JP7208797B2 - プーリング及び分割アプローチを適用することによって生物の集団内の突然変異体をスクリーニングする方法 - Google Patents
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Description
-第1に、CRISPR-Cas9技術はGMベースとみなされ得ることである。これにより、ゲノムの標的部位における二本鎖DNA切断の導入を含む、ゲノム編集について新しい遺伝的ツールを規制することを当局がどのように規制しようとしているかについて、基本的な立法情報が欠落している。
-第2に、CRISPR-Cas9技術を用いたオフターゲット切断に関係する主要な複雑性があることである。
-複製エラーと;
-間違って修復されたか修復されていないDNA損傷と;
-化学物質、紫外線、電離放射線などの外因性要因によって引き起こされるDNA損傷と;
-内因性要因、例えば、反応性酸素種、アルデヒド、または有糸分裂エラーと;
-DNA修復またはゲノム編集に関与する酵素と;
-DNA断片を挿入するウイルス及び内因性レトロトランスポゾンと、を含む多くの要因に応答して生じる。
-穀物における生殖系列の範囲と体細胞突然変異率の限界決定。
-現在のアプローチは、状況に依存しないgDNA配列解析に基づくgDNA断片への突然変異体発見の絞り込みに焦点を当てている[例えば、5,000~10,000の突然変異体、及び突然変異体と野生型由来のgDNA断片との融点差でスクリーニングすることに限定されているTilling方法論(Botticellaら、2011)]。
今まで、非GM法を用いて所定の複雑な突然変異を見出すことは非現実的であると考えられていた。また、このラインに沿って、対象の特定のヌクレオチド置換を強固に同定するためにどの試料サイズで作業すべきかについてのヒントはなかった。これは、今、本刊行物で提供される指針に従うことによって可能になっている。
a)複数の遺伝子型を表す、該種、またはその生殖部分の生物のプールを提供する工程と;
b)該プールを生物の1つ以上のサブプールまたはその生殖部分に分割する工程と;
c)該サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖の可能性を維持しながら、サブプール内の各遺伝子型からのgDNAをそれぞれ含むgDNA試料を調製する工程と;
d)それぞれが1つのサブプールからのgDNA試料を含む複数のPCR増幅を実施し、これにより標的配列を増幅させる工程であって、各PCR増幅が、それぞれ該gDNA試料の一部、標的配列に隣接するプライマーの1つのセット、及びPCR試薬を含む複数の区画化されたPCR増幅を含む、工程と;
e)対象のNOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含む1つ以上の標的配列を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより該突然変異を含むサブプール(複数可)を同定する工程と;
f)該同定されたサブプールの生物、またはその生殖部分を、二次サブプールに分割する工程と;
g)該二次サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖の可能性を維持しながら、それぞれが二次サブプール内の各遺伝子型からのgDNAを含むgDNA試料を調製する工程と;
h)それぞれが1つの二次サブプールからのgDNA試料、標的配列に隣接するプライマーの1つのセット、及びPCR試薬を含む、複数のPCR増幅を実施し、これにより標的配列を増幅する工程と;
i)NOI(複数可)中に所定の突然変異(複数可)を含む標的配列を含むPCR増幅産物を検出し、これにより該突然変異を含む工程h)下で二次サブプールを同定する工程と;
j)該突然変異(複数可)を保有する該二次サブプール内の生物、またはその生殖部分(複数可)を同定する工程と、を含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
標的配列において、対象のヌクレオチド(複数可)[NOI(複数可)]中に1つ以上の所定の突然変異(複数可)を保有している定義済みの種の生物の同定方法であって、
a)複数の遺伝子型を表す、前記種の生物、またはその生殖部分のプールを提供する工程と、
b)前記プールを、生物、またはその生殖部分の1つ以上のサブプールに分割する工程と、
c)前記サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、サブプール内の各遺伝子型から、それぞれゲノムDNA(gDNA)を含む、gDNA試料を調製する工程と、
d)それぞれが1つのサブプールからの前記gDNA試料を含む、複数のPCR増幅を実施し、これにより前記標的配列(複数可)を増幅させる工程であって、各PCR増幅が、それぞれが前記gDNA試料の一部、各セットが標的配列に隣接するプライマーの1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬を含む複数の区画化PCR増幅を含む、前記工程と、
e)前記NOI(複数可)において前記突然変異(複数可)を含む1つ以上の標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、前記突然変異(複数可)を含むサブプール(複数可)を同定する工程と、
f)前記同定したサブプールの前記生物、またはその生殖部分を、二次サブプールに分割する工程と、
g)二次サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、それぞれが前記二次サブプール内の各遺伝子型からのgDNAを含むgDNA試料を調製する工程と、
h)それぞれが1つの二次サブプールからの前記gDNA試料、各セットが標的配列に隣接するプライマーの1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬を含む複数のPCR増幅を実施し、これにより前記標的配列(複数可)を増幅する工程と、
i)前記NOI(複数可)において前記所定の突然変異(複数可)を含む1つ以上の標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物を検出し、これにより前記突然変異(複数可)を含む工程i)下にある二次サブプールを同定する工程と、
j)前記突然変異(複数可)を保有している前記二次サブプール内の生物またはその生殖部分を同定する工程と、を含む、前記方法。
(項目2)
工程d)の前記PCR増幅(複数可)が、以下の:
-前記gDNA試料、各セットが標的配列に隣接するプライマーの1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬を含む1つ以上のPCR増幅を準備する工程と、
-前記PCR増幅(複数可)を複数の空間的に分離された区画に区分化する工程と、
-PCR増幅(複数可)を実施する工程と、
-PCR増幅産物を検出する工程と、を含む方法によって実施される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記空間的に分離された区画が、水-油エマルジョン液滴などの液滴である、項目2に記載の方法。
(項目4)
各液滴が、0.1~10nLの範囲の平均容積を有する、項目3に記載の方法。
(項目5)
各PCRが、1000~100,000個の範囲の空間的に分離された区画に区画化される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記PCR試薬が、1つ以上の突然変異検出プローブを含み、各突然変異検出プローブ(複数可)が、検出可能な手段に任意に連結したオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記NOIの所定の突然変異を含む標的配列に同一であるか、または相補的である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記PCR試薬が、1つ以上の参照検出プローブ(複数可)を含み、各参照検出プローブ(複数可)が、検出可能な手段に任意に連結したオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、参照NOIを含む標的配列に同一であるか、または相補的である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記突然変異体検出プローブ(複数可)が、フルオロフォア及びクエンチャーに連結されており、前記参照検出プローブが、異なるフルオロフォア及びクエンチャーに連結されている、項目5及び6のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記PCR試薬が、前記参照検出プローブ(複数可)を超えて、少なくとも2倍過剰の前記突然変異体検出プローブ(複数可)を含む、項目7に記載の方法。
(項目10)
前記生物のプールが、前記種の前記生物、またはその生殖部分を、ランダム突然変異誘発にかけることによって調製される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記生物プールが、異なる遺伝子型を有する、少なくとも10,000、好ましくは少なくとも100,000、さらにより好ましくは少なくとも500,000の生物、またはその生殖部分を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記方法が、前記プール内の生物、またはその生殖部分の複製の工程を含み、前記生殖の工程が、前記生物をサブプールに分割する工程b)と同時に、またはそれに続いて実施されてもよい、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記種が、植物であり、前記方法の工程a)及びb)が、
-植物の複数の種子を提供する工程と、
-前記種子をランダム突然変異誘発にかけて、これにより、M0世代の種子を得る工程と、
-前記M0世代の種子を成熟植物に生育させて、前記成熟植物から種子を得る工程であって、前記種子がM1世代の種子である、前記工程と、
-任意に、先の工程をX回繰り返し、M(1+X)世代の種子を含む植物を得る工程と、-前記成熟植物からM1世代またはM(1+X)のいずれかの種子を得て、これにより種子のプールを得る工程と、
-様々な工程の前記プールをサブプールに分割する工程であって、所与の成熟植物からの全ての種子が、同じサブプール中に配置される、前記工程と、を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
少なくとも100,000個の、例えば少なくとも500,000個の種子が提供される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記種が、単細胞生物であり、前記方法の工程a)及びb)が、
-複数の単細胞生物を提供する工程と、
-前記生物をランダム突然変異誘発にかける工程と、
-前記突然変異誘発された生物をサブプールに分割する工程と、
-各サブプールを複製の工程にかける工程と、を含む、項目1~12のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
1つ以上のサブプール(複数可)が、それぞれが少なくとも10個、好ましくは少なくとも90個の二次サブプールに分けられた状態で、前記突然変異を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記種が、単細胞種であり、工程f)が、以下の:
-1つまたはいくつかのNOI(複数可)において前記突然変異(複数可)を含むサブプールを提供する工程と、
-前記サブプールの前記生物の一部または全てをクローン方式で複製して、クローン培養を得る工程と、
-複数の前記クローン培養からの生物の分画を組み合わせて、二次サブプールを得る工程と、を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
各二次サブプールが、10~100個のクローン培養の範囲の分画を含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記種が、植物であり、工程f)及びg)が、以下の:
-植物の複数の種子を含むサブプールを提供する工程であって、前記サブプールが、前記NOI(複数可)の1つまたはいくつかの突然変異(複数可)を含む、前記工程と、
-前記サブプールの前記種子を、それぞれが1~100個の範囲の種子を含む二次サブプールに分割する工程と、
-植物に生育するのに十分に完全な状態で前記種子を保つ方法で、前記二次サブプールの各種子から試料を得て、各二次サブプールの全ての種子からの全ての試料を組み合わせる工程と、
-gDNA試料を前記組み合わせた試料から調製する工程と、を含む、項目1~14のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記試料が、前記種子に穴をあけて、その後得られた細粉を収集することによって得られる、項目19に記載の方法。
(項目21)
工程h)の前記PCR増幅(複数可)が、複数の区画化PCR増幅を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
工程h)の前記PCR増幅(複数可)が、項目2~5のいずれか一項に定義されたものである、項目20に記載の方法。
(項目23)
前記種が、単細胞種であり、前記生物を同定する工程j)が、
-前記NOIにおいて前記突然変異を含む二次サブプールを提供する工程と、
-前記サブプールの前記生物の一部または全てを、クローン方式で複製する工程と、
-どのクローン(複数可)が前記NOIにおいて前記突然変異を含む生物を含むかを決定する工程と、を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記種が植物であり、前記生物を同定する工程j)が、
-前記NOIにおいて前記突然変異を含む、生物、またはその生殖部分を含む二次サブプールを提供する工程と、
-前記二次サブプール内の全ての種子を栽培して発芽を可能にし、任意に各種子から植物を発育させる工程と、
-各発芽した種子から試料を得る工程と、
-前記試料を、前記NOIにおける前記突然変異の存在について試験し、これにより、前記NOIにおいて前記突然変異を保有する植物を同定する工程と、
-任意に前記植物を成熟まで生育させる工程と、を含む、項目1~14及び19~22のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記方法が、前記NOI(複数可)において1つ以上の突然変異(複数可)を含むスーパープールを同定する工程をさらに含み、前記スーパープールが、サブプールの一群である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記方法が、工程c)の後に実施される以下の:
-各サブプールからの各gDNA試料の分画を得る工程と、
-複数の分画をスーパープール中に組み合わせて、これにより、複数のサブプールからのgDNA試料を含むgDNAスーパープールを得る工程であって、各サブプールからのgDNAが、1つのスーパープール中にのみ存在する、前記工程と、
-それぞれがgDNA試料のスーパープールを含む複数のPCR増幅を実施して、これにより前記標的配列(複数可)を増幅する工程であって、各PCR増幅が、それぞれが前記gDNA試料の一部、各セットが標的配列に隣接するプライマーの1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬を含む複数の区画化PCR増幅を含む、前記工程と、
-前記NOI(複数可)における前記突然変異(複数可)を含む1つ以上の標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、前記突然変異を含むスーパープール(複数可)を同定する工程と、をさらに含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記方法が、前記区画化PCRを実施する前に実施される前記gDNAスーパープールの富化の工程をさらに含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記富化の工程が、gDNAスーパープールでPCR増幅を実施することを含み、各PCR増幅が、前記標的配列に隣接するプライマーのセット、ブロッキングプローブ及びPCR試薬を含み、前記ブロッキングプローブが、前記参照NOIを含む前記標的配列の増幅を阻害するように設計されている、項目27に記載の方法。
(項目29)
PCR増幅を実施する工程d)が、前記突然変異(複数可)のうちの1つを含むサブプール(複数可)からのgDNAの試料でのみ実施される、項目25~28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
