーに属する、斯かる保護されたアミノ酸の非限定的な例は、Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ－ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル（ｘａｎｔｈｙｌ））、Ａｓｎ（Ｎ－δ－キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ－ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ－ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ－ベンジル）を含む（保護基は括弧内に収載）がこれらに限定されない。

本明細書に記載されているポリペプチドを構成することができるコンフォメーション的に制約された非コードアミノ酸は、Ｎ－メチルアミノ酸（Ｌ－立体配置）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４－カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン－３－カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、例えば、単離された調製物、実質的に精製された酵素、酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された細胞全体、ならびに／または斯かる細胞の細胞抽出物および／もしくはライセート等、様々な形態であり得る。酵素は、下でさらに記述する通り、凍結乾燥されていてよい、噴霧乾燥されていてよい、沈殿されていてよい、または粗ペーストの形態であってよい。

一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、膜、樹脂、固体担体または他の固相材料等、固体支持体に提供することができる。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド等の有機ポリマー、ならびにこれらのコポリマーおよびグラフトで構成され得る。固体支持体は、ガラス、シリカ、細孔制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）、逆相シリカ等の無機、または金もしくは白金等の金属であってもよい。固体支持体の構成は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面状、実質的に平面状または非平面状であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤または非膨潤特徴を有することができる。固体支持体は、ウェル、窪み、または他のコンテナ、容器、特色もしくは場所の形態で構成され得る。

一部の実施形態では、本発明のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の参照ポリペプチドと比べてその改善された活性、選択性および／または他の改善された特性を保持するように、固体支持体に固定化することができる。斯かる実施形態では、固定化されたポリペプチドは、基質化合物または他の適した基質から産物への生体触媒変換を容易にすることができ、反応が完了した後に、容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定化されたビーズを保持することにより）、次いでその後の反応において再利用またはリサイクルされる。斯かる固定化された酵素のプロセスは、さらなる効率と、コスト削減を可能にする。したがって、本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用する方法のいずれも、固体支持体に結合または固定化された同じプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用して実行することができることがさらに企図される。

酵素固定化方法は、当技術分野で周知である。操作されたポリペプチドは、非共有結合または共有結合により結合され得る。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラス等）への酵素のコンジュゲーションおよび固定化のための様々な方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｙｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４２（５）：８９５－８９８［２００７］；Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７６（４）：８４３－８５１［２００７］；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６３：３９－４４［２０１０］；Ｔｒｕｐｐｏｅｔａｌ．，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎｌｉｎｅ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２^ｎｄｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ［２００８］；Ｍａｔｅｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１８（３）：６２９－３４［２００２］；および”ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，” ＩｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｎｉｅｍｅｙｅｒ（ｅｄ．），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ［２００４］を参照；これらそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼの固定化に有用な固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂を含むがこれらに限定されない。本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの固定化に有用な例示的な固体支持体は、キトサンビーズ、ＥｕｐｅｒｇｉｔＣ、ならびに次の異なる型のＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含むＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチドは、キットの形態で提供される。キットにおける酵素は、個々にまたは複数の酵素として存在することができる。キットは、酵素反応を実行するための試薬、酵素の活性を評価するための基質、および産物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットは、試薬ディスペンサー、およびキットの使用のための指示を含むこともできる。

一部の実施形態では、本発明のキットは、異なるアドレス可能な位置に複数の異なるプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドは、少なくとも１種の異なる改善された酵素特性をそれぞれ有する参照配列の異なるバリアントである。一部の実施形態では、固体支持体に固定化された複数のポリペプチドは、ロボットによる試薬送達のためにまたは検出方法および／もしくは機器によってアドレス可能な、様々な場所におけるアレイで構成される。アレイを使用して、ポリペプチドによる変換について種々の基質化合物を検査することができる。複数の操作されたポリペプチドを含む斯かるアレイおよびその使用方法は、当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ２００９／００８９０８Ａ２を参照）。

操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を制御する１個または複数の異種調節配列に作動可能に連結して、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを創出することができる。操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させる。

当業者には明らかな通り、タンパク質配列の利用可能性、および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドの記載を提供する。代替または同義コドンによって同じアミノ酸がコードされるという遺伝暗号の縮重は、全て改善されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードする極めて多数の核酸の作製を可能にする。よって、特定のアミノ酸配列の知識を有するため、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない仕方で１種または複数のコドンの配列を単純に修飾することにより、いくつもの異なる核酸を作製することができる。この点について、本発明は特に、可能なコドン選択に基づき組合せを選択することにより、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする、作製することができるポリヌクレオチドのありとあらゆる可能なバリエーションを具体的に企図し、あらゆる斯かるバリエーションは、表４．１、４．２、４．３、４．４、５．１、５．２、５．３、６．１、７．１、７．２、７．３、８．１、８．２、９．１、９．２、１０．１、１０．２、１１．１、１１．２および／または１２．１に提示されており、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列として参照により本明細書に組み込まれる配列表に開示されているアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチドのために具体的に開示されていると考慮されるべきである。

