CN114959098A - 通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法。具体而言，在传统的植物育种方法中，化学突变可用于在植物基因组中随机引入核苷酸取代，即不可能控制核苷酸的变化位点。由于基因组的复杂性，就找到预定的核苷酸取代而言，其统计概率极小。然而，本发明显示了如何研发出一种数字聚合酶链反应(dPCR)优选液滴dPCR(ddPCR)的新的替代用途，以用于发现突变基因中特定核苷酸取代。整个平台包括具有突变生物体文库的筛选方法，基于数字PCR的系统和用于繁殖和分析经鉴定的突变生物体的装置。
Description
本申请是申请号为201780041101.5，申请日为2017年6月23日，发明名称为“通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法”的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本发明提供了高度加速的方法和工艺，其可以在实践中扩展和处理生物体的制备、选择和/或繁殖，所述生物体在一个或多个感兴趣的核苷酸(NOI)位点具有特定的、预定的突变。例如，本发明的方法可用于提高制备植物的速度和能力，所述植物在一个或多个NOI具有特定的、预定的突变。
背景技术
生成遗传修饰(GM)生物体(GMO)的遗传方法广泛可用。然而，出于许多目的，特别是在食品和饮料工业中，GMO的应用通常不太合乎需要。因此，仍然存在着长期需求以提供改进的和更精确的方法用于传统的作物育种，包括谷物如大麦，从而简单地获得用于开发和制造新产品的更好的定制原料。在其他生物体中也存在类似缺点，包括微生物和动物。遗憾的是，传统育种方法中缺乏一种解决发现基因组中预定核苷酸突变的方法，从而限制了原料开发的进程。
存在允许基因组编辑和在生物体基因组中的靶向位点引入双链DNA断裂的方法，例如通过CRISPR-Cas9技术(Jiang等，2016)。CRISPR-Cas9技术存在两个明确的主要相关问题：
-首先，CRISPR-Cas9技术可被视为基于GM。因此，缺乏基本立法信息，即当局旨在如何规范基因组编辑的新遗传工具，包括在基因组中的靶向位点引入双链DNA断裂；
-其次，存在与CRISPR-Cas9技术的脱靶切割有关的主要问题。
在自然环境中的种系突变，例如导致生物体表型后果的突变，既代表了遗传性状变异的主要原因，也是分子水平上有利或破坏性影响的进化改变的最终来源。突变由多种因素引起，包括：
-复制错误；
-DNA损伤，要么未正确修复要么未修复；
-由外源因素引起的DNA损伤-例如化学品、紫外线和电离辐射；
-内生因素，例如活性氧、醛类或有丝分裂错误；
-参与DNA修复或基因组编辑的酶；
-插入DNA片段的病毒和内源性反转录转座子。
此外，目前的理解是暴露于突变剂可能诱导大量的体细胞基因突变，其中大部分没有明显的选择性优势，但有些可能改变关键的细胞功能。此外，一些基因组相关特性可能是非突变的，例如表观遗传变化和细胞微环境的改变。
传统的作物育种涉及随机诱变，然后筛选所需的性状。遗憾的是，缺乏有效的筛选方法来鉴定预定的基因变化，即突变生物体的基因或调节元件中的特定核苷酸取代，例如没有采用基于GM的方法的谷物。实际上，GM植物在性状开发本身的定向方法和更广泛的科学应用方面经历了＞10年的竞争优势。然而，如上所述，基于GM的方法并不是优选的。
最近开发的基因组测序技术的结果彻底改变了对性状遗传结构的理解(以及响应于诱变的相应变化)。例如人们普遍期望的是，全基因组测序和新的计算方法在大的高通量gDNA测序的帮助下将有助于回答几个基本的生物学问题并加速突变体表征，例如，使用单子叶谷类植物大麦。
在真核生物中，一些突变过程似乎在基因组分布上显示出相当大的变异(Pleasance等，2010；
和Lehner，2012)。点突变的数量沿着基因组变化，并且在低基因表达水平、抑制的染色质和晚期复制时间的序列区域中通常更高。这种变化中的一些可以通过减少错配修复机制对闭合染色质区域的访问来实现。
鉴于上面提供的背景信息，谷物研究领域的技术人员将会知道，所述分析进展使大麦和谷物研究成为新领域的门槛，特别是在基于分子生物学的深入理解和具有新特征植物的工业应用之间的R&D阶段。也就是说，尽管用于突变体鉴定的基因组测序技术取得了进展，但这些方法仍然耗时且在逻辑上具有挑战性，并且对于鉴定特定的预定突变几乎没有用处。
另外两个属性仍然令人感兴趣，不仅涉及鉴定具有预定突变的植物，而且涉及利用改进：
-划定谷物种系和体细胞突变率的范围。
-目前的方法集中在gDNA片段突变体搜寻的范围缩小，其基于背景非依赖性的gDNA序列分析[例如，Tilling方法，其仅限于筛选最多5,000到10,000个突变体，以及突变体和野生型衍生gDNA片段之间的熔点差异(Botticella等，2011)]。
到目前为止，使用非GM方法找到预定的和复杂的突变被认为是不现实的。同样沿着这条线，没有关于何种样品大小可以可靠地鉴定出感兴趣的特定核苷酸取代的提示。现在，通过本公开中提供的指导可以实现这一点。
发明内容
本发明公开了发现在一个或多个靶序列中具有预定的感兴趣的核苷酸突变的单个、传统开发的生物体的方法。所述突变可以是赋予特定、有用性状的基因突变。
特别地，基于对突变结构的令人惊讶的新颖见解，本发明提供了用于突变体发现应用的惊人的但相对简单的、新的全基因组方法。本发明提供了鉴定在一个或多个NOI具有预定突变的生物体的方法。预定突变可以是任何期望的突变。因此，本发明提供了非GM方法，其能够鉴定具有特定突变的生物体。归因于PCR技术特别是数字PCR的创造性利用，这成为可能。因此，本发明公开了一种定位用于筛选的突变DNA背景的新方法，其与逻辑创新的系统相结合，该系统能够分析突变生物体的巨大集合。
还公开了耗时间少、处理最小化的新操作，其完成了寻找罕见突变的挑战性任务，例如预计位于谷粒核的上述闭合染色质区域的那些突变，包括大麦的那些突变。利用对全基因组序列的访问来设计用于所述方法的引物和/或探针。因此，全大麦基因组序列(Ensembl Plants中的大麦基因组集合，版本号082214v1)可用于设计特定基因的引物和探针，非常适合于提高发现具有预定突变的植物的速率。
在一个实施方案中，本发明提供了通过传统或常规育种方法搜索预定突变的方法，所述预定突变例如是导致基因中的核苷酸取代的突变，与谷物性状相关。利用所公开的方法，提出了有助于阐明与内源诱变和诱导诱变相关的潜在分子机制的方法。
本发明在所附权利要求中限定。
本发明提供了鉴定预定物种的生物体的方法，所述生物体在靶序列的NOI携带一种或多种预定突变，所述方法包括以下步骤：
a)提供代表多个基因型的所述物种生物体或其繁殖部分的池；
b)将所述池划分为一个或多个生物体或其繁殖部分的子池；
c)制备gDNA样品，每个样品包含来自子池内每个基因型的gDNA，同时保持所述子池内每个基因型生物体的增殖潜力；
d)进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包含来自一个子池的gDNA样品，其中每个PCR扩增包括多个区室化PCR扩增，每个区室化PCR扩增包含所述gDNA样品的一部分、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列；
e)检测包含一个或多个靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含感兴趣的NOI的突变，从而鉴定包含所述突变的子池；
f)将所述经鉴定的子池的生物体或其繁殖部分分为次级子池；
g)制备gDNA样品，每个样品包括来自次级子池中的每个基因型的gDNA，同时保持所述次级子池内每个基因型生物体的增殖潜力；
h)进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包含来自一个次级子池的gDNA样品、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列；
i)检测包含靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI的预定突变，从而鉴定包含所述突变的步骤h)中的次级子池；
j)鉴定携带所述突变的所述次级子池内的生物体或其繁殖部分。
本发明还提供了通过本发明方法鉴定的生物体。例如，本发明提供了一种携带编码谷氨酰胺合酶的HvGS1-3基因中的突变的大麦植物，其中所述突变基因编码活性降低的突变HvGS1-3蛋白。
本文中以5个工作流(WS)进一步说明本发明，其以顺序方式鉴定谷类突变谷粒集合中的特定的、预定的核苷酸突变：WS1项目公开了建立传统诱导的谷类植物集合的过程；WS2细节详细介绍了如何构建复杂的谷粒样品；WS3强调了如何识别包含突变体的谷粒样品；与WS4相关的分析描述了如何寻找单个的突变谷物谷粒，以及；WS5重点关注结合使用的两种不同的数字PCR仪器如何有助于筛选来自谷物谷粒的超高量gDNA样品。
附图说明
图1给出了关于本申请整体实验概念的示例。
图2给出了使用植物物种大麦作为实例的本申请总体实验概念的示例。A涉及突变的大麦谷粒的繁殖(如在本发明的详细描述中解释的WS1)；B显示了制备有序的突变谷粒文库的各方面(如在本发明的详细描述中解释的WS2)；C提供了关于如何确定谷粒部分是否包含单个感兴趣的谷粒的概述(如本发明的详细描述中解释的WS3)；D着重于如何在具有谷粒混合物的样品中鉴定具有特定突变的谷粒(如本发明详细描述中解释的WS4)；E提供了在组合gDNA样品中检测突变DNA所涉及的工作流程的说明(如本发明的详细描述中解释的WS5)。
本发明的详细描述
定义
术语“等位基因”是指基因的特定形式或状态。这里使用的术语“突变体等位基因”是指在NOI携带一个或多个预定突变的基因。当突变是整个基因的缺失时，突变体等位基因也可以是缺少所述基因的等位基因。
本文所用的与数字有关的术语“大约”是指±10％，优选±5％，例如±1％。
本文所用的术语“阻断探针”是指寡核苷酸，其不能通过DNA聚合酶在3′末端延伸。阻断探针通常是寡核苷酸，其与靶序列相同或互补，包括与阻断剂连接的参考NOI，其抑制DNA聚合酶对阻断探针的延伸。
本文所用的术语“基因型”是指包含特定组基因的生物体。因此，包含相同基因组的两个生物体具有相同的基因型。与特定基因相关的生物体基因型由所述生物体携带的等位基因决定。在二倍体生物体中，给定基因的基因型可以是AA(纯合的，显性的)或Aa(杂合的)或aa(纯合的，隐性的)。
本文所用的术语“突变检测探针”是指任选地与可检测手段连接的寡核苷酸，其中寡核苷酸与靶序列相同或互补，包括NOI的预定突变。
本文所用的术语“PCR”是指聚合酶链式反应。PCR是用于扩增核酸的反应。该方法依赖于热循环，并且包括反复加热和冷却反应的周期，以获得所述DNA的连续解链和酶促复制。在第一步中，形成DNA双螺旋的两条链在高温下物理分离，这一过程也称为DNA解链。在第二步中，降低温度以允许DNA的酶促复制。PCR还可以包括在另外的温度下孵育以增强引物的退火和/或优化复制的温度。在PCR中，温度通常在各种温度之间循环多个周期。
本文所用的术语“PCR试剂”是指除了样品和一组引物之外还添加到PCR中的试剂。PCR试剂至少包含核苷酸和核酸聚合酶。另外，PCR试剂可包含其他化合物，例如盐和缓冲剂。
术语“ddPCR”是指液滴数字聚合酶链反应。在ddPCR中，进行一次或多次PCR扩增，其中每个反应被分离成多个水-油乳液液滴，从而可以在每个单独的液滴中发生靶序列的PCR扩增。
本文所用的术语“繁殖”是指有性和无性繁殖。因此，繁殖可以克隆方式繁殖生物体(也称为“无性繁殖”)。繁殖还可以产生生物体的后代，其中后代包含来自亲本生物体的等位基因。因此，包含突变体等位基因的生物体的繁殖可以指产生所述生物体的后代，其中后代包含突变体等位基因。优选地，突变体等位基因携带NOI的一种或多种突变。
本文所用的术语“生物体的繁殖部分”是指在适当条件下可生长成整个生物体的生物体的任何部分。举例来说，在物种是植物的本发明的实施方案中，所述生物体的繁殖部分可以例如是所述植物的种子、谷粒或胚。在本发明的实施方案中，其中物种是单细胞生物体，那么繁殖部分是整个生物体，即一个细胞。
本文所用的术语“位于靶序列侧翼的引物组”是指位于靶序列侧翼的一组两个引物，因此，一个引物包含与靶序列的5'末端相同的序列(也称为“正向引物”)，一个引物包含与靶序列的3'末端互补的序列(也称为“反向引物”)。当在允许扩增所述靶序列的条件下，与包含靶序列和PCR试剂的核酸一起加入PCR时，“引物组”能够扩增靶序列。
本文所用的术语“靶序列”是指在其中需要产生或鉴定突变的任何核酸序列。此外，靶序列优选是核酸序列，其可以使用位于靶序列侧翼的引物通过PCR技术扩增。另外，靶序列通常包含一个或多个NOI。本发明提供了产生和/或鉴定在所述NOI中携带突变的生物体的方法。例如，靶序列可以是与特定性状相关的核酸序列。
本文所用的术语“参考检测探针”是指任选与可检测手段连接的寡核苷酸，其中寡核苷酸与靶序列相同或互补，包括参考NOI。通常，包括参考NOI的靶序列对应于诱变前的靶序列。“参考检测探针”也可以称为“野生型探针”。
本文所用的术语“工作流”(WS)涉及方法的一系列的一个或多个步骤。
鉴定生物体的方法
本发明涉及鉴定预定物种的生物体的方法-例如，下文“物种”部分中描述的任何物种，其在靶序列中携带NOI的突变[例如下文“感兴趣的核苷酸”部分中描述的任何突变]-且所述方法包括以下步骤：
a.提供指定的预定物种的生物体或其繁殖部分的池，代表多个基因型，例如下文“生物体池”部分所述的任何池；
b.将所述池分为一个或多个生物体或其繁殖部分的子池，例如下文“将池划分为子池”部分所述；
c.准备gDNA样品，每个样品包含来自子池内每个基因型的gDNA，同时保持所述子池内每个基因型的生物体的增殖潜力，其例如如下文“制备DNA样品”部分所述进行；
d.进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包含来自一个子池的gDNA样品，其中每个PCR扩增包含多个区室化PCR扩增，每个区室化PCR扩增包含所述gDNA样品的一部分、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，其例如如下文“包含多个区室化PCR扩增的PCR扩增”部分中所述完成；
e.检测包含具有NOI突变的靶序列的PCR扩增产物，从而鉴定包含所述突变的子池，其例如如下文“检测PCR扩增产物”部分所述进行；