5~100個の範囲のスーパープールが調製される、項目25~29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
gDNA試料のスーパープールを含む前記PCR増幅(複数可)が、以下の:
-前記gDNA試料、各セットが標的配列に隣接するプライマー(複数可)の1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬を含むPCR増幅を準備する工程と、
-前記PCR増幅(複数可)を複数の空間的に分離された区画に区分化する工程であって、各区画が、0.1~10pLの範囲の平均容積を有する、前記工程と、
-PCR増幅を実施する工程と、
-PCR増幅産物を検出する工程と、を含む方法によって実施される、項目26~30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
各PCRが、空間的に分離された区画などの少なくとも1,000,000個の区画に区画化される、項目25~31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記空間的に分離された区画が、水-油エマルジョン液滴などの液滴である、項目31~32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記種が、単細胞生物、例えば酵母である、項目1~12、15~18、21~34のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記種が、植物、例えば顕花植物である、項目1~14、14、17~20、及び23~28のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記種が、穀物、例えばオオムギである、項目1~12、16、19~22、及び24~34のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記突然変異が、単一ヌクレオチドの置換である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記方法が、2つ以上の所定の突然変異の同定する方法である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記PCR試薬が、各所定の突然変異に特異的な、1つの突然変異体検出プローブを含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記方法が、標的配列における1つの所定の突然変異を同定する方法であり、前記方法が、前記標的配列に隣接するプライマーの1つのセットのみを使用する、項目1~37のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記PCR試薬が、1つのみの突然変異検出プローブを含む、項目40に記載の方法。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子の特定のバージョンまたは状態を指す。本明細書で使用される場合、「変異対立遺伝子」は、NOI(複数可)中に1つ以上の所定の突然変異(複数可)を有する遺伝子を指す。突然変異が遺伝子全体の欠失であるとき、変異対立遺伝子は該遺伝子を欠く対立遺伝子であり得る。
本発明は、定義済みの種の生物、例えば、標的配列中のNOI中に突然変異[例えば、以下の「対象のヌクレオチド(複数可)」のセクションに記載されている突然変異のいずれか]を保有する、「種」のセクションで以下に記載される種のいずれかを同定するための方法に関し、該方法は、
a.複数の遺伝子型を表す、特定の定義済みの種の生物、またはその生殖部分のプール、例えば、以下の「生物のプール」のセクションで本明細書に記載されるプールのうちのいずれかを提供する工程と;
b.該プールを、生物またはその生殖部分の1つ以上のサブプール、例えば、以下の「プールのサブプールへの分割」セクションにおいて本明細書に記載されるサブプールに分割する工程と;
c.該サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖の可能性を維持しながら、それぞれがサブプール内の各遺伝子型からのgDNAを含む、gDNA試料を調製する工程であって、これが、例えば、以下の「DNA試料の調製」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実施されてもよい、工程と;
d.それぞれが1つのサブプールからのgDNA試料を含む複数のPCR増幅を実施し、これにより標的配列を増幅させる工程であって、各PCR増幅が、それぞれ該gDNA試料の一部、標的配列に隣接するプライマーの1つのセット、及びPCR試薬を含む複数の区画化されたPCR増幅を含み、これが、例えば、以下の「複数の区画化されたPCR増幅を含むPCR増幅」のセクションにおいて本明細書に記載されるように行われてもよい、工程と;
e.NOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含む標的配列を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより該突然変異を含むサブプール(複数可)を同定する工程であって、これが、例えば、以下の「PCR増幅産物(複数可)の検出」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実行されてもよい、工程と;
f.該同定されたサブプールの生物、またはその生殖部分を、二次サブプールに分割する工程であって、「サブプールの二次サブプールへの分割」のセクションにおいて記載される、工程と;
g.該二次サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖の可能性を維持しながら、それぞれが二次サブプール内の各遺伝子型からのゲノムDNAを含むgDNA試料を調製する工程であって、これが、例えば、「DNA試料の調製」セクションにおいて記載されるように実施されてもよい、工程と;
h.それぞれが1つの二次サブプールからのgDNA試料、標的配列に隣接するプライマーの1つのセット、及びPCR試薬を含む、複数のPCR増幅を実施し、これにより標的配列を増幅する工程であって、これが、例えば、「二次サブプールの同定」のセクションにおいて記載されるように実施されてもよい、工程と;
i.NOI(複数可)中に所定の突然変異(複数可)を含む標的配列を含むPCR増幅(複数可)を検出し、これにより該突然変異を含む二次サブプールを同定する工程であって、これが、例えば、「二次サブプールの同定」のセクションにおいて記載されるように実施されてもよい、工程と;
j.該突然変異を保有する該二次サブプール内の生物を同定する工程であって、これが、例えば、「生物の同定」のセクションに記載されるように実施されてもよい、工程と、を含む。
工程b.は、例えば、本明細書のWS2に記載されるように実施されてもよい。
工程c.、d.、及びe.は、例えば、本明細書のWS3に記載されるように実施されてもよい。
工程f.、g.、h.、i.及びj.は、例えば、本明細書のWS4に記載されるように実施されてもよい。
-図2Aは、種がオオムギである、本発明の実施形態におけるWS1の特定の例に関する。本図は、本明細書でWS1に詳述されるように、変異オオムギ穀粒の繁殖を図示している。
-図2Bは、本明細書でWS2に詳述されるように、変異穀粒の整列されたライブラリーを作製する態様の例を示す(実施例1及び実施例2を参照されたい)。
-図2Cは、本明細書でWS3に詳述されているように、「穀粒総」分画にNOI中に突然変異に特徴づけられる穀粒(複数可)が含まれているかどうかを決定する方法の要約の例を提供する。(実施例3~実施例7を参照されたい)
-図2Dは、WS4の例、すなわち、本明細書で工程4に詳述されるように、図2Cを参照されたいが、NOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含有する穀粒を含有することが以前に示された該分画を有する「穀物総」分画中のどの穀粒(複数可)がNOI(複数可)中に突然変異を有するかを決定する手順を強調する(実施例8~実施例15を参照されたい)。
-図2Eは、区画化PCR技術(例えば、ddPCR)をNOI中にそれに対応する突然変異を含む、gDNAのそれらの「スーパープール」、すなわち、gDNA試料の組み合わせアリコート(実施例17)を決定するために利用する、WS5における手順の概要の例を表す。
本発明は、対象の1つ以上のヌクレオチドにおいて突然変異(複数可)を保有する1つ以上の生物(複数可)を同定するための方法に関する。特に、本方法は、NOI(複数可)中に1つ以上の所定の突然変異(複数可)を保有する生物(複数可)の同定を可能にする。したがって、本方法は、非GM法になお依拠しながら、特定の突然変異を有する生物の同定を可能にする。
本発明の方法は、所定の種の生物の同定を含む。種は、多細胞生物及び単細胞生物の両方を含む、任意の種であり得る。例えば、種は、Open Tree of Lifeに含有される種、例えば、2015年10月12日に製造されたThe Open Tree of Life参照分類バージョン2.9ドラフト12であってもよい。
本発明の方法は、複数の遺伝子型を表す所与の種の生物のプールを提供することを含む。該種は、例えば、「種」のセクションで上記に記載された種のいずれかであり得る。
本発明の方法は、生物のプールを1つ以上のサブプールに分割する工程を含み、ここで、各サブプールは、複数の生物、またはその生殖部分を含む。好ましくは、各サブプールは、複数の遺伝子型を表す複数の生物、またはその生殖部分を含む。
-突然変異誘発後、各単細胞生物は、単細胞生物がクローン培養に発育するように、別々の方法で繁殖させることができる。これは、固体培地上の各クローンのコロニーを培養することによって、または液体培地を用いて別々の空間、例えば、チューブまたはウェル中で各クローンを培養することによって行うことができる。サブプールは、複数のクローンからの単細胞生物を組み合わせることによって形成することができる。
-単細胞生物は突然変異誘発の直後にサブプールに分割されて得、各サブプールは生殖が可能にされ得る。
-複数の単細胞生物(例えば、酵母)を提供する工程と;
-前記生物をランダム突然変異誘発にかける工程と;
-突然変異誘発された生物をサブプールに分割する工程と;
-各サブプールを生殖工程にかける工程と、を含み得る。
-植物の複数の種子、例えば、穀類を提供する工程と;
-該種子を突然変異誘発させ、これによりM0世代の種子を得る工程と;
-M0世代の該種子を成熟植物に成長させて、該成熟植物から種子を得る工程であって、該種子がM1世代の種子である、工程と;
-任意に先の工程をX回繰り返して、M(1+X世代)の種子を含む植物を得る工程と;
-該成熟植物からM1またはM(1+X)世代のいずれかの種子を取得し、これにより種子のプール(例えば、穀粒のプール)を得る工程と;
-該プールをサブプールに分割する工程であって、所与の成熟植物からの全ての種子(例えば、穀粒)が、同じサブプールに配置される、工程と、を含む。
-複数の植物種子(例えば、穀物粒)を提供する工程と;
-該種子を突然変異誘発させ、これによりM0世代の種子を得る工程と;
-任意に、M0世代の種子を成熟した植物に栽培し、該成熟植物から種子を得る工程であって、該種子が、M1世代の種子である、工程と;
-任意に、先の工程をX回繰り返して、M(1+X)世代の種子を含む植物を得る工程と;
-M0、M1またはM(1+X)世代の種子を別個の畑区画において、成熟植物まで栽培する工程であって、該成熟植物の種子が、種子のプールを構成する、工程と;
-該領域を畑サブ区画に分割する工程と;
-1つの畑サブ区画内の全ての植物の全ての種子を収穫し、これにより、「穀粒の合計」と称されてもよい(図2Bを参照)、種子のサブプール(例えば、穀物粒のサブプール)を得る工程と、を含むことができる。
本発明の方法は、生物、またはその生殖部分のプールをサブプールに分割する工程を含む。これは、NOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含む、生物、またはその生殖部分を含むサブプールを同定する工程を伴う。
a)それぞれが1つのサブプール内の各遺伝子型からのgDNAを含むgDNA試料を調製する工程であって、これが、例えば、以下の「DNA試料の調製」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実施されてもよい、工程と;
b)それぞれが複数の区画化されたPCR増幅を含む、複数のPCR増幅を実施する工程であって、例えば、以下の「複数の区画化されたPCR増幅を含むPCR増幅」のセクションにおいて本明細書で記載されるように行われる、工程と;
c)対象のNOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、該サブプール(複数可)を同定する工程であって、例えば、以下の「PCR増幅産物(複数可)の検出」のセクションにおいて本明細書で記載されるように行われる、工程と、を含むことができる
-サブプールを提供する工程と;
-該サブプールの一部から試料を調製する工程と;
-該試料からgDNA試料を調製する工程と;
-例えば、プレート、例えばマイクロタイタープレートの個々のウェル中のサブプールの全てからの個々のgDNA試料の全てを含むPCR増幅を準備する工程と;
-NOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含むこれら試料を選択する工程と、を強調している。
本発明の方法は、DNA試料、特にgDNA試料を調製する1つ以上の工程を含む。特に、本方法は、サブプールからgDNA試料を調製する1つの工程と、二次サブプールからgDNA試料を調製する1つの工程とを含み得る。本方法はまた、スーパープールからgDNA試料を調製する工程を含み得る。
本発明の方法は、それぞれが1つのサブプールからのgDNA試料を含む複数のPCR増幅を実施し、(例えば、上記のセクションに記載されるように調製される)これにより標的配列を増幅する工程を含む。各PCR増幅は、該gDNA試料の一部、標的配列に隣接する1つ以上のプライマーセット(複数可)、及びPCR試薬をそれぞれ含む複数の区画化されたPCR増幅を含み得る。
-gDNA試料、標的配列に隣接するプライマーのセット及びPCR試薬を含むdPCR増幅を準備する工程と;
-試料中の核酸分子が局在化され、複数の空間的に分離された区画内に濃縮されるように、該dPCR増幅を分配する工程と;
-dPCR増幅を実施する工程と;
-dPCRに基づく増幅産物を検出する工程と、含む方法で調製される。
本方法は、いくつかのPCR増幅を実施することを包含し、ここで、これらのPCRの少なくともいくつかは、複数の区画化されたPCR増幅を含み得る。
本発明の方法は、標的配列に隣接する1つ以上のプライマーセット(複数可)の使用を含む。標的配列に隣接する別個の「プライマーのセット」は、標的配列の5’末端と同一の配列を含む1つのプライマー(「フォワードプライマー」とも称される)、及び標的配列の3’末端に相補的な配列を含む1つのプライマー(「リバースプライマー」とも称される)を含む。プライマーセットは、該標的配列の増幅を可能にする条件下で、標的配列及びPCR試薬を含む核酸と共にPCRに添加されたときに標的配列を増幅することができる。本発明の異なる工程のPCR増幅のために異なるプライマーのセットが使用されることもまた可能であるが、同じプライマーセットを本発明による方法の全てのPCR増幅に使用され得る。
本発明の方法は、対象のNOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含む標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出する少なくとも2つの工程を含む。PCR増幅産物(複数可)は、任意の有用な手段によって検出され得る。
-Clegg,Meth.Enzymol.,211:353-388(1992);Wo et al.,Anal.Biochem.,218:1-13(1994);Pesce et al.,editors,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971);White et al.,Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970);など;