様々な実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生される宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において遺伝子を発現させるために、細菌において使用される好まれるコドンが使用され；酵母において使用される好まれるコドンが、酵母における発現に使用され；哺乳動物において使用される好まれるコドンが、哺乳動物細胞における発現に使用される。一部の実施形態では、天然の配列は、好まれるコドンを含むであろうことから、また、全てのアミノ酸残基に対して好まれるコドンの使用が要求されない場合があるため、プロリンヒドロキシラーゼのコドン使用を最適化するために、全てのコドンが置き換えられる必要はない。結果的に、プロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％超において、好まれるコドンを含有することができる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０によって表される天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドアミノ酸配列をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列をコードするコドン最適化された核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を含む核酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、次の範囲：配列番号５～６５７における奇数番号の配列におけるコドン最適化された核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を含む核酸配列を有する。次の範囲：配列番号５～６５７における奇数番号の配列のコドン最適化された配列は、コードされた野生型プロリンヒドロキシラーゼの発現を増強し、ミニＤＳＰアッセイ（ｍｉｎｉ－ＤＳＰＡｓｓａｙ）条件下で化合物Ｌ－プロリンの８０％超を産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンにｉｎｖｉｔｒｏで変換し、ＤＳＰアッセイ条件下で化合物Ｌ－プロリンの４５％超を産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる酵素の調製物を提供する。一部の実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、真菌種番号１１２４３由来のＡＮＯの天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも１．２倍、１．５倍もしくは２倍またはそれよりも多く、プロリンヒドロキシラーゼの発現を増強することができる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号３～６５７における奇数番号の配列から選択される参照配列またはその相補体にハイブリダイズすることができ、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、上に記載されている通り、ポリヌクレオチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較して１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列から選択される配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較した１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列から選択される。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号４である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号１１６である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号１６２である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号３２２である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号４１２である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号４９２である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５６２である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５９８である。一部の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号６３０である。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の参照ポリペプチドと比較して改善された酵素特性を有する、基質化合物Ｌ－プロリンを産物化合物トランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうちいずれか１種から選択される参照ポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、アミノ酸配列が、表４．１、４．２、４．３、４．４、５．１、５．２、５．３、６．１、７．１、７．２、７．３、８．１、８．２、９．１、９．２、１０．１、１０．２、１１．１、１１．２および／または１２．１に収載される通り、次の範囲：配列番号６～６５８における偶数番号の配列由来のポリペプチド配列のうちいずれか１種に含有される配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較した残基差異のセットのうちいずれか１種を含むことを条件とする。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、次の範囲：配列番号５～６５７における奇数番号の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、次の範囲：配列番号５～６５７における奇数番号の配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズすることができ、本明細書に記載されている改善された特性のうち１種または複数を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１、２８、５８／２４７、６５、８０、８５、９５、９８、１１７、１２０、１５９、１８５、１９４、１９９、２００、２３３、２３７、２４３、２５０、２６８、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３０、３３８、３４３、３４６および３４８から選択される残基位置における、または２１、２８、４５、６５、９５、１１２、１１７、１３９、１７７、１８５、１９９、２３３、２４３、２５０、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３５、３３８、３４３および３４６から選択される残基位置における、または４８／６６／１８９／１９４、４８／６６／１９４および６６／８２／８５／１３５／１８９／１９４／２６７から選択される残基位置における、または２０／５６／７６／１６８／１６９／２９６、２０／５６／２３２／２９４、２０／１１９／２９４／２９６、５６／７６／１１９／１２４／１４７／２３２、５６／７６／２９４、７６／１６８／２３２／２９４、７６／２９４／２９６、７６／２９６、１４７および２３２から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１２３、１８９、１９５、２３３および２９６から選択される残基位置における、または２０／２１／５６、２０／２１／５６／７６／９５／２３２／２９４／３０７／３３５、２０／２１／５６／７６／１４７／２２５／２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７／３３５、２０／２１／５６／９５／１４７／２８１／２９４／３０７、２０／２１／５６／２８１／３０７、２０／２１／７６／２３２／２４３、２０／２１／９５／２３２／３０７、２０／２１／９５／２８１／２９４／２９６、２０／２１／１４７／１８９／２３３／２４３／２８１／３０７、２０／５６、２０／５６／７６／９５／２８１／３０７、２０／５６／７６／１４７／２９４／２９６／３０７、２０／５６／９５／１４７／２９４、２０／５６／２８１、２０／７６、２０／７６／９５／２８１／２９４／２９６、２０／７６／９５／２８１／２９６／３０７、２０／７６／２３３／２９４／３０７、２０／７６／２４３／２８１／２９４、２１／７６／１４７／２３３／２９４／３０７、２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、２１／９５／１８５／１８９／２３２／２８１／２９６、２１／９５／２３３／２４３／２８１／２９６、２１／９５／２９４／２９６／３０７／３３５、２１／９５／３０７、２１／２８１／３０７、２９／７６／２８１、５６／７６／９５／２３２／２４３／２８１、５６／７６／１４７／２８１／３０７、５６／７６／２４３／２９４、５６／７６／２８１／２９４、５６／７６／２９６、５６／７６／３０７、５６／９５／１４７／３０７／３３５／３４８、５６／９５／２３２／２３３／２８１／２９４／３０７、５６／９５／２４３／２８１、５６／１４７／２８１、５６／２３２／２４３／２８１、５６／２３２／２８１、５６／２３２／２８１／２９４／２９６、５６／２３３／２８１／２９４／２９６、５６／２８１／３０７、７６／９５／２３２／２４３／２８１／３０７、７６／９５／２４３／２８１／３０７／３３５、７６／９５／２９４／３０７、７６／１４７、７６／１４７／２３３／２４３／２９４、７６／１４７／２３３／２８１／２９４／３０７、７６／１４７／２４３／２９４／２９６／３０７／３３５、７６／１４７／２８１／３０７、７６／１８９／２９６、７６／２３２／２３３／２４３／２９４／２９６／３０７、７６／２８１、７６／２８１／２９４、７６／２９４／２９６、９５／１２０、９５／１４７／３３５、９５／２３２／２４３／２８１／２９４／３０７、９５／２３２／２８１／２９４／２９６、９５／２８１／２９４／２９６、９５／３３５、１４７、１４７／２２５／２３２／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、１４７／２３３／２４３／２８１／３０７、１４７／２３３／２８１／３０７／３３５、１４７／２４３／２８１、１４７／３０７、２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７、２３２／２８１、２３２／２８４／３０７、２３３／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、２３３／２８１／２９６／３０７、２４３／２８１／２９４／２９６、２８１、２８１／２９４、２８１／３０７、３０７および３３５から選択される残基位置における、または２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、５６／７６／１４７／２８１／３０７および９５／１４７／３３５から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号１６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２／８５／１２３／２３７、２８／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７０／３４３／３４６／３４８、４５／１２３／３２６、６５／１１７／１２０／１２３／３４３／３４６、８５／１２３／２８１／２８２、１１４／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７１／３１３／３２６／３４３／３４６、１２３／１３９／２３３／２３７／２８１／２８２／２８９／３２４／３２６および１２３／１９９／２００／２４７／２５０／３３８から選択される残基位置における、配列番号１６２と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２６、５４、６１、１２９、１３２、１４９、１５６、１７５、１８９、２０１、２０９、２２８、２３６、２４８、２６２、２７２、２７７、２９１および３４５から選択される残基位置における、または２５、４３、５４、５８、６１、７９、１２９、１３２、１４３、１５６、１６３、１７５、１７９、２０１、２０９、２３６、２４８、２７８、２９１、３４５および３４７から選択される残基位置における、または８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６、８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２８１／２８２／２８９、８５／１１７／１２０／２７０／２８１／２８９、８５／１１７／１３５／１３９／２０８および１１７／１２０／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７、４８、５６／１１８、８５、９５、９５／２８９、１１３、１１８、１１８／２４７、１５４、１６２、１６２／２０４、１６４、１６４／１９８／２７１、１６８、１６９、１８７、１９５、２４３、２７１、２７５、２８１、３１４、３３０および３４２から選択される残基位置における、または２５／１２９／１６３／２３６／２６２／３４５／３４７、１２０／１５６／１７５／１７９／２０１、１２９／１８９／２３６／２６２／２７７／２７８、１２９／２３６／２６２、１５６／１７５／１７９／２２８および１６２から選択される残基位置における、配列番号４１２と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５、１７、２８、２９、６５、１３５、１６７、１７７、１９９、２０８、２２８、２３５、２８７、２９４、３０７および３４３から選択される残基位置における、または８５／１８７／２８１／３４７、８５／１８７／３４７、１１８／１２０／１６２／１７５／１７９／３３０、１１８／１２０／１６２／１７５／３３０、１６２／１７５／１７９／３３０、１７５／２２８／３３０、１９５／３４７および２７８／３１４／３４７から選択される残基位置における、配列番号４９２と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５、４０、４３、４４、５９、７９、８２、１４９、１６４、１７９、３４５および３４７から選択される残基位置における、または２９／８５／１７７／２０８／２２８／３４７、２９／８５／２０８／２２８／３４３／３４７、２９／１７７／１９５／２２８／３４３、２９／２０８／２２８／２７８／２９４／３４７、５６／１９５／２７８、８５／１８７／２０５／２０８／２７８、１１３／１７７／１８７／１９５／２０８／２７８／２９４／３４３／３４７および１７７／２０５／２０８／２２８から選択される残基位置における、配列番号５６２と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７、１６２、２０９、２１９、２２７および３４２から選択される残基位置における、または１７／４４／１７９／１９５／２５０／３１３／３４５、１７／４４／１９９／３１３、４３／４４／１９５／１９９、４４／１４９／１６４／１７１／１８７、４４／１７９／１９５／１９９、４４／１７９／１９５／１９９／３４５、７９／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２８６／２８８、８２／１６３／１６４、８２／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２０３／２０８／２８６／２８８／３２０、１４９／１６４／１７１／２８８および１８７／２８６から選択される残基位置における、配列番号５９８と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号６３０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８２／１６４／１７１／２０３／２０８、１３５／１６３／１６４／２０１／２０３／２０８、１６２、１６２／２１９／２３６、１６２／２１９／３１３／３３８、１６２／２３６／３４２、１６２／３１３／３４２および１６４／１７１／２０１／２０３／２８２から選択される残基位置における、配列番号６３０と比較した１個または複数の残基差異を含む、１種または複数の改善された特性を有するプロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているポリペプチドをコードするが、ヌクレオチドレベルで、操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、範囲、配列番号３～６５７における奇数番号の配列から選択される。

一部の実施形態では、本明細書に提供される操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすように種々の仕方で操作される。一部の実施形態では、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために１種または複数の制御配列が存在する、発現ベクターとして提供される。単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に操作することが、発現ベクターに応じて望ましくなるまたは必要となる場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技法は、当技術分野で周知である。

一部の実施形態では、制御配列は、配列の中でもとりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターを含む。当技術分野で公知の通り、適したプロモーターは、使用される宿主細胞に基づき選択することができる。細菌宿主細胞のため、本願の核酸構築物の転写を方向付けるのに適したプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：３７２７－３７３１［１９７８］を参照）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２１－２５［１９８３］を参照）を含むがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターは、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ－アミラーゼ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ（ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ）およびＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参照）ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにこれらの変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ８：４２３－４８８［１９９２］を参照）。

一部の実施形態では、制御配列は、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列である、適した転写ターミネーター配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択宿主細胞において機能的であるいかなるターミネーターも、本発明における用途を見出す。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．、上記を参照）。

一部の実施形態では、制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である、適したリーダー配列である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択宿主細胞において機能的であるいかなるリーダー配列も使用されてもよい。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適したリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるリーダーを含むがこれらに限定されない。

制御配列は、核酸配列の３’末端に作動可能に連結した配列であり、転写されるときに、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される、ポリアデニル化配列であってもよい。選択宿主細胞において機能的であるいかなるポリアデニル化配列も、本発明において使用されてもよい。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子由来のポリアデニル化配列を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列もまた、当技術分野で公知である（例えば、ＧｕｏａｎｄＳｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，１５：５９８３－５９９０［１９９５］を参照）。

一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付ける、シグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、翻訳読み枠において天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含有することができる。その代わりに、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有することができる。発現されたポリペプチドを選択宿主細胞の分泌経路に方向付けるいかなるシグナルペプチドコード領域も、本明細書に提供される操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの発現のための用途を見出す。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、ＢａｃｉｌｌｕｓＮＣｌＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域を含むがこれらに限定されない。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野で公知である（例えば、ＳｉｍｏｎｅｎａｎｄＰａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９－１３７［１９９３］を参照）。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、ＨｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来のシグナルペプチドを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。結果として得られるポリペプチドは、場合により「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒的切断によって、成熟した活性ポリペプチドへと変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含むがこれらに限定されない（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照）。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。

一部の実施形態では、調節配列も利用される。このような配列は、宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにする調節系である。原核宿主細胞において、適した調節配列は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞において、適した調節系は、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を含むがこれらに限定されない。糸状菌において、適した調節配列は、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターを含むがこれらに限定されない。

別の態様では、本発明はまた、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれが導入される宿主の型に応じて、プロモーターおよびターミネーター等の１種または複数の発現調節領域、複製起点等を含む組換え発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、上に記載されている様々な核酸および制御配列を、互いに組み合わせて、当該部位におけるバリアントプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする、１個または複数の便利な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生する。その代わりに、本発明のポリヌクレオチド配列（複数可）は、ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することにより発現される。発現ベクターの創出において、コード配列が、発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列は、ベクターに配置される。

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に便利に供することができ、バリアントプロリンヒドロキシラーゼポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、いずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入されるべき宿主細胞とベクターの適合性に依存するであろう。ベクターは、直鎖状または閉環状プラスミドであり得る。

一部の実施形態では、発現ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体等、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外の実体として存在するベクター）である。ベクターは、自己複製を保証するためのいずれかの手段を含有することができる。一部の代替実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と共に複製される、ベクターであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入されるべき総ＤＮＡを一緒に含有する２種もしくはそれよりも多いベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。

一部の実施形態では、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする、１種または複数の選択可能マーカーを含有する。「選択可能マーカー」は、その産物が、殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性、その他を提供する、遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例は、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン抵抗性等の抗生物質抵抗性を付与するマーカーを含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための適したマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３を含むがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞における使用のための選択可能マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物を含むがこれらに限定されない。別の態様では、本発明は、本願の少なくとも１種の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞における操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素（複数可）の発現のための１種または複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞等の細菌細胞；酵母細胞（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ［ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８］）等の真菌細胞；ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞等の動物細胞；ならびに植物細胞を含むがこれらに限定されない。例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）である。

したがって、別の態様では、本発明は、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを産生するための方法であって、ポリペプチドの発現に適した条件下で、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されている通りにプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。

上述の宿主細胞のための適切な培養培地および育成条件は、当技術分野で周知である。プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法によって細胞に導入することができる。技法は、とりわけ、電気穿孔、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合を含む。

本明細書に開示されている特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、天然に存在するまたは操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知であり本明細書に記載されている変異誘発および／または定向進化方法に供することにより得ることができる。例示的な定向進化技法は、変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリング（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７－１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号を参照）である。使用することができる他の定向進化手順は、とりわけ、ずらした伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、ｉｎｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：２５８－２６１［１９９８］を参照）、変異原性ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌｅｔａｌ．，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．，３：Ｓ１３６－Ｓ１４０［１９９４］を参照）およびカセット変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：３５２５－３５２９［１９９６］を参照）を含む。