f.将所述经鉴定的子池的生物体或其繁殖部分分成次级子池，例如下文“将子池分为次级子池”部分所述；
g.制备gDNA样品，每个样品包含来自次级子池中每个基因型的基因组DNA，同时保持所述次级子池内每个基因型的生物体的增殖潜力，其例如如“制备DNA样品”部分中所述进行；
h.进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包含来自一个次级子池的gDNA样品、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，其例如如“鉴定次级子池”部分中所述进行；
i.检测包含靶序列的PCR扩增，所述靶序列包含NOI的突变，从而鉴定包含所述突变的次级子池，其例如如“鉴定次级子池”部分中所述进行；
j.鉴定携带所述突变的所述次级子池内的生物体，其例如如“鉴定生物体”部分中所述进行。
步骤a.可以例如包括提供如本文WS1中所述制备的生物体池。
步骤b.可以如本文WS2中所述进行。
步骤c.、d.和e.可以如本文WS3中所述进行。
步骤f.、g.、h.、i.和j.可以如本文WS4中所述进行。
通常，PCR试剂至少包含核苷酸和核酸聚合酶。此外，PCR试剂还可以优选包括一种或多种检测探针，例如上文“检测PCR产物”部分中所述的突变检测探针和/或参考检测探针。
除了上面概述的步骤之外，本发明的方法可以包括一个或多个另外的步骤。例如，该方法可以包括制备所述生物体池的步骤，例如通过诱变。制备生物体池的方法在下文“生物体池”部分中描述。
该方法还可以包括在生物体或其繁殖部分的池或子池内繁殖一个或多个所述生物体或其繁殖部分的步骤。在简单生物体，例如无性繁殖的单细胞生物体的情况下，所述繁殖步骤可以包括一个或多个细胞分裂。在更复杂的生物体，例如有性繁殖的生物体的情况下，该步骤可包括通过一个或多个周期培育所述生物体或其繁殖部分。
在下文中，仅参考“生物体”。然而，同样的考虑适用于使用生物体的繁殖部分的方法。培养生物体的每个步骤都可能导致后代，其与原始生物体不同。例如，在多倍体生物体的随机诱变之后，大多数生物体仅在一个等位基因上携带任何随机突变，因此就该突变而言是遗传杂合的。通常，后代生物体包括没有突变的生物体，对于突变遗传杂合的子代生物体和对于突变遗传纯合的子代生物体。因此，原始池或生物体或其繁殖部分的子代池与原始池不同，但通常至少代表原始池中存在的NOI的任何突变-即杂合子和/或纯合子生物体。因此，至少一些所述后代包含突变体等位基因。同样，子池、超级池或次级子池的后代可能与原始子池、超级池或次级子池不同，但通常至少代表原始子池、超级池或次级子池中存在的NOI的任何突变，以杂合子或纯合子的形式存在。
因此，将池分成另外一个子池的步骤b)可以包括繁殖生物体或其繁殖部分的步骤。例如，其可以与将池分成子池同时进行。或者，其可以在将池分为子池之后完成。因此，本发明的方法可以在步骤b)之后包括繁殖所述子池内的生物体或其繁殖部分的步骤。
类似地，本发明的方法可以在步骤f)之后包括繁殖所述次级子池内生物体或其繁殖部分的步骤。然而，在本发明的一些实施方案中，特别是在本发明的实施方案中，其中所述物种是植物例如谷类，则优选所述方法不包括在步骤f)和g)之间繁殖次级子池的生物体或其繁殖部分的步骤。
在本发明的一些实施方案中，所述方法包括繁殖次级子池中包含的生物体或其繁殖部分的步骤，所述次级子池包含NOI的突变。所述步骤可以在任何有用的时间进行，例如，在上述步骤i)和j)之间。
该方法还可以包括鉴定包含NOI的突变的一组子池的步骤。所述步骤可以在任何有用的时间进行，但是经常在上述方法的步骤c)之后进行，并且可以如下文“超级池”部分中所述进行。
在一个实施方案中，本发明的方法可以总结为4至5个单独的工作流，例如，WS1到WS5，每个被分成若干个单独的“步骤”，如下所述。尽管包含或甚至由WS1至WS5组成的方法代表本发明的优选实施方案，但本发明不限于包含这些WS的方法。例如，本发明的方法可以仅包括WS2至WS5，缺少WS1。所述方法例如在图1中示出。图2中进一步示出了包括WS1至WS5的方法的示例，其分为5个部分，其中：
-图2A涉及本发明实施方案中WS1的具体示例，其中所述物种是大麦。该图说明了突变的大麦谷粒的繁殖，如本文WS1中详述。
-图2B显示了制备有序的突变谷粒文库方面的示例，如本文WS2中详述(参见实施例1和实施例2)。
-图2C提供了关于如何确定“谷粒总量”部分是否包含以NOI的突变为特征的谷粒的概述示例，如本文WS3中详述(参见实施例3至实施例7)。
-图2D突出显示了WS4的一个例子，即确定“谷粒总量”部分中哪个或哪些谷粒含有NOI的突变的程序-所述部分先前显示包括含有NOI突变的谷粒，参见图2C-，如本文步骤4中详述(参见实施例8至实施例15)。
-图2E给出了WS5中过程概述的一个例子，其中利用区室化PCR技术(例如ddPCR)来确定gDNA的“超级池”，即gDNA样品的组合等份试样(实施例17)，其包含对应于NOI突变的突变。
感兴趣的核苷酸(NOI)
本发明涉及鉴定一种或多种携带一个或多个感兴趣核苷酸突变的生物体的方法。特别地，该方法允许鉴定携带一个或多个NOI预定突变的生物体。因此，该方法允许鉴定携带特定突变的生物体，同时仍依赖于非GM方法。
突变可以是任何突变，其中所述一个或多个感兴趣的NOI与参考序列中的相应NOI不同。通常，参考序列是野生型序列。然而，参考序列也可以是任何其他序列。
突变可以是任何种类的突变，例如上述的缺失、插入、取代或混合。
NOI可以是单个核苷酸或几个核苷酸，因此NOI可以由至少一个，例如1个，例如2个，例如3个，例如4个，例如5个，例如6个，例如7个，例如8个，例如9个，例如10个，例如10至20个，例如20至50个，例如超过50个核苷酸组成。
在本发明的优选实施方案中，NOI由单个核苷酸组成-在这种情况下，突变例如可以是单个核苷酸的取代。这种突变也称为点突变。
在本发明的其他实施方案中，突变可以是所述NOI的缺失。在其他实施方案中，突变可以是在感兴趣的两个核苷酸之间插入一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中，参考序列是野生型序列，即最常见的天然存在的序列，因此突变是与所述野生型序列相比的突变。
在一个实施方案中，突变可以与所述物种内的期望性状相关。根据物种的类型，可以从多种不同性状中选择所需的性状。在本发明的实施方案中，其中所述物种是驯化植物，所述性状可以例如活力增强，对各种环境因子的抗性增强，生长或更高产量的增加。在本发明的实施方案中，其中所述物种是用于食品、饲料或饮料生产的植物，所述性状还可以涉及增强的营养价值，增强的风味特性，增强的储存特性或增强的用于生产所述食物、饲料或饮料的有用性。
NOI可以位于任何核酸中的任何靶序列中。通常，靶序列是gDNA序列的一部分。更优选地，靶序列是gDNA序列的一部分。因此，突变可以是所述生物体的gDNA的突变。NOI可以位于gDNA的任何部分，编码区和非编码区中。通常，NOI可以位于基因的任何部分，例如在编码区内(例如在外显子内)，在内含子中或在基因的调节区中，例如，在启动子、终止子和/或内含子中。
物种
本发明的方法包括鉴定预定物种的生物体。该物种可以是任何物种，包括多细胞和单细胞生物。例如，该物种可以是Open Tree of Life中包含的物种，例如，2015年10月12日生成的Open Tree of Life参考分类版本2.9草案12。
该物种可以是原核生物，例如细菌。细菌的实例包括用于生产食物的细菌，例如选自由醋杆菌属(Acetobacter)，节杆菌属(Arthrobacter)，Alactobacillus，芽孢杆菌属(Bacillus)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)，短状杆菌属(Brachybacterium)，短杆菌属(Brevibacterium)，肉杆菌属(Carnobacterium)，棒状杆菌属(Corynebacterium)；肠球菌(enterococcus)，葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)，哈夫尼菌属(Hafnia)，盐单胞菌(Halomonas)，考克氏菌属(Kocuria)，乳杆菌属(Lactobacillus)，乳球菌属(Lactococcus)，明串珠菌属(Leuconostoc)，巨型球菌(Macrococcus)，微杆菌(Microbacterium)，微球菌(Micrococcus)，片球菌属(Pediococcus)，丙酸杆菌(Propionibacterium)，变形杆菌(Proteus)，假单胞菌属(Pseudimonas)，嗜冷杆菌(Psychrobacter)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，链霉菌属(Streptomyces)，四联球菌(Tetragenococcus)，魏斯氏菌属(Weissella)和发酵单胞菌属(Zymomonas)构成的组的属的菌。
该物种也可以是真核生物，例如选自真菌、藻类、植物和动物。
在一个实施方案中，该物种选自真菌。因此，该物种可以是单细胞或多细胞生物体。例如，该物种可以选自由曲霉属(Aspergillus)，念珠菌属(Candida)，Cystofilobasidium，Cyberlindnera，德巴利酵母属(Debaryomyces)，镰孢属(Fusarium)，地霉属(Geotrichum)，伊萨酵母(Issatchenkia)，Kazachstania，克勒克酵母属(Kloeckera)，Klyveromyces，毛霉属(Mucor)，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，毕赤酵母属(Pichia)，Rhiozopus，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，红酵母属(Rhodotorula)，酵母属(Saccharomyces)，孢圆酵母(Torulaspora)，球拟酵母属(Torulopsis)，毛孢子菌属(Thrichosporon)，轮枝菌属(Verticillium)，耶氏酵母(Yarrowia)和Zygotorulaspora构成的组的属的真菌。
特别地，该物种可以是酵母，如选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)，贝酵母(Saccharomyces bayanus)和葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)构成的组。其他感兴趣的酵母包括酒香酵母属(Brettanomyces)等。
在本发明的一个优选实施方案中，该物种是植物。所述植物可以是绿色植物，例如选自由开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类植物、石松、金鱼藻、苔类、苔藓和绿藻构成的组的植物。植物可以是例如单子叶植物或双子叶植物。
特别地，植物可以是驯化植物。所述驯化植物可以是人类培养的任何植物，例如作为食品、饲料的来源，或用于生产商品或用于美学目的的原材料。
在本发明的一个优选实施方案中，该物种是谷物。如本文所定义的“谷类”是禾本科植物家族的成员，主要为其含淀粉的种子或谷粒而栽培。谷物包括但不限于大麦(Hordeum)，小麦(Triticum)，水稻(Oryza)，玉米(Zea)，黑麦(Secale)，燕麦(Avena)，高粱(Sorghum)和小麦-黑麦杂交的黑小麦。
植物也可以是其他驯化植物，包括番茄。
如上所述，该物种也可以是动物，例如家养动物，例如选自牛、鸡、猪、绵羊、山羊，骆驼、马、火鸡、鸭和兔的动物。
生物池
本发明的方法包括提供代表多个基因型的给定物种的生物体池。例如，所述物种可以是上文“物种”部分中描述的任何物种。
因此，生物体池包括多个生物体，它们都属于同一物种，但代表所述物种的不同基因型。该池可包含每个基因型的一种以上的生物体。然而，该池必须包含多个不同基因型的生物体。优选地，所述池包含具有不同基因型的至少100，更优选至少1000，甚至更优选至少5000，还更优选至少10,000，甚至更优选至少50,000，还更优选至少100,000，例如至少500,000，例如至少1,000,000个生物体，或其繁殖部分。
优选的是，生物体池包含具有不同基因型的足够数量的生物体或其繁殖部分，使得该池理论上可以包括所述生物体所有基因中所有可能的突变。例如，在本发明的实施方案中，其中物种是大麦，据信包含～500,000个随机诱变的大麦谷粒的池理论上将包含所述大麦的所有基因中所有可能的突变(基于以下假设：用1mM NaN3诱变一个谷粒中的～10,000单碱基突变)。为了提高本发明方法的效率，所述池可以包含理论上预期包含所有可能突变的至少2×，例如至少3×的生物体或其繁殖部分，其具有不同的基因型。因此，生物体池可以包括具有不同基因型的至少500,000，例如至少1,000,000，例如至少1,500,000个生物体或其繁殖部分。例如，这可以是实施方案中的情况，其中所讨论的物种是大麦。
在一些实施方案中，所述池可包含具有不同基因型的至少30,000个生物体或其繁殖部分，例如在30,000至500,000的范围内。
在一些实施方案中，生物体池可包含具有不同基因型的至少5,000,000，例如1,000,000至100,000,000个生物体或其繁殖部分。例如，其可以是本发明的实施方案中的情况，其中所述生物体是小生物体，例如单细胞生物体。
在其他实施方案中，所述池可以包含具有不同基因型的100,000至500,000个生物体或其繁殖部分。例如，其可以是本发明实施方案中的情况，其中生物体是单细胞生物体。
本发明方法的一个优点是该方法允许筛选大量不同基因型的生物体。因此，生物体池可包含极大量的不同基因型的生物体。此外，本发明的方法可以允许鉴定在任何NOI具有预定突变的生物体。为了能够鉴定具有任何NOI突变的生物体，这需要生物体池包含大量不同的基因型，例如上述数量的不同基因型。
可以任何有用的方式获得生物体池。
在一个实施方案中，通过收集单个生物体获得生物体池。例如，这可以从种子库(假设物种是植物)，从细胞集合(假设物种是单细胞生物体)或从其他生物体集合中实现。还可以通过以任何其他方式收集单个生物体或所述生物体的样品来实现。