-文献には、レポーター-クエンチャー対を選択するための、蛍光分子及び発色分子の網羅的なリスト及びそれらに関連する光学的特性を提供する参考文献、例えば、Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd Edition(Academic Press,New York,1971);Griffiths,Colour and Constitution of Organic Molecules(Academic Press,New York,1976);Bishop,editor,Indicators(Pergamon Press,Oxford,1972);Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes,Eugene,1992)Pringsheim,Fluorescence and Phosphorescence(Interscience Publishers,New York,1949);などが挙げられる。
-さらに、以下の参考文献に例示されるように、オリゴヌクレオチドに添加することができる共通の反応基を介した共有結合のためのレポーター分子及びクエンチャー分子を誘導体化するための文献には広範な指針がある。Haugland(上記引用);Ullmanら、米国特許第3,996,345号;Khannaら、米国特許第4,351,760号;などである。
1)分画存在量の増加、及び/または;
2)突然変異体液滴の濃度の増加、及び/または;
3)平均よりも50%以上のスケールで突然変異体イベントの数の増加
によって特徴付けられるならば、NOI中に突然変異を含む標的DNAを含有すると仮定され得る。
NOI中に突然変異を保有する生物、またはその生殖部分を含むサブプールが一旦同定されると、次いで、本発明の方法は、該サブプールを複数の二次サブプールに分割するステップを含む。
-NOI中に突然変異を含むサブプールの同定後、該サブプールの各単細胞生物は、単細胞生物のそれぞれがクローン性培養物を生じるように、別々の方法で繁殖させることができる。これは、固体培地上の各クローンのコロニーを培養することによって、または液体培地、例えば、マイクロチューブまたはマイクロタイタープレートのウェル中の別個の空間で各クローンを培養することによって行うことができる。二次サブプールは、複数のクローンからの単細胞生物を組み合わせることによって形成され得る。
-単細胞生物は、対象のサブプールの同定直後に二次サブプールに分割さてもよく、各二次サブプールは生殖が可能であってもよい。
i)NOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含むサブプールを提供する工程と;
ii)クローン様式で該サブプールのいくつか、または全ての生物を繁殖させて、クローン性培養物を得る工程と;
iii)複数の該クローン性培養物からの生物の分画を組み合わせて、二次サブプールを得る工程と、によって調製される。
-植物の複数の種子、例えば、穀粒を含むサブプールを提供する工程であって、該サブプールがNOI中に突然変異を含む、工程。
-該サブプールの種子を、それぞれが少なくとも1つの種子、例えば、1~100個の種子を含む二次サブプールに分割する工程。
-二次サブプールの各種子から試料を、これらを植物に成長させるために十分に無傷なままにする様式で取得し、各二次サブプールの全ての種子からの全ての試料を組み合わせる工程。
-該組み合わされた試料からgDNA試料を調製する工程。
発明の方法は、NOI(複数可)中に1つ以上の突然変異(複数可)を含む、生物のサブプールまたはその生殖部分を二次サブプールに分割し、続いて、NOI(複数可)によって特定される突然変異(複数可)を含む生物、またはその生殖部分を含む二次サブプールを同定する工程を含む。
a)それぞれが1つの二次サブプール内の各遺伝子型からのgDNAを含む、gDNA試料を調製する工程であって、これは、例えば、上記「DNA試料の調製」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実施されてもよい、工程と;
b)標的配列を増幅するために複数のPCR増幅を実施する工程と;
c)NOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、該二次サブプール(複数可)を同定する工程であって、これは、例えば、以下の「PCR増幅産物(複数可)の検出」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実施されてもよい、工程と、を含むことができる。
-二次サブプールを提供する工程と;
-該二次サブプールの一部から試料を調製する工程と;
-該試料からgDNA試料を調製する工程と;
-全ての二次サブプール、例えば、プレート、例えばマイクロタイタープレートにおける個々のウェル中からの全ての個々のgDNA試料でPCR増幅を準備する工程と;
-NOI(複数可)中に突然変異を含む標的配列の存在を検出する工程と、を示している。
一旦生物、またはその生殖部分を含む二次サブプールが同定されると、本方法は、NOI(複数可)の突然変異(複数可)を含む生物の同定を含む。
i)NOI中に突然変異を含む二次サブプールを提供する工程と;
ii)該サブプールの生物の一部または全てをクローン様式で生殖する工程と;
iii)NOI中に突然変異を含む生物を含むクローンを決定する工程と、含むことができる。
A.NOI(複数可)中に突然変異(複数可)を含む、生物、またはその生殖部位を含む二次サブプールを同定する工程と;
B.該二次サブプール内の全ての種子を栽培して発芽させ、任意に各種子から植物を発育させる工程と;
C.各発芽した種子から試料を得る工程と;
D.NOI(複数可)中の該突然変異(複数可)の存在について該試料を試験し、これによって、NOI(複数可)中に突然変異(複数可)を保有する1つの植物を同定する工程であって、該試験が、任意の方法、例えば、該試料からgDNA試料を調製し、本明細書で上記に記載されるようにPCR増幅を実施することによって実施されてもよい、工程と、を含むことができる。
本発明の一実施形態では、本方法は、NOI(複数可)において突然変異(複数可)を含む、本明細書でスーパープールとも称されるサブプールの群を同定する工程を含む。この方法において、非常に多数の可能性のある生物、またはその生殖部分を、NOI(複数可)における突然変異(複数可)の存在についてスクリーニングすることができる。該工程は、好ましくは、プールをサブプールに分割し、gDNA試料をサブプールから調製した後に、例えば、本発明の方法の工程c)の後に実施される。
-各サブプールからの各gDNA試料の分画を得る工程と、
-複数のサブプール分画をスーパープール中に組み合わせて、これにより、複数のサブプールのgDNAを含むスーパープールのgDNA試料を得る工程と、
-それぞれがスーパープールのgDNA試料を含む複数のPCR増幅を実施して、これにより標的配列を増幅する工程であって、各PCR増幅が、それぞれが該gDNA試料の一部、標的配列に隣接するプライマーのセット及びPCR試薬を含む複数の区画化PCR増幅を含み、該PCRが、例えば、以下の「スーパープールでのPCR増幅」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実施することができる、工程と、
-NOI(複数可)における突然変異(複数可)を含む標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、該突然変異(複数可)を含むスーパープール(複数可)を同定する工程であって、該検出の工程が、例えば、上記の「PCR産物の検出」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実施することができる、工程と、を含むことができる。
-上記記載のように、複数のサブプールのgDNAを含むスーパープールのgDNA試料を提供する工程と、
-それぞれがスーパープールのgDNA試料を含むPCR増幅を実施する工程であって、各PCR増幅が、標的配列に隣接するプライマーのセット、ブロッキングプローブ及びPCR試薬を含む、工程と、を含むことができる。
・DNAポリメラーゼによって3’末端で伸長され得ない;
・NOIの所定の突然変異を含む標的配列よりも参照NOIを含む標的配列またはその相補的配列に優先的に結合する、オリゴヌクレオチドであり得る。
-サブプールが、各遺伝子型のわずか数種の、例えば1種の生物のみ、またはその生殖部分を含むならば、このときは、該サブプールが、複製の工程を受けてもよい工程と、
-サブプール内の各遺伝子型を代表する、各サブプールの分画を調製する工程であって、サブプールの残りの部分もまた、サブプール内の各遺伝子型を代表する、工程と、
-複数の分画をスーパープールに組み合わせて、これにより、複数のサブプールからの生物、またはその生殖部分を含むスーパープールを得る工程であって、生物、またはその生殖部分が、1つのスーパープール内にのみ存在する、工程と、
-それぞれがスーパープール内の各遺伝子型からのgDNAを含むgDNA試料を調製する工程であって、これが、例えば、上記「DNA試料の調製」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実施されてもよい、工程と;
-それぞれがスーパープールのgDNA試料を含む複数のPCR増幅を実施して、これにより標的配列を増幅する工程であって、各PCR増幅が、それぞれが該gDNA試料の一部、標的配列に隣接するプライマーのセット及びPCR試薬を含む複数の区画化PCR増幅を含み、該PCRが、例えば、以下の「スーパープールでのPCR増幅」のセクションにおいて本明細書に記載されるように実施されてもよい、工程と;
-NOI(複数可)において突然変異(複数可)を含む標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、該突然変異(複数可)を含むスーパープール(複数可)を同定する工程と、を含むことができる。
本発明の方法は、それぞれが、例えば上記セクションにおいて記載されるように調製された1つのスーパープールからのgDNA試料を含む、複数のPCR増幅を実施し、これにより、標的配列を増幅する工程を含み、各PCR増幅は、それぞれが該gDNA試料の一部、標的配列に隣接するプライマーのセット及びPCR試薬を含む、複数の区画化PCR増幅を含む。
-区画化PCR増幅は、上記記載のように、液滴中に含まれ得る。スーパープールでのPCR増幅については、高感度が重要であるが、一方サブプールでのPCR増幅はより低い感度を必要とする。大量の試薬が、通常、高感度を用いるPCR増幅には必要とされるのに対して、低感度を用いるPCR増幅は、より少量の試薬を必要とする。これにより、スーパープールでのPCR増幅が、少なくとも200,000個内の、より好ましくは少なくとも250,000個の参照NOI内の1つまたは数個の突然変異体NOI(複数可)を検出するための感度を有することが好ましい。
-スーパープールでのPCR増幅については、各液滴が、非常に小さい容積、例えば、pLサイズの容積を有することが好ましい場合がある。したがって、液滴が、平均で0.1~10pLの範囲の容積を有することが好ましい。
-各PCR増幅は、任意の好適な数の区画に区画化することができる。しかしながら、1つの好ましい実施形態では、各PCR増幅は、200,000~100,000,000個の範囲の区画(例えば、液滴)に区画化される。例えば、各PCR増幅は、500,000~50,000,000個の範囲の区画(例えば、液滴)に区画化されてもよく、例えば、各PCR増幅は、1,000,000~10,000,000個の範囲の区画(例えば、液滴)に区画化されてもよい。各PCR増幅が、少なくとも1,000,000個、好ましくは、少なくとも3,000,000個、さらにより好ましくは、少なくとも5,000,000個、例えば少なくとも7,000,000個の区画(例えば、液滴)に区画化されることが好ましい場合がある。
-場合によっては、液滴は、PCR増幅産物(複数可)を検出するために使用することもできるシステムである、Raindance TechnologiesからのRainDrop Digital PCRシステムなどの市販の液滴発生器を用いて生成される。
本明細書に記載の方法は、区画化PCR増幅を含むPCR増幅、例えば、「複数の区画化PCR増幅を含むPCR増幅」のセクションにおいて、または「スーパープールでのPCR増幅」のセクションにおいて記載されるPCR増幅を実施する多段階の工程を含む。
1)gDNA試料、標的配列に隣接するプライマーのセット、及びPCR試薬を含むPCR増幅を準備する工程と;
2)PCR増幅を実施する工程であって、通常、
-PCR増幅を変性温度で、例えば85~100℃の範囲で、例えば、90~98℃の範囲で、二本鎖DNAを変性させるのに十分な時間、例えば、15~30分の範囲にわたって、例えば、30秒~5分の範囲でインキュベートする、工程;
-複数のサイクル、例えば、10~60サイクルの範囲、例えば20~40サイクルの範囲を実施する工程であって、下記の工程:
-プライマーと標的DNAとの間のアニーリングを可能にするための、例えば15秒~2分の範囲の、例えば30秒~1分の範囲のアニーリング温度でのインキュベーション(通常、アニ―リング温度は、プライマーの融解温度と同様であるか、またはこれよりも低く、例えば、45~75℃の範囲の温度であろう。アニーリング温度でのインキュベーションは、プライマーの伸長を可能にする)と;
-任意に、核酸ポリメラーゼが活性を有する伸長温度で、例えば、55~75℃の範囲の温度で、15秒~2分の範囲、例えば30秒~1分の範囲でのインキュベーションと;
-変性温度での、例えば85~100℃の範囲の、または90~98℃の範囲の温度での、15秒~2分の範囲の、例えば30秒~1分の範囲でのインキュベーションと;
-DNAポリメラーゼの伸長温度、例えば、55~98℃の範囲での、例えば15秒~20分の範囲の、例えば1~15分の範囲でのインキュベーションと、を含む、工程、を含む、工程と、を含む。
一実施形態では、本発明は、グルタミンシンセターゼ1をコードする遺伝子、特にアイソフォーム3(GS1-3)中に突然変異を保有するオオムギ植物に関する。該遺伝子はまた、HvGS1-3遺伝子と称されてもよく、そのタンパク質コード配列は、本明細書では配列番号1として提供されており、一方コードされたHvGS1-3酵素のアミノ酸配列は、配列番号2として提供されている。
i アンモニウムの縮合を触媒することと;
ii アンモニア及びグルタミン酸のグルタミンへの縮合を触媒することと;
iii グルタミン酸、ヒドロキシルアミン、及びATPからのグルタミルヒドロキサメートの合成を触媒すること。
i.実施形態1~3のいずれか1つに記載のオオムギ植物の穀粒を提供する工程と、
ii.任意に、前記穀粒の少なくとも一部を麦芽製造し、これにより麦芽を得る工程と、
iii.前記オオムギ及び/または前記オオムギ麦芽の抽出物を調製する工程と、
iv.前記抽出物を飲料に加工する工程と、を含む、前記方法。
一実施形態では、本発明は、Aゲノム上のGASR7をコードする遺伝子中に突然変異を保有するコムギ植物に関する。該遺伝子はまたTaGASR7-A1とも称され、この配列は、番号NCBI:KJ000052でGenBankにおいて入手可能であり、コード配列は、本明細書で配列番号25として提供されている。GASR7のアミノ酸配列は、配列番号8として提供されている。
一実施形態では、本発明は、HvGS1-遺伝子中に突然変異を保有するオオムギ植物、例えば、上記「GS1-3遺伝子中に突然変異を保有するオオムギ植物」のセクションにおいて本明細書に記載のオオムギ植物のいずれかの植物性産物に関する。植物性産物は、植物それ自体またはその一部であってもよい。例えば、植物性産物は、オオムギ穀粒であってもよい。
-穀物粒、例えば、オオムギ穀粒を浸漬する工程と、
-穀物粒を発芽させる工程と、
-該発芽させた穀物粒を、例えば、高温でキルン乾燥することによって、乾燥させる工程と、を含む方法によって調製することができる。
一実施形態では、本発明は、飲料の製造方法に関する。このような方法は、
-HvGS1-3遺伝子中に突然変異、例えば、上記「GS1-3遺伝子中に突然変異を保有するオオムギ植物」のセクションにおいて本明細書で記載された突然変異のいずれかを保有するオオムギ植物を提供する工程と;
-該植物またはその部分の水性抽出物を調製する工程と;
-任意に、該水性抽出物を飲料にさらに加工する工程と、を含むことができる。
a)HvGS1-3をコードする遺伝子中に突然変異、例えば、上記「GS1-3遺伝子中に突然変異を保有するオオムギ植物」のセクションにおいて本明細書で記載された突然変異のいずれかを保有するオオムギ植物の穀粒を提供する工程と、
b)任意に、該穀粒の少なくとも一部の麦芽組成物を調製して、これにより麦芽組成物を得る工程と;
c)該オオムギ及び/または麦芽組成物の水性抽出物を調製する工程と;
d)該抽出物を飲料に加工する工程と、を含む。
d-i)抽出物を加熱する(例えば、追加の成分(複数可)、例えばホップの存在下で)工程と;
d-ii)加熱した抽出物、または加熱した麦汁を、酵母の存在下で発酵させる工程と;
d-iii)任意に、1つ以上の追加の成分(複数可)を添加し、これによりビールを製造する工程と、を含むことができる。
i.麦汁を提供する工程と、