一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼは、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを、上に記述されている通りに、変異誘発および／または定向進化方法に供することによって得られる。変異誘発は、ランダムなおよび部位特異的な変異誘発を含む、当技術分野で公知の技法のいずれかに従って行うことができる。定向進化は、シャッフリングを含む、改善されたプロモーターバリアントについてスクリーニングするための当技術分野で公知の技法のいずれかにより行うことができる。変異誘発および定向進化方法は、当技術分野で周知である（例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、ならびにあらゆる関連非ＵＳ対応物；Ｌｉｎｇｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４（２）：１５７－７８［１９９７］；Ｄａｌｅｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７：３６９－７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：４２３－４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３－１２０１［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３７：１－７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，３８：８７９－８８７［１９８４］；Ｗｅｌｌｓｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５－３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３：２８４－２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２５９－２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８－２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：４３６－４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４５０４－４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５－３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９－３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７－１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照）。

一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られる酵素クローンは、酵素を規定された温度（または広範囲の基質にわたる酵素の活性の検査等、他のアッセイ条件）に付し、熱処理または他のアッセイ条件後に残っている酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次に、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを配列決定して、ヌクレオチド配列変化（あるとすれば）を同定し、宿主細胞における酵素の発現に使用する。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当技術分野で公知のいずれか適した方法（例えば、ＨＰＬＣ解析等、標準生化学技法）を使用して行うことができる。

一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られるクローンは、１種または複数の所望の改善された酵素特性（例えば、改善された位置選択性）を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼについてスクリーニングすることができる。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、例えば、塩化ダンシルまたはＯＰＡを使用した、産物のＨＰＬＣ解析および／または誘導体化（分離前または後）等、標準生化学技法を使用して行うことができる（例えば、Ｙａｅｇａｋｉｅｔａｌ．，ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３５６（１）：１６３－７０［１９８６］を参照）。

操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知合成方法に従って標準固相方法によって調製することができる。一部の実施形態では、最大で約１００塩基の断片を個々に合成し、次いで連結して（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）方法、またはポリメラーゼ媒介性方法によって）、いずれか所望の連続した配列を形成することができる。例えば、プロリンヒドロキシラーゼの部分をコードするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、自動化された合成方法において典型的に実施される通り、当技術分野で公知の化学合成（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅｅｔａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９－６９［１９８１］の古典的ホスホルアミダイト方法、またはＭａｔｔｈｅｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．３：８０１－０５［１９８４］によって記載された方法）によって調製することができる。ホスホルアミダイト方法に従い、オリゴヌクレオチドが合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成機において）、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローニングされる。加えて、本質的にいかなる核酸も、種々の商業的供給源のいずれから得ることもできる。一部の実施形態では、欠失、挿入および／または置換を含有するオリゴヌクレオチドを合成し、様々な並べ替えでオリゴヌクレオチドを組み合わせて、１種または複数の改善された特性を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼを創出することによって、追加的なバリエーションを創出することができる。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２１、２８、５８／２４７、６５、８０、８５、９５、９８、１１７、１２０、１５９、１８５、１９４、１９９、２００、２３３、２３７、２４３、２５０、２６８、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３０、３３８、３４３、３４６および３４８から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２１、２８、４５、６５、９５、１１２、１１７、１３９、１７７、１８５、１９９、２３３、２４３、２５０、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３５、３３８、３４３および３４６から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、４８／６６／１８９／１９４、４８／６６／１９４および６６／８２／８５／１３５／１８９／１９４／２６７から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２０／５６／７６／１６８／１６９／２９６、２０／５６／２３２／２９４、２０／１１９／２９４／２９６、５６／７６／１１９／１２４／１４７／２３２、５６／７６／２９４、７６／１６８／２３２／２９４、７６／２９４／２９６、７６／２９６、１４７および２３２から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１２３、１８９、１９５、２３３および２９６から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、２０／２１／５６、２０／２１／５６／７６／９５／２３２／２９４／３０７／３３５、２０／２１／５６／７６／１４７／２２５／２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７／３３５、２０／２１／５６／９５／１４７／２８１／２９４／３０７、２０／２１／５６／２８１／３０７、２０／２１／７６／２３２／２４３、２０／２１／９５／２３２／３０７、２０／２１／９５／２８１／２９４／２９６、２０／２１／１４７／１８９／２３３／２４３／２８１／３０７、２０／５６、２０／５６／７６／９５／２８１／３０７、２０／５６／７６／１４７／２９４／２９６／３０７、２０／５６／９５／１４７／２９４、２０／５６／２８１、２０／７６、２０／７６／９５／２８１／２９４／２９６、２０／７６／９５／２８１／２９６／３０７、２０／７６／２３３／２９４／３０７、２０／７６／２４３／２８１／２９４、２１／７６／１４７／２３３／２９４／３０７、２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、２１／９５／１８５／１８９／２３２／２８１／２９６、２１／９５／２３３／２４３／２８１／２９６、２１／９５／２９４／２９６／３０７／３３５、２１／９５／３０７、２１／２８１／３０７、２９／７６／２８１、５６／７６／９５／２３２／２４３／２８１、５６／７６／１４７／２８１／３０７、５６／７６／２４３／２９４、５６／７６／２８１／２９４、５６／７６／２９６、５６／７６／３０７、５６／９５／１４７／３０７／３３５／３４８、５６／９５／２３２／２３３／２８１／２９４／３０７、５６／９５／２４３／２８１、５６／１４７／２８１、５６／２３２／２４３／２８１、５６／２３２／２８１、５６／２３２／２８１／２９４／２９６、５６／２３３／２８１／２９４／２９６、５６／２８１／３０７、７６／９５／２３２／２４３／２８１／３０７、７６／９５／２４３／２８１／３０７／３３５、７６／９５／２９４／３０７、７６／１４７、７６／１４７／２３３／２４３／２９４、７６／１４７／２３３／２８１／２９４／３０７、７６／１４７／２４３／２９４／２９６／３０７／３３５、７６／１４７／２８１／３０７、７６／１８９／２９６、７６／２３２／２３３／２４３／２９４／２９６／３０７、７６／２８１、７６／２８１／２９４、７６／２９４／２９６、９５／１２０、９５／１４７／３３５、９５／２３２／２４３／２８１／２９４／３０７、９５／２３２／２８１／２９４／２９６、９５／２８１／２９４／２９６、９５／３３５、１４７、１４７／２２５／２３２／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、１４７／２３３／２４３／２８１／３０７、１４７／２３３／２８１／３０７／３３５、１４７／２４３／２８１、１４７／３０７、２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７、２３２／２８１、２３２／２８４／３０７、２３３／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、２３３／２８１／２９６／３０７、２４３／２８１／２９４／２９６、２８１、２８１／２９４、２８１／３０７、３０７および３３５から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、５６／７６／１４７／２８１／３０７および９５／１４７／３３５から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、２／８５／１２３／２３７、２８／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７０／３４３／３４６／３４８、４５／１２３／３２６、６５／１１７／１２０／１２３／３４３／３４６、８５／１２３／２８１／２８２、１１４／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７１／３１３／３２６／３４３／３４６、１２３／１３９／２３３／２３７／２８１／２８２／２８９／３２４／３２６および１２３／１９９／２００／２４７／２５０／３３８から選択される残基位置における、配列番号１６２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、２６、５４、６１、１２９、１３２、１４９、１５６、１７５、１８９、２０１、２０９、２２８、２３６、２４８、２６２、２７２、２７７、２９１および３４５から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、２５、４３、５４、５８、６１、７９、１２９、１３２、１４３、１５６、１６３、１７５、１７９、２０１、２０９、２３６、２４８、２７８、２９１、３４５および３４７から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６、８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２８１／２８２／２８９、８５／１１７／１２０／２７０／２８１／２８９、８５／１１７／１３５／１３９／２０８および１１７／１２０／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、４７、４８、５６／１１８、８５、９５、９５／２８９、１１３、１１８、１１８／２４７、１５４、１６２、１６２／２０４、１６４、１６４／１９８／２７１、１６８、１６９、１８７、１９５、２４３、２７１、２７５、２８１、３１４、３３０および３４２から選択される残基位置における、配列番号４１２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、２５／１２９／１６３／２３６／２６２／３４５／３４７、１２０／１５６／１７５／１７９／２０１、１２９／１８９／２３６／２６２／２７７／２７８、１２９／２３６／２６２、１５６／１７５／１７９／２２８および１６２から選択される残基位置における、配列番号４１２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、１５、１７、２８、２９、６５、１３５、１６７、１７７、１９９、２０８、２２８、２３５、２８７、２９４、３０７および３４３から選択される残基位置における、配列番号４９２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、８５／１８７／２８１／３４７、８５／１８７／３４７、１１８／１２０／１６２／１７５／１７９／３３０、１１８／１２０／１６２／１７５／３３０、１６２／１７５／１７９／３３０、１７５／２２８／３３０、１９５／３４７および２７８／３１４／３４７から選択される残基位置における、配列番号４９２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、１５、４０、４３、４４、５９、７９、８２、１４９、１６４、１７９、３４５および３４７から選択される残基位置における、配列番号５６２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、２９／８５／１７７／２０８／２２８／３４７、２９／８５／２０８／２２８／３４３／３４７、２９／１７７／１９５／２２８／３４３、２９／２０８／２２８／２７８／２９４／３４７、５６／１９５／２７８、８５／１８７／２０５／２０８／２７８、１１３／１７７／１８７／１９５／２０８／２７８／２９４／３４３／３４７および１７７／２０５／２０８／２２８から選択される残基位置における、配列番号５６２と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、４７、１６２、２０９、２１９、２２７および３４２から選択される残基位置における、配列番号５９８と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、１７／４４／１７９／１９５／２５０／３１３／３４５、１７／４４／１９９／３１３、４３／４４／１９５／１９９、４４／１４９／１６４／１７１／１８７、４４／１７９／１９５／１９９、４４／１７９／１９５／１９９／３４５、７９／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２８６／２８８、８２／１６３／１６４、８２／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２０３／２０８／２８６／２８８／３２０、１４９／１６４／１７１／２８８および１８７／２８６から選択される残基位置における、配列番号５９８と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