在本发明的一个优选实施方案中，通过诱变，特别是通过随机诱变来制备生物体池。因此，可以对多个生物体进行诱变以获得生物体池。所述诱变可以特别是随机诱变，其可以例如如下所述进行。
在本发明的实施方案中，其中所述生物体是单细胞生物体，然后通常对多个完整生物体进行随机诱变。
在本发明的实施方案中，其中物种是多细胞生物体，使所述多细胞生物体的繁殖部分经受所述随机诱变可能就足够了。在这样的实施方案中，对多个生物体或生物体的多个繁殖部分或其混合物进行随机诱变。
在本发明的实施方案中，其中物种是植物，然后所述池可包含代表多种基因型的多个种子。因此，池可以包含多个已经经历诱变的种子。然而，该池还可以包含已经经历诱变的种子后代。
此处，已经经历诱变的种子(例如谷物谷粒)可以称为M0代。所述种子，例如谷物谷粒可以播种并允许发育成成熟植物，其种子(例如谷物谷粒)被认为是M1代。可以播种M1代种子并使其生长成成熟植物，其种子被认为是M2代，以此类推。该原理如图2A所示。
生物体池可以包括种子，例如任何上述各代的谷物谷粒。因此，该池不一定必然包含先前经历直接诱变的种子。生物体池也可包含M1、M2或M3代的种子，例如谷物谷物。
所述随机诱变可以任何有用的方式进行，例如，通过辐射或化学处理。辐射可以是紫外线照射，X射线照射或放射性照射。化学诱变可以用任何诱变化学品处理，例如选自由以下构成的组的化合物：叠氮化钠(NaN3)，烷化剂如N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)，甲基亚硝基胍(MNNG)和乙基甲磺酸盐(EMS)或下面提到的烷化剂。NaN3、ENU和EMS通常用于随机产生突变体。MNNG和EMS经常用于制备随机诱变的酵母培养物。
为了在植物的gDNA中诱导随机突变，可以用突变剂或突变剂混合物处理谷粒或可再生的植物组织，包括但不限于，烷化剂，例如磺酸盐(如乙基甲磺酸盐(EMS)、磺酸二乙酯(DES))；硫磺芥子，例如乙基-2-氯乙基硫醚；氮芥，例如2-氯乙基-二甲胺，和；环氧化物，例如环氧乙烷。其他是乙烯亚胺、羟胺(NH2OH)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、NaN3和重氮甲烷。然后经处理的组织或谷粒可以繁殖以产生后代生物体。这种随机诱变可用于植物，如作物，包括谷物，但不限于小麦、玉米、水稻、高粱和小米，以及双子叶作物，包括但不限于，油菜籽、棉花、大豆和甜菜。
本发明的方法不限于任何特定类型的诱变。因此，可以使用任何诱变类型，例如任何形式的随机诱变。
在本发明的一个实施方案中，然后可如下文实施例的“WS1”部分中所述制备生物体池。在本发明的实施方案中，其中物种是大麦，可以如下文实施例的关于大麦的“WS1”部分中所述制备生物体池。本领域技术人员能够对WS1中描述的方法进行改动使其适用于其他开花植物，包括其他谷类植物。在本发明的实施方案中，其中物种是酵母，可以如下文实施例的“WS1”部分中关于酵母的方法制备生物体池。本领域技术人员能够对WS1中描述的方法进行改动使其适用于其他单细胞生物体。
将生物池分为子池
本发明的方法包括将生物体池分成一个或多个子池的步骤，其中每个子池包括多个生物体或其繁殖部分。优选地，每个子池包括代表多种基因型的多个生物体或其繁殖部分。
通常，池被分成多个子池，优选地分成至少5个子池，更优选地分成至少10个子池，甚至更优选地分成至少30个子池，更优选地至少分成50个子池，甚至更优选至少70个子池，更优选至少90个子池。
在一些实施方案中，池被划分为至少500个，例如至少1000个，例如至少1500个子池。特别地，这可以是本发明实施方案中的情况，其中所述池包含大量不同基因型的生物体。
原则上，子池的数量没有上限。然而，通常池被分成最多50,000个，例如最多25,000个，例如最多10,000个子池。
在一些实施方案中，池被分成90到500个子池。
每个子池优选包含代表多个基因型的多个生物体或其繁殖部分。优选地，每个子池包括具有不同基因型的至少10，更优选至少100，甚至更优选至少500，还更优选至少1000，甚至更优选至少5000，还更优选至少10,000，例如至少50,000，例如至少100,000个生物体或其繁殖部分。在一些实施方案中，每个子池包含具有不同基因型的2000至10,000个，例如3000至5000个生物体或其繁殖部分。
在一些实施方案中，每个子池包含代表不同的基因型的1000至2000个生物体或其繁殖部分。
可以以任何需要的方式对子池进行排序。如果池包含相同基因型的多个生物体，则优选相同基因型的大多数生物体或甚至所有生物体都包含在同一子池中。这可以通过多种方式确保，取决于例如下文所述的物种。在本发明的实施方案中，其中通过随机诱变制备生物体池或其繁殖部分，优选所述池以下述方式划分：来自所述池的一个生物体或其繁殖部分的所有后代均包含在一个子池中。
例如，可以将池分为子池，并且可以对所述子池进行增殖步骤。增殖步骤也可能与将池分成子池的步骤同时进行，以使得单个生物体或其繁殖部分的后代最终进入相同的子池的方式。
还优选每个子池包含每个基因型的一个以上的生物体或其繁殖部分。这可以以不同的方式确保。例如，子池可以进行增殖步骤，允许所述子池的每个生物体或其繁殖部分都产生后代。特别地，优选每个子池包含每个基因型的足够多的生物体，以便将子池随机地分成2、3或4个部分，以使得每个部分理论上包含代表子池的每个基因型的生物体(或其繁殖部分)的方式。因此，优选每个子池包含代表每种基因型的至少5个，优选至少10个，甚至更优选至少15个生物体。特别地，这可以是本发明实施方案中的情况，其中所述物种是植物，例如谷物。在本发明的实施方案中，其中物种是单细胞生物体，则优选每个子池包含每个基因型的更多个生物体，例如至少100个，例如至少1000个，例如至少10,000个。
图1A中提供了将池分为子池的方法的示例。
在本发明的实施方案中，其中物种是单细胞生物体，并且通过诱变多个单细胞生物体制备池，可以例如以以下方式制备子池：
-诱变后，允许每个单细胞生物体以单独的方式繁殖，使得每个单细胞生物体发育成克隆培养物。这可以通过在固体培养基上培养每个克隆的集落或通过在分开的空间中用液体培养基培养每个克隆来实现，例如在管或孔中。将多个克隆的单细胞生物体组合形成子池；
-诱变后立即将单细胞生物分成子池，并允许每个子池增殖。
因此，该方法可以包括以下步骤：
-提供多个单细胞生物体，例如酵母；
-对所述生物体进行随机诱变；
-将诱变的生物体分成子池；
-使每个子池进行增殖步骤。
所述增殖步骤可包括在允许所述生物体生长的条件下在培养基中孵育每个子池。例如，该步骤可以包括在允许所述生物体生长的温度下在培养基中孵育子池1至5天。
在本发明的实施方案中，其中物种是植物，则可以使得一种特定植物的所有种子包含在一个子池中的方式制备子池。因此，在本发明的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
-提供植物的多个种子，例如谷物谷粒；
-诱变所述种子，从而获得M0代种子；
-使所述M0代种子生长为成熟植物，并从所述成熟植物获得种子，其中所述种子是M1代种子；
-任选地重复前一步骤X次，以获得包含M(1+X)代种子的植物；
-从所述成熟植物中获得M1或M(1+X)代的种子，从而获得种子池(例如谷物谷粒池)；
-将所述池分成子池，其中来自给定成熟植物的所有种子(例如谷物谷粒)被放入相同的子池中。
图2A和2B中示出了这些步骤，其中使用大麦作为例子。该方法可以包括图2A和2B中所示的步骤。图2A和2B中所示的步骤可以使用任何开花植物进行，因此不限于大麦。而且，图2A和2B中所示的步骤可以使用任何数量的突变植物来实施(图中提供的数字仅仅是一个例子)。
因此，该方法可以包括以下步骤：
-提供多个植物种子，例如谷物谷粒；
-诱变所述种子，从而获得M0代种子；
-任选地使所述M0代种子生长为成熟植物，并从所述成熟植物获得种子，其中所述种子是M1代种子；
-任选地重复前一步骤X次，以获得包含M(1+X)代种子的植物；
-在不同田块中培育M0、M1或M(1+X)代种子，使其生长为成熟植物，其中所述成熟植物的种子构成了种子池；
-将所述区域划分为田块；
-在一个小田块中收获所有植物的所有种子，从而获得种子子池(例如谷物谷粒子池)，其可称为“谷粒总量”(参见图2B)。
除了在田块培育种子之外，还可以任何有用的方式培育这些种子以将植物分成亚组，从而获得子池。例如，种子可以在分开的容器中培养，每个容器包含一种或多种植物。种子也可以在温室中培养。
将池分为子池的方法的一个示例在下文中在WS2中描述。
鉴定子池
本发明的方法包括将生物体或其繁殖部分的池分成子池的步骤。接下来是鉴定子池的步骤，所述子池包含在NOI具有突变的生物体或其繁殖部分。
所述子池的鉴定可以包括以下步骤：
a)制备gDNA样品，每个样品包含来自一个子池内每个基因型的gDNA，其例如可按照下文“制备DNA样品”部分中所述进行；
b)进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包括多个区室化PCR扩增，例如可按照下文“包含多个区室化PCR扩增的PCR扩增”部分所述进行；
c)检测包含感兴趣NOI的突变的PCR扩增产物，从而鉴定所述子池，例如可按照下文“检测PCR扩增产物”部分所述进行。
例如，可以直接鉴定子池，只要包括NOI的突变的PCR扩增产物可以在PCR扩增之后或期间直接检测。例如，如果PCR扩增产物包含产生一种或多种可检测信号的检测手段，则可以进行这种操作，只要PCR扩增产物包含含有NOI的突变的靶序列。这种检测手段在下文“检测PCR扩增产物”部分中更详细地描述，可以例如是突变检测探针。
图1B中示出了用于鉴定包含一个或多个特定突变的子池的方法的示例，突出显示以下步骤：
-提供子池；
-从所述子池的一部分制备样品；
-从所述样品中制备gDNA样品；
-使用来自所有子池的所有单个gDNA样品进行PCR扩增，例如，在板的各个孔中，例如微量滴定板中；
-选择那些包含NOI的突变的样品。
图2C中示出了用于鉴定子池的方法的更具体示例。在该例中，该物种属于谷物植物组。图2C中提供的具体数字仅是示例，并且本领域技术人员将理解该方法可以使用另一数量的谷粒来实施。例如，可以如下文WS3中所概述的实施包含NOI的突变的子池的鉴定。
制备DNA样品
本发明的方法包括制备DNA样品特别是gDNA样品的一个或多个步骤。特别地，该方法可以包括从子池制备gDNA样品的一个步骤，以及从次级子池制备gDNA样品的一个步骤。该方法还可包括从超级池制备gDNA样品的步骤。
通常，所述gDNA样品以这样的方式制备，使得理论上的gDNA样品包含来自子池、次级子池或超级池内的每个基因型的gDNA，同时保持所述子池、次级子池或超级池内每个基因型的生物体的增殖潜力。
这可以不同的方式确保。例如，优选每个子池和超级池包含每个基因型的一种以上的单个生物体或其繁殖部分。特别地，优选的是，每个子池或超级池包含每个基因型的足够多的生物体，以便能够将子池或超级池随机分成2、3或4个部分，以每个部分理论上包括代表子池或超级池的每个基因型的生物体或其繁殖部分的方式。
这样，来自子池或超级池的一部分生物体或其繁殖部分，例如，每个子池或每个超级池的10至90％、优选10至50％、例如25至50％的生物体或其繁殖部分可以用于制备gDNA样品。所述生物体或其繁殖部分的一部分在本文中也称为“生物体样品”。可以在保持所述生物体或其繁殖部分的增殖潜力的条件下储存子池的生物体的剩余部分。在生物体是植物的实施方案中，储存所述植物的种子可能就足够了。种子例如谷物谷粒，可以经常存放在任何干燥和黑暗的地方。在生物体是单细胞生物体的本发明实施方案中，可优选冷冻所述生物体，例如在存在冷冻保护剂如甘油的情况下。
类似地，每个所述次级子池可包含每个基因型的一个以上的单个生物体或其繁殖部分。因此，次级子池的一部分生物体或其繁殖部分，例如每个次级子池的10至90％、优选40至60％、例如25至50％的生物体或其繁殖部分可以用于制备gDNA样品。然而，在一些实施方案中，特别是当物种是较大的生物体时，优选的是，次级子池的gDNA样品从每个生物体或其繁殖部分的部分样品制备得到，如下文所述。
本发明还包括，gDNA样品可以由来自子池、次级子池或超级池的每个生物体或其繁殖部分的样品制备。例如，本发明包括，每个子池、超级池和次级子池可以仅包含每个基因型的一个或一些生物体或其繁殖部分。在所述实施方案中，gDNA样品可以从来自每个生物体或其繁殖部分的样品制备。通常，在本发明的实施方案中，仅可能从每个生物体获得样品，其中所述物种的大小足以获得所述样品。特别地，这可以与物种是动物或植物的本发明实施方案相关，例如开花植物。
尽管子池和超级池优选地包括如本文其他地方所述的每个基因型的若干单个生物体或其繁殖部分，但是次级子池通常可仅包含每个基因型的少数有时甚至仅包含一个单个生物体或其繁殖部分。因此，在物种是植物(例如谷物)的本发明实施方案中，优选通过获得每个单个生物体的样品并从所述样品制备gDNA样品，来制备来自次级子池的gDNA样品。
当从每个生物体或其繁殖部分获得样品时，优选的是，以不显著损害所述生物体或其繁殖部分的增殖潜力的方式获得样品。因此，优选地，样品包含对于繁殖而言并不是必需的生物体或其繁殖部分的部分，或由其组成。根据物种，可以任何有用的方式获得样品，例如，通过活组织检查、切割、钻孔、磨碎、撕裂或使用配有针头的注射器。
举例来说，在物种是谷物并且子池、超级池或次级子池包含谷物谷粒的实施方案中，所述样品优选包含谷物谷粒的对于繁殖不是必需的部分。样品可以不同的方式获得，例如，通过使用诸如刀、手术刀或剪刀之类的尖锐器械切割谷粒的一部分，可以通过在谷粒上钻孔来获得谷粒的一部分。在后一种情况下，样品可以是钻孔后获得的面粉。
一旦获得生物体样品或从生物体或其一部分获得样品(本文也统称为“样品”)，可以任何有用的方式从所述样品制备gDNA样品。如果所述样品含有巨大的结构，例如整个种子，制备gDNA样品的第一步通常包括将所述样品的所述内容物分成较小的部分，例如通过物理方法，如通过压碎或研磨。制备gDNA样品的方法通常包括破坏细胞和/或组织的步骤，例如使用去污剂、酶(例如裂解酶)、超声波或其组合，从而产生粗裂解物。可通过任何有用的手段将所述裂解物与任何残留的碎片分离。粗裂解物可构成gDNA样品。或者，可以进一步纯化gDNA，例如通过将所述gDNA与裂解物的其余部分分离，如通过与选择性基质结合、离心、梯度离心和/或沉淀(例如使用沉淀剂，例如盐、醇或磁珠)。在分离之前，裂解物的其他组分-包括蛋白质和/或核蛋白-可以被变性或破坏，例如，通过使用酶和/或变性剂。可以除去其他含RNA的分子，例如，在酶的帮助下。制备gDNA样品的有用方法例如描述在Sambrook等，Molecular Cloning-Laboratory Manual，ISBN 978-1-936113-42-2。