ii.前記麦汁を、実施形態10~11のいずれか1つに記載の酵母によって発酵させる工程と、
iii.任意に、前記発酵させた麦汁を飲料に加工する工程と、を含む、前記方法。
本発明は、WSの説明及び実施例によって例示され、これらは本発明を限定するものとして考えられるべきではない。別途指示がない限り、基本的な生化学的手法及び分子生物学的手法を、核酸、タンパク質(酵素を含む)、及び生物の取り扱いで利用した。
工程1.1:突然変異誘発の手順
突然変異を誘発させるために、オオムギ植物から収集した穀粒を、Kleinhofら(1978)及びK.Breddamらへの米国特許第7,838,053号によるもの療法で提供される詳細に従って、NaN3突然変異原の溶液中でインキュベートした。この手順は、典型的には、タンパク質をコードするDNAのアミノ酸置換または翻訳停止についてのランダムに分布されたコドンを付与する、すなわち、突然変異誘発されたDNAによってコードされるタンパク質におけるタンパク質変化及び短縮につながる、オオムギ穀粒のgDNA中に点突然変異を誘発させる。しかしながら、本発明の方法は、非タンパク質コード領域、例えば、プロモーター、ターミネーター及びイントロンのgDNAにおける点突然変異を有する穀物植物の産生にも有用である。
工程2.1:穀物植物の収穫、穂の脱穀
畑の各7.5m2の「畑区画」(FP#01、FP#02など、図2Bを参照)を、各々が0.45m2の大きさで、約300個の個々の植物を含有する、多数の「畑サブ区画」(FSP#01、FSP#02など、図2Bの1で表示された動作)に分割した。1つのサブ区画中の全ての穂を、鎌を用いて手作業で収穫し、その後、単一の袋に収集した。個々の袋の内容物を、別々に脱穀して、それぞれが、約6000個の穀粒を含む「穀粒の合計」と表示した袋を得た(GT#01、GT#02など、図2Bの2で表示された動作)。
-実施例1:「畑区画」におけるオオムギ植物の生育;
-実施例2:個々の「畑区画」における穀粒の収穫。
工程3.1:個々の「穀粒の合計」穀粒プールの2つの分画への分割
個々の「穀粒の合計」の袋における脱穀した穀粒を、それぞれ、約1500個の穀粒からなる「サブ穀粒の合計」の2つの分画に分割し(SGT#01、SGT#02など、図2Cの動作1を参照)、この処理を、以下の工程3.2~工程3.4に詳説する。「サブ穀粒の合計」分画における穀粒の処理は、広い意味では、該穀粒分画(複数可)のうちのどれが、対象の突然変異(複数可)を含有するかを決定しようとするものである。明確にするためではあるが、工程3に関する動作には無関係に、約4500個の穀粒からなる「穀粒の合計」分画の残りを、工程4に関する説明で詳説されるように処理した。
-実施例3:「サブ穀粒の合計」における穀粒の説明。
1500個の穀粒を含有する各サブ穀粒の合計試料-すなわち、SGT#01、SGT#02などと表示された試料-を、標準的な実験室ミルを用いて、適用間の徹底的なクリーニングを行って粉砕し(図2B、動作2を参照)、対応する細粉試料を得た-SFT#01、SFT#02など(図2Cを参照)。
-実施例4:「サブ細粉の合計」の試料に由来する穀粒の細粉の作製。
それぞれが25gであり、「サブ細粉試料のアリコート」(ASFT#01、ASFT#02など)と表示される個々の「サブ細粉の合計」試料のアリコートを、別々の容器に分配した(図2Cの動作3を参照)。
-実施例5:25gの細粉のアリコート(ASFT)の調製;
-実施例6:ASFTのgDNAの調製
-実施例7:ASFTに由来するgDNAによるddPCRベースの実験。
工程4.1:「穀粒ライブラリープール」(GLP)の特定
例えば上記工程3.4において詳説した解析が、解析された96個の試料-すなわち、図2CでgDNA(GT#01)、gDNA(GT#02)などで表示されたもの-のうちの1つ以上において突然変異gDNAの存在を示すシグナルを生成したと仮定すると、「穀粒ライブラリープール」(GLP#01、GLP#02など、図2D、動作2)と表示された、「穀粒の合計」分画の4500個の穀粒が、対象の同一の突然変異を有する1つ以上の穀粒を含む可能性が高いと考えられた。本出願では、該GLPの処理は、「穀粒の合計」の試料に由来する処理されたアリコートにおいて検出された鋳型分子のものと同じ突然変異を保有し(図2B、2C、及び2D)、かつ対応するddPCR解析において突然変異体シグナルをさらに発生する(図2C、動作5に示すような)、特異的突然変異穀粒の発見の最終的な取り組みに関連するであろう。
-実施例8:「穀粒ライブラリープール」用の穀粒の収集。
1つの特定のGTに由来する約4500個の穀粒を含有する完全GLP試料によって(そして、図2C、動作5で示されたようなgDNAのddPCRベースの解析が、該DNAがgDNA中に突然変異を含有することを示すと仮定すると)、工程3.4の解析によって明らかにされたものと同一の特異的遺伝子突然変異をスクリーニングするのに、通常、12個未満の穀粒で十分であった。そうした理由から、対象のGLPの約1200個の穀粒の試料を調製して(図2D、動作2)、FGLPと略される「穀粒ライブラリープールの分画」を得た。最終的に、各試料が、特定のFGLPからの12個の穀粒からなる(それぞれが二次サブプールを構成する)合計で96個の試料を単離した。
-実施例9:「穀粒ライブラリープールの分画」の「穀粒ライブラリープール」からの取得。
上記工程4.2に記載の調製した試料中の12個の穀粒のそれぞれを、胚乳中への細い穴を穿孔することによって損傷させた。損傷されたが生存能力のある穀粒を深型ウェルのマイクロタイタープレートの1つのウェルに移し(図2D、動作3)、同じ穀粒を穿孔することによって遊離した細粉をプールし、第2のマイクロタイタープレートに移した(図2D、動作4)。この手順を、残りの95個の試料について実行し(2つのプレートの同一の番号付けシステムを保持しながら)、穀粒試料を含む1つのマイクロタイタープレート(「ライブラリープールの分画からの穿孔した穀粒のプール」と表示、PDGLPと略される、図2Dを参照)、及び胚乳細粉試料を含む1つのマイクロタイタープレート(「穿孔穀粒からの細粉のプール」と表示、PFGLPと略される、図2D)を得た。
-実施例10:オオムギ穀粒の穿孔;
-実施例11:「穿孔穀粒からの細粉のプール」の作製。
上記工程4.3に記載のように調製されたマイクロタイタープレートの各ウェル中の細粉を、別個に、gDNAの抽出にかけた(図2D、動作5)。該抽出は、NucleoSpin 96 Plant IIキット(Machery-Nagel)によって提供された推奨に基づいて、半自動化の手順を使用して、マイクロタイタープレートの個々のウェルが、12個のオオムギ穀粒の細粉に由来するgDNAを含有する、「gDNAのプール」を得た。
-実施例12:穿孔穀粒からの細粉に由来するgDNAの精製(「gDNAのプール」)。
標準ddPCR解析を、対象の特異的突然変異を試験するためにプライマーセットを用いて、QX200液滴リーダー及び液滴発生器の利用のためにBio-Radによって提供された推奨に従って、上記工程4.4で記載したように調製されたgDNAの試料で実施した。個々のウェルに由来するgDNAの解析が、その試料中の突然変異DNAの存在を示すシグナルを生成したとしたならば(図2D、動作6を参照)、gDNAが起源を有する穀粒のうちの1つまたは数個が対称の突然変異を含有することになる高い可能性がある。
-実施例13:穿孔穀粒からの細粉のddPCRベースのgDNA解析。
PFGLPと表示されたマイクロタイタープレートの試料は、細粉を含有したが(工程4.3を参照)、PDGLPと表示されたプレートの整合するウェルは、12個の対応の生きている穀粒を含有した。したがって、次の工程は、対象の12個の穀粒からなる試料を単離し(図2D、動作7)、続いてこれらを発芽させることであった(図2D、動作8)。
-実施例14:可能性のある突然変異体植物の発芽。
可能性のある突然変異体が予想した特徴、すなわち、対象の形質を有するかどうかを決定するために、多くの方法が熟練した研究者に利用可能である。本発明の場合には、gDNAを発芽した苗から抽出し、上記工程4.6に記載のように同定かつ繁殖させて、ddPCR及びDNA配列決定を利用する複合解析によって、12個の可能性のある突然変異体のうちのどれが実際に対象の突然変異を保有するかを確認する(図2D、動作9を参照)。
-実施例15:ddPCR及びDNA配列決定を含む解析の詳細。
工程5.1:突然変異オオムギ穀粒の超高スループット同定
本発明はまた、低保有率の突然変異の同定法を向上させる、2つの異なるデジタルPCR解析プラットフォームの組み合わせ使用も開示する。本明細書では、RainDance Technologiesにより市販されるRainDropプラットフォームを、突然変異植物に由来するgDNAの複合試料においてDNA突然変異を見出すために利用し、一方個々のオオムギ突然変異体に由来するこれらの穀粒抽出物を同定するために、Bio-Radが提供する方法を利用した。
-実施例16:gDNAの「スーパープール」の作製;
-実施例17:「スーパープール」に由来するgDNAによるddPCR。
WS2:
-実施例1:「畑区画」におけるオオムギ植物の生育;
-実施例2:個々の「畑区画」における穀粒の収穫。
WS3:
-実施例3:「サブ穀粒の合計」における穀粒の説明;
-実施例4:「サブ細粉の合計」の試料に由来する穀粒の細粉の作製;
-実施例5:25gの細粉のアリコート(ASFT)の調製;
-実施例6:ASFTのgDNAの調製;
-実施例7:ASFTに由来するgDNAによるddPCRベースの実験。
WS4:
-実施例8:「穀粒ライブラリープール」用の穀粒の収集;
-実施例9:「穀粒ライブラリープールの分画」の「穀粒ライブラリープール」からの取得;
-実施例10:オオムギ穀粒の穿孔;
-実施例11:「穿孔穀粒からの細粉のプール」の作製;
-実施例12:穿孔穀粒からの細粉に由来するgDNAの精製(「gDNAのプール」);
-実施例13:穿孔穀粒からの細粉のddPCRベースのgDNA解析;
-実施例14:可能性のある突然変異体植物の発芽;
-実施例15:ddPCRベースのスクリーニングを通して同定された突然変異体植物の詳細。
WS5:
-実施例16:gDNAの「スーパープール」の作製;
-実施例17:「スーパープール」に由来するgDNAによるddPCR。
オオムギ穀粒を、本明細書で上記WS1において記載されたように、NaN3で突然変異誘発させた。突然変異誘発させたオオムギ穀粒を7.5m2の畑区画において繁殖させた。各区画において、250gの穀粒を播種し、成熟まで生育させた。
収穫時に、畑区画を、それぞれがおよそ300個の植物を含む15~17のサブ区画に分割した。植物は鎌で収穫し、脱穀して、袋詰めした(各サブ区画を個別に)。したがって、1つの「穀粒の合計」袋中の穀粒は、300個の植物に由来した。
1つの「穀粒の合計」試料の全ての穀粒を、穀粒試料分取器を用いて、等しいサイズの4つのランダム化分画に分割した。各分画は、1つの「穀粒の合計」試料の全穀粒量の25%を表す。これらの分画のうちの1つは、1つの「サブ穀粒の合計」を構成する。
1つの「サブ穀粒の合計」試料の全ての穀粒を、穀類製粉機(Retch,GrindoMix GM200)中に置いた。穀粒を、10,000RPMで30秒間粉砕した。得られた細粉(「サブ細粉の合計」;約75g)を紙袋にいれ、23℃で保管した。
1つの「サブ細粉の合計」試料から、25gの細粉のアリコートを秤量した。25gの細粉のアリコート(ASFT)を、紙袋に移し、23℃で保管した。
1つの25g細粉のアリコート(ASTF)を、250mLのガラス瓶に移し、30mLのH2O中に再懸濁させて、続いて、1MのNaOHでpH8.0に調整した、1.4MのNaCl、20mMのNa2EDTA、100mMのTris-HClを含有する、65℃に加熱した2%臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)緩衝液70mLを添加した。溶液をオートクレーブにかけた後に、続いて250μlの10mg/mlのRNase A及び250μlのプロテイナーゼKを補充し、これを規則的に混合してインキュベートし、RNA及びタンパク質を分解させた。50mLのアリコートを、50mLのファルコンチューブに移し、続いて、4000rpmで10分間の遠心分離によって、不溶性沈殿物を除去し、その後、24mLの得られた上清を新しい50mLチューブに移した。
ddPCRを、液滴デジタルPCR QX200システム(Bio-Rad)を用いて、製造業者によって提供された使用説明書に従って実施した。野生型及び変異対立遺伝子に対する配列特異的プライマー及びプローブを、Bio-Radから購入した。
1つの「穀粒の合計」試料の全ての穀粒を、穀粒試料分取器を用いて、等しいサイズの4つのランダム化分画に分割した。各分画は、1つの「穀粒の合計」試料の全穀粒量の25%を表す。1つの「穀粒ライブラリープール」は、分画のうちの3つのプールされた穀粒を含有した。
それぞれが1つの「穀粒ライブラリープール」からの12個の穀粒の96個の試料を順次取り出すことによって、「穀粒ライブラリープールの分画」を確立し、12この穀粒の各試料は、二次サブプールを構成する。
「穀粒ライブラリープール」からの穀粒を、それぞれが12個の穀粒からなる、96個のアリコートに分離した。各12個の穀粒アリコートを1枚の秤量紙上に置き、次いで1対の鉗子で連続的に固定し、それと同時に、1.6mmのドリルを装備した彫刻盤(Marathon-3、Saeyang Microtech)を用いて、胚乳への2~3mmの深さの小さな孔を穿孔した。回転運動によって、胚乳からの細粉を穀粒の頂部及び周囲の秤量紙に移動させた。12個の穿孔された穀粒試料を、別の2mLのウェルのマイクロタイタープレート中に置き、「ライブラリープールの分画からの穿孔オオムギ穀粒のプール」とも表示される穿孔オオムギ穀粒の二次サブプールを得た(図2D、動作3)。穿孔穀粒を、さらなる解析まで20℃で保管した。
それぞれが12個の穿孔オオムギ穀粒に由来する(実施例10で詳説)細粉を含む96個の細粉試料を、穿孔穀粒のものと一致する試料番号付けシステムを維持しながら、1.5mLのマイクロタイタープレートの別々のウェルに移した(「穿孔穀粒からの細粉のプール」、図2D、動作4を参照)。
実施例11で詳説したように作製された、穿孔オオムギ穀粒の細粉プールを、NucleoSpin 96 Plant IIキット(Macherey-Nagel)の使用説明書に詳説された半自動化DNA抽出手順を用いてgDNAの抽出にかけた。したがって、マイクロタイタープレートの各ウェルは、12個の穀粒の細粉からのgDNAを含有した(図2D、動作5)。
WS3の形質(図2C及び実施例3~7を参照)を、合計で約6000個の突然変異穀粒のgDNAを代表する96個のgDNAアリコートの個々の試料(複数可)のうちのどれが、対象のヌクレオチド突然変異を含有するかを同定するように設計されたが、その次のWS4に特異的な取り組み(図2D参照)は、特異的突然変異体穀粒を正確に示すように設計された。
12個のオオムギ穀粒の細粉からのgDNAの解析が、突然変異体シグナルを生成したならば(図2D、動作6を参照)、「ライブラリープールの分画からの穿孔穀粒のプール」の対応する穀粒を発芽させた(図2D、動作7及び8)。
12個の穿孔穀粒からなる、1つの「ライブラリープールの分画からの穿孔穀粒のプール」の内容物を、9mmのペトリ皿(2mLのH2Oを添加した濾紙2枚(8.5mm、Whatman)を備えるように準備)に置いた。16℃で暗所において96時間の発芽期の後に、穀粒を土壌に載置させて、制御された条件下でさらに7日間発育させた。次いで、2×5mmの組織片を第一葉から取り出し、0.2mLのチューブに置いた。50μLの抽出溶液(Sigma)を、各葉に分注して、95℃で10分間インキュベートした。試料を室温まで冷却し、50μLの希釈溶液(Sigma)と混合した。gDNA試料を、10μLの抽出-希釈-混合物と30μLのH2Oを合わせることによって完成させた。
簡単に言うと、1つのライブラリープレートの全ての94個の「サブプール」の各gDNA抽出物アリコート(例えば、50μL)を、1つの「スーパープール」中にプールした。
突然変異オオムギ穀粒によるスクリーニングの取り組みにおける改善されたスループットレートを得ることと並行して化学物質使用量を低減させるために、一方がRainDance手法(液滴作製でより優れたもの)及び他方がBio-Radによるもの(同時に処理される試料の数で際立っているもの)の2つの手法の併用を開発した。大まかに言えば、RainDance手法は、多数の突然変異体穀粒からdDNA鋳型を含有する特定のさらに複雑な試料を同定するために利用し(本明細書では、以下の「手順A」のセクションで詳説される)、一方後続のBio-Radベースの解析は、対象の突然変異によって特徴付けられる単一の穀粒を同定するために役立った(本明細書では、以下の「手順B」で記載される)。