したがって、一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４～６５８の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、８２／１６４／１７１／２０３／２０８、１３５／１６３／１６４／２０１／２０３／２０８、１６２、１６２／２１９／２３６、１６２／２１９／３１３／３３８、１６２／２３６／３４２、１６２／３１３／３４２および１６４／１７１／２０１／２０３／２８２から選択される残基位置における、配列番号６３０と比較した１個または複数の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるステップとを含む。

方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、必要に応じて１個またはいくつかの（例えば、最大で３、４、５または最大で１０個の）アミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する操作されたプロリンヒドロキシラーゼをコードする。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５または１～５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換であり得る。

一部の実施形態では、宿主細胞において発現された操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素のいずれかは、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知技法のうちいずれか１種または複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌の溶解およびＥ．ｃｏｌｉ等の細菌からのタンパク質の高効率抽出のための適した溶液は、市販されている（例えば、ＣｅｌＬｙｔｉｃＢ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭＯ）。

プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法は、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および親和性クロマトグラフィーを含む。特定の酵素を精製するための条件は、部分的に、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等の因子に依存し、当業者には明らかとなるであろう。

一部の実施形態では、親和性技法を使用して、改善されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素を単離することができる。親和性クロマトグラフィー精製のため、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合するいずれかの抗体を使用することができる。抗体の産生のため、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはその断片による注射によって、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない、様々な宿主動物を免疫化することができる。プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に取り付けられたリンカーを用いて、ＢＳＡ等の適した担体に取り付けることができる。一部の実施形態では、親和性精製は、ポリ（Ｌ－プロリン）または色素親和性カラム等、プロリンヒドロキシラーゼによって結合された特異的リガンドを使用することができる（例えば、ＥＰ０６４１８６２；Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ， ”ＤｙｅＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，” ＩｎＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｔ９．２－９．２．１６［２００１］を参照）。

操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素を使用する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載されているプロリンヒドロキシラーゼは、適した基質をそのヒドロキシル化産物に変換するためのプロセスにおいて用途を見出す。一般に、ヒドロキシル化反応を行うためのプロセスは、上のスキーム１に示す通り、ヒドロキシル化産物の形成に適した反応条件下で、α－ケトグルタレート等の補助基質の存在下で基質化合物を本発明のプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドと接触させるまたはインキュベートするステップを含む。

本明細書に提供され、実施例において説明される実施形態では、プロセスにおいて使用することができる様々な範囲の適した反応条件は、基質負荷、補助基質負荷、還元剤、二価遷移金属、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、ポリペプチド負荷および反応時間を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用した基質化合物から産物化合物への生体触媒変換のためのプロセスを実行するためのさらに適した反応条件は、濃度、ｐＨ、温度および溶媒条件の実験的反応条件下で操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドおよび基質化合物を接触させるステップと、産物化合物を検出するステップを含むがこれらに限定されない、慣例的な実験法によって、本明細書に提供されるガイダンスを考慮して容易に最適化することができる。

操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用した適した反応条件は典型的に、ヒドロキシル化反応において化学量論的に使用される補助基質を含む。一般に、プロリンヒドロキシラーゼのための補助基質は、α－ケトグルタル酸および２－オキソグルタル酸とも称されるα－ケトグルタレートである。プロリンヒドロキシラーゼのための補助基質として働くことができるα－ケトグルタレートの他のアナログを使用することができる。補助基質として働くことができる例示的なアナログは、α－オキソアジペートである。補助基質は、化学量論的に使用されるため、補助基質は、基質化合物と等モル濃度またはそれよりも多い量で存在する（すなわち、補助基質のモル濃度は、基質化合物のモル濃度に等しいまたはそれよりも高い）。一部の実施形態では、適した反応条件は、基質化合物のモル濃度の少なくとも１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍もしくは５倍またはそれよりも多い補助基質モル濃度を含むことができる。一部の実施形態では、適した反応条件は、約０．００１Ｍ～約２Ｍ、０．０１Ｍ～約２Ｍ、０．１Ｍ～約２Ｍ、０．２Ｍ～約２Ｍ、約０．５Ｍ～約２Ｍまたは約１Ｍ～約２Ｍの補助基質濃度、特に、アルファ－ケトグルタレートを含むことができる。一部の実施形態では、反応条件は、約０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５または２Ｍの補助基質濃度を含む。一部の実施形態では、反応中に追加的な補助基質を添加することができる。

反応混合物中の基質化合物は、例えば、産物化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の効果、反応条件下での酵素の安定性、および基質から産物へのパーセント変換を考慮に入れつつ変動させることができる。一部の実施形態では、適した反応条件は、少なくとも約０．５～約２００ｇ／Ｌ、１～約２００ｇ／Ｌ、５～約１５０ｇ／Ｌ、約１０～約１００ｇ／Ｌ、２０～約１００ｇ／Ｌまたは約５０～約１００ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。一部の実施形態では、適した反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌもしくは少なくとも約２００ｇ／Ｌまたはそれよりもさらに多い基質化合物負荷を含む。本明細書に提供される基質負荷の値は、Ｌ－プロリンの分子量に基づくが、Ｌ－プロリンの等モル濃度量の様々な水和物および塩をプロセスにおいて使用することもできることも企図される。

本明細書に記載されているプロリンヒドロキシラーゼ媒介性プロセスの実行において、操作されたポリペプチドは、精製された酵素、部分的に精製された酵素、酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された細胞全体の形態で、斯かる細胞の細胞抽出物および／もしくはライセートとして、ならびに／または固体支持体に固定化された酵素として、反応混合物に添加することができる。操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された細胞全体、またはその細胞抽出物、ライセート、および単離された酵素は、固体（例えば、凍結乾燥された、噴霧乾燥された、その他）または半固体（例えば、粗ペースト）を含む種々の異なる形態で用いることができる。細胞抽出物または細胞ライセートは、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理その他と、それに続く、凍結乾燥に先立つ脱塩手順（例えば、限外濾過、透析等）によって部分的に精製することができる。酵素調製物（細胞全体の調製物を含む）のいずれかは、例えば、グルタルアルデヒド等の公知架橋剤を使用した架橋、または固相（例えば、ＥｕｐｅｒｇｉｔＣその他）への固定化によって安定化することができる。

操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子（複数可）は、宿主細胞へと、別々に、または同じ宿主細胞に一緒に形質転換することができる。例えば、一部の実施形態では、１セットの宿主細胞は、１種の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子（複数可）で形質転換することができ、別のセットは、別の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子（複数可）で形質転換することができる。両方のセットの形質転換細胞は、細胞全体の形態で、またはそれから得られるライセートもしくは抽出物の形態で、反応混合物において一緒に利用することができる。他の実施形態では、宿主細胞は、複数の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子（複数可）で形質転換することができる。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、分泌ポリペプチドの形態で発現させることができ、分泌ポリペプチドを含有する培養培地は、プロリンヒドロキシラーゼ反応に使用することができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示されている操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドの改善された活性および／または選択性は、より高いパーセンテージ変換がより低い濃度の操作されたポリペプチドにより達成され得る、プロセスを提供する。プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、基質化合物負荷の約１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、７５％（ｗ／ｗ）、１００％（ｗ／ｗ）またはそれよりも多い操作されたポリペプチド量を含む。

一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ；約０．０５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ；約２ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌ；または約０．１ｇ／Ｌ～約２ｇ／Ｌで存在する。一部の実施形態では、プロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌまたは５０ｇ／Ｌで存在する。

一部の実施形態では、反応条件は、酸化反応における補助因子として働くことができる二価遷移金属も含む。一般に、二価遷移金属補助因子は、二価鉄イオン（すなわち、Ｆｅ^＋２）である。二価鉄イオンは、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ_４）、塩化第一鉄（ＦｅＣｌ_２）、炭酸第一鉄（ＦｅＣＯ_３）、ならびにクエン酸塩、乳酸塩およびフマル酸塩等の有機酸の塩等、様々な形態で提供することができる。硫酸第一鉄の例示的な供給源は、モール塩であり、これは、硫酸第一鉄アンモニウム（ＮＨ_４）_２Ｆｅ（ＳＯ_４）_２であり、無水物および水和（すなわち、六水和物）形態で利用できる。二価鉄イオンは、天然に存在するプロリンヒドロキシラーゼにおいて見出される遷移金属補助因子であり、操作された酵素において効率的に機能するが、補助因子として作用することができる他の二価遷移金属をプロセスにおいて使用することができることを理解されたい。一部の実施形態では、二価遷移金属補助因子は、Ｍｎ^＋２およびＣｒ^＋２を含むことができる。一部の実施形態では、反応条件は、約０．１ｍＭ～１０ｍＭ、０．１ｍＭ～約５ｍＭ、０．５ｍＭ～約５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３ｍＭまたは約１ｍＭ～約２ｍＭの濃度で、二価遷移金属補助因子、特にＦｅ^＋２を含むことができる。一部の実施形態では、反応条件は、約０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭまたは１０ｍＭの二価遷移金属補助因子濃度を含む。一部の実施形態では、より高濃度の二価遷移金属補助因子、例えば、最大で５０ｍＭまたは最大で１００ｍＭを使用することができる。

一部の実施形態では、反応条件は、三価鉄（ｆｅｒｒｉｃ）イオン、Ｆｅ^＋３を二価鉄イオン、Ｆｅ^＋２に還元することができる還元剤をさらに含むことができる。一部の実施形態では、還元剤は、アスコルビン酸、典型的には、Ｌ－アスコルビン酸を含む。アスコルビン酸は、ヒドロキシル化反応に要求されないが、酵素活性は、その存在下で増強される。理論に制約されることなく、アスコルビン酸塩は、ヒドロキシル化反応を媒介する活性形態である酵素－Ｆｅ^＋２形態を維持または再生すると考えられる。一般に、反応条件は、基質負荷に比例して対応するアスコルビン酸濃度を含むことができる。一部の実施形態では、アスコルビン酸は、基質のモル濃度量の少なくとも約０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、１．５倍または少なくとも２倍で存在する。一部の実施形態では、還元剤、特に、Ｌ－アスコルビン酸は、約０．００１Ｍ～約０．５Ｍ、約０．０１Ｍ～約０．５Ｍ、約０．０１Ｍ～約０．４Ｍ、約０．１～約０．４Ｍまたは約０．１～約０．３Ｍの濃度である。一部の実施形態では、還元剤、特に、アスコルビン酸は、約０．００１Ｍ、０．００５Ｍ、０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍまたは０．５Ｍの濃度である。