包括多个区室化PCR扩增的PCR扩增
本发明的方法包括进行多个PCR扩增的步骤，每个PCR扩增包含来自一个子池的gDNA样品(例如，如以上部分所述制备)，从而扩增靶序列。每个PCR扩增可以包括多个区室化PCR扩增，每个区室化PCR扩增包含所述gDNA样品的一部分、位于靶序列侧翼的一组或多组引物和PCR试剂。
包含多个区室化PCR扩增的整个PCR反应可以以多种不同方式制备。在一个实施方案中，包含多个区室化PCR扩增的PCR扩增可以作为数字PCR(dPCR)扩增进行。本领域技术人员已知的任何dPCR扩增均可与本发明一起使用。通常，为所制备的每种gDNA样品准备至少一种包含多个区室化PCR扩增的dPCR扩增。因此，每个子池将准备至少一个包含多个区室化dPCR扩增的dPCR扩增。
通常，区室化dPCR扩增以包括下述步骤的方法制备：
-制备dPCR扩增，其包括gDNA样品、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂；
-对所述dPCR扩增进行分区，使得样品中的核酸分子定位并集中在多个空间上分离的区室内；
-进行dPCR扩增；
-检测基于dPCR的扩增产物。
所述分离的区室可以是任何单独的可以进行PCR扩增的区室。例如，它可以是一个平板的孔，例如微孔板或微量滴定板的孔，可以是微流体室，可以是毛细管，可以是乳液的分散相，或者可以是微型室阵列的液滴或小型化室。分离的区室也可以是固体支持物上的离散点，例如离散的核酸结合表面。
通常优选将gDNA样品随机分配到样品中用于区室化dPCR扩增。还优选每个区室化dPCR扩增仅包括少量包含靶序列的核酸。由于随机分布的性质，每个区室化dPCR扩增中包含的核酸分子的数量可能存在一些变化。在一个实施方案中，每个区室化dPCR扩增平均包含至多10个，例如至多5个包含靶序列的核酸分子。
在本发明的一个优选实施方案中，包含多个区室化PCR扩增的dPCR扩增是液滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)。ddPCR是一种基于水-油乳液液滴技术进行dPCR的方法。将PCR扩增分级为多个微滴，并且在每个单独的液滴中发生靶序列的PCR扩增。通常，ddPCR技术采用类似于进行常规PCR所用的PCR试剂和工作流程。因此，PCR扩增的分区是ddPCR技术的关键方面。
因此，区室化ddPCR扩增可以包含在液滴中，其可以例如包括乳液组合物，或两种或更多不混溶流体的混合物(例如，美国专利号7,622,280中所述或如下文例子中所述)。液滴可以通过WO/2010/036352中描述的装置产生。特别地，可以使用液滴发生器制备液滴，例如可从Bio-Rad Laboratories，USA(下文缩写为Bio-Rad)获得的QX200 DropletGenerator。如本文所用，术语乳液可以指不混溶液体(例如油和水)的混合物。例如，乳液可以是油包水液滴，如[Hindson，BJ等人(2011年)，High-throughput droplet digital PCRsystem for absolute quantitation of DNA copy number.Anal Chem 83：8604-8610]所述。因此，乳液可包括位于连续油相中的水性液滴。乳液也可以是水包油乳液，其中液滴是位于连续水相中的油滴。本文使用的液滴通常设计成防止区室之间的混合，不仅保护单个区室内的内容物免于蒸发，而且还防止与其他区室的内容物聚结。因此，每个液滴可以被视为空间分离的区室。
ddPCR的每个液滴可以具有任何有用的体积。然而，优选地，液滴具有nL范围内的体积。因此，优选液滴体积平均在0.1至10nL的范围内。
已知使用微通道交叉流聚焦或物理搅拌产生乳液液滴的微流体方法产生单分散或多分散乳液。液滴可以是单分散液滴。而且，可以产生液滴，使得它们的尺寸变化不超过液滴平均尺寸的±5％。在一些情况下，产生液滴，使得液滴尺寸的变化仅在液滴平均尺寸的2％内。
较高的机械稳定性可用于微流体操作和更高剪切的流体处理(例如在微流体毛细管中或通过90°转弯，例如流体路径中的阀)。热处理前和热处理后的液滴或胶囊对于标准移液管操作和离心是机械稳定的。
通过使油相流过含水样品可以形成液滴。水相可以包含PCR扩增中的组分，或由其组成，例如，包含gDNA样品、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂的PCR扩增，例如下文“PCR试剂”部分中所述的任何PCR试剂。
油相可包含氟化基油，其可另外通过与氟化表面活性剂(例如全氟化聚醚)组合以稳定化。在一些情况下，基油可以是HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或其他常见氟化油中的一种或多种。在一些情况下，阴离子表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AM)、KrytoxFSH的铵盐或Krytox-FSH的吗啉代衍生物。
油相可进一步包含用于调节油性质的添加剂，例如蒸气压、粘度或表面张力。非限制性例子包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。油相也可以是产生液滴的油，例如来自Bio-Rad的Droplet Generation Oil。
可以配制该乳液以产生具有液状界面膜的高度单分散液滴，其可以通过加热成具有固体状界面膜的微胶囊而转化；这样的微胶囊可以作为生物反应器，其通过反应过程，例如PCR扩增，保留其内容物。在加热时可以发生向微胶囊形式的转化。例如，这种转化可以在大于50、60、70、80、90或95℃的温度下发生。在某些情况下，使用热循环仪进行所述加热。在加热过程中，可以使用流体或矿物油覆盖层来防止蒸发。
在一些情况下，使用市售的液滴发生器产生液滴，例如Bio-Rad QX100TM DropletGenerator或Bio-Rad QX200TM Droplet Generator。ddPCR和随后的检测可以使用市售的液滴读取器进行，例如Bio-Rad QX100或QX200TM Droplet Reader。
每个PCR扩增可以区室化为任何合适数量的区室。然而，在一个优选的实施方案中，每个PCR扩增被区室化为1000至100,000个区室(例如液滴)。例如，每个PCR扩增可以区室化为10,000至50,000个区室(例如液滴)。例如，每个PCR扩增可以区室化为15,000至25,000个区室(例如液滴)。进一步地，每个PCR扩增可以区室化为大约20,000个区室(例如液滴)。
PCR试剂
该方法包括进行几个PCR扩增，其中这些PCR中的至少一些可包含多个区室化PCR扩增。
无论所述PCR是否包含区室化PCR扩增，PCR扩增通常包括gDNA样品、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂。所述PCR试剂可以是本部分所述的任何PCR试剂。
通常，PCR试剂至少包含核苷酸和核酸聚合酶。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸三磷酸分子，并且优选地，PCR试剂包含至少dATP、dCTP、dGTP和dTTP。在一些情况下，PCR试剂还包含dUTP。
核酸聚合酶可以是能够催化核苷酸的模板依赖性聚合即复制的任何酶。核酸聚合酶应该耐受PCR扩增的温度，并且它应该在延伸温度下具有催化活性。几种热稳定核酸聚合酶是本领域技术人员已知的。
在本发明的一些实施方案中，核酸聚合酶具有5'-3'核酸酶活性，因此可用于与TaqMan探针的扩增反应。
核酸聚合酶可以是大肠杆菌DNA聚合酶I。核酸聚合酶也可以是Taq DNA聚合酶，其具有取代5'-3'外切核酸酶活性的DNA合成依赖性链。具有5'-3′核酸酶活性的其他聚合酶包括但不限于rTth DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶，例如从New England Biolabs获得的，可包括Crimon
TaqDNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、Hemo KlenTaqTM或
Taq。
在一些情况下，核酸聚合酶可以是例如大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、噬菌体29、REDTaqTM、基因组DNA聚合酶或测序酶。DNA聚合酶例如在美国专利申请公开号20120258501中所述。
另外，PCR试剂可包括盐、缓冲液和检测手段。缓冲液可以是任何有用的缓冲液，例如TRIS。盐可以是任何有用的盐，例如氯化钾、氯化镁或乙酸镁或硫酸镁。
PCR试剂可包含非特异性阻断剂，例如BSA、来自牛皮的明胶、β-乳球蛋白、酪蛋白、干乳、鲑鱼精子DNA或其他常见的阻断剂。
PCR试剂还可包含生物防腐剂(例如NaN3)、PCR增强剂(例如甜菜碱、海藻糖等)和抑制剂(例如RNase抑制剂)。其他添加剂可包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、甜菜碱(单)水合物、海藻糖、7-脱氮-2′-脱氧鸟苷三磷酸(7-deaza-2′-dGTP)、牛血清白蛋白(BSA)、甲酰胺(甲酰胺)、四甲基氯化铵(TMAC)、其他四烷基铵衍生物[例如四乙基氯化铵(TEA-Cl)]；四丙基氯化铵(TPrA-Cl)或非离子型洗涤剂，例如Triton X-100、吐温20、Nonidet P-40(NP-40)或PREXCEL-Q。
此外，PCR试剂还可以包含一种或多种用于检测包含NOI的突变的PCR扩增产物的手段。所述手段可以是任何可检测的手段，并且它们可以作为单独的化合物添加或与引物之一结合或甚至共价连接。可检测的手段包括但不限于染料、放射性化合物、生物发光和荧光化合物。在优选的实施方案中，检测手段是一种或多种探针。因此，优选PCR试剂包含一种或多种检测探针，例如下文“检测PCR扩增产物”部分中所述的任何探针。
位于靶序列侧翼的引物
本发明的方法涉及使用位于靶序列侧翼的一个或多个引物组。位于靶序列侧翼的离散“引物组”包括包含与靶序列的5'末端相同的序列的一个引物(也称为“正向引物”)，以及包含与靶序列的3'末端互补的序列的一个引物(也称为“反向引物”)。当在允许扩增所述靶序列的条件下，将引物组与包含靶序列的核酸、PCR试剂一起加入PCR时，该引物组能够扩增靶序列。相同的引物组可用于本发明方法的所有PCR扩增，即使不同组的引物也可能用于本发明不同步骤的PCR扩增。
除了与靶序列的5'末端相同的序列外，正向引物可以包含另外的序列。类似地，除了与靶序列的3′末端互补的序列外，反向引物可以包含另外的序列。例如，引物可以在5′末端含有另外的核酸序列，该核酸序列不与靶核酸杂交，但是有助于处理引物或PCR扩增产物，例如检测所述产物。
正向引物和反向引物的长度可取决于靶序列的序列。例如，可以调节引物的长度以获得引物的所需解链温度Tm。因此，正向引物和反向引物的长度可以分别在10至100个核苷酸的范围内，例如在10至50个核苷酸的范围内，例如在15至20个核苷酸的范围内，例如在15至25个核苷酸的范围，例如15至30个核苷酸的范围内，例如15至40个核苷酸的范围内，例如15至45个核苷酸的范围内，例如15至50个核苷酸长度的范围内。通常将正向引物和反向引物的Tm调节在40至70℃的范围。
PCR扩增的水相内的引物浓度可以例如在0.05至2.0μM的范围内，例如在0.1至1.0μM的范围内，例如在0.2至1.0μM的范围内，例如在0.3至1.0μM的范围内，例如在0.4至1.0μM的范围内或在0.5至1.0μM的范围内。
通常，正向引物和反向引物包含或甚至由寡核苷酸组成。然而，在一些情况下，引物可包含核苷酸类似物。许多核苷酸类似物是本领域技术人员已知的并且包括衍生物，其中糖被修饰，如2′-O-甲基，2′-脱氧-2′-氟和2′，3′-双脱氧核苷衍生物，基于其他糖骨架的核酸，例如苏糖，锁核酸(LNA)，LNA衍生物，肽核酸(PNA)，乙二醇核酸(GNA)，苏糖核酸(TNA)，双环糖或己糖，甘油和乙二醇糖，基于非离子骨架的核酸类似物，或非线性拓扑的核酸及其类似物，例如树枝状大分子、梳状结构和纳米结构。
引物还可以与各种标签(例如荧光标签、功能化标签或结合标签)连接，其可任选地与其末端、糖或核碱基结合。
引物可以通过多种方法制备，包括但不限于，使用本领域熟知的方法克隆合适的序列和直接化学合成[Narang等，Methods Enzymol.68:90(1979)；Brown等人，MethodsEnzymol.68：109(1979)]。引物也可以从商业来源获得。
正向引物和反向引物可以具有相同的解链温度或类似的解链温度，例如，±5℃的解链温度。引物的长度可以在5′和/或3′末端延伸或缩短，以产生具有所需熔解温度的引物组。因此，引物对的引物之一可以比另一引物长。
可以基于解链温度设计引物。确定小于25bp的引物的解链温度的等式被称为Wallace Rule[Td＝2×(A+T)+4×(G+C)]。这里，Td是特定盐浓度下的温度，其中50％的寡核苷酸及其完美过滤结合互补体处于双链构象。通常，Td在0.9M NaCl中测定。然而，在设计引物时，其他考虑也很重要，例如，其预测的二级结构。有若干种计算机程序和在线服务可用于设计引物。
在一个实施方案中，可以下列方式设计引物组，其中引物能够特异性地扩增包含NOI的突变的靶序列，但不能扩增包含参考NOI的靶序列。例如，这可以通过将正向引物设计为包括与包含突变的NOI相同的序列来实现，和/或可以通过设计反向引物使其包括一个或多个与包含突变的NOI互补的序列来实现。
在其他实施方案中，引物组可以下列方式设计，其中能够引物特异性地扩增包含参考NOI的靶序列，但不能扩增包含NOI的突变的靶序列。这可以例如通过设计正向引物使其包含与参考NOI相同的序列，和/或通过设计反向引物使其包含与参考NOI互补的序列来实现。
然而，在本发明的优选实施方案中，引物组能够扩增包含NOI的突变的靶序列和包含参考NOI的靶序列。
值得注意的是，本发明的方法包括具有一组以上引物的PCR扩增，例如2组引物，例如3组引物，例如2至10组引物。因此，每个PCR扩增可包含侧翼于不同靶序列的几组引物。这允许在一次PCR扩增期间检测一种以上不同的突变。