最初に、個々の「スーパープール」(例えば、4~8個のスーパープール)について、RainDropソース機器を用いて、液滴を生成した。RainDanceベースのddPCRに使用されるgDNAは、組み合わされたgDNA抽出物であってもよく、または、これは、実施例16で記載されるように作製されたgDNAの富化スーパープールであってもよい。例えば、1つの「スーパープール」からのgDNAの20μLのアリコートまたはgDNAの富化スーパープールの10μlのアリコートを、25μLのプローブ用Supermix(Bio-Rad)、液滴安定剤(RainDance)、900nMの標的特異的フォワードプライマー、900nMの標的特異的リバースプライマー、120~250nMの野生型検出プローブ(VIC)、250~440nMの突然変異体検出プローブ(FAM)、及びH2Oと組み合わせて、総反応物容量を50μLに調整した。4~8個の個々のgDNAの「スーパープール」を代表する、合計で4~8個の個々の反応混合物を、8チャネルのソースチップ(RainDance)に添加し、ソース機器(RainDance)で処理した。本明細書で上記に記載した手順の全体を、追加の「スーパープール」に対して繰り返すことができ、8~16個の試料の総数を後続の解析用にもたらす。
ddPCR解析を、本明細書の上記手順Aに詳説された、対象の「スーパープール」を構成する96個のgDNA試料のそれぞれのアリコートで実施し、突然変異体鋳型の存在を示した。解析を、WS3及びWS4について本明細書で上記に記載されたように行った。
-分画存在量の増加、
-突然変異体液滴のレベルの増加、または
-平均よりも50%以上高いスケールでの突然変異事象の数の増加。
特異的突然変異を保有するオオムギ植物を、本明細書の上記ワークストリーム及び実施例で記載された方法を用いて同定した。記載されたように、これらの方法は、いかなる突然変異体の同定にも使用され得る。特異的突然変異、G→Aの同定は、オオムギグルタミンシンセターゼ1アイソフォーム3(HvGS1-3)の配列の287位におけるGlyのAsp酸残基への置換につながる。
グルタミンシンセターゼ1(GS1)は、アンモニウムまたはアンモニア及びグルタミン酸のグルタミンへの縮合を触媒することによる、高等植物における窒素同化に関与する重要な酵素である。窒素を豊富に含む土壌では、窒素の過剰利用可能性が、オオムギにおける登熟中の窒素蓄積の増加につながり得るので、麦芽の品質に悪影響を及ぼす。GS1中のノックアウト突然変異は、深刻な発育不全をもたらす可能性があり、植物全体の適応度に対するこの酵素の重要性を強調している(Tomoyuki Yamada及びMiyako Kusano、2014)。GS1の3つのアイソフォームがオオムギでは既知である(HvGS1-1、HvGS1-2、HvGS1-3)。3つのオオムギアイソフォームのうちで、HvGS1-3が、穀粒発育において主に活性であり、高アンモニウム条件下でアップレギュレートされる。突然変異戦略を、穀粒の窒素蓄積能力をさらに低下させて、最適な植物発育を維持することを目的として設計した。この突然変異戦略は、GS1-3の酵素活性を低下させるアミノ酸置換に焦点を合わせた。好適なアミノ酸置換を、タンパク質配列中の287位に同定した(タンパク質配列番号NCBI:AFX60877.1-本明細書では配列番号2として提供)。コドンGGC(ヌクレオチド859、860、861;GenBank番号NCBI:JX878491.1のCDS-本明細書では配列番号1として提供)をGACに変化させることは、タンパク質配列(タンパク質配列番号、NCBI:AFX60877.1)の287位においてグリシンからアスパラギン酸へのアミノ酸交換をもたらす。このアミノ酸変化は、負に荷電したアミノ酸をタンパク質配列に導入するであろう。GS1-3は、5つのサブユニットから構成される2つの環からなる十量体であり、アミノ酸残基287が、2つの環の間の中間相に、かつ活性部位から離れて位置する状態である。したがって、負に荷電したアミノ酸の導入が、その反応を触媒する全体的な能力に影響を及ぼさないが、その代わりに十量体の組み立てにおける構造的変化を通して酵素活性を低下させ得ることを提唱する。
独特なddPCRアッセイを、具体的には、野生型コード配列(GenBank番号NCBI:JX878491.1)におけるヌクレオチド860位でのHvGS1-3の変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子を識別するように設計した。突然変異体検出プローブは、ヌクレオチド860位でA塩基を含有するコード配列に相補的であった。参照検出プローブは、ヌクレオチド860位にG塩基を含有するコード配列に相補的であった。2つの隣接するプライマーを、コード配列中のヌクレオチド860を包囲するゲノム配列を増幅させるように設計した。
以下のプライマー及びプローブを、HvGS1-3遺伝子座に対して特異的に設計した:
-標的特異的フォワードプライマー(配列番号3):
5’-GTGATCAAGAGGGCGATCAA-3’;
-標的特異的リバースプライマー(配列番号4):
5’-CAAGTCTCAACTCGCCGTAT-3’;
-突然変異体特異的検出プローブ(配列番号5):
5’-AAGACAACGAGCGC-3’-6-カルボキシフルオレセイン(FAM)で標識付け;
-参照特異的検出プローブ(配列番号6):
5’-AAGGCAACGAGCGC-3’-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)で標識付け。
一般的に、次の工程は、ライブラリーが突然変異穀粒を含有するかどうかを決定する、特に、下記の詳細で、本明細書の上記WS3及び実施例7で記載されたように決定するためのものであった。
-およそ120,000個の突然変異オオムギ植物を代表する、合計で376個のGLP(すなわち、376個のサブプール)を用いて、スクリーニングを実施した。ddPCRを、本質的に実施例7に記載されるように実施した;
-1つの5μLの、gDNAに由来するgDNA試料(GT#377~GT#470)を、17μlのPCR反応混合物を含有する各ウェルに添加し、上下にピペッティングすることによって、完全に混合した。
遺伝子突然変異を保有する個々のオオムギ穀粒を、下記の連続番号が付けられた詳細を含む、本質的に上記WS4においてに本明細書に記載されたように同定した。
1.HvGS1-3特異的ddPCRアッセイによるGT#377~GT#470に由来するgDNAの解析に基づいて、GLP#380の4500個の穀粒[陽性試料gDNA(GT#380)に一致する]が、対象の遺伝子突然変異を有する1つ以上の穀粒を含む可能性が高いと考えられた。
2.FGLP#380を、GLP#380から96×12個の穀粒試料を順次取り出すことによって確立した。各12個の穀粒のアリコートを、1枚の秤量紙の上に置き、次いで1対の鉗子で連続的に固定し、それと同時に1.6mmのドリルを装備した彫刻盤(Marathon-3、Saeyang Microtech)を用いて、胚乳への2~3mmの深さの小さな孔を穿孔した。回転運動によって、胚乳からの細粉を穀粒の頂部及び周囲の秤量紙に移動させた。12個の穿孔された穀粒試料を、別の2mLのウェルのマイクロタイタープレート中に置き、穿孔オオムギ穀粒の二次サブプールPDGLP#380を得た。それぞれが12個の穿孔オオムギ穀粒に由来する細粉を有する、96個の細粉試料を、穿孔穀粒のものと一致する試料番号付けシステムを維持しながら、1.5mLのマイクロタイタープレートの別々のウェルに移した(PFGLP#380)。
3.次に、PFGLP#380を、NucleoSpin 96 Plant IIキット(Machery-Nagel)の使用説明書に詳説されるような半自動化DNA抽出手順を用いて、gDNAの抽出にかけた。したがって、マイクロタイタープレートの各ウェルは、12個の穀粒の細粉からのgDNAを含有した。
4.PFGLP#380に由来するgDNAを、上記記載のように解析した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて解析した。閾値を、2D-プロットを用いて、かつチャネル1の振幅について2700、チャンネル2の振幅について1500に設定して決定した。分画存在量についての個々の値の比較は、PFGLP#380の試料のいずれも突然変異体穀粒を含有しないことを示した。GLP#380が突然変異体穀粒を含有する可能性が高いと考えられたため、第2のFGLP(FGLP#380-2)を確立することによって、追加の試料を調製し解析することを決定した。これは、PDGLP#380-2及びPFGLP#380-2の作製をもたらした。PFGLP#380-2からのgDNAを、上記記載のように解析した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて解析した。閾値を、2D-プロットを用いて、かつチャネル1の振幅について2700、チャンネル2の振幅について1500に設定して決定した。全てがPDGLP#380-2の3つの独立したウェルで3つの個々のヘテロ接合突然変異体の存在を示唆する、4.02%、4.11%及び5.55%の分画存在量を示したマイクロタイタープレートの3つの個々のウェル(C02、F04、F05)を同定した。
5.PDGLP#380-2のウェルC02及びF04からの全ての12個の穀粒を発芽させた。全ての24個の苗からの葉材料を採取し、REDExtract(Sigma Aldrich)を用いるDNA抽出にかけた。葉試料に由来するgDNAを、上記記載のように解析した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて解析した。閾値を、2D-プロットを用いて、かつチャネル1の振幅について2700、チャンネル2の振幅について1500に設定して決定した。PDGLP#380-2のウェルC02に由来する1つの苗は、41%の分画存在量を示し、ヘテロ接合突然変異体の存在を確認した。PDGLP#380-2のウェルF04に由来する1つの苗は、39.6%の分画存在量を示し、ヘテロ接合突然変異体の存在を確認した。
6.追加の形質の検証を、同定した突然変異体及び参照試料の両方での直接配列決定法を用いて実施した。REDExtract DNA抽出手順(Sigma Aldrich)を用いて、葉材料からDNAを抽出した。配列決定解析については、1μlの精製gDNA、20μlのREDExtract(Sigma Aldrich)、500nMの標的特異的フォワードプライマー、500nMの標的特異的リバースプライマー及び水を含有する50μlのPCR反応を準備した。試料を、次のPCR条件:94℃で2分間の変性、94℃で45秒間、58℃で45秒間、及び75℃で45秒間の38サイクルのPCR、ならびに72℃で5分間の最終的伸長を用いて熱サイクルさせて、その後、PCRプレートを8℃で保存した。個々のPCR産物を、NucleoSpin Gel及びPCRクリーンアップキットを用いて精製した。全ての試料を、標的特異的フォワードプライマー及び標的特異的リバースプライマーを用いて配列決定した。
7.ddPCR解析において突然変異に対して陽性であると同定された両方の苗は、所定のゲノム位置における遺伝子型に関してヘテロ接合であった。参照試料は、同じ位置においてホモ接合野生型遺伝子型を示した。
3つの組換えHvGS1-3変異体の合成は、E.coli宿主細胞を利用し、続いて、親和性精製によって、この酵素を高純度に富化した。次の変異体をE.coli中で発現させた。
-Q:野生型参照-配列番号1;
-3864:アミノ酸交換G287Dを有する配列番号1、すなわち、突然変異体オオムギ植物(実施例18で記載されたように同定)によって発現される突然変異体タンパク質に一致する。
-LR:アミノ酸交換D300Nを有する配列番号1、すなわち、変化が酵素活性に及ぼす影響をほとんど有さないと予想される酵素変異体。
GS1-3複合体のオリゴマー化が、Qと比べて2つの変異体のいずれかに影響を与えたかどうかを決定するために、精製HvGS1-3のアリコートを、最初にサイズ排除カラム上を移動させた。全ての3つの変異体は、同じ溶出容量で主ピークを有した。
登録番号JX878491.1でGenBankに寄託された、オオムギグルタミンシンセターゼアイソフォームGS1-3(HvGS1-3)のコード配列を、野生型HvGS1-3(Q)及び突然変異を含有する2つの型(3864またはLR)のいずれかを表す、3つの対応する遺伝子配列(GenScript,China)の合成のための基礎として用いた。野生型GS1-3遺伝子及びタンパク質配列を、本明細書では、それぞれ配列番号1及び配列番号2として提供する。全ての3つの変異体のタンパク質をコードするDNA配列を、MerckMillipore(ドイツ)から購入したE.coli発現プラスミドpET-28a(+)中に挿入し、続いて、標準的方法を用いて、BL21(DE3)菌株のE.coliの細胞の形質転換を行った。
HvGS1-3 Qで形質転換されたE.coli BL21(DE3)細胞またはpET-28a(+)中のその変異体を用いた。細菌を、30μg/mLのカナマイシンを含有するLB培地中で、標準的条件下で培養した。250μMのイソプロピルβ-D-1チオガラクトピラノシド(IPTG、Sigma-Aldrich)を添加して、遺伝子発現を誘導させた。発現は、120rpmで37℃にて4時間行った。8℃において4,000×gで15分間の遠心分離によって、細胞を採取した。上清を廃棄しながら、細胞ペレットを、10mLの緩衝液A(20mMのTris-HCl、pH8.0、500mMのNaCl、1mMのMgCl2)中に再懸濁させた。再懸濁した細胞を、さらに使用するまで-20℃に凍結させた。
形質転換し、凍結させたE.coli BL21(DE3)細胞を、先ず解凍し、次いでVibra細胞超音波処理装置(Sonics & Materials Inc.,USA)を用いて、氷上で30%の振幅で90秒間、5秒間のパルス及び5秒間の中断で破壊させた。超音波処理後、5μg/mLのDNasel(Sigma-Aldrich)を用いて、DNAを10分間分解させた。4℃で13,000×gにて10分間の遠心分離によって、溶解細胞を除去した。上清を0.45μmのフィルターを通過させて、新しいチューブにシリンジで注入した。
ニッケル溶液で荷電した1mLの固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMC)を、5カラム容量の再蒸留水で洗浄し、同一容量の緩衝液A(この組成は上記に詳説)で平衡化させた。濾過した可溶性分画を、シリンジを用いて平衡化カラムに手動で注入し、未結合物質を収集し、4℃に維持した。緩く結合したカラム物質を、50mMのイミダゾールを含有する緩衝液A(Sigma-Aldrich)を用いて、10カラム容量(CV)にわたって洗い流した。HvGS1-3を、400mMのイミダゾールを含有する緩衝液Aを用いて、10CVにわたって同様な条件下で溶出させて、収集した。溶出タンパク質溶液を、10,000の公称分画分子量を有する再生セルロースから作製された遠心濾過機ユニット(Millipore,Ireland)上で、緩衝液Aに対して透析濾過を4回行った[過剰のイミダゾールを除去するために、8℃で3,000×g(SL-16R)にて20分間の遠心分離により]。
Wellner及びMeister(1966)によって記載された活性アッセイの改作を用いて、2つのHvGS1-3変異体の活性における変化を(HvGS1-3 Qのものと比べて)決定した。50μLの反応物は、100mMのTris-Hcl、pH8.0、50mMのMgCl2、20mMのATP、異なる濃度のγ-グルタミン酸ヒドロキシルアミン(L-グルタミン酸を変化させた場合、そうでなければ50mM)、異なる濃度のL-グルタミン酸(グルタミン酸ヒドロキシルアミンを変化させた場合、そうでなければ50mM)を含有した。反応を、37℃で平衡化させた平底の96ウェルマイクロプレート(Corning,USA)の半分の領域で調整した。精製HvGS1-3を1または5μg/mLの最終濃度で添加することによって、反応を開始させた。30分後、370mMのFe(III)Cl3、200mMのTCA、670mMのHClを50μL添加することによって、反応を停止させた。次いで、容量の微量な差を考慮に入れるために経路補正を用いて、SpectraMax 340PC384マイクロプレートリーダー(Molecular Devices,USA)で、A540nmを底部から測定した。GraphPad Prism(バージョン4、GraphPad Software,USA)を用いて、データをプロットした。
3つのHvGS1-3変異体の等量を、Superdex 200(GE Life Sciences,USA)を含む10/300サイズ排除カラム上に個々に充填し、AKTA FPLC(GE LifeSciences)上の緩衝液A中で平衡化させた。結合タンパク質の溶出を、0.5mL/分で行い、タンパク質溶出の後にA280を測定した。
説明を明確にするために、かつ限定するものではないことを示すために、以下のテーマを本実施例で詳説する。
-パート1:ランダムに突然変異誘発させた酵母培養物の調製
-パート2:順序付きライブラリーの作製