一部の実施形態では、反応条件は、分子状酸素（すなわち、Ｏ_２）を含む。理論に制約されることなく、分子状酸素の一方の酸素原子は、基質化合物に取り込まれて、ヒドロキシル化産物化合物が形成される。Ｏ_２は、反応溶液中に天然に存在することができる、または反応物中に人為的に導入および／または補充され得る。一部の実施形態では、反応条件は、空気、Ｏ_２ガスまたは他のＯ_２含有ガスによる強制通気（例えば、散布）を含むことができる。一部の実施形態では、Ｏ_２またはＯ_２含有ガスにより反応物の圧力を増加させることにより、反応物中のＯ_２を増加させることができる。これは、Ｏ_２ガスにより加圧され得る容器内で反応を実行することにより行うことができる。一部の実施形態では、Ｏ_２ガスは、１時間当たり少なくとも１リットル（Ｌ／ｈ）、少なくとも２Ｌ／ｈ、少なくとも３Ｌ／ｈ、少なくとも４Ｌ／ｈ、少なくとも５Ｌ／ｈまたはそれよりも速い速度で、反応溶液を通して散布することができる。一部の実施形態では、Ｏ_２ガスは、約１Ｌ／ｈ～１０Ｌ／ｈの間、約２Ｌ／ｈ～７Ｌ／ｈの間または約３Ｌ／ｈ～５Ｌ／ｈの間の速度で、反応溶液を通して散布することができる。

反応の経過中に、反応混合物のｐＨは変化し得る。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨにまたは所望のｐＨ範囲内に維持することができる。これは、反応の経過前および／または経過中における、酸または塩基の添加によって行うことができる。その代わりに、ｐＨは、緩衝剤を使用することにより制御することができる。したがって、一部の実施形態では、反応条件は、緩衝剤を含む。所望のｐＨ範囲を維持するための適した緩衝剤は、当技術分野で公知であり、限定ではなく例として、ホウ酸塩、リン酸塩、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、酢酸塩、トリエタノールアミンおよび２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（Ｔｒｉｓ）その他を含む。一部の実施形態では、緩衝剤は、リン酸塩である。プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、約０．０１～約０．４Ｍ、０．０５～約０．４Ｍ、０．１～約０．３Ｍまたは約０．１～約０．２Ｍの緩衝剤（例えば、リン酸塩）濃度を含む。一部の実施形態では、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３または０．４Ｍの緩衝剤（例えば、リン酸塩）濃度を含む。一部の実施形態では、反応条件は、適した溶媒として水を含み、緩衝剤は存在しない。

プロセスの実施形態では、反応条件は、適したｐＨを含むことができる。所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲は、酸もしくは塩基、適切な緩衝剤、または緩衝および酸もしくは塩基添加の組合せの使用によって維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応の経過前および／または経過中に制御することができる。一部の実施形態では、適した反応条件は、約４～約１０の溶液ｐＨ、約５～約１０のｐＨ、約５～約９のｐＨ、約６～約９のｐＨ、約６～約８のｐＨを含む。一部の実施形態では、反応条件は、約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０の溶液ｐＨを含む。

本明細書におけるプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度における反応速度の増加、および反応期間中の酵素の活性を考慮に入れつつ、反応条件のために適した温度を使用することができる。したがって、一部の実施形態では、適した反応条件は、約１０℃～約６０℃、約１０℃～約５５℃、約１５℃～約６０℃、約２０℃～約６０℃、約２０℃～約５５℃、約２５℃～約５５℃または約３０℃～約５０℃の温度を含む。一部の実施形態では、適した反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃または６０℃の温度を含む。一部の実施形態では、酵素反応中の温度は、反応の経過を通して特定の温度で維持することができる。一部の実施形態では、酵素反応中の温度は、反応の経過中に温度プロファイルにわたり調整することができる。

本発明のプロセスは一般に、溶媒中で実行される。適した溶媒は、水、水性緩衝溶液、有機溶媒、ポリマー溶媒、ならびに／または水性溶媒、有機溶媒および／もしくはポリマー溶媒を一般に含む共溶媒系を含む。水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝されていても、緩衝されていなくてもよい。一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用したプロセスは、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１－オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンその他）、イオン性または極性溶媒（例えば、１－エチル４メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１－ブチル３メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、ポリエチレングリコールその他）を含む水性共溶媒系中で実行することができる。一部の実施形態では、共溶媒は、ポリオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または低級アルコール等、極性溶媒であり得る。水性共溶媒系の非水性共溶媒構成成分は、水性構成成分と混和性であり、単一の液相をもたらすことも、または水性構成成分と部分的に混和性もしくは非混和性であり、２つの液相をもたらすこともある。例示的な水性共溶媒系は、水と、有機溶媒、極性溶媒およびポリオール溶媒から選択される１種または複数の共溶媒とを含むことができる。一般に、水性共溶媒系の共溶媒構成成分は、反応条件下でプロリンヒドロキシラーゼ酵素を有害に不活性化しないように選ばれる。適切な共溶媒系は、本明細書に記載されているもの等、酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系において、目的の、規定された基質を用いて、指定された、操作されたプロリンヒドロキシラーゼ酵素の酵素活性を測定することにより容易に同定することができる。

プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、水性共溶媒を含み、共溶媒は、約１％～約５０％（ｖ／ｖ）、約１～約４０％（ｖ／ｖ）、約２％～約４０％（ｖ／ｖ）、約５％～約３０％（ｖ／ｖ）、約１０％～約３０％（ｖ／ｖ）または約１０％～約２０％（ｖ／ｖ）でＤＭＳＯを含む。プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、約１％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、約２０％（ｖ／ｖ）、約２５％（ｖ／ｖ）、約３０％（ｖ／ｖ）、約３５％（ｖ／ｖ）、約４０％（ｖ／ｖ）、約４５％（ｖ／ｖ）または約５０％（ｖ／ｖ）でＤＭＳＯを含む水性共溶媒を含むことができる。

一部の実施形態では、反応条件は、反応を安定化または増強するために界面活性物質を含むことができる。界面活性物質は、非イオン性、カチオン性、アニオン性および／または両親媒性界面活性物質を含むことができる。例示的な界面活性物質は、限定ではなく例として、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ポリオキシエチレン－ステアリルアミン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、オレイルアミド硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｏｌｅｙｌａｍｉｄｏｓｕｌｆａｔｅ）、ポリオキシエチレン－ソルビタンモノステアレート、ヘキサデシルジメチルアミン等を含む。反応を安定化または増強することができるいかなる界面活性物質を用いることもできる。反応において用いるべき界面活性物質の濃度は一般に、０．１～５０ｍｇ／ｍｌ、特に、１～２０ｍｇ／ｍｌであり得る。

一部の実施形態では、反応条件は、反応溶液が混合または散布されるとき等に、反応溶液における気泡の形成の低下または防止を助ける消泡剤を含むことができる。消泡剤は、非極性油（例えば、鉱物、シリコーン等）、極性油（例えば、脂肪酸、アルキルアミン、アルキルアミド、硫酸アルキル等）および疎水性（例えば、処理シリカ、ポリプロピレン等）を含み、これらのいくつかは、界面活性物質としても機能する。例示的な消泡剤は、Ｙ－３０（登録商標）（ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）、ポリ－グリコールコポリマー、オキシ／エトキシ化アルコールおよびポリジメチルシロキサンを含む。一部の実施形態では、消泡剤は、約０．００１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）または約０．１％（ｖ／ｖ）～約２％（ｖ／ｖ）で存在することができる。一部の実施形態では、消泡剤は、反応を促進するのに望ましいように、約０．００１％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）もしくは約５％（ｖ／ｖ）またはそれよりも高く存在することができる。

ヒドロキシラーゼ反応において使用される反応物の量は一般に、所望される産物の量に応じて、また、用いられるプロリンヒドロキシラーゼ基質の量に付随して変動するであろう。当業者であれば、これらの量を変動させて、生産性の所望のレベルおよび生産のスケールを調整する方法を容易に理解するであろう。

一部の実施形態では、反応物の添加の順序は、重要ではない。反応物は、溶媒（例えば、単相性溶媒、二相性水性共溶媒系その他）に同時に一緒に添加することができる、またはその代わりに、反応物の一部は、別々に、一部は一緒に、異なる時点で添加することができる。例えば、補助因子、補助基質、プロリンヒドロキシラーゼおよび基質は、溶媒に最初に添加することができる。

固体反応物（例えば、酵素、塩等）は、粉末（例えば、凍結乾燥した、噴霧乾燥したその他）、溶液、エマルション、懸濁液その他を含む種々の異なる形態で反応に提供することができる。反応物は、当業者にとって公知の方法および機器を使用して容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液を、少量のアリコートにおいて－８０℃で凍結し、次いで、予め冷却された（ｐｒｅ－ｃｈｉｌｌｅｄ）凍結乾燥チャンバーに添加し、続いて真空に引くことができる。

水性共溶媒系が使用される場合の改善された混合効率のため、プロリンヒドロキシラーゼおよび補助因子を、最初に水相に添加および混合することができる。次に、有機相を添加および混合し、続いて、プロリンヒドロキシラーゼ基質および補助基質を添加することができる。その代わりに、水相への添加に先立ち、プロリンヒドロキシラーゼ基質を有機相に予め混合することができる。

ヒドロキシル化プロセスは一般に、基質からヒドロキシル化産物へのさらなる変換が反応時間とともに著しく変化することがなくなるまで（例えば、基質の１０％未満が変換される、または基質の５％未満が変換される）進められる。一部の実施形態では、反応は、基質から産物への完全なまたはほぼ完全な変換が生じるまで進められる。基質から産物への転換は、誘導体化ありまたはなしで、基質および／または産物を検出することによって公知方法を使用してモニターすることができる。適した分析方法は、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＭＳその他を含む。

プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、少なくとも約５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌまたはそれよりも多い基質負荷を含み、方法は、約４８ｈもしくはそれ未満、約３６ｈもしくはそれ未満または約２４ｈもしくはそれ未満における、基質化合物から産物化合物への少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれよりも高い変換をもたらす。

適した反応条件下でプロセスにおいて使用される場合の本発明の操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドは、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い異性体過剰率において、トランス－４－ヒドロキシル化産物よりも過剰なトランス－３－ヒドロキシル化産物をもたらす。一部の実施形態では、検出可能な量の化合物トランス－４－ヒドロキシル化産物は形成されない。

操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用して基質化合物をヒドロキシル化産物化合物に変換するためのプロセスのさらなる実施形態では、適した反応条件は、反応溶液への初期基質負荷を含むことができ、これは次いで、ポリペプチドによって接触される。次に、この反応溶液は、少なくとも約１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約６ｇ／Ｌ／ｈまたはそれよりも速い速度での時間をかけた連続したまたはバッチ式（ｂａｔｃｈｗｉｓｅ）の添加として、追加的な基質化合物をさらに補充される。よって、これらの適した反応条件に従って、ポリペプチドは、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液に添加される。このポリペプチド添加に続いて、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌまたはそれよりも多いはるかにより高い最終基質負荷に達するまで、約２ｇ／Ｌ／ｈ、４ｇ／Ｌ／ｈまたは６ｇ／Ｌ／ｈの速度で溶液へのさらなる基質の連続した添加が為される。したがって、プロセスの一部の実施形態では、適した反応条件は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液へのポリペプチドの添加と、それに続く、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌまたはそれよりも多い最終基質負荷に達するまでの、約２ｇ／Ｌ／ｈ、４ｇ／Ｌ／ｈまたは６ｇ／Ｌ／ｈの速度での溶液へのさらなる基質の添加を含む。この基質補充反応条件は、基質の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれよりも高い変換の、基質からヒドロキシル化産物への変換の高い率を維持しつつ、より高い基質負荷が達成されることを可能にする。このプロセスの一部の実施形態では、添加される基質は、さらに添加される基質の等モル濃度またはより多い量でα－ケトグルタレートを含む溶液中に存在する。

プロセスの一部の実施形態では、操作されたプロリンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用した反応は、次の適した反応条件を含むことができる：（ａ）約６０ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約６ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）基質化合物の約１．２モル当量のα－ケトグルタレート；（ｄ）約１０ｍＭアスコルビン酸；（ｅ）約４ｍＭＦｅＳＯ_４；（ｆ）約６．８のｐＨ；（ｇ）約２０℃の温度；および（ｈ）約２４ｈの反応時間。

一部の実施形態では、追加的な反応構成成分または追加的な技法を実行して、反応条件を補う。これらは、酵素を安定化するまたはその不活性化を防止する、産物阻害を低下させる、反応平衡をヒドロキシル化産物形成へとシフトさせるための方策を講じることを含むことができる。

さらなる実施形態では、基質化合物から産物化合物への変換のための上述のプロセスのいずれかは、産物化合物の抽出；単離；精製；および結晶化から選択される１種または複数のステップをさらに含むことができる。上に開示されているプロセスによって産生された生体触媒反応混合物からヒドロキシル化産物を抽出、単離、精製および／または結晶化するための方法、技法およびプロトコールは、当業者にとって公知である、および／または慣例的な実験法によりアクセスされる。その上、説明のための方法が、下の実施例に提供される。

本発明の様々な特色および実施形態が、次の代表的な実施例において説明されるが、これらは、説明を意図するものであり、限定を意図するものではない。

実験
実験および達成された結果を含む、下記の実施例は、単なる説明目的で示されており、本発明を限定するものとして解釈するべきではない。

後述する実験の開示において、次の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（ユニット）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；℃（摂氏度）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＮＡ（核酸；ポリヌクレオチド）；ＡＡ（アミノ酸；ポリペプチド）；Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＣｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＴから入手できる、一般的に使用されている研究室のＥ．ｃｏｌｉ株）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）；ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）；ＩＰＴＧ（イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）；ＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する倍数改善（ｆｏｌｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｖｅｒｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ））；ＤＯ（溶存酸素）；ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）；ＬＢ（ルリアブロス（Ｌｕｒｉａｂｒｏｔｈ））；ＴＢ（テリフィックブロス（ｔｅｒｒｉｆｉｃｂｒｏｔｈ））；ＭｅＯＨ（メタノール）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＳＦＰ（振盪フラスコ粉末（ｓｈａｋｅｆｌａｓｋｐｏｗｄｅｒ））；ＤＳＰ（下流加工粉末（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｐｒｏｃｅｓｓｐｏｗｄｅｒ））；ＡｔｈｅｎｓＲｅｓｅａｒｃｈ（ＡｔｈｅｎｓＲｅｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）；ＰｒｏＳｐｅｃ（ＰｒｏＳｐｅｃＴａｎｙＴｅｃｈｎｏｇｅｎｅ、ＥａｓｔＢｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；ＲａｍＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＲａｍＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｙｏｎｋｅｒｓ、ＮＹ）；ＰａｌｌＣｏｒｐ．（Ｐａｌｌ，Ｃｏｒｐ．、Ｐｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、ＢｉｌｌｅｒｉｃａＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ｋｕｈｎｅｒ（ＡｄｏｌｆＫｕｈｎｅｒ，ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹの一部）、Ａｇｉｌｅｎｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの一部）；Ｆｉｓｈｅｒ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）；Ｗａｔｅｒｓ（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；Ｐｉｅｒｃｅ（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（現在、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）；Ｏｐｔｉｍａｌ（ＯｐｔｉｍａｌＢｉｏｔｅｃｈＧｒｏｕｐ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）；ならびにＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。

（実施例１）
組換えプロリンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ発現宿主
本発明のバリアントの産生に使用された初期プロリンヒドロキシラーゼ（ＰＨ）酵素は、真菌種番号１１２４３（受託番号ＧＡＭ８４９８２）由来の野生型ＡＮＯ配列から得た。野生型ＰＨタンパク質配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、ＤＮＡを、ｌａｃＩリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結された発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照）へとクローニングした。発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール抵抗性遺伝子も含有する。その結果得られるプラスミドを、当技術分野で公知の標準方法を使用してＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０へと形質転換した。当技術分野で公知の通りに細胞をクロラムフェニコール選択に供することにより、形質転換体を単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照）。

（実施例２）
ＨＴＰＰＨを含有する湿潤細胞ペレットおよびライセートの調製
モノクローナルコロニーから得た組換えＰＨコード遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、９６ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートのウェル内の１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有する１８０μｌＬＢに播種した。プレートをＯ_２透過性シールで封着し、培養物を一晩、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％湿度で育成した。次に、細胞培養物のそれぞれの１０μｌを、３９０ｍＬＴＢおよび３０μｇ／ｍＬＣＡＭを含有する９６ウェルのディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをＯ_２透過性シールで封着し、ＯＤ_６００が０．６～０．８に達するまで、３０℃、２５０ｒｐｍおよび８５％湿度でインキュベートした。次に、１ｍＭまでの最終濃度のＩＰＴＧによって細胞培養物を誘導し、一晩２０℃または３０℃でインキュベートした。次に、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎの遠心分離を使用して、細胞をペレットにした。上清を廃棄し、溶解に先立ち、ペレットを－８０℃で凍結した。

溶解のため、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／Ｌ硫酸ポリミキシンｂ（ＰＭＢＳ）を含有する４００μｌ溶解緩衝液を、実施例２に記載されている通りに産生された各ウェル内の細胞ペーストに添加した。室温で２時間、卓上振盪機で振盪しつつ、細胞を溶解した。次に、１５ｍｉｎ、４０００ｒｐｍおよび４℃でプレートを遠心分離した。次に、清澄な上清を生体触媒反応において使用して、その活性レベルを決定した。

（実施例３）
振盪フラスコ（ＳＦ）培養物からの凍結乾燥ライセートの調製
上に記載されている通りに育成された選択されたＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌＣＡＭを有するＬＢ寒天プレート上に蒔き、一晩３７℃で育成した。各培養物から得た単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌＣＡＭを有する６ｍｌのＬＢに移した。培養物を１８ｈ、３０℃、２５０ｒｐｍで育成し、３０μｇ／ｍｌＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢへとおよそ１：５０で継代培養して、０．０５の最終ＯＤ_６００にした。およそ１９５分間、３０℃、２５０ｒｐｍで培養物を育成して、０．６～０．８の間のＯＤ_６００にし、１ｍＭＩＰＴＧで誘導した。次に、２０ｈ、２０℃または３０℃、２５０ｒｐｍで培養物を育成した。４０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ培養物を遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを３０ｍｌの２０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．５に再懸濁し、１８，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して溶解させた。ライセートをペレットにし（１０，０００ｒｐｍで６０ｍｉｎ）、上清を凍結および凍結乾燥して、振盪フラスコ（ＳＦ）酵素を生成した。

（実施例４）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号４を上回る改善
Ｌ－プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換についてのバリアントのスクリーニングの結果に基づき、親酵素として配列番号４を選択した。配列番号４は、配列番号２と同一である；どちらの配列も、Ｎ末端ｈｉｓタグが付加された野生型プロリンヒドロキシラーゼであるが、配列番号３は、野生型プロリンヒドロキシラーゼをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドである。十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩２０℃でのタンパク質発現による）、ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、２００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

３００μＬ丸底プレートにおいて、５０μＬのＥ．ｃｏｌｉライセートを、各ウェルにおける２００μＬの反応ミックス（７５μＬの６３ｇ／Ｌ α－ケトグルタル酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］、６５ｍＭアスコルビン酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］における５０μＬの２０ｍＭモール塩、および７５μＬの３３ｇ／ＬＬ－プロリンを含む）に添加した。プレートをＡｉｒＰｏｒｅシール（Ｑｉａｇｅｎ）で封着し、２”行程のＫｕｈｎｅｒにおいて３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％相対湿度で一晩（ほぼ１８時間）放置して反応を進めた。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することによって、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号４と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号４によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。配列番号４と比べた活性（活性ＦＩＯＰ）は、配列番号４によって産生されたトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算した。結果を表４．１および４．２に示す。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、実施例３に記載されている通りに（一晩２０℃でのタンパク質発現による）振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：１０ｇ／ＬＬ－プロリン、５０ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．５当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、０．１５当量アスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号４と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号４によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表４．３に示す。