检测PCR产物
本发明的方法包括至少两个检测包含靶序列的PCR扩增产物的步骤，所述靶序列包含感兴趣的NOI的突变。可以通过任何有用的手段检测PCR扩增产物。
如上所述，所述突变可以是取代、缺失和/或插入，仅涉及一个或几个核苷酸至大量核苷酸。因此，检测可以适应于NOI指定的特定突变。
在一些实施方案中，以下列方式设计引物组，其中引物能够特异性地扩增包含NOI的突变的靶序列，但不能扩增包含参考NOI的靶序列。在其他实施方案中，可以下列方式设计引物组，其中这些引物能够特异性地扩增包含参考NOI的靶序列，但不能扩增包含NOI的突变的靶序列。在此类实施方案中，可以简单地基于检测PCR扩增产物的存在或不存在来进行检测。特别地，这可以是突变为大量NOI突变的本发明实施方案中的情况。
在优选的实施方案中，借助于检测探针检测PCR扩增产物。特别地，当突变是较少数量的NOI突变(例如一个或多个点突变)时，可以是这种情况。
检测探针可以是包括与包含突变的NOI相同的序列的寡核苷酸。另外，所述探针通常还包含与NOI侧翼的靶序列区域相同的序列。类似地，检测探针可以是包括与包含突变的NOI互补的序列的寡核苷酸，此外，所述探针还可以包含与NOI侧翼的靶序列区域互补的序列。位于NOI侧翼的所述区域可以分别是NOI的5′和/或3′的序列。此类探针优选与包含NOI突变的PCR扩增产物退火，但不与包含参考NOI的PCR扩增产物退火。此类检测探针在本文中也称为“突变体检测探针”。突变检测探针通常包含10至30个核苷酸。特别地，突变检测探针可以包括与包含NOI的突变的靶序列相同或互补的10至30个核苷酸的连续序列。
检测探针也可以是包含与参考NOI相同的序列的寡核苷酸。另外，所述探针通常还包含与NOI侧翼的靶序列区域相同的序列。类似地，检测探针可以是包含与参考NOI互补的序列的寡核苷酸，并且所述探针还可以包含与NOI侧翼的靶序列区域互补的序列。此类探针优选与包含参考NOI的PCR扩增产物退火，但不与包含NOI突变的扩增产物退火。此类检测探针在本文中也称为“参考检测探针”。参考检测探针通常包含10至30个核苷酸。特别地，参考检测探针可以包括与包含参考NOI的靶序列相同或互补的10至30个核苷酸的连续序列。
在一些实施方案中，PCR试剂包含一组探针，其由突变检测探针和参考检测探针组成。当在允许所述靶序列扩增的条件下，当与包括靶序列的核酸、PCR试剂和引物组一起加入PCR扩增时，“探针组”优选能够竞争NOI处的结合位点。如上所述，检测探针通常是寡核苷酸。特别地，它们可以是单链DNA的短核苷酸片段。检测探针可以与可检测手段结合或甚至共价连接，包括但不限于，报道分子、染料、放射性化合物、生物发光化合物、荧光化合物和荧光团/猝灭剂对。
在一些实施方案中，检测探针的最5'核苷酸不是G。因此，突变检测探针可以包含寡核苷酸，其中最5'核苷酸不是G。类似地，参考检测探针可以包含寡核苷酸，其中最5'核苷酸不是G。
本发明的方法可包括使用突变检测探针和参考检测探针。在此类情况下，优选地，探针被差异标记，例如，使得一个探针与可检测手段相结合或共价连接，而另一个则不是。两种探针可能均与可检测手段相结合或共价连接，其中所述可检测手段是不同的。
在一个实施方案中，参考检测探针在5'末端用荧光团标记，在3'末端用猝灭剂标记。所述荧光团和猝灭剂可以分别是例如HEX和Black-Hole Quencher。在一个实施方案中，突变检测探针在5'末端用荧光团标记，在3'末端用猝灭剂标记。所述荧光团和猝灭剂可以分别例如是FAM和Black-Hole Quencher。
PCR反应可包含相似量的突变检测探针和野生型检测探针。然而，在一些实施方案中，可优选使用过量的突变检测探针。尤其在超级池PCR扩增后检测PCR产物的情况下。在此类情况下，与参考检测探针相比，PCR反应可以包括至少2倍过量、更优选至少4倍过量的突变检测探针。
在一些实施方案中，检测探针是
探针(Heid等，1996)，其利用核酸聚合酶的5'核酸外切酶活性。这就是为什么PCR试剂优选包括具有5'核酸外切酶活性的核酸聚合酶(例如Taq聚合酶)的原因。通常，
探针可以是如上所述的突变检测探针，或如上所述的参考检测探针，其与荧光团/猝灭剂对共价连接。因此，探针可含有荧光团，通常在5'碱基处或附近。此外，
探针可以含有猝灭剂，其可以在3'碱基处或附近，并且能够淬灭所述荧光团的荧光[参见Tyagi等，Nature Biotechnology 16：49-53(1998)]。当被照射时，激发的荧光团将能量转移到附近的猝灭剂而不是发荧光[Forste或荧光共振能量转移(FRET)]。因此，荧光团和猝灭剂的紧密接近可以防止任何荧光的发射，同时探针是完整的。然而，当
探针与靶序列的内部区域退火，并且聚合酶复制其上结合
探针的模板时，其5′外切核酸酶活性可以切割探针。这一系列事件消除了猝灭的功能，即没有FRET，荧光团开始发射荧光，其可以通过任何有用的手段来测量。
值得注意的是，如上所强调的，本发明还包括，这些方法可用于鉴定一种以上不同的突变。这可以通过使用如上所述的多组引物来实现。然而，这也可以通过使用几种不同的检测探针来实现。因此，在一个实施方案中，所述方法可用于鉴定靶序列中NOI的一种以上不同的突变。在所述实施方案中，PCR试剂可包含参考检测探针和若干突变检测探针，其中每个突变检测探针包括与一个突变相同或互补的序列的寡核苷酸。优选地，参考检测探针和突变检测探针与不同的检测手段连接。所有突变检测探针可以连接到相同的检测手段或类似的检测手段或不同的检测手段。
在一些情况下，检测探针是分子信标(MB)，即包含能够自身杂交的互补序列(也称为“茎”)的探针，产生“发夹环”结构。MB的环可含有与NOI(或突变体或参考NOI)互补或相同的序列。此外，MB通常包括位于MB任一端的荧光团和猝灭剂，使得当探针与其自身杂交时它们彼此接近。MB可以是如上所述与荧光团/猝灭剂对以及提供MB互补区域的茎序列共价连接的如上所述的突变检测探针或参考检测探针。文献中已经给出了关于制备和使用MB的标准方法的进一步细节，并且MB可以从许多商业试剂来源获得。
在某些情况下，使用引物/探针；在某些情况下，引物/探针是ScorpionsTM探针，它可以提供类似于MB的基于FRET的茎-环检测机制，不同之处在于，探针还具有连接的区段，其用作正向或反向引物(参见Whitcombe等，Nature Biotechnol.1999，8月17日(8)：804-7；美国专利No.6,326,145)。ScorpionsTM探针可以在未杂交状态下保持茎-环构型，荧光团淬灭。ScorpionsTM探针可以具有更长的多组分结构，例如5'荧光团，然后是靶特异性茎-环部分，然后是猝灭剂，然后是阻断剂[例如己二醇(HEG)]，最后是3'引物序列。阻断剂可以防止产物反向延伸到探针上。
在一些情况下，引物/探针是SunriseTM探针，其包含附着于发夹探针的引物，所述发夹探针在扩增期间延伸。该设置可以将内部猝灭剂与5'末端荧光团分开(Nazarenko等，Nucl.Acids Res.1997,25：2516-2521)。
检测探针可以是任何有用的长度，例如长度为10至60个核苷酸。寡核苷酸探针的长度也可以在10至30个核苷酸的范围内。寡核苷酸探针的精确序列和长度可部分取决于其结合的靶多核苷酸的性质。可以改变结合位置和长度以在特定情况下实现适当的退火和解链特性。例如，检测探针可以设计成具有与正向引物和/或反向引物相同的解链温度，例如±10℃以内，例如±5℃以内。
检测探针的3'末端核苷酸可被核酸聚合酶阻断或不能延伸。通过连接部分，通过荧光团或猝灭剂将可检测手段连接至寡核苷酸探针的末端3'碱基，可以便利地实现所述阻断。
文献中有大量实用指南，描述了有用的荧光团-猝灭剂对，包括选择荧光团-猝灭剂对的方法，如下所示：
-Clegg，Meth.Enzymol.，211：353-388(1992)；Wo等人，Anal.Biochem.，218：113(1994)；Pesce等，编辑，Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker，New York，1971)；White等，Fluorescence Aanalysis：APratical Approach(Marcel Dekker，New York，1970)；等等；
-文献还包括提供荧光和生色分子的详尽列表以及用于选择报告分子-猝灭剂对的相关光学性质的参考文献，例如，Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra ofAromatic Molecules，第2版(Academic Press，New York，1971)；Griffiths，Color andConstitution of Organic Molecules(Academic Press，New York，1976)；Bishop，编辑，Indicators(Pergamon Press,Oxford,1972)；Haugland，Fluorescent Probes andResearch Chemicals(Molecular Probes，Eugene，1992)Pringsheim，Fluorescence andPhosphorescence(Interscience Publishers，New York，1949)；等等。
-此外，文献中有广泛的用于衍生报告分子和猝灭剂分子的指导，通过可以加入寡核苷酸的常见反应基团进行共价连接，如下列参考文献所示：Haugland(上文引用)；Ullman等人，美国专利No.3,996,345；Khanna等人，美国专利No.4,351,760；等等。
荧光团和猝灭剂可以例如选自荧光素和罗丹明染料。这些染料与用于连接至寡核苷酸的适当连接方法结合在许多参考文献中描述，例如，Khanna等人.(如上所述)；Marshall，Histochemical J.，7：299-303(1975)；Menchen等人，美国专利No.5,188,934；Menchen等，欧洲专利申请87310256.0；和Bergot等人，国际申请PCT/US90/05565。后四篇文献在此引入作为参考。
荧光团/猝灭剂对可以例如在5′末端使用荧光团如EDANS或荧光素，和在3′端使用猝灭剂如Dabcyl。
PCR扩增产物的检测可以包括将在包含给定gDNA样品的PCR扩增中获得的信号与在对照PCR扩增中获得的信号进行比较的步骤。该信号通常与可检测手段相关，所述可检测手段与突变检测探针和/或野生型检测探针相关。因此，如果所述探针与荧光团连接，则信号可以是荧光。对照PCR扩增可以是在相同条件下进行的PCR扩增，但缺少gDNA样品，即所述对照PCR扩增可能缺乏gDNA模板，或者它可能仅包括只包含参考靶序列的对照DNA，例如野生型gDNA。在一些实施方案中，任何比来自对照PCR扩增的信号更强的信号可以被认为是阳性信号，即指示存在包含NOI的一个或多个突变的靶序列的信号。
在一个实施方案中，高于给定阈值的任何信号可以被认为是阳性信号。阈值可以通过任何有用的方式确定，通常通过合适的软件，例如Biorad提供的QX200TM DropletReader和QuantasoftTM软件。
在使用突变检测参考检测探针的本发明实施方案中，可确定位于突变检测探针获得的信号与参考检测探针的信号之间的分数丰度，并用于评估PCR产物的存在。分数丰度可以确定为：[(“突变检测探针”)的信号]除以[(“参考检测探针”+“突变检测探针”)的信号]。
例如，可以假设样品含有包含NOI的突变的靶DNA，只要与对照PCR扩增相比其具有以下特征：
1)分数丰度增加，和/或；
2)突变体液滴的浓度增加，和/或；
3)突变体事件的数量增加，比平均值高50％或更高。
突变体液滴可以是从突变检测探针产生阳性信号的液滴。本文，“突变体事件”等于突变体液滴的数量。
将子池划分为次级子池
一旦鉴定了包含携带NOI突变的生物体或其繁殖部分的子池，则本发明的方法包括将所述子分成多个次级子池的步骤。
如上所述，部分子池已用于制备gDNA样品。因此，只有子池的剩余部分可用于分为次级子池。本发明还包括将子池分成几个部分，并且只有一个部分用于制备次级子池。
每个次级子池可以仅包含一个生物体或其繁殖部分。或者，每个次级子池可包括多个生物体或其繁殖部分。例如，每个次级子池可包括代表多个基因型的多个生物体或其繁殖部分。
通常，子池或其一部分被分为多个次级子池，优选地分为至少5个次级子池，更优选地分为至少10个次级子池，甚至更优选地至少分为至少30个次级子池，更优选至少50个次级子池，甚至更优选至少70个次级子池，更优选至少90个次级子池。原则上，次级子池的数量没有上限。然而，池通常被分成最多50,000个，例如最多25,000个，例如最多10,000个次级子池。
每个次级子池可包括代表多个基因型的一个或多个生物体或其繁殖部分。优选地，每个次级子池包含具有不同基因型的1至100个，优选1至50个，甚至更优选1至20个生物体或其繁殖部分。
可以任何期望的方式对次级子池进行排序。在一些实施方案中，次级子池仅包含有限数量的生物体或其繁殖部分。
在其他实施方案中，次级子池包含多个相同基因型的生物体。这可以通过使次级子池经历繁殖步骤来确保。繁殖步骤也可能与将子池分成次级子池的步骤同时进行，其方式是允许单个生物体的后代或其繁殖部分最终进入相同的次级子池。
本发明的方法包括从次级子池制备一种或多种gDNA样品。在次级子池仅包含每个基因型的一个或几个生物体或其繁殖部分的本发明实施方案中，gDNA样品通常由每个生物体或其繁殖部分的样品制备，例如上文“制备DNA样品”部分所述。
在次级子池包含每个基因型的单个基因型的多个生物体或其繁殖部分的实施方案中，可以从次级子池的一部分制备gDNA样品。
图1C中提供了用于将子池分为次级子池的方法的示例，其中所述图的第一步骤显示划分子池，并获得gDNA样品。
在物种是单细胞生物体的本发明实施方案中，次级子池可以如下制备：
-在鉴定包含NOI突变的子池后，允许所述子池中的每个单细胞生物体以单独的方式繁殖，使得每个单细胞生物体产生克隆培养物。其可以通过在固体培养基上培育每个克隆的集落或通过在与液体培养基分开的空间中培养每个克隆来实现，例如在微管或微量滴定板的孔中。次级子池可以通过将多个克隆的单细胞生物体组合来形成；
-在鉴定感兴趣的子池后，可以立即将单细胞生物体分成次级子池，并且可以允许每个次级子池增殖。
在一个实施方案中，通过以下步骤制备次级子池：
i)提供包含NOI突变的子池；
ii)以克隆方式增殖所述子池的一些或所有生物体以获得克隆培养物；