-パート3:所定の突然変異を有するgDNAを含有するウェルの同定
-パート4:所定の突然変異によって特徴付けられた酵母細胞の富化
工程1.1:突然変異誘発の手順
突然変異を誘発させるために、酵母菌株を、Methods in Molecular Biology,Yeast Protocols,V.313,2006)に記載されるプロトコールに従って、MNNG(メチルニトロニトロソグアニジン)による処理にかける。
工程2.1.細胞生存性
生存細胞力価を決定し、全ての突然変異誘発させた酵母細胞を、Biomek FXpロボットを用いて、YPDを含む96ウェルプレート中にアリコートで接種する。3000~5000個の生存単細胞をウェル当たりに接種する。
工程3.1:突然変異誘発させた酵母細胞のライブラリーの作製
工程1.1からの96ウェルプレート中に接種した突然変異誘発させた酵母細胞は、標的化突然変異酵母を含有する総ライブラリーとみなされる。酵母細胞を3日間インキュベートして、成長飽和状態にさせる。増殖から3日後に、gDNA単離に使用するために、Biomek FXpロボットを用いて、最小成長培地中に再接種することによって、ライブラリーを増幅させる(コピー工程)。96ウェルプレート内の酵母細胞懸濁液の残りを、所望の突然変異体酵母を単離するための後工程用途のために、グリセロール(15%の最終濃度)と共に-80℃で保存する。
gDNAを調製するために、酵母細胞をDNA単離用の96ウェルプレートに移し、ロボットを用いるDNA単離の手順にかける(Biomek FXp、Agencount DNAdvanceキット及びBeckman Coulterからのプロトコール)。手順は、酵母細胞壁を分解しかつ細胞を破壊するためにリチカーゼ酵素を用いる追加の工程を伴う、製造業者の使用説明書に従う。プロトコールは、磁気ビーズによるgDNAの沈殿を使用する。96ウェルプレート中のgDNAを、所定の突然変異についての陽性プールを同定するために後工程用途に使用する。DNA濃度を、96ウェルプレートリーダーを用いて測定し、これと共にDNAの濃度を25ng/5μLに調整し、これをddPCRに直接使用する。96ウェルプレート中の元々の濃縮したDNAを後の使用のために保存する。
工程2.2にて96ウェルプレート様式で調製されたgDNAを定量し、濃度を25ng/5μLに調整する。陽性及び陰性対照DNA試料が含まれる。その後ddPCR解析を、各gDNA試料で、本質的に実施例7に記載されたように実施する。この段階で、遺伝子配列中のいくつかの、または全ての可能な位置における異なる点突然変異を認識し、未成熟終止コドンを作成するプローブのアレイを適用し、突然変異体同定の機会を向上させることができる。本方法は、所望の突然変異に対して陽性のウェル、すなわち、所望の突然変異を保有する酵母を含むウェルの同定を可能にする。
工程4.1:プールされた酵母ライブラリーの作製
突然変異に対して陽性のウェルを含む96ウェルプレートを解凍し、陽性ウェルの内容物を新鮮なYPDブロスに接種(1:10)し、室温で回転させながら4~6時間インキュベートさせることによって酵母細胞を蘇生させる。酵母細胞のさらなる増殖がないことを確実にするために、蘇生させた酵母培養物を、後工程のプレーティングまで冷蔵庫に保存し、純粋な突然変異体培養物の単離を成功裏に完了する。プレーティング前に、生存酵母細胞を計数し、1mMのEDTAを含有するPBSで希釈し、その後、YPD寒天を含むQpix角型皿上でプレーティングし、プレート当たり2000~3000個のコロニーを得る。この方法を準備するためのプレートの数は、凍結ストックから蘇生させた後の生存酵母細胞の力価及び突然変異体同定の進捗に依存する。例えば、10~12個のQpixプレートは、個々のコロニーを生じる最大50,000個の単一細胞で接種することができる。最大1:5000の野生型:突然変異体の比を有する、パート3に記載された陽性プールの同定は、50,000個の単一細胞の中で、少なくとも10個の細胞が標的化突然変異体であることを示唆している。コロニーの成長を監視して、Qpixロボットで個々のコロニーを拾い上げることができるのに適切なサイズ及びコロニー間の距離を確実にする。一旦コロニーを拾い上げる準備ができたら、YPD成長させた酵母細胞を有する96ウェルプレートのライブラリーを、以下の方法で作成する:全てのQpixプレートからのコロニーをランダムに10個の96ウェルプレート内に収集し、これにより、各ウェルが、1:50に等しい野生型:突然変異体の最小可能性比で50個のコロニーのプールを含有することになる。これらのプレートをさらに処理して、gDNAを単離し、また凍結ストックを作製して、工程3.1(WS3)に記載されたようにさらなる後工程の用途のために-80℃で保存する。
gDNAを50個の単離されたコロニーのプールから調製するために、工程3.1で得られた96ウェルプレート中の酵母培養物を、新鮮な最小成長培地中に再接種する。一旦成長が十分になったら、酵母培養物を、工程3.2(WS3)に記載されたようなロボットを用いるDNA単離の手順にかける。DNA濃度を、96ウェルプレートリーダーを用いて測定し、そしてDNAの濃度を25ng/5μLに調整し、アリコートをddPCRに直接使用する。96ウェルプレート様式中の元々の濃縮したgDNAを保存する。96ウェルプレート中のgDNAを、所定の突然変異を有する陽性プール/ウェルを同定するために、後工程用途に使用する。合計で10個の、gDNAを含む96ウェルプレートを調製する。
96ウェルプレート様式で工程3.2において調製されたgDNAを定量し、濃度を25ng/5μLに調整する。陽性及び陰性対照DNA試料が含まれる。その後ddPCR解析を、各gDNA試料で、本質的に実施例7に記載されたように実施する。複数のプローブが工程3.3で使用されるならば、このときは、この段階で、工程3.3において陽性プールの肯定的な同定を供与したプローブ(複数可)のみを適用する。本方法は、所定の突然変異を有する陽性のサブプール(複数可)の同定を可能にする。
工程4.3で同定した、陽性ウェル(複数可)を有する凍結した96ウェルプレートを用いて、単一コロニーの成長のためにプレーティングする。陽性ウェルからの酵母培養物を、新鮮なYPDブロス中に接種し、一晩培養する。1000個の細胞をYPD寒天(Qpix角型皿様式)上にプレーティングし、単一コロニーを得る。成長させたコロニーをQpixロボットで、YPDブロスを成長培地として含む10個の96ウェルプレート中に拾い上げる。これらのプレートをさらに処理して、gDNAを単離し、また工程3.1(WS3)に記載されたように、さらなる後工程の用途のために凍結ストックを作製する。
gDNAを、工程4.2に記載されたように調製する。
工程4.5で調製されたgDNA、すなわち、96ウェルプレート様式におけるものを定量し、濃度を25ng/5μLに調整する。陽性及び陰性の対照DNA試料が含まれる。その後ddPCR解析を、実施例7に記載されたように実施する。この段階で、工程3.1において肯定的な同定を供与したプローブ(複数可)のみを適用する。本方法は、所定の突然変異を有する純粋な酵母培養物の同定を可能にする。本方法は、分離菌株のホモ接合またはヘテロ接合状態を決定することを可能にする。
突然変異体酵母のストックを作製するために、陽性ウェル(複数可)からの酵母懸濁液を、YPD寒天上に広げ、単離されたコロニーの成長を開始させる。3つのコロニーを手動で拾い上げ、生物学的複製品としてさらに処理する。
工程4.7(WS4)からの同定された突然変異を有する酵母突然変異体分離菌株をgDNAの単離、続いて特異的PCR、得られたDNA断片のクローニング及びDNA配列決定の実施のために用いて、突然変異の同一性を確認する。
対象のホモ接合突然変異を有する酵母突然変異体を用いて、突然変異が予想した効果を有することを直接確認する。ヘテロ接合状態が決定され、かつ予想される効果を提供するために不十分と判明するならば、このときは、突然変異誘発が繰り返されるか、あるいは酵母分離菌株が胞子形成、続いて突然変異の分離を受けて、ホモ接合状態及び突然変異体表現型を確認するかのいずれかが行われる。対象の突然変異を有する酵母分離菌株を適用された目的に直接使用されるか、またはこれは、所望の表現型を制御するために酵母育種に使用される。
Saccharomyces cerevisiaeにおいては、フェルラ酸デカルボキシラーゼFdc1は、ケイ皮酸またはクマル酸を含む芳香族カルボン酸の脱炭酸に必須である。脱炭酸反応は、基質をそれらの対応するビニル誘導体に変換し、それらのいくつかは風味活性化合物として既知である。例えば、ビール発酵中に、Fdc1は、麦汁からのフェルラ酸を4-ビニルグアイアコールに変換し、4-ビニルグアイアコールは、最終ビールにおいてチョウジノキに似た香調として顕著になる。これらの香調は、特定のビール、特にドイツの小麦ビールに典型的であるが、ラガービールを含む他のものではフェノール系オフフレーバー(POF)とみなされる。ここでは、遺伝子ScFDC1中にナンセンス突然変異を保有するS.cerevisiaeの同定は、非GMO法により、それが記載される。同定した酵母はPOF陰性酵母菌株であると予想される。
工程1.1:菌株FS0105でのEMS突然変異誘発
突然変異を誘発させるために、酵母菌株FS0105を、「Methods in Yeast Genetics」(CSHL Press,2000)に記載されるプロトコールに従って、エチルメタンスルホネート(EMS)による処理にかけた。簡単に言うと、菌株FS0105をYPD培地中で一晩、定常期まで増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、滅菌蒸留水で1回、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)で1回洗浄した。細胞を、最終的に、0.1Mのリン酸緩衝液中に、約2×108細胞/mlに再懸濁させた。30μlのEMSを、2mlのセーフロック反応チューブ中の1mlの細胞に添加し、細胞をEppendorf Thermomixer comfort(1.5ml)上で、30℃及び1000rpmでおよそ75分間インキュベートし、通常、菌株FS0105に対して約60~80%の死滅率をもたらした。突然変異誘発を停止させるために、細胞を短時間の遠心分離によってペレット状にして、新しく調製した滅菌5%チオ硫酸ナトリウム溶液で3回、滅菌蒸留水で1回洗浄した。細胞を、最終的に、1mlのYPD中に再懸濁させて、Eppendorf Thermomixer comfort(1.5ml)上で30℃及び1000rpmで1時間インキュベートした。この段階で、細胞を4℃で保存することができるか、または後処理プロセス、例えば、複合培地にプレーティングすることによって死滅率を決定するために直ちに使用した。
工程2.1:突然変異誘発させたFS0105酵母細胞の総ランダムライブラリーの作成
EMS突然変異誘発の第4及び最終のラウンド(工程1.1を参照)の後に、それぞれの希釈物を複合培地プレートにプレーティングすることによって、生存細胞力価を決定した。その後、およそ1,200~1,500の生細胞/プレートを、YPDプレート上に広げ、ペトリ皿を30℃で3日間インキュベートした。96個の別個のプレートから、3mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で細胞を洗い流し、96個の「ライブラリープール」を形成した。これらのライブラリープールからのおよそ5×107個の細胞を、その後、DNA単離に使用し(以下を参照)、一方残りの細胞を遠心沈殿し、40%のグリセロール/10%のYP中に再懸濁させて、-80℃で冷凍し、全体でおよそ120,000~150,000個のEMS突然変異誘発させたFS0105クローンを含有する96個のライブラリープールの「総ランダムライブラリー」を確立した。
工程3.1:FS0105総ランダムライブラリーからの酵母ゲノムDNA単離
総ランダムライブラリーの各プールからのゲノムDNAを、PureLink(登録商標)Pro96ゲノムDNAキット(invitrogen)及びEveryPrep(商標)Ubiversal Vacuum Manifold(invitrogen)を用いて、製造業者の使用説明書に従って単離した。各試料のDNA濃度を、NanoDrop 10003.8.1を用いて決定し、DNA溶液を、滅菌DNAseフリー水で、5ngのDNA/μlの最終濃度に調整した。DNA試料を、さらに使用するまで、96ウェルPCRプレート中で-20℃にて保存した。
独特のddPCRアッセイを、具体的には、菌株FS0105の野生型コード配列中のヌクレオチド+476位におけるScFDC1の変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子を識別するために設計した。対応するTGGコドンは、一般的な実験室参照菌株S288CのScFDC1配列とこの位置で同一である(GenBank番号NCBI:NM_001180847)。突然変異体検出プローブは、ヌクレオチド+476位でA塩基を含有するコード配列に相補的であった。参照検出プローブは、ヌクレオチド+476位でG塩基を含有するコード配列に相補的であった。2つの隣接するプライマーを、コード配列中のヌクレオチド+476を包囲するゲノム配列を増幅するように設計した。アッセイを、突然変異検出用のBioRads液滴デジタルPCRアッセイ設計ツールを用いて設計した。以下のプライマー及びプローブを、特異的ScFDC1遺伝子座のために開発した。
標的特異的フォワードプライマー((5’-CATGTTTCAGACGGTGG-3’)(配列番号13)
標的特異的リバースプライマー(5’-CATACCTCTAGCAATTGACC-3’)(配列番号14)
突然変異体検出プローブ(5’-ACGTACGGAATGTAGATTCT-3’)(配列番号15)-6-カルボキシフルオレセイン-FAMで標識付け
参照検出プローブ(5’-ACGTACGGAATGTGGATT-3’)(配列番号16)-ヘキサクロロフルオレセイン-HEXで標識付け。
工程4.1:FS0105総ランダムライブラリーからの100erサブプールの作成
ScFDC1特異的ddPCRアッセイを用いて解析された96個のgDNAライブラリープール試料の解析に基づくと、プールG01中の1,200~15,00個の酵母菌株が、対象の遺伝子突然変異を保有する1つ以上の個々のクローンを含有することになる可能性が高いと考えられた。
ゲノムDNAを、工程3.1に従って、48個の100erサブプール(前の工程を参照)のそれぞれから単離し、最終濃度を、約5ngのgDNA/μlに再度調整した。
それぞれがプールG01からのおよそ100個のコロニーを含有する、48個の100erサブプールに由来するgDNAを、上記記載のように解析した(工程3.2を参照)。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて解析した。閾値を、2-Dプロットを用いて、かつチャネル1の振幅について2000を及びチャンネル2の振幅について2500を設定して決定した。100個のコロニーの特定のプール中の少なくとも1つの突然変異コロニーの存在を示す、1%を超える分画存在量を示す、マイクロタイタープレート中の4つの個々のウェル(G07、C08、C09、G10)を同定した。
100erサブプールC09は、ddPCR解析において最も高い分画存在量(2.99%)を示し、さらなる解析のために選択した。
ゲノムDNAを、工程3.1に従って、24個の100erサブプール(工程4.4を参照)のそれぞれから単離し、最終濃度を、約5ngのgDNA/μlに再度調整した。
24個の10erサブプールに由来するgDNAを、上記記載のように解析した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて上記記載のように解析した(工程3.2参照)。閾値を、2-Dプロットを用いて、かつチャネル1の振幅について1500を、及びチャンネル2の振幅について2000を設定して決定した。3つの個々のプール(A02、C03、及びD03)は、10%を超える分画存在量を示し、10個のコロニーの3つのプールのそれぞれにおける少なくとも1つの突然変異コロニーの存在を確認した。
ddPCR解析において最も高い分画存在量を示す10erサブプールD03(工程4.6)を、さらなる解析のために選択した。gDNAを、10erサブプールD03に由来する16個の個々の酵母コロニーから単離し、上記記載のものと同じ解析にかけた(工程4.3及び4.6を参照)。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて解析した。閾値を、2-Dプロットを用いて、かつチャネル1の振幅について2000を、及びチャンネル2の振幅について2500を設定して決定した。2つの個々のプール(C02及びD02)は、99.9%を超える分画存在量を示し、16個の試験した個々のコロニーうち、2つの突然変異酵母コロニーの存在を確認した。