配列番号４によって産生されたプロリンヒドロキシラーゼタンパク質は、３０℃における標準発現条件下で、十分には安定していなかった。上に記載されている通り、表４．１、４．２および４．３に示す全データについて、ＨＴＰおよび振盪フラスコタンパク質は、２０℃での発現により産生された。より安定しかつ活性があるバリアントについて選択するために、配列番号４に由来する操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生し、各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、３０℃における発現によりＨＴＰで産生した。反応、誘導体化および解析を上に記載されている通りに行った。配列番号４と比べた安定性および活性（安定性／活性ＦＩＯＰ）は、配列番号４によって産生されたトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算し、両方の酵素を３０℃で産生した。結果を表４．４に示す。

（実施例５）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号１１６を上回る改善
十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号１１６のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号１１５）から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩２０℃でのタンパク質発現による）ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、２００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号１１６と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号１１６によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表５．１に示す。

配列番号１１６によって産生されたプロリンヒドロキシラーゼタンパク質は、３０℃における標準発現条件下で、十分には安定していなかった。より安定しかつ活性があるバリアントについて選択するために、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号１１６に由来する操作された遺伝子のライブラリーを産生し、各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、３０℃における発現によりＨＴＰで産生した。反応、誘導体化および解析を上に記載されている通りに行った。配列番号１１６と比べた安定性および活性（安定性／活性ＦＩＯＰ）は、配列番号１１６によって産生されたトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算し、両方の酵素を３０℃で産生した。結果を表５．２に示す。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、実施例３に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。配列番号１１６のためのＳＦＰを２０℃で産生し、配列番号１１６に由来するバリアントを３０℃で産生した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：２０ｇ／ＬＬ－プロリン、５ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．５当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、０．１５当量アスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号１１６と比べた安定性および活性（安定性／活性ＦＩＯＰ）は、配列番号１１６によって産生されたトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算し、配列番号１１６を２０℃で産生し、配列番号１１６に由来するバリアントを３０℃で産生した。結果を表５．３に示す。

（実施例６）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号１６２を上回る改善
十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号１６２のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号１６１）から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩３０℃でのタンパク質発現による）ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、４００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

３００μＬ丸底プレートにおいて、５０μＬのＥ．ｃｏｌｉライセートを、各ウェルにおける２００μＬの反応ミックス（７５μＬの１３３ｇ／Ｌ α－ケトグルタル酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］、６５ｍＭアスコルビン酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］における５０μＬの２０ｍＭモール塩、および７５μＬの６７ｇ／ＬＬ－プロリンを含む）に添加した。プレートをＡｉｒＰｏｒｅシール（Ｑｉａｇｅｎ）で封着し、２”行程のＫｕｈｎｅｒにおいて３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％相対湿度で一晩（ほぼ１８時間）放置して反応を進めた。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号１６２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号１６２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、３０℃における発現により、実施例３に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：４０ｇ／ＬＬ－プロリン、５ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．２当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、２５ｍＭアスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号１６２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号１６２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表６．１に示す。

（実施例７）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号３２２を上回る改善
十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号３２２のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号３２１）から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩３０℃でのタンパク質発現による）ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、４００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

３００μＬ丸底プレートにおいて、５０μＬのＥ．ｃｏｌｉライセートを、各ウェルにおける２００μＬの反応ミックス（７５μＬの２６６ｇ／Ｌ α－ケトグルタル酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］、６５ｍＭアスコルビン酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］における５０μＬの２０ｍＭモール塩、および７５μＬの１３３ｇ／ＬＬ－プロリンを含む）に添加した。プレートをＡｉｒＰｏｒｅシール（Ｑｉａｇｅｎ）で封着し、２”行程のＫｕｈｎｅｒにおいて３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％相対湿度で一晩（ほぼ１８時間）放置して反応を進めた。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号３２２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号３２２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。配列番号３２２と比べた活性（活性ＦＩＯＰ）は、配列番号３２２によって産生されたトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積と比較した、バリアントのトランス－３－ヒドロキシプロリンのピーク面積の比として計算した。結果をそれぞれ表７．１および７．２に示す。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、３０℃における発現により、実施例３に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：４０ｇ／ＬＬ－プロリン、５ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．２当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、１０ｍＭアスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号３２２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号３２２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表７．３に示す。

（実施例８）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号４１２を上回る改善
十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号４１２のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号４１１）から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩３０℃でのタンパク質発現による）ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、４００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号４１２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号４１２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表８．１に示す。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、３０℃における発現により、実施例３に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：６０ｇ／ＬＬ－プロリン、５ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．２当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、１０ｍＭアスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号４１２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号４１２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表８．２に示す。

（実施例９）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号４９２を上回る改善
十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号４９２のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号４９１）から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩３０℃でのタンパク質発現による）ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、６００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

３００μＬ丸底プレートにおいて、５０μＬのＥ．ｃｏｌｉライセートを、各ウェルにおける２００μＬの反応ミックス（７５μＬの６６７ｇ／Ｌ α－ケトグルタル酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］、６５ｍＭアスコルビン酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］における５０μＬの２０ｍＭモール塩、および７５μＬの３３３ｇ／ＬＬ－プロリンを含む）に添加した。プレートをＡｉｒＰｏｒｅシール（Ｑｉａｇｅｎ）で封着し、２”行程のＫｕｈｎｅｒにおいて３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％相対湿度で一晩（ほぼ１８時間）放置して反応を進めた。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号４９２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号４９２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表９．１に示す。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、３０℃における発現により、実施例３に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：６０ｇ／ＬＬ－プロリン、５ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．２当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、１０ｍＭアスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号４９２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号４９２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表９．２に示す。

（実施例１０）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号５６２を上回る改善
十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号５６２のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号５６１）から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩３０℃でのタンパク質発現による）ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、４００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

３００μＬ丸底プレートにおいて、５０μＬのＥ．ｃｏｌｉライセートを、各ウェルにおける２００μＬの反応ミックス（７５μＬの４００ｇ／Ｌ α－ケトグルタル酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］、６５ｍＭアスコルビン酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］における５０μＬの２０ｍＭモール塩、および２００μＬの２００ｇ／ＬＬ－プロリンを含む）に添加した。プレートをＡｉｒＰｏｒｅシール（Ｑｉａｇｅｎ）で封着し、２”行程のＫｕｈｎｅｒにおいて３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％相対湿度で一晩（ほぼ１８時間）放置して反応を進めた。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号５６２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号５６２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表１０．１に示す。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、３０℃における発現により、実施例３に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：６０ｇ／ＬＬ－プロリン、５ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．２当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、１０ｍＭアスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号５６２と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号５６２によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表１０．２に示す。

（実施例１１）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号５９８を上回る改善
十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号５９８のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号５９７）から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩３０℃でのタンパク質発現による）ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、２００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

３００μＬ丸底プレートにおいて、５０μＬのＥ．ｃｏｌｉライセートを、各ウェルにおける２００μＬの反応ミックス（７５μＬの２６７ｇ／Ｌ α－ケトグルタル酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］、６５ｍＭアスコルビン酸［５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中］における５０μＬの２０ｍＭモール塩、および２００μＬの１３３ｇ／ＬＬ－プロリンを含む）に添加した。プレートをＡｉｒＰｏｒｅシール（Ｑｉａｇｅｎ）で封着し、２”行程のＫｕｈｎｅｒにおいて３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％相対湿度で一晩（ほぼ１８時間）放置して反応を進めた。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号５９８と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号５９８によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表１１．１に示す。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、３０℃における発現により、実施例３に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：６０ｇ／ＬＬ－プロリン、５ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．２当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、１０ｍＭアスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号５９８と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号５９８によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表１１．２に示す。

（実施例１２）
プロリン基質のトランス－３－ヒドロキシプロリンへの変換における配列番号６３０を上回る改善
十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号６３０のプロリンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号６２９）から、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によってコードされたポリペプチドを、実施例２に記載されている通りに（一晩３０℃でのタンパク質発現による）ＨＴＰで産生した。全バリアントのために、２００μＬ溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬＰＭＢＳを含有する）を添加し、室温で２時間、卓上振盪機において振盪することにより、細胞ペレットを溶解した。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間、４℃にて遠心分離して、細胞デブリを除去した。

一晩インキュベーション後に、２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、各ウェル由来の反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。配列番号６３０と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号６３０によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。

ＨＴＰ解析に加えて、ＨＴＰスクリーニング由来の有益なバリアントの選択サブセットはまた、３０℃における発現により、実施例３に記載されている通りに、振盪フラスコスケールで調製した。凍結乾燥された振盪フラスコライセート粉末（ＳＦＰ）を、次の条件下で、１ｍＬスケール反応において検査した：６０ｇ／ＬＬ－プロリン、５ｗｔ％プロリンヒドロキシラーゼバリアントＳＦＰ、１．２当量ａ－ＫＧ（α－ケトグルタル酸）、１０ｍＭアスコルビン酸、４ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８、空気および室温。反応を一晩実行し、ＨＴＰ反応について上に記載されている同様の方法を使用して解析した。配列番号６３０と比べた選択性（選択性ＦＩＯＰ）は、配列番号６３０によって産生された比に対する、バリアントによって形成された産物のトランス－３－ヒドロキシプロリン：トランス－４－ヒドロキシプロリンの比として計算した。結果を表１２．１に示す。

（実施例１３）
プロリンから産生されたトランス－３－ヒドロキシプロリンの分析的検出
実施例４～１２に記載されているデータは、表１３．１における分析方法を使用して収集された。本明細書に提供される方法は全て、本発明を使用して産生されたバリアントの解析において用途を見出す。しかし、本明細書に記載されている方法が、本明細書に提供されるバリアントおよび／または本明細書に提供される方法を使用して産生されたバリアントの解析に適用可能な唯一の方法であるとは意図されない。