iii)将来自多个所述克隆培养物的一部分生物体组合以获得次级子池。
如上所述，可以从子池的一部分生物体制备gDNA样品，同时储存子池的其余生物体。当生物体是单细胞时，则可以将所述生物体冷冻储存。在所述实施方案中，上述步骤i)可包括在足以生长所述生物体的温度下在培养基中温育以复活生物体的步骤。优选地，所述复活步骤仅包括最小的繁殖。
上述步骤ii)可以例如通过将生物体以足够低的滴度铺在固体培养基上以在所述培养基中在空间上将生物体彼此分离来进行。
上述步骤iii)可以包括组合10至1000，优选10至500，更优选10至100，例如30至70个独立的克隆培养物部分。优选的是，获得每个次级子池的两个备份。这可以通过如上所述组合所述级分、然后将每个次级子池分成至少2个部分来完成。或者，从一开始将两个不同容器中的相同克隆培养物的部分组合从而制备每个次级子池的两个备份。通常，子池的一部分用于制备gDNA样品，而另一部分储存(例如在冷冻保护剂下冷冻)。在制备gDNA样品和/或在储存之前，可以对次级子池进行增殖步骤，例如，在用于生物体生长的温度下在培养基中孵育。
在物种是植物的本发明实施方案中，可以通过获得子池内每个种子的样品，并将来自预定数量的种子的样品组合起来制备次级子池。在所述实施方案中，重要的是对次级子池进行排序，使得可以鉴定一个次级子池的种子和所述次级子池的样品。因此，在本发明的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
-提供包含植物的多个种子的子池，例如谷物谷粒，其中所述子池包含NOI的突变。
-将所述子池的种子分成次级子池，每个次级子池包括至少一个种子，例如在1到100粒种子的范围内。
-从次级子池的每个种子中获取样品，方式为使其足够完整地发育成植物，并将每个次级子池中所有种子的所有样品组合起来。
-从所述组合样品中制备gDNA样品。
上面概述的步骤在图2D的上部示出，采用谷物谷粒作为示例。因此，该方法可以包括图2D中所示的步骤。而且，图2D中所示的步骤可以使用任何开花植物来进行，因此不限于谷物。此外，可以使用任何数量的突变植物来执行图2D中所示的步骤(图2D中提供的数字仅代表一个例子)。
将子池分为次级子池的方法的一个示例在下文的WS4中描述。
鉴定次级子池
本发明的方法包括以下步骤：将包含NOI的一个或多个突变的生物体或其繁殖部分的子池分成次级子池，然后进行鉴定次级子池的步骤，所述次级子池包含含有由NOI指定的突变的生物体或其繁殖部分。
所述次级子池的鉴定可以包括以下步骤：
a)制备gDNA样品，每个样品包含来自一个次级子池内每个基因型的gDNA，其例如如上文“制备DNA样品”部分中所述进行；
b)进行多个PCR扩增以扩增靶序列；
c)检测包含NOI的突变的PCR扩增产物，从而鉴定所述次级子池，其例如如下文“PCR扩增产物检测”部分中所述进行。
上文描述的PCR扩增可以是靶序列的任何PCR扩增。因此，所述PCR扩增可以是常规PCR扩增，或者是包含上述多个区室化PCR扩增的PCR扩增。
通常，每个所述PCR扩增包括一个次级子池的gDNA样品、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂。引物可以是上文“位于靶序列侧翼的引物”部分中所述的任何引物。PCR试剂可以是上文“PCR试剂”部分中描述的任何PCR试剂。特别地，PCR试剂包含核苷酸和核酸聚合酶。优选地，PCR试剂还包含一种或多种检测探针，例如突变检测探针和/或参考检测探针，如上文“检测PCR产物”部分中所述。
例如，可以直接鉴定次级子池，只要可以在PCR扩增过程之后或期间直接检测包含NOI的突变的PCR扩增产物。例如，这可以在PCR扩增包含检测手段的情况下进行，所述检测手段产生可检测的信号，只要PCR扩增产物包括包含NOI的突变的靶序列。这种检测手段在上文“检测PCR扩增产物”部分中更详细地描述，并且可以例如包括用于突变检测的探针。
在图1C的下部示出了鉴定包括所述突变的次级子池的方法的一个示例，示出了以下步骤：
-提供次级子池；
-从所述次级子池的一部分准备样品；
-从所述样品中制备gDNA样品；
-使用来自所有次级子池的所有单个gDNA样品制备PCR扩增，例如在板的各个孔中，如在微量滴定板中；
-检测包含NOI的突变的靶序列的存在。
图2D中示出了用于鉴定次级子池的方法的更具体示例。在该例中，所讨论的物种是谷物植物。图2D中提供的具体数字仅是示例，本领域技术人员将理解该方法可以使用另外数量的谷粒来实施。
值得注意的是，可以如下文WS4中所概述的，鉴定包含NOI特异性突变的次级子池。
鉴定生物体
一旦鉴定出包含生物体或其繁殖部分的次级子池，该方法包括鉴定包含NOI的突变的生物体。
其可以通过多种方式完成，取决于物种和次级子池。
在次级子池仅包含一种生物体或其繁殖部分的本发明实施方案中，一旦鉴定出相关的次级子池就鉴定出了该生物体或其繁殖部分。
在次级子池包含一种以上的生物体或其繁殖部分的本发明实施方案中，该方法通常包括鉴定生物体的步骤。在此之前，在鉴定生物体或其繁殖部分的同时或之后，可以对包含NOI的突变的次级子池实施增殖步骤。
在物种是单细胞生物体的本发明实施方案中，所述增殖步骤可以是生物体的克隆扩增，例如，以空间分离的方式克隆次级子池的每个生物体从而实现生物体的克隆扩增。因此，该方法可以包括以下步骤：
i)提供包含NOI的突变的次级子池；
ii)以克隆方式增殖所述子池的一些或所有生物体；
iiii)确定哪些克隆包括含有NOI的突变的生物。
上述步骤ii)可以例如通过将生物体以足够低的滴度铺在固体培养基上以在所述培养基中在空间上将生物体彼此分离来进行。
上述步骤iii)可以涉及从每个克隆的一部分制备gDNA样品并进行PCR扩增，例如基本如上文“鉴定次级子池”部分中所述的PCR扩增。
在物种是植物并且所述次级子池包含所述植物的种子的本发明实施方案中，所述方法可以包括以下步骤：
A.鉴定包含含有NOI的突变的生物体或其繁殖部分的次级子池；
B.培养次级子池中的所有种子以允许发芽和任选地从每个种子生长植物；
C.从每个发芽种子中获取样品；
D.检测所述样品中所述NOI的突变的存在，其中所述检测可以通过任何方法进行，例如通过从所述样品制备gDNA样品并进行如上所述的PCR扩增，
从而鉴定出一种携带NOI的突变的植物。
在上述步骤B中，所述种子可以例如发芽并允许发育成包含根、茎和叶的小植株。在所述实施方案中，步骤C中获得的样品可以是例如所述小植株的叶、根或其部分，例如第一批叶子的部分。在获得样品后，发芽的种子或小植株可以生长至成熟。本发明还包括植物生长至成熟，在这种情况下，步骤C中获得的样品可以例如是叶、花、根、种子、茎或其部分。
在鉴定包含一个或多个NOI的突变的单个生物体或其繁殖部分之后，所述生物体或其繁殖部分通常进行一个或多个增殖步骤以获得包含突变的多个生物体。
在所鉴定的生物体相对于所讨论的突变是杂合的本发明实施方案中，该方法可以包括将所述生物体培育成相对于所述突变为纯合的步骤。
在鉴定包含NOI的突变的生物体后，本发明的方法可以包括进一步育种所述生物体的步骤，以保留NOI的突变。进行所述育种的目的是将由NOI的突变赋予的性状与相同物种的其他生物体的性状相结合。
该方法还可以包括验证NOI的突变的存在的其他步骤。例如，靶序列或包含靶序列的基因可以进行整体测序。
超级池
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括鉴定一组包含NOI的突变的子池的步骤，在本文中也称为超级池。以这种方式，可以筛选极大量的潜在生物体或其繁殖部分，以确定NOI的突变的存在。所述步骤优选在将池分成子池，并且从子池中制备gDNA样品之后进行，例如在本发明方法的步骤c)之后。
因此，该方法包括在步骤c)之后执行以下步骤：
-从每个子池中制备每个gDNA样品的一部分；
-将多个子池部分组合成超级池，从而获得超级池的gDNA样品，其包含多个子池的gDNA；
-进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包含超级池的gDNA样品，其中每个PCR扩增包括多个区室化PCR扩增，每个区室化PCR扩增包含所述gDNA样品的一部分、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，其中所述PCR例如如下文“超级池中的PCR扩增”部分中所述进行；
-检测包括含有NOI的突变的靶序列的PCR扩增产物，从而鉴定包含所述突变的超级池，其中所述检测步骤例如如上文“检测PCR产物”部分所述进行。
在一些实施方案中，可优选富集超级池的gDNA样品。这可以有助于特异性地检测包含NOI的突变的靶序列。富集步骤可包括以下步骤：
-提供超级池的gDNA样品，其包含上述多个子池的gDNA；
-进行PCR扩增，每个PCR扩增包含超级池的gDNA样品，其中每个PCR扩增包括靶序列侧翼的一组引物、阻断探针和PCR试剂。
在富集步骤期间进行的PCR扩增通常是常规PCR扩增，并且可以如下文“PCR”部分中所述进行。通常，该PCR包括相对较少数量的循环，例如10至30，例如15至25个PCR循环。
阻断探针通常为设计用于抑制包含参考NOI的靶序列扩增的探针。因此，阻断探针可以例如是寡核苷酸，其：
·不能通过DNA聚合酶在3'末端延伸；
·相对于包含预定NOI突变的靶序列，优先结合包含参考NOI或其互补序列的靶序列
阻断探针通常包含10至30个核苷酸。特别地，阻断探针可以包括与包含参考NOI的靶序列相同或互补的10至30个核苷酸的连续序列。此外，阻断探针通常与阻断剂连接，其抑制经DNA聚合酶的探针延伸。
所述阻断剂可以例如是与阻断探针的最3'核苷酸共价连接的部分。事实上，大多数3′修饰将阻断延伸。例如，所述阻断剂可选自由2′,3′-双脱氧C间隔基、3′ddC和3′反向dT构成的组。阻断剂也可以是末端3′羟基的修饰，例如，具有氨基(例如3′氨基)或烷基，例如3′C3间隔基。阻断剂也可以是3′核苷酸的磷酸化。
一旦鉴定出包含一个或多个NOI的突变的超级池，则可以执行步骤d)和后续步骤。然而，步骤d)可限于用超级池中所包含的子池的gDNA样品制备PCR扩增。
在步骤b)中制备子池之后，也可以直接执行超级池的鉴别。在这种情况下，该方法可以包括步骤b)之后的以下步骤：
-如果子池仅包含每个基因型的少数例如仅一个生物体或其繁殖部分，则所述子池可以随后进行增殖步骤；
-制备每个子池的一部分，其代表子池内的每个基因型，其中子池的剩余部分也代表子池内的每个基因型；
-将多个部分组合并成超级池，由此从多个子池获得包含生物体或其繁殖部分的超级池，其中生物体或其繁殖部分仅存在于一个超级池中；
-制备gDNA样品，每个样品包含来自超级池内每个基因型的gDNA，其例如可如上文“制备DNA样品”部分中所述进行；
-进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包含超级池的gDNA样品，其中每个PCR扩增包括多个区室化PCR扩增，每个区室化PCR扩增包含所述gDNA样品的一部分、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，其中所述PCR例如如下文“超级池的PCR扩增”部分中所述进行。
-检测包括靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI的突变，从而鉴定包括所述突变的超级池。
在所述实施方案中，以保持所述超级池内每个基因型的生物体的增殖潜力的方式制备超级池的gDNA样品并不重要。这通常是预期的结果，因为每个超级池包含来自多个子池的DNA，并且每个子池包含代表子池内的每个基因型的生物体(或其繁殖部分)。
一旦鉴定出包含NOI的突变的超级池，则可以执行步骤c)和后续步骤。然而，步骤c)可以限于制备超级池中所包括的子池的gDNA样品。
可以制备任何所需数量的超级池，例如在5至100的范围内，例如在5至50的范围内，例如在5到20的范围内。
图1D中示出了用于鉴定超级池的方法的例子。另一个例子，其中物种是谷物，如图2E所示。应当理解，图2E中提供的数字仅是示例，并且该方法可以用另外数量的谷粒等来执行。
在下文中还在WS5中描述了制备和鉴定超级池的非限制性例子。
超级池的PCR扩增
本发明的方法包括进行多个PCR扩增的步骤，每个PCR扩增包含来自一个超级池的gDNA样品，例如上述部分中所制备的，其中每个PCR扩增包含多个区室化PCR扩增，每个区室化PCR扩增包含所述gDNA样品的一部分、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列。
通常，所述PCR可以如上文“含有多个区室化PCR扩增的PCR扩增”部分中所述进行，但优选地，除了如下所述的例外：
-如上所述，区室化PCR扩增可以包含在液滴中。对于超级池的PCR扩增，高灵敏度非常重要，而子池的PCR扩增需要较低的灵敏度。尽管高灵敏度的PCR扩增通常需要大量试剂，较低灵敏度的PCR扩增需要较少量的试剂。因此，优选超级池的PCR扩增具有检测至少200,000个，更优选至少250,000个参考NOI内一个或几个突变体NOI的灵敏度。
-对于超级池的PCR扩增，可能优选的是每个液滴具有非常小的体积，例如，pL级的体积。因此，优选液滴的平均体积为0.1至10μL。
-每个PCR扩增可以区室化为任何合适数量的区室。然而，在一个优选的实施方案中，每个PCR扩增被区室化为200,000至100,000,000个区室(例如液滴)。例如，每个PCR扩增可以区室化为500,000至50,000,000个区室(例如液滴)，例如，每个PCR扩增可以区室化为1,000,000至10,000,000个区室(例如液滴)。优选将每个PCR扩增区室化为至少1,000,000，优选至少3,000,000，甚至更优选至少5,000,000，例如至少7,000,000个区室(例如液滴)。
-在某些情况下，使用市售的液滴发生器产生液滴，例如Raindance Technologies的RainDrop Digital PCR System，该系统也可用于检测PCR扩增产物。
一旦制备了区室化PCR反应，可以如下文“PCR”部分中所述进行扩增。
检测包含突变体NOI的靶序列的存在可以如上文“检测PCR产物”部分中所述进行。
在一个实施方案中，优选使用基本如在“检测PCR产物”部分中描述的参考检测探针和突变检测探针进行检测，其中使用过量的突变检测探针。优选地，与参考检测探针相比，PCR反应包含至少2倍，更优选至少4倍过量的突变检测探针。也可以不使用参考检测探针而仅使用突变检测探针。