菌株FS0105は、より大きな細胞凝集体を形成する傾向性を示す。対象の突然変異体酵母の将来のストックが、単一の細胞に由来し、細胞集塊に由来しないことを保証するために、本発明者らはSinger MSM 400解剖顕微鏡を用いて、2つの個々のプールC02及びD02から単一細胞を単離した。そのために、個々のプールからの細胞懸濁液を、ある特定の細胞集塊の放出を支援するTE緩衝液中で1000倍希釈し、10μlの希釈物を複合培地寒天プレート上にスポットした。次いで、単一細胞を製造業者の推奨/マニュアルに従って単離した。
工程4.8からの単一細胞分離株に由来するゲノムDNAを、標準酵母ゲノムDNAS調製プロトコールを用いて単離し、標的遺伝子ScFDC1を網羅する領域を、ScFDC1特異的オリゴヌクレオチドを用いる標準PCR手法によって増幅させた。得られたDNA断片を、Wizard(登録商標)SV Gel及びPCR Clean-upシステム(Promega)を用いて浄化し、対照のヌクレオチド(ScFDC1の+476)の周りの領域について配列決定した(LGC Genomics)。回収したDNA配列の解析は、個々のプールC02及びD03(4.7及び4.8を参照)に由来する単一細胞のクローンの両方共に、ScFDC1遺伝子のヌクレオチド+476におけるGからAへの移行によって生じた、所望のナンセンス突然変異W159*を含有することを示した。
特異的突然変異を保有するコムギ植物を、本明細書の上記ワークストリーム及び実施例に記載される方法を用いて同定した。様々なプールなどの命名を、図2に示した命名を用いて行った。オオムギは自家受粉の、14個の染色体を有する二倍体であるのに対し、コムギでは多倍数性が一般的である。本実施例は、本発明の方法が、コムギなどの多倍数体の生物でも使用することができることを実証している。記載されるように、本方法は、任意の突然変異体の同定に使用することができる。本実施例は、91位でのA-ゲノム(TaGASR7-A1)上のコムギ遺伝子GASR7のコドン領域中のアミノ酸トリプトファンの翻訳終止への交換につながる、特異的突然変異(グアニンからアデニンへ)の同定を記載する。GASR7-A1遺伝子の配列は、番号NCBI:KJ000052でGenBankにおいて入手可能であり、cDNA配列は、本明細書では配列番号25として提供され、GASR7のアミノ酸配列は、配列番号8として提供される。
具体的には、野生型コード配列(GenBank番号NCBI:KJ000052)中のヌクレオチド273位におけるTaGASR7-A1の変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子を識別する、特異的ddPCRアッセイを設計した。突然変異体検出プローブは、ヌクレオチド273位にアデニンを含有するコード配列に相補的であった。参照検出プローブは、ヌクレオチド273位にグアニンを含有するコード配列に相補的であった。2つの隣接するプライマーを、コード配列中のヌクレオチド273を包囲するゲノム配列を増幅させるように設計した。以下のプライマー及びプローブを、特異的TaGASR7-A1遺伝子座のために開発した。
標的特異的フォワードプライマー(5’-CGCCTGCCCCTGCTA-3’)(配列番号9)
標的特異的リバースプライマー(5’-AGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAACCAAGAA-3’)(配列番号10)
突然変異体検出プローブ(5’-CAACAACTGAAAGACCA-3’)(配列番号11)-6-カルボキシフルオレセイン-FAMで標識付け
参照検出プローブ(5’-CAACAACTGGAAGACCA-3’)(配列番号12)-フルオロフォアVICで標識付け。
次いで、ライブラリーが突然変異穀粒を含有するかどうかを、本明細書で上記WS3及び実施例7に本質的に記載されるように、下記の詳細を伴って決定した。
スクリーニングを、およそ30,000個の突然変異コムギ植物を代表する、合計94個のGLP(94個のサブプール)で実施した。ddPCRを、本質的に実施例7に記載されるように実施した。
gDNA(GT#10001~GT#10094)に由来する1つの5μlのgDNA試料を、17μlのPCR反応混合物を含有する各ウェルに添加し、上下にピペット操作することによって十分に混合した。
PCRプレートを、液滴解析のためにQX200液滴リーダー(Bio-Rad Laboratories)上に装填した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad Laboratories)を用いて解析した。閾値を、2-Dプロットを用いて、かつチャネル1振幅に3000を、及びチャンネル2の振幅について2000設定して決定した。分画存在量についての個々の値の比較は、gDNA(GT#10072)が、あらゆる他の試料よりも突然変異体検出に由来する多くのシグナルを含有することを示した。gDNA(GT#10072)の分画存在量は、全ての94個の試験したgDNA試料の平均分画存在量を表す0.024%と比べて0.130%であった。
突然変異を保有する個々のコムギ穀粒を、本質的に上記WS4で本明細書に記載されたように、下記の詳細を伴って同定した。
TaGASR7-A1特異的ddPCRアッセイによるサブプールのgDNA(GT#10001~GT#10094)の解析に基づくと、GLP#10072の4500個の穀粒(陽性試料gDNA(GT#10072)に一致する)が、対象の同一の突然変異を有する1つ以上の穀粒を含む可能性が高いと考えられた。
それぞれGLP#10072からの10個の穀粒の96個の試料を順次取り出すことによって、FGLP#10072を確立した。各10個の穀粒アリコートを1枚の秤量紙上に置き、次いで1対の鉗子で連続的に固定し、それと同時に、1.6mmのドリルを装備した彫刻盤(Marathon-3、Saeyang Microtech)を用いて、胚乳への2~3mmの深さの小さな孔を穿孔した。回転運動によって、胚乳からの細粉を穀粒の頂部及び周囲の秤量紙に移動させた。10個の穀粒の穿孔された試料を、別の2mLのウェルのマイクロタイタープレート中に置き、穿孔された穀粒PDGLP#10072の二次サブプールを得た。それぞれが、10個の穿孔されたコムギ穀粒に由来する細粉を含む96個の細粉試料を、穿孔された穀粒のものと一致する試料番号付けシステムを維持しながら、1.5mlのマイクロタイタープレートの別個のウェルに移した(PFGLP#10072)。
PFGLP#10072を、NucleoSpin 96 Plant IIキット(Macherey-Nagel)の使用説明書に詳説された半自動化DNA抽出手順を用いて、gDNAの抽出にかけた。したがって、マイクロタイタープレートの各ウェルは、10個の穀粒の細粉からのgDNAを含有した。
PFGLP#10072に由来するgDNAを、上記記載のように解析した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad Laboratories)を用いて解析した。閾値を、2-Dプロットを用いて、かつチャネル1の振幅について2500を及びチャンネル2の振幅について1700を設定して決定した。マイクロタイタープレートにおける2つの個々のウェル(B10及びG05)が、7.6%及び5.2%の分画存在量を示すことを同定し、全てが、PDGLP#10072の2つの独立したウェル中の2つの個々の突然変異体の存在を示した。
PDGLP#10072のウェルB10からの全ての10個の穀粒を発芽させた。全ての10個の苗からの葉材料を採取し、REDExtract(Sigma Aldrich)を用いるDNA抽出にかけた。葉試料に由来するgDNAを、上記記載のように解析した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad Laboratories)を用いて解析した。閾値を、2D-プロットを用いて、かつチャネル1の振幅について2000を、チャンネル2の振幅について1600に設定して決定した。PDGLP#10072のウェルC03に由来する1つの苗は、99%の分画存在量を示し、ヘテロ接合突然変異体の存在を確認した。
追加の形質の検証を、同定した突然変異体及び参照試料の両方での直接配列決定法を用いて実施した。REDExtract DNA抽出手順(Sigma Aldrich)を用いて、葉材料からDNAを抽出した。配列決定解析については、1μlの精製gDNA、20μlのREDExtract(Sigma Aldrich)、500nMの標的特異的フォワードプライマー、500nMの標的特異的リバースプライマー及び水を含有する50μlのPCR反応を準備した。試料を、次のPCR条件:94℃で2分間の変性、94℃で45秒間、58℃で45秒間、及び75℃で45秒間の38サイクルのPCR、ならびに72℃で5分間の最終的伸長を用いて熱サイクルさせて、その後、PCRプレートを8℃で保存した。個々のPCR産物を、NucleoSpin Gel及びPCRクリーンアップキットを用いて精製した。全ての試料を、標的特異的フォワードプライマー及び標的特異的リバースプライマーを用いて配列決定した。
ddPCR解析において突然変異に対して陽性である苗はまた、所定のゲノム位置におけるヘテロ接合突然変異体遺伝子型を示した。参照試料は、同じ位置においてホモ接合野生型遺伝子型を示した。
特異的突然変異を保有するオオムギ植物を、2つの手法(その1つがRainDance Technologiesにより提供され、他方がBio-Rad Laboratoriesにより提供される)の併用によって同定された。大まかに言えば、RainDance手法は、多数の突然変異体穀粒からdDNA鋳型を含有する特定のさらに複雑な試料を同定するために利用し、一方後続のBio-Radベースの解析は、対象の突然変異によって特徴付けられる単一の穀粒を同定するために役立った。様々なプールなどの命名は、図2に示した命名を用いて行った。
記載するように、本方法は、任意の突然変異体の同定に使用することができる。本実施例は、31位での推定BAHDアシルトランスフェラーゼ(HvBADH1)をコードするオオムギ遺伝子のコドン領域中のアミノ酸トリプトファンの翻訳終止への交換につながる、特異的突然変異(グアニンからアデニンへ)の同定を記載する。
具体的には、ヌクレオチド93位におけるHvBADH1の変異対立遺伝子伝子と野生型対立遺伝子を識別する、特異的ddPCRアッセイを設計した。野生型コード配列(cDNA配列)は、本明細書では配列番号17として提供され、突然変異体コード配列は、本明細書では配列番号18として提供されている。HvBADH1のアミノ酸配列は、配列番号19として提供されている。突然変異体検出プローブは、配列番号17のヌクレオチド93位にアデニンを含有するコード配列の一部に相補的であった。参照検出プローブは、ヌクレオチド93位にグアニンを含有するコード配列の一部に相補的であった。2つの隣接するプライマーを、コード配列中のヌクレオチド93を包囲するゲノム配列を増幅させるように設計した。さらに、PCR中にDNAポリメラーゼによって参照配列決定の伸長を防止するブロッキングプローブを、3’スペーサで補充された参照検出プローブのヌクレオチド配列を用いて開発した。以下のプライマー及びプローブを、特異的HvBADH1遺伝子座のために開発した。
標的特異的フォワードプライマー(5’-CCCGACCACACGC-3’)(配列番号20)
標的特異的リバースプライマー(5’-ACTCCACCAGGCCG-3’)(配列番号21)
突然変異体検出プローブ(5’-CTGGCGTGAGTGGAC-3’)(配列番号22)-6-カルボキシフルオレセイン-FAMで標識付け
参照検出プローブ(5’-CTGGCGTGGGTGGA-3’)(配列番号23)-テトラクロロフルオレセイン-TETで標識付け
ブロッキングプローブ(5’-CTGGCGTGGGTGGA-3’)(配列番号24)-2’3’-ジデオキシCスペーサで標識付け。
簡単に言うと、1つの96ウェルプレートで表された、全ての94個の「個々のサブ細粉合計のアリコート(ASFT)」の各gDNA抽出物50μLを、1つの「スーパープール」中にプールした。
次いで、94個のASFTからのDNAを含む「スーパープール」が、突然変異穀粒を含有するかどうかを、本質的に上記実施例17で記載されたように、下記の詳細を伴って決定した。
最初に、スーパープールからのgDNAの2μlを、10μlの5×Q5反応緩衝液(New England Biolabs)、200μMのdNTP、0.02U/μlのQ5高性能DNAポリメラーゼ、100nMの標的特異的フォワードPCRプライマー、100nMの標的特異的リバースPCRプライマー、100nMのブロッキングプローブ(2’,3’-ジデオキシCスペーサ)及び水を含有する50μlの富化及びブロッキングPCRに添加した。PCR混合物を、標準PCR条件:98℃で2分間の変性、98℃で10秒間、57℃で20秒間及び72℃で10秒間のPCRの20サイクル、ならびに72℃の5分間の最終伸長を用いて熱サイクルし、その後8℃で保存した。
次いで、SP-gDNA#05に一致する94個のASFTのプレートが突然変異穀粒を含有するかどうかを、本明細書で上記実施例7に本質的に記載されるように、下記の詳細を伴って決定した。
スクリーニングを、およそ30,000個の突然変異オオムギ植物を代表する、合計94個のSGT(サブ穀粒の合計)で実施した。スクリーニングのこの部分に使用されたgDNAは、ASFTから精製されたgDNA-すなわち、富化されていないDNAであった。解析の目的のために、gDNA(GT#377~GT#470)に由来する5μlの精製gDNAを、11μLの2×プローブ用ddPCR Supermix(No.dUTP、Bio-Rad Laboratories)、900nMの標的特異的PCRプライマーのプライマー、250nMの突然変異体検出プローブ(6-カルボキシフルオレセイン-FAM)及び野生型検出プローブ(テトラクロロフルオレセイン-TET)プローブを含有する17μlのPCR混合物に添加した。反応混合物を、AutoDG液滴発生器(Bio-Rad)上に装填し、製造業者のマニュアルに従って、液滴発生を行った。液滴エマルジョンを、標準PCR条件:95℃で10分間の変性、94℃で30秒間及び55℃で1分間の40サイクルのPCR、ならびに98℃で10分間の最終的伸長を用いて熱サイクルさせて、その後、マイクロタイタープレートを8℃で保存した。液滴中のPCR増幅を、QX200液滴リーダー(Bio-Rad Laboratories)を用いて確認した。
突然変異を保有する個々のオオムギ穀粒を、本質的に上記実施例9~15で本明細書に記載されたように、下記の詳細を伴って同定した。
HvBADH1特異的ddPCRアッセイによるgDNA(GT#416)の解析に基づくと、GLP#416の4500個の穀粒(陽性試料gDNA(GT#416)に一致する)が、対象の同一の突然変異を有する1つ以上の穀粒を含む可能性が高いと考えられた。
それぞれGLP#416からの12個の穀粒の96個の試料を順次取り出すことによって、FGLP#416を確立した。各12個の穀粒アリコートを1枚の秤量紙上に置き、次いで1対の鉗子で連続的に固定し、それと同時に、1.6mmのドリルを装備した彫刻盤(Marathon-3、Saeyang Microtech)を用いて、胚乳への2~3mmの深さの小さな孔を穿孔した。回転運動によって、胚乳からの細粉を穀粒の頂部及び周囲の秤量紙に移動させた。10個の穀粒の穿孔された試料を、別の2mLのウェルのマイクロタイタープレート中に置き、穿孔されたオオムギ穀粒PDGLP#416の二次サブプールを得た。それぞれが、12個の穿孔されたオオムギ穀粒に由来する細粉を含む96個の細粉試料を、穿孔された穀粒のものと一致する試料番号付けシステムを維持しながら、1.5mlのマイクロタイタープレートの別個のウェルに移した(PFGLP#416)。
PFGLP#416を、NucleoSpin 96 Plant IIキット(Macherey-Nagel)の使用説明書に詳説された半自動化DNA抽出手順を用いて、gDNAの抽出にかけた。したがって、マイクロタイタープレートの各ウェルは、12個の穀粒の細粉からのgDNAを含有した。
PFGLP#416に由来するDNAを、上記記載(ライブラリー試料が突然変異穀粒を含有するかどうかの決定)と同じPCR混合物及びPCR反応条件を用いて解析した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad Laboratories)を用いて解析した。閾値を、2-Dプロットを用いて、かつチャネル1の振幅について3000を及びチャンネル2の振幅について2500を設定して決定した。マイクロタイタープレートにおける2つの個々のウェル(D10及びF02)が、3.4%及び13.7%の分画存在量を示すことを同定し、PDGLP#416の2つの独立したウェル中の2つの個々の突然変異体の存在を示した。