プロリン基質およびヒドロキシルプロリン産物を後述する通りに解析した。２５μＬの反応ミックスを、２２５μＬの誘導体化溶液（ウェル当たり７５μＬの飽和炭酸水素ナトリウム、２５μＬの水および１２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬＦｍｏｃＣｌ［ＡＣＮ中］を含む）を含有する９６ウェルのディープウェルプレートへと等分することにより、反応物を誘導体化およびクエンチした。室温での１ｈｒの振盪後に、プレートを１分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、クエンチした反応物の可溶性画分の４０μＬを、１６０μＬの１：１ＡＣＮ：０．５ＭＨＣｌと混合した。誘導体化および希釈された試料は、表１３．１に記載されている通りに解析した。

本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許、特許出願および他の文書は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書のそれぞれが、あらゆる目的のために参照により組み込まれると個々に指し示されるのと同じ程度まで、あらゆる目的のためにこれらの全体がこれにより参照により組み込まれる。

様々な具体的な実施形態について説明および記載してきたが、本発明（複数可）の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化が生じ得ることが認められるであろう。

Claims

配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０と比較した１個または複数の残基差異を含む、プロリンヒドロキシラーゼ活性を有する操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１９４、１２３、２１、２８、５８／２４７、６５、８０、８５、９５、９８、１１７、１２０、１５９、１８５、１９９、２００、２３３、２３７、２４３、２５０、２６８、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３０、３３８、３４３、３４６および３４８から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１、２８、４５、６５、９５、１１２、１１７、１３９、１７７、１８５、１９９、２３３、２４３、２５０、２８１、２８２、２８７、２８９、３０７、３２４、３２６、３２７、３３５、３３８、３４３および３４６から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４８／６６／１８９／１９４、４８／６６／１９４および６６／８２／８５／１３５／１８９／１９４／２６７から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２０／５６／７６／１６８／１６９／２９６、２０／５６／２３２／２９４、２０／１１９／２９４／２９６、５６／７６／１１９／１２４／１４７／２３２、５６／７６／２９４、７６／１６８／２３２／２９４、７６／２９４／２９６、７６／２９６、１４７および２３２から選択される残基位置における、配列番号４と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１２３、１８９、１９５、２３３および２９６から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２０／２１／５６、２０／２１／５６／７６／９５／２３２／２９４／３０７／３３５、２０／２１／５６／７６／１４７／２２５／２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７／３３５、２０／２１／５６／９５／１４７／２８１／２９４／３０７、２０／２１／５６／２８１／３０７、２０／２１／７６／２３２／２４３、２０／２１／９５／２３２／３０７、２０／２１／９５／２８１／２９４／２９６、２０／２１／１４７／１８９／２３３／２４３／２８１／３０７、２０／５６、２０／５６／７６／９５／２８１／３０７、２０／５６／７６／１４７／２９４／２９６／３０７、２０／５６／９５／１４７／２９４、２０／５６／２８１、２０／７６、２０／７６／９５／２８１／２９４／２９６、２０／７６／９５／２８１／２９６／３０７、２０／７６／２３３／２９４／３０７、２０／７６／２４３／２８１／２９４、２１／７６／１４７／２３３／２９４／３０７、２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、２１／９５／１８５／１８９／２３２／２８１／２９６、２１／９５／２３３／２４３／２８１／２９６、２１／９５／２９４／２９６／３０７／３３５、２１／９５／３０７、２１／２８１／３０７、２９／７６／２８１、５６／７６／９５／２３２／２４３／２８１、５６／７６／１４７／２８１／３０７、５６／７６／２４３／２９４、５６／７６／２８１／２９４、５６／７６／２９６、５６／７６／３０７、５６／９５／１４７／３０７／３３５／３４８、５６／９５／２３２／２３３／２８１／２９４／３０７、５６／９５／２４３／２８１、５６／１４７／２８１、５６／２３２／２４３／２８１、５６／２３２／２８１、５６／２３２／２８１／２９４／２９６、５６／２３３／２８１／２９４／２９６、５６／２８１／３０７、７６／９５／２３２／２４３／２８１／３０７、７６／９５／２４３／２８１／３０７／３３５、７６／９５／２９４／３０７、７６／１４７、７６／１４７／２３３／２４３／２９４、７６／１４７／２３３／２８１／２９４／３０７、７６／１４７／２４３／２９４／２９６／３０７／３３５、７６／１４７／２８１／３０７、７６／１８９／２９６、７６／２３２／２３３／２４３／２９４／２９６／３０７、７６／２８１、７６／２８１／２９４、７６／２９４／２９６、９５／１２０、９５／１４７／３３５、９５／２３２／２４３／２８１／２９４／３０７、９５／２３２／２８１／２９４／２９６、９５／２８１／２９４／２９６、９５／３３５、１４７、１４７／２２５／２３２／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、１４７／２３３／２４３／２８１／３０７、１４７／２３３／２８１／３０７／３３５、１４７／２４３／２８１、１４７／３０７、２３２／２３３／２８１／２９４／２９６／３０７、２３２／２８１、２３２／２８４／３０７、２３３／２４３／２８１／２９６／３０７／３３５、２３３／２８１／２９６／３０７、２４３／２８１／２９４／２９６、２８１、２８１／２９４、２８１／３０７、３０７、および３３５から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号１１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２１／７６／１４７／２４３／２９６／３０７／３３５、５６／７６／１４７／２８１／３０７および９５／１４７／３３５から選択される残基位置における、配列番号１１６と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号１６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２／８５／１２３／２３７、２８／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７０／３４３／３４６／３４８、４５／１２３／３２６、６５／１１７／１２０／１２３／３４３／３４６、８５／１２３／２８１／２８２、１１４／１１５／１１７／１２０／１２３／２６８／２７１／３１３／３２６／３４３／３４６、１２３／１３９／２３３／２３７／２８１／２８２／２８９／３２４／３２６および１２３／１９９／２００／２４７／２５０／３３８から選択される残基位置における、配列番号１６２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２６、５４、６１、１２９、１３２、１４９、１５６、１７５、１８９、２０１、２０９、２２８、２３６、２４８、２６２、２７２、２７７、２９１および３４５から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２５、４３、５４、５８、６１、７９、１２９、１３２、１４３、１５６、１６３、１７５、１７９、２０１、２０９、２３６、２４８、２７８、２９１、３４５および３４７から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号３２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６、８５／１１７／１２０／１３５／２０８／２８１／２８２／２８９、８５／１１７／１２０／２７０／２８１／２８９、８５／１１７／１３５／１３９／２０８および１１７／１２０／２０８／２７０／３２４／３４３／３４６から選択される残基位置における、配列番号３２２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７、４８、５６／１１８、８５、９５、９５／２８９、１１３、１１８、１１８／２４７、１５４、１６２、１６２／２０４、１６４、１６４／１９８／２７１、１６８、１６９、１８７、１９５、２４３、２７１、２７５、２８１、３１４、３３０および３４２から選択される残基位置における、配列番号４１２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号４１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２５／１２９／１６３／２３６／２６２／３４５／３４７、１２０／１５６／１７５／１７９／２０１、１２９／１８９／２３６／２６２／２７７／２７８、１２９／２３６／２６２、１５６／１７５／１７９／２２８および１６２から選択される残基位置における、配列番号４１２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５、１７、２８、２９、６５、１３５、１６７、１７７、１９９、２０８、２２８、２３５、２８７、２９４、３０７および３４３から選択される残基位置における、配列番号４９２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号４９２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８５／１８７／２８１／３４７、８５／１８７／３４７、１１８／１２０／１６２／１７５／１７９／３３０、１１８／１２０／１６２／１７５／３３０、１６２／１７５／１７９／３３０、１７５／２２８／３３０、１９５／３４７および２７８／３１４／３４７から選択される残基位置における、配列番号４９２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１５、４０、４３、４４、５９、７９、８２、１４９、１６４、１７９、３４５および３４７から選択される残基位置における、配列番号５６２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号５６２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに２９／８５／１７７／２０８／２２８／３４７、２９／８５／２０８／２２８／３４３／３４７、２９／１７７／１９５／２２８／３４３、２９／２０８／２２８／２７８／２９４／３４７、５６／１９５／２７８、８５／１８７／２０５／２０８／２７８、１１３／１７７／１８７／１９５／２０８／２７８／２９４／３４３／３４７および１７７／２０５／２０８／２２８から選択される残基位置における、配列番号５６２と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに４７、１６２、２０９、２１９、２２７および３４２から選択される残基位置における、配列番号５９８と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号５９８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに１７／４４／１７９／１９５／２５０／３１３／３４５、１７／４４／１９９／３１３、４３／４４／１９５／１９９、４４／１４９／１６４／１７１／１８７、４４／１７９／１９５／１９９、４４／１７９／１９５／１９９／３４５、７９／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２８６／２８８、８２／１６３／１６４、８２／１６３／１６４／１７１／１８７／２０１／２０３／２０８／２８６／２８８／３２０、１４９／１６４／１７１／２８８および１８７／２８６から選択される残基位置における、配列番号５９８と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
参照配列、配列番号６３０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに８２／１６４／１７１／２０３／２０８、１３５／１６３／１６４／２０１／２０３／２０８、１６２、１６２／２１９／２３６、１６２／２１９／３１３／３３８、１６２／２３６／３４２、１６２／３１３／３４２および１６４／１７１／２０１／２０３／２８２から選択される残基位置における、配列番号６３０と比較した１個または複数の残基差異を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
配列番号６～６５８における偶数番号の配列のうち少なくとも１種に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
天然に存在する酵素の活性の少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれよりも高い活性で、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる、請求項２３に記載の操作されたポリペプチド。
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高いトランス－３－ヒドロキシプロリンのジアステレオマー過剰率（ｄｉａｓｔｅｒｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓｓ）で、Ｌ－プロリンをトランス－３－ヒドロキシプロリンに変換することができる、請求項２３に記載の操作されたポリペプチド。
請求項１～２５のいずれかに記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項２２に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項２４に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化された核酸配列を含む、請求項２６～２８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
請求項２６～２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含み、必要に応じて、少なくとも１種の制御配列をさらに含む発現ベクター。
配列番号４、１１６、１６２、３２２、４１２、４９２、５６２、５９８および／または６３０の操作されたポリペプチドを含む、請求項３０に記載の発現ベクター。
請求項２６～２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
請求項３０または３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項３２または３３に記載の宿主細胞。
操作されたポリペプチドを調製する方法であって、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項３２～３４のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
前記操作されたポリペプチドを単離するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。