PCR
本文描述的方法包括进行PCR扩增的多个步骤，包括区室化PCR扩增，例如，“包含多个区室化PCR扩增的PCR扩增”部分或“超级池中的PCR扩增”部分中所述的PCR扩增。
此处，通常PCR扩增包括以下步骤：
1)制备PCR扩增，其包含gDNA样品、位于靶序列侧翼的一组引物和PCR试剂；
2)进行PCR扩增，其通常包括以下步骤：
-在变性温度下孵育PCR扩增，例如85至100℃，例如90至98℃，孵育足以使双链DNA变性的时间，例如15至30分钟，例如30秒至5分钟；
-实施多个循环，例如10到60个循环，例如20到40个循环，包括以下步骤：
-在退火温度下孵育以允许引物和靶DNA之间的退火，例如15秒至2分钟，例如30秒至1分钟。通常，退火温度类似于或低于引物的解链温度，例如，温度为45至75℃。在退火温度下孵育也可以使引物伸长；
-任选地，在核酸聚合酶具有活性的延伸温度下孵育，例如55至75℃的温度，15秒至2分钟的时间，例如30秒至1分钟；
-在变性温度下孵育，例如温度为85至100℃，或者90至98℃，15秒至2分钟，例如30秒至1分钟；
-在DNA聚合酶的延伸温度下孵育，例如55至98℃，例如15秒至20分钟，例如1至15分钟。
在扩增步骤之前，例如在前一列表的步骤2)之前，可以将PCR分成多个空间分离的区室，以便获得区室化的PCR扩增。例如，这可以通过产生液滴来实现，例如通过添加产生液滴的油，并在液滴发生器中制备液滴。
携带GS1-3基因中的突变的大麦植物
在一个实施方案中，本发明涉及在编码谷氨酰胺合成酶1，特别是同种型3(GS1-3)的基因中携带突变的大麦植物。所述基因也可称为HvGS1-3基因，其蛋白编码序列参见本文SEQ ID NO：1，而编码HvGS1-3酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述突变是指其在所述基因内赋予编码活性降低的突变HvGS1-3酶的序列的突变。HvGS1-3的活性是以下一种或多种：
i.催化铵的缩合；
ii.催化氨和谷氨酸缩合成谷氨酰胺；
iii.催化谷氨酸、羟胺和ATP合成谷氨酰羟肟酸。
特别地，HvGS1-3的活性可以如iii中所述。此处，活性可以例如按照下文“重组HvGS1-3的体外活性测定”部分的实施例19进行测定。
突变HvGS1-3蛋白的活性优选具有低于野生型蛋白活性的活性。然而，酶应优选保留至少一些活性。特别地，当如实施例19所述的方法进行检测时，所述突变HvGS1-3蛋白的kcat(min-1)为野生型HvGS1-3蛋白kcat(min-1)的1至20％，例如2至10％。
野生型HvGS1-3酶被认为是由两个环构成的十聚体，所述环由5个亚基组成。在一个实施方案中，突变的HvGS1-3蛋白在位于两个环之间界面的氨基酸残基中含有突变。特别地，突变可以是选自SEQ ID NO：2的第141、235、285、287和290的氨基酸残基的突变。
因此，大麦植物可以在编码HvGS1-3的基因中包含突变，其中所述基因编码突变的HvGS1-3蛋白，其携带上述氨基酸残基之一的突变。
特别地，突变HvGS1-3蛋白可以是具有SEQ ID NO：2的第287氨基酸残基突变的蛋白，例如由Gly突变为任何其他氨基酸残基，例如任何其他天然存在的氨基酸残基。突变也可以是SEQ ID NO：2的第287氨基酸残基的突变，即从Gly突变为极性或带电荷的氨基酸残基，例如选自由Arg、Lys、Asp、Glu、Gln、Asn、His、Ser、Thr、Tyr、Cys、Met和Trp构成的组的氨基酸残基，选自由Arg、Lys、Asp、Glu、Tyr、Phe、Met和Trp构成的组的氨基酸残基。突变也可以是SEQ ID NO：2的第287氨基酸残基从Gly突变为带电残基，例如选自由Arg、Lys、Asp和Glu构成的组的氨基酸残基。特别地，突变也可以是SEQ ID NO：2的第287氨基酸残基从Gly突变为Asp。
因此，HvGS1-3基因的突变可以是导致编码一种或多种上述突变的HvGS1-3基因的任何突变。在一个实施方案中，基因突变可以是核苷酸859、860和861中的一个或多个突变，从而获得编码上述氨基酸残基之一的密码子。在一个例子中，突变是核苷酸860从G到A的基因突变。
在一个实施方案中，突变的HvGS1-3蛋白可以是携带SEQ ID NO：2的第235氨基酸残基的突变的蛋白，例如从Asp突变至任何其他氨基酸残基。突变也可以是SEQ ID NO：2的第235氨基酸残基从Asp突变至带正电荷的残基，例如，选自Arg和Lys的氨基酸残基。因此，HvGS1-3基因中的突变可以是导致编码任何上述突变的HvGS1-3蛋白的HvGS1-3基因的任何突变。
在一个实施方案中，突变的HvGS1-3蛋白可以是携带SEQ ID NO：2的第285氨基酸残基突变的蛋白，例如从Gly突变为任何其它氨基酸，如任何其它天然存在的氨基酸。突变也可以是SEQ ID NO：2的第285氨基酸残基从Gly突变为极性或带电荷的氨基酸，例如选自由Arg、Lys、Asp、Glu、Gln、Asn、His、Ser、Thr、Tyr、Cys、Met和Trp构成的组的氨基酸残基。因此，HvGS13基因中的突变可以是导致编码上述突变HvGS1-3蛋白的HvGS1-3基因的任何突变。
在一个实施方案中，突变HvGS1-3蛋白可以是携带SEQ ID NO：2的第290氨基酸残基突变的蛋白，例如从Arg突变为任何其他氨基酸残基。突变也可以是SEQ ID NO：2的第290氨基酸残基从Arg突变为带负电荷的氨基酸残基，例如选自Asp和Glu的氨基酸残基。因此，HvGS13基因中的突变可以是导致编码上述突变HvGS1-3蛋白的HvGS1-3基因的任何突变。
在一个实施方案中，突变HvGS1-3蛋白可以是携带SEQ ID NO：2的第141氨基酸残基突变的蛋白，例如从Trp突变为任何其他氨基酸残基。突变也可以是SEQ ID NO：2的第141氨基酸残基从Trp突变到任何其他天然存在的氨基酸，除了Tyr或Trp。因此，HvGS13基因中的突变可以是导致编码任何上述突变HvGS1-3蛋白的HvGS1-3基因的任何突变。
本申请还涉及以下实施方案：
1、一种具有编码HvGS1-3的基因中的突变的大麦植物，其中所述突变基因编码具有降低的酶活性的突变HvGS1-3蛋白。
2、根据实施方案1的大麦植物，其中就由谷氨酸、羟胺和ATP合成谷氨酰羟肟酸而言，突变HvGS1-3蛋白的kcat值为野生型HvGS1-3的kcat的1至20％。
3、根据实施方案1至2中任一项的大麦植物，其中HvGS13形式携带SEQ ID NO：2的第287氨基酸残基的突变。
4、由根据实施方案1至3中任一项的大麦植物制备的麦芽。
5、一种由根据实施方案1至3中任一项的大麦植物制备的饮料。
6、一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
i.提供根据实施方案1至3中任一项的大麦植物的麦粒；
ii.任选地，将至少部分所述麦粒制成麦芽，从而获得麦芽；
iii.制备所述大麦和/或所述大麦麦芽的提取物；
iv.将所述提取物加工成饮料。
7、根据实施方案6所述的方法，其中所述饮料是啤酒。
携带GASR7基因中突变的小麦植物
在一个实施方案中，本发明涉及携带在编码A基因组上GASR7的基因中的突变的小麦植物。所述基因也可称为TaGASR7-A1，且该序列在GenBank中可以NCBI号KJ000052获得，且编码序列在本文中提供为SEQ ID NO：25。GASR7的氨基酸序列提供为SEQ ID NO：8。
优选地，所述突变是在所述基因中使得赋予编码具有降低活性的突变GASR7酶的序列的突变。更优选地，突变是导致GASR7功能完全丧失的突变。GASR7功能完全丧失可以是例如缺失GASR7多肽。GASR7功能的丧失也可导致谷粒长度增加。
特别地，优选突变是导致编码截短形式的GASR7的GASR7基因的突变，其中所述截短形式的GASR7包含最多91个氨基酸，例如SEQ ID NO：8的最多91个连续氨基酸。例如，小麦植物可以包含GASR7基因中的突变，其导致过早形成的终止密码子，例如导致在编码Trp的密码子处形成终止密码子的突变。在一个实施方案中，小麦植物可以包含GASR7基因中的突变，其导致SEQ ID NO：25的密码子91处(核苷酸271-273)或位于更靠近5′端的任何密码子处的过早形成的终止密码子。
在一个实施方案中，小麦植物可以包含GASR7基因中的突变，其导致编码SEQ IDNO：8的第91氨基酸残基的位置处的过早形成的终止密码子。
本申请还涉及以下实施方案：
8、携带编码GASR7的基因中的突变的小麦植物。
9、根据实施方案8的小麦植物，其中小麦植物携带在编码GASR7的基因中的突变，其导致过早形成的终止密码子。
植物产品及其生产方法
在一个实施方案中，本发明涉及携带HvGS1-3基因中的突变的大麦植物的植物产品，例如，上文“携带GS1-3基因突变的大麦植物”部分中描述的任何大麦植物。植物产品可以是植物本身或其部分。例如，植物产品可以是大麦麦粒。
在一个实施方案中，植物产品是麦芽组合物。麦芽组合物可包含发芽的大麦植物或其部分，或由其组成，例如发芽的大麦麦粒，即来自携带HvGS13基因中突变的大麦植物的大麦麦粒，例如上文“携带GS1-3基因突变的大麦植物”部分中描述的任何大麦植物。
发芽的大麦麦粒是大麦粒，其经过发芽步骤，随后是干燥步骤。麦芽组合物可包含经加工的麦芽或由其组成，例如，它可以是“碾磨的麦芽”或“面粉”。因此，所述麦芽组合物可通过包括以下步骤的方法制备：
-浸泡谷物谷粒，例如大麦麦粒；
-使谷物谷粒发芽；
-干燥所述发芽的谷物谷粒，例如，通过窑在高温下干燥。
本发明还涉及从携带HvGS1-3基因中突变的大麦植物制备的麦芽汁，例如，上文“携带GS1-3基因突变的大麦植物”部分中描述的任何一种大麦植物。麦芽汁是一种含水大麦提取物，其例如可以通过将麦芽、未发芽的大麦粒和/或辅料捣碎来制备。“辅料”应理解为包括麦芽之外的任何碳水化合物来源，例如但不限于谷物(例如大麦、小麦、玉米或大米)-作为完整谷粒或加工产品如粗粒、糖浆或淀粉。所有上述辅料均可主要用作提取物的额外来源(糖浆通常在捣碎后加入)。在捣碎之前，通常研磨麦芽。较大的辅料例如整个谷粒通常也被碾磨。
未发芽的大麦麦粒缺乏或仅含有有限量的有利于生产麦芽汁的酶，例如能够降解细胞壁或将淀粉解聚成糖的酶。因此，在将未发芽大麦用于捣碎的本发明实施方案中，优选将一种或多种合适的外源性酿造酶添加到麦芽浆中。甚至在本发明的实施方案中，其中谷物麦芽用于麦芽汁生产，可以在捣碎过程中添加外源酶。合适的酶可以是脂肪酶，淀粉降解酶(例如淀粉酶)，葡聚糖酶[优选(1-4)-和/或(1-3,1-4)-β-葡聚糖酶]，和/或木聚糖酶(例如阿拉伯木聚糖酶)，和/或蛋白酶，或包含一种或多种上述酶的酶混合物，例如Cereflo、Ultraflo或Ondea Pro(Novozymes)。
通常将所述经碾磨的麦芽和/或大麦麦粒和任选的辅料在升高的预定温度下用水孵育进行捣碎(mashing)。通常，在40至80℃的温度下捣碎。通常，孵育温度要么保持恒定(等温捣碎)，要么逐渐增加。例如，可以顺序方式实施。如果凝胶化温度高于正常麦芽糖化通常观察到的温度，则淀粉可在加入麦芽浆之前凝胶化并液化。在任一情况下，麦芽/大麦/辅料中的可溶性物质被释放到所述液体部分中。随后的过滤使得麦芽汁和残留固体颗粒分离，后者也称为“废麦糟”。由此获得的麦芽汁也可以表示为“初次麦芽汁”。在“指示清洗麦糟”的过程中，可以将额外的液体例如水添加到废麦糟中。在清洗麦糟和过滤之后，可以获得“二次麦芽汁”。可以通过重复该过程来制备其他麦芽汁。Briggs等人(同上)和Hough等人(同上)描述了制备麦芽汁的合适方法的非限制性例子。
在捣碎和/或清洗麦糟后，使麦芽汁进行沸腾步骤-任选地在其他化合物例如啤酒花存在下，获得煮沸的麦芽汁。
根据本发明的麦芽汁可以是初次麦芽汁，二次麦芽汁，其他麦芽汁或上述的组合，以及上述的任意煮沸形式。
在本发明的一个优选实施方案中，植物产品是由大麦植物制备的饮料，例如基于大麦的饮料，例如基于大麦的酒精饮料和基于大麦的非酒精饮料，该大麦植物在编码HvGS1-3的基因中具有突变。例如，基于谷物的酒精饮料可以是啤酒或蒸馏酒。
所述啤酒可以是任何种类的啤酒，例如贮藏啤酒或麦芽啤酒。因此，啤酒可以例如选自老啤酒(Altbier)，琥珀啤酒(Amber ale)，大麦酒(Barley wine)，柏林白啤酒(Berliner weisse)，Bière de Garde，苦酒(Bitter)，金色麦啤(Blonde Ale)，烈性黑啤(Bock)，棕色艾尔啤酒(Brown ale)，加州蒸汽啤酒(California Common)，奶油艾尔啤酒(Cream Ale)，多特蒙德出口贮藏啤酒(Dortmunder Export)，杜特勃克啤酒(Doppelbock)，黑啤(Dunkel)，小麦黑啤(Dunkelweizen)，德国冰啤(Eisbock)，兰比克果啤(Fruitlambic)，金色艾尔啤酒(Golden Ale)，哥塞啤酒(Gose)，香槟啤酒(Gueuze)，小麦啤酒(Hefeweizen)，淡啤酒(Helles)，印度淡色艾尔(India pale ale)，科隆啤酒
拉比克啤酒(Lambic)，淡啤酒(Light ale)，淡色巴克黑啤酒(Maibock)，麦芽酒(Maltliquor)，柔性啤酒(Mild)，三月啤酒
老艾尔(Old ale)，老黑啤(Oud bruin)，淡色艾尔啤酒(Pale ale)，比尔森啤酒(Pilsener)，波特啤酒(Porter)，红色艾尔啤酒(Redale)，黑麦啤酒(Roggenbier)，塞尚啤酒(Saison)，苏格兰啤酒(Scotch ale)，蒸汽啤酒(Steam beer)，斯陶特啤酒(Stout)，黑啤酒(Schwarzbier)，贮藏啤酒(lager)，比利时白啤(Witbier)，Weissbier和小麦巴克黑啤(Weizenbock)。
所述蒸馏酒可以是任何种类的蒸馏酒。特别地，蒸馏酒可以基于携带HvGS1-3基因中突变的大麦植物，例如麦芽化谷物，例如大麦麦芽。这类蒸馏酒的非限制性例子包括威士忌和伏特加。
饮料可以是非酒精饮料，例如基于大麦的非酒精饮料，例如非酒精啤酒或非酒精麦芽饮料，如maltina。
饮料可以通过例如下文所述的任何方法制备。
生产饮料的方法
在一个实施方案中，本发明涉及生产饮料的方法。这些方法可包括以下步骤：
-提供携带HvGS1-3基因中突变的大麦植物，例如上文“携带GS1-3基因中突变的大麦植物”部分中描述的任何突变；