PDGLP#416のウェルF02からの全ての12個の穀粒を発芽させた。全ての12個の苗からの葉材料を採取し、REDExtract(Sigma Aldrich)を用いるDNA抽出にかけた。葉試料に由来するgDNAを、上記記載(ライブラリー試料が突然変異穀粒を含有するかどうかの決定)と同じPCR混合物及びPCR反応条件を用いて解析した。データを、QuantaSoftソフトウェア(バージョンv1.7、Bio-Rad Laboratories)を用いて解析した。閾値を、2D-プロットを用いて、かつチャネル1の振幅について5000を、チャンネル2の振幅について3200に設定して決定した。PDGLP#416のウェルF02に由来する1つの苗は、39%の分画存在量を示し、ヘテロ接合突然変異体の存在を確認した。
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Claims (24)
- 標的配列において、対象のヌクレオチド(複数可)[NOI(複数可)]中に1つ以上の所定の突然変異(複数可)を保有している定義済みの種の生物の同定方法であって、前記突然変異(複数可)は置換(複数可)であり、前記方法は、
a)複数の遺伝子型を表す、前記種の生物、またはその生殖部分のプールを提供する工程と、
b)前記プールを、生物、またはその生殖部分の1つ以上のサブプールに分割する工程であって、各サブプールが、異なる遺伝子型を有する少なくとも100の生物またはその生殖部分を含み、各サブプールは、各遺伝子型の2つ以上の個々の生物またはその生殖部分を含み、前記プールからの1つの生物またはその生殖部分のすべての子孫は、1つのサブプール内に含まれる、工程と、
c)理論的には、各部分が前記サブプールの各遺伝子型を表す生物またはその生殖部分を含むように、各サブプールを部分にランダムに分割する工程と、
d)前記サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、サブプール内の各遺伝子型から、それぞれgDNAを含む、ゲノムDNA(gDNA)試料を調製する工程であって、前記gDNA試料が各サブプールの前記部分のうちの1つから調製される、工程と、
e)それぞれが1つのサブプールからの前記gDNA試料を含む、複数のPCR増幅を実施し、これにより前記標的配列(複数可)を増幅させる工程であって、各PCR増幅が、前記gDNA試料の一部、各セットが標的配列に隣接するプライマーの1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬をそれぞれの区画化PCR増幅が含む複数の区画化PCR増幅を含むデジタルPCRである、前記工程と、
f)前記NOI(複数可)において前記置換(複数可)を含む1つ以上の標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、前記置換(複数可)を含むサブプール(複数可)を同定する工程であって、前記置換(複数可)を含むサブプールの前記同定が、
(α)前記置換(複数可)を含むプライマーの1つ以上のセット(複数可)で増幅された前記PCR増幅産物の存在、
(β)前記置換(複数可)を含まないプライマーの1つ以上のセット(複数可)で増幅された前記PCR増幅産物の不在、
(γ)前記置換(複数可)を含む前記PCR増幅産物に特異的な検出プローブの検出、および/または
(δ)前記置換(複数可)を含まないPCR増幅産物に特異的な検出プローブの検出
によって決定される、工程と、
g)前記同定したサブプールの前記生物、またはその生殖部分を、二次サブプールに分割する工程と、
h)二次サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、それぞれが前記二次サブプール内の各遺伝子型からのgDNAを含むgDNA試料を調製する工程と、
i)それぞれが1つの二次サブプールからの前記gDNA試料、各セットが標的配列に隣接するプライマーの1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬を含む複数のPCR増幅を実施し、これにより前記標的配列(複数可)を増幅する工程と、
j)前記NOI(複数可)において前記所定の置換(複数可)を含む1つ以上の標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物を検出し、これにより前記置換(複数可)を含む工程j)下にある二次サブプールを同定する工程であって、前記置換(複数可)を含む二次サブプールの前記同定が、
(α)前記置換(複数可)を含むプライマーの1つ以上のセット(複数可)で増幅された前記PCR増幅産物の存在、
(β)前記置換(複数可)を含まないプライマーの1つ以上のセット(複数可)で増幅された前記PCR増幅産物の不在、
(γ)前記置換(複数可)を含む前記PCR増幅産物に特異的な検出プローブの検出、および/または
(δ)前記置換(複数可)を含まないPCR増幅産物に特異的な検出プローブの検出
によって決定される、工程と、
k)前記置換(複数可)を保有している前記二次サブプール内の生物またはその生殖部分を同定する工程と、を含む、前記方法。 - 工程e)の前記デジタルPCR増幅(複数可)が、以下の:
-前記gDNA試料、各セットが標的配列に隣接するプライマーの1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬を含む1つ以上のPCR増幅を準備する工程と、
-前記PCR増幅(複数可)を複数の空間的に分離された区画に区分化する工程と、
-PCR増幅(複数可)を実施する工程と、
-PCR増幅産物を検出する工程と、を含む方法によって実施される、請求項1に記載の方法。 - 前記空間的に分離された区画が、水-油エマルジョン液滴などの液滴である、請求項2に記載の方法。
- 各PCRが、1000~100,000個の範囲の空間的に分離された区画に区画化される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物のプールが、前記種の前記生物、またはその生殖部分を、ランダム突然変異誘発にかけることによって調製される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物プールが、異なる遺伝子型を有する、少なくとも10,000、好ましくは少なくとも50,000、好ましくは少なくとも100,000の生物、またはその生殖部分を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記プール内の生物、またはその生殖部分の複製の工程を含み、前記生殖の工程が、前記生物をサブプールに分割する工程b)と同時に、またはそれに続いて実施される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記種が、植物であり、前記方法の工程a)及びb)が、
-植物の複数の種子を提供する工程と、
-前記種子をランダム突然変異誘発にかけて、これにより、M0世代の種子を得る工程と、
-前記M0世代の種子を成熟植物に生育させて、前記成熟植物から種子を得る工程であって、前記種子がM1世代の種子である、前記工程と、
-任意に、先の工程をX回繰り返し、M(1+X)世代の種子を含む植物を得る工程と、-前記成熟植物からM1世代またはM(1+X)のいずれかの種子を得て、これにより種子のプールを得る工程と、
-様々な工程の前記プールをサブプールに分割する工程であって、所与の成熟植物からの全ての種子が、同じサブプール中に配置される、前記工程と、を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも50,000個の種子、例えば、少なくとも100,000個の種子が提供される、請求項8に記載の方法。
- 前記種が、単細胞生物であり、前記方法の工程a)及びb)が、
-複数の単細胞生物を提供する工程と、
-前記生物をランダム突然変異誘発にかける工程と、
-前記突然変異誘発された生物をサブプールに分割する工程と、
-各サブプールを複製の工程にかける工程と、を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記種が、単細胞種であり、工程g)が、以下の:
-1つまたはいくつかのNOI(複数可)において前記置換(複数可)を含むサブプールを提供する工程と、
-前記サブプールの前記生物の一部または全てをクローン方式で複製して、クローン培養を得る工程と、
-複数の前記クローン培養からの生物の分画を組み合わせて、二次サブプールを得る工程と、を含む、請求項1~7および10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記種が、植物であり、工程g)及びh)が、以下の:
-植物の複数の種子を含むサブプールを提供する工程であって、前記サブプールが、前記NOI(複数可)の1つまたはいくつかの置換(複数可)を含む、前記工程と、
-前記サブプールの前記種子を、それぞれが1~100個の範囲の種子を含む二次サブプールに分割する工程と、
-植物に生育するのに十分に完全な状態で前記種子を保つ方法で、前記二次サブプールの各種子から試料を得て、各二次サブプールの全ての種子からの全ての試料を組み合わせる工程と、
-gDNA試料を前記組み合わせた試料から調製する工程と、を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試料が、前記種子に穴をあけて、その後得られた細粉を収集することによって得られる、請求項12に記載の方法。
- 前記方法が、前記NOI(複数可)において1つ以上の置換(複数可)を含むスーパープールを同定する工程をさらに含み、前記スーパープールが、サブプールの一群である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、工程d)の後に実施される以下の:
-各サブプールからの各gDNA試料の分画を得る工程と、
-gDNA試料の複数の分画をスーパープール中に組み合わせて、これにより、複数のサブプールからのgDNA試料を含むgDNAスーパープールを得る工程と、
-それぞれがgDNA試料のスーパープールを含む複数のPCR増幅を実施して、これにより前記標的配列(複数可)を増幅する工程であって、各PCR増幅が、それぞれが前記gDNA試料の一部、各セットが標的配列に隣接するプライマーの1つ以上のセット(複数可)及びPCR試薬を含む複数の区画化PCR増幅を含む、前記工程と、
-前記NOI(複数可)における前記置換(複数可)を含む1つ以上の標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、前記突然変異を含むスーパープール(複数可)を同定する工程と、をさらに含む、請求項14に記載の方法。 - 前記種が、単細胞生物、例えば酵母である、請求項1~7、10~11、14~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記種が、植物、例えば顕花植物である、請求項1~9、及び12~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記種が、穀物、例えばオオムギである、請求項1~9、12~15、及び17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記置換が、単一ヌクレオチドの置換である、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、2つ以上の所定の突然変異の同定する方法である、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 標的配列において、定義済みの種の生物、またはその生殖部分のサブプールの同定方法であって、前記サブプールは、対象のヌクレオチド(複数可)[NOI(複数可)]中に1つ以上の所定の突然変異(複数可)を保有している定義済みの種の生物を含み、前記突然変異(複数可)は置換(複数可)であり、前記方法は、
a)複数の遺伝子型を表す、前記種の生物、またはその生殖部分のプールを提供する工程と、
b)前記プールを、生物、またはその生殖部分の1つ以上のサブプールに分割する工程であって、各サブプールが、異なる遺伝子型を有する少なくとも100の生物またはその生殖部分を含み、各サブプールは、各遺伝子型の2つ以上の個々の生物またはその生殖部分を含み、前記プールからの1つの生物またはその生殖部分のすべての子孫は、1つのサブプール内に含まれる、工程と、
c)理論的には、各部分が前記サブプールの各遺伝子型を表す生物またはその生殖部分を含むように、各サブプールを部分にランダムに分割する工程と、
d)各サブプールの前記部分のうちの1つからゲノムDNA(gDNA)試料を調製し、そして残余の生物またはその生殖部分を生殖能を維持する条件下で保存する工程と、
e)それぞれが1つのサブプールからの前記gDNA試料を含む、複数のPCR増幅を実施し、これにより前記標的配列(複数可)を増幅させる工程であって、各PCR増幅が、前記gDNA試料の一部、各セットが標的配列に隣接する1つ以上のプライマーセット(複数可)、及びPCR試薬をそれぞれの区画化PCR増幅が含む複数の区画化PCR増幅を含むデジタルPCRである、工程、
f)前記NOI(複数可)において前記置換(複数可)を含む1つ以上の標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、前記置換(複数可)を含むサブプール(複数可)を同定する工程であって、前記置換(複数可)を含むサブプールの前記同定が、
(α)前記置換(複数可)を含むプライマーの1つ以上のセット(複数可)で増幅された前記PCR増幅産物の存在、
(β)前記置換(複数可)を含まないプライマーの1つ以上のセット(複数可)で増幅された前記PCR増幅産物の不在、
(γ)前記置換(複数可)を含む前記PCR増幅産物に特異的な検出プローブの検出、および/または
(δ)前記置換(複数可)を含まないPCR増幅産物に特異的な検出プローブの検出
によって決定される、工程と、
を含む、前記方法。 - 各サブプールの前記生物またはその部分の10~50%の範囲が、前記gDNA試料を調製するために使用される、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 標的配列において、定義済みの植物種の植物、またはその生殖部分のサブプールの同定方法であって、前記サブプールは、対象のヌクレオチド(複数可)[NOI(複数可)]中に1つ以上の所定の突然変異(複数可)を保有している植物を含み、前記突然変異(複数可)は置換(複数可)であり、前記方法は、
a)植物の複数の生殖部分を提供する工程であって、少なくとも100個の生殖部分を提供する工程と、
b)前記生殖部分をランダム突然変異誘発にかけて、これにより、M0世代の生殖部分を得る工程と、
c)前記M0世代の生殖部分を成熟植物に生育させて、前記成熟植物から生殖部分を得る工程であって、前記生殖部分がM1世代の生殖部分である、前記工程と、
d)前記成熟植物からM1世代の生殖部分を得て、これにより生殖部分のプールを得る工程と、
e)M1世代の生殖部分の前記プールをサブプールに分割する工程であって、所与の成熟M0植物からの全ての生殖部分が、同じサブプール中に配置され、各サブプールが、複数の遺伝子型を含む、前記工程と、
f)理論的には、各部分が前記サブプールの各遺伝子型を表す生殖部分を含むように、各サブプールを部分にランダムに分割する工程と、
g)前記サブプール内の各遺伝子型の植物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、サブプール内の各遺伝子型から、それぞれgDNAを含む、ゲノムDNA(gDNA)試料を調製する工程であって、前記gDNA試料が各サブプールの前記部分のうちの1つから調製される、工程と、
h)それぞれが1つのサブプールからの前記gDNA試料を含む、複数のPCR増幅を実施し、これにより前記標的配列(複数可)を増幅させる工程であって、各PCR増幅が、前記gDNA試料の一部、各セットが標的配列に隣接する1つ以上のプライマーセット(複数可)、及びPCR試薬をそれぞれの区画化PCR増幅が含む複数の区画化PCR増幅を含むデジタルPCRである、工程、
i)前記NOI(複数可)において前記置換(複数可)を含む1つ以上の標的配列(複数可)を含むPCR増幅産物(複数可)を検出し、これにより、前記置換(複数可)を含むサブプール(複数可)を同定する工程であって、前記置換(複数可)を含むサブプールの前記同定が、
(α)前記置換(複数可)を含むプライマーの1つ以上のセット(複数可)で増幅された前記PCR増幅産物の存在、
(β)前記置換(複数可)を含まないプライマーの1つ以上のセット(複数可)で増幅された前記PCR増幅産物の不在、
(γ)前記置換(複数可)を含む前記PCR増幅産物に特異的な検出プローブの検出、および/または
(δ)前記置換(複数可)を含まないPCR増幅産物に特異的な検出プローブの検出
によって決定される、工程と、
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