-制备所述植物或其部分的水提取物；
-任选地，将所述含水提取物进一步加工成饮料。
因此，本发明在一个实施方案中提供了用于生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供携带编码HvGS13的基因中突变的大麦植物的麦粒，例如，上文“携带GS1-3基因中突变的大麦植物”部分中描述的任何突变；
b)任选地制备至少部分所述麦粒的麦芽组合物，从而获得麦芽组合物；
c)制备所述大麦和/或麦芽组合物的含水提取物；
d)将所述提取物加工成饮料。
步骤b)可以如上文“植物产品及其生产方法”部分中所述进行。并且步骤c)可以例如是制备麦芽汁的步骤，即水性提取物可以是麦芽汁。所述麦芽汁可以是上文“植物产品及其生产方法”部分中所述的任何麦芽汁；它也可以按照该部分的描述进行制备。
步骤d)可包括发酵所述含水提取物的步骤，例如，用酵母发酵所述麦芽汁。步骤d)可以包括以下步骤：
d-i)加热提取物(例如在另外的成分如啤酒花的存在下)；
d-ii)在酵母存在下发酵加热的提取物或加热的麦芽汁；
d-iii)任选地添加一种或多种其他成分，
从而生产出啤酒。
所述其他成分可以例如是CO2或芳香化合物。
生产啤酒的方法在本领域中是公知的，并且因此生产饮料的方法可以是任何生产啤酒的常规方法，其涉及使用本发明的大麦植物作为起始材料。例如，可以找到麦芽制造和酿造的合适方法示例的详细描述，包括Briggs等人(1981)和霍夫等人(1982年)的出版物。有许多定期更新的用于分析大麦、麦芽和啤酒产品的方法，例如但不限于AmericanAssociation of Cereal Chemists(1995)，American Society of Brewing Chemists(1992)，European Brewery Convention(1998)，和Institute of Brewing(1997)。人们认识到，给定的啤酒长采用了许多特定的程序，其中最显著的变化涉及当地消费者的偏好。任何生产啤酒的方法都可以用于本发明。
本申请还涉及以下实施方案：
10、一种携带FDC1基因中突变的酵母，所述突变导致fdc1活性功能完全丧失，其中突变导致在编码Trp的密码子处形成终止密码子。
11、根据实施方案10所述的酵母，其中所述酵母是酿酒酵母，并且所述酿酒酵母携带突变，所述突变导致在编码酿酒酵母ScFDC1的Trp159的密码子处形成终止密码子。
12、一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
i.提供麦芽汁；
ii.用根据实施方案10至11中任一项的酵母发酵所述麦芽汁；
iii.任选地，将发酵的麦芽汁进一步加工成饮料。
序列表
除非另有说明，否则所有GenBank登录号均是2016年7月1日的GenBank数据库版本。
实施例
通过WS描述和实施例说明本发明，其不应视为对本发明的限制。除非另有说明，否则采用基本的生物化学和分子生物学技术处理核酸、蛋白质(包括酶)和生物体。
下面描述的所有工作流包括例如所用谷粒的具体数量、特定浓度和PCR的具体条件等。本领域技术人员将能够调整所提供的具体实施例以使用不同数量的谷粒、不同浓度、不同的PCR条件等。
WS1：制备随机诱变的谷物谷粒
步骤1.1：诱变方法
为了诱导突变，根据Kleinhofs等人(1978)和K.Breddam等人的美国7,838,053提供的细节，将从大麦植物收集的谷粒在NaN3突变剂的溶液中温育。该方法诱导大麦粒gDNA中的点突变，通常赋予随机分布的用于氨基酸取代或蛋白编码DNA的翻译终止的密码子，即导致由诱变DNA编码的蛋白中的蛋白变化和截短。然而，本发明的方法也用于生产在gDNA的非蛋白质编码区中具有点突变的谷类植物，例如启动子、终止子和内含子。
将总共500g诱变的谷粒(全部为M0代)播种在7.5m2的田块中。在某些情况下，M1代的谷粒在田块中繁殖，最终产生M2或M3代的突变植物(参见图2A)。M3代谷粒中的突变频率预期为每10,000个谷粒0.9-2.3(参见Kleinhofs等，同上)。
WS2：从突变的谷类植物中制备有序谷物池
步骤2.1：收获谷类植物，对穗进行脱粒
田地中每个7.5m2的“田块”(FP#01、FP#02等；参见图2B)被分成若干个“小田块”(FSP#01、FSP#02等；图2B，标记为1的动作)，每个0.45m2并含有300个单独的植物。使用镰刀手动收割一个小田块中的所有穗，随后收集在单个袋中。将各个袋子的内容物分别脱粒，得到标有“谷粒总量”的袋子，每个袋子包含～6000谷粒(GT#01、GT#02等；图2B，标记为2的动作)。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，以下实施例中详述了以下步骤2相关主题：
-实施例1：在“田块”中种植大麦植物；
-实施例2：收获单个“田块”中的谷粒。
WS3：确定文库样品是否包含突变谷粒
步骤3.1：将单个“谷粒总量”谷粒池分成两个部分
将单个“谷粒总量”袋中的脱粒谷粒分成两部分，其中“子谷粒总量”样品由～1500个谷粒组成(标记为SGT#01、SGT#02等；参见图2C；动作1)，其处理详见下面的步骤3.2至步骤3.4。广义上讲，“子谷粒总量”部分中的谷粒加工寻求确定哪部分所述谷粒中含有感兴趣的突变。出于清楚的原因，但与步骤3的相关动作无关，“谷粒总量”的剩余部分由～4500粒组成，如涉及步骤4的描述详述对其进行处理。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，以下步骤3.1相关主题在以下实施例中详述：
-实施例3：“子谷粒总量”中谷粒的描述。
步骤3.2：从“子谷粒总量”的谷粒制备面粉样品
含有1500粒的每个子谷粒总量样品，即用SGT#01、SGT#02等表示样品，在标准实验室研磨机中研磨(参见图2B，动作2)，在应用之间进行彻底清洁，得到相应的面粉样品-表示为SFT#01、SFT#02等(参见图2C)。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，以下步骤3.2-相关主题在以下实施例中详述：
-实施例4：制备来自“子面粉总量”样品的谷粒面粉。
步骤3.3：从面粉等份试样制备gDNA
将“子面粉总量”样品的等份试样(每个25g，并用“子面粉样品等份试样”表示(ASFT#01、ASFT#02等))分配到单独的容器中(参见图2C，动作3)。
然后从每个面粉等份试样中提取gDNA(参见图2C，动作4)，并将每个提取的gDNA置于微量滴定板的一个孔中，样品表示为gDNA(GT#01)、gDNA(GT#02)等，用于表示样品的特定“谷粒总量”来源。或者，可以在微量滴定板的多个孔中进行提取。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，以下实施例中详述了与步骤3.3相关的以下主题：
-实施例5：制备25g面粉等份试样(ASFT)；
-实施例6：制备ASFT的gDNA。
步骤3.4：分析含有来自GT的gDNA的样品
接下来，将来自“谷粒总量”的各个样品的gDNA等份试样转移到新的96孔微量滴定板(参见图2C，动作5)，有时包括两个阴性对照样品。随后的ddPCR分析，例如实施例7中详述的，可以帮助鉴定含有突变体植物gDNA的样品。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，在实施例部分中详细描述了与步骤3.4相关的以下主题：
-实施例7：用来自ASFT的gDNA进行的基于ddPCR的实验。
WS4：发现以感兴趣的突变为特征的单个谷粒
步骤4.1：“谷粒文库池”(GLP)的细节
鉴于例如上文步骤3.4中所描述的分析产生信号以指示在所分析的96个样品中的一个或多个存在突变的gDNA，即图2C中表示为gDNA(GT#01)、gDNA(GT#02)等，标记为“谷粒文库池”(GLP#01、GLP#02等；图2D，作用2)的“谷粒总量”部分的4500粒被认为极有可能包含一个或多个具有相同感兴趣突变的谷粒。在本申请中，所述GLP的处理将涉及发现特定的突变谷粒的最终努力，其具有与在来自“谷粒总量”样品的加工的等份试样中检测到的模板分子相同的突变(图2B、2C和2D)，并且其在相应的ddPCR分析中进一步引起突变体信号(如图2C，动作5所示)。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，在本发明的实施例部分中详细描述了以下步骤4.1-相关主题：
-实施例8：收集作为“谷粒文库池”的谷粒。
步骤4.2：将“谷粒文库池”减少为“谷粒文库池的一部分”
当来自一个特定GT的、含有～4500谷粒的完整GLP样品(并且鉴于基于ddPCR的gDNA分析，如图2C、动作5所示，表明所述gDNA含有gDNA中的突变，正常情况下，对于与步骤3.4分析所揭示的特定基因突变相同的基因突变，其足以筛选少于12个单个谷粒。因此，制备了感兴趣的GLP的～1200个谷粒的样品(图2D，动作2)，产生“谷粒文库池的一部分”，缩写为FGLP。最后，共分离出96个样品，每个样品由来自特定FGLP的12个谷粒组成-每个构成一个次级子池。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，以下步骤4.2-主题在本发明的以下实施例中详述：
-实施例9：从“谷粒文库池”中获取“谷粒文库池的一部分”。
步骤4.3：分离谷粒和相应的面粉样品
通过在胚乳中钻一个小孔，使如上述步骤4.2制备的样品中的12个谷粒的每一个均受伤。将受伤但存活的谷粒转移到深孔微量滴定板的一个孔中(图2D，动作3)，将通过钻孔相同谷粒而释放的面粉合并且转移到第二个微量滴定板中(图2D，动作4))。对剩余的95个样品进行该程序(保持两个板的相同编号系统)，得到一个带有谷粒样品的微量滴定板(命名为“来自文库池的一部分的钻孔谷粒池”，缩写为PDGLP；参见图2D)和一个带有胚乳粉样品的微量滴定板(命名为“来自钻孔谷粒的面粉池”，缩写为PFGLP；图2D)。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，以下实施例中详述了与步骤4.3相关的以下主题：
-实施例10：大麦谷粒的钻孔；
-实施例11：制备“来自钻孔谷粒的面粉池”。
步骤4.4：制备源自突变体植物的胚乳粉的gDNA
将如上述步骤4.3制备的位于微量滴定板每个孔中的面粉分别进行gDNA提取(图2D，动作5)。所述提取采用半自动化方法，基于NucleoSpin 96Plant II试剂盒(Machery-Nagel)提供的推荐方法，产生“gDNA池”，其中微量滴定板的单个孔含有来自12个大麦谷粒面粉的gDNA。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，在本发明的实施例中详细描述了与步骤4.4相关的以下主题：
-实施例12：从钻孔谷粒的面粉中纯化gDNA(“gDNA池”)。
步骤4.5：分析来自突变体胚乳的gDNA
根据Bio-Rad提供的关于使用QX200液滴读数器和液滴发生器装置的建议，使用上述步骤4.4制备的gDNA样品进行标准ddPCR分析，采用引物组检测感兴趣的特定突变。只要来自单个孔的gDNA分析产生信号以指示该样品中存在突变DNA(参见图2D，动作6)，则该gDNA所来源的一个或几个谷粒极有可能包括所述感兴趣的突变。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，在本发明的实施例部分中详细描述了以下步骤4.5相关主题：
-实施例13：钻孔谷粒面粉的基于ddPCR的gDNA分析。
步骤4.6：鉴定感兴趣的突变体谷粒
虽然表示为PFGLP的微量滴定板的样品含有面粉(参见步骤4.3)，但是表示为PDGLP的板中的匹配孔含有12个相应的活谷粒。因此，下一步是分离由12个感兴趣的谷粒构成的样品(图2D，动作7)，然后使这些谷粒发芽(图2D，动作8)。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，本发明的实施例部分中详细描述了以下步骤4.6-主题：
-实施例14：潜在突变体植物的发芽。
步骤4.7：性状验证
本领域技术人员可以使用许多方法来确定潜在的突变体是否具有预期的特征，即感兴趣的性状。在此情况下，从发芽的小植株中提取gDNA，如上文步骤4.6中所述进行鉴定和繁殖，并利用ddPCR和DNA测序通过组合分析确认12个潜在突变体中的哪一个实际上含有感兴趣的突变(参见图2D，动作9)。
出于描述清楚的目的，而不是作为限制，本发明的实施例部分中详细描述了与步骤4.7相关的以下主题：
-实施例15：分析细节，包括ddPCR和DNA测序。
WS5：生成和使用gDNA“超级池”
步骤5.1：突变的大麦谷粒的超高通量鉴定
本发明还公开了两种不同数字PCR分析平台的组合使用，其改进了鉴定低发生率突变的方法。此处，RainDance Technologies商业化的RainDrop平台被用于发现来自突变体植物的gDNA复杂样品中的DNA突变，而Bio-Rad的产品提供了鉴定来自单个大麦突变体的谷粒提取物的方法。
出于清楚描述的目的，而不是作为限制，本发明的实施例部分中详细描述了与步骤4.7相关的以下主题：
-实施例16：制备gDNA“超级池”；
-实施例17：来自“超级池”的gDNA的ddPCR。
总之，简单提供简短的概述，WS和相应的实施例按以下方式排列：
WS2：
-实施例1：在“田块”中种植大麦植物；
-实施例2：收获单个“田块”中的谷粒。
WS3：
-实施例3：“子谷粒总量”中谷粒的描述；
-实施例4：制备来自“子面粉总量”样品的谷粒面粉；
-实施例5：制备25g面粉等份试样(ASFT)；
-实施例6：制备ASFT的gDNA；
-实施例7：用来自ASFT的gDNA进行的基于ddPCR的实验。
WS4：
-实施例8：收集作为“谷粒文库池”的谷粒；
-实施例9：从“谷粒文库池”中获取“谷粒文库池的一部分”；
-实施例10：大麦谷粒的钻孔；
-实施例11：制备“来自钻孔谷粒的面粉池”；
-实施例12：从钻孔谷粒的面粉中纯化gDNA(“gDNA池”)；
-实施例13：钻孔谷粒面粉的基于ddPCR的gDNA分析；
-实施例14：潜在突变体植物的发芽；
-实施例15：通过基于ddPCR的筛选鉴定的突变体植物的细节。
WS5：
-实施例16：制备gDNA“超级池”；
-实施例17：来自“超级池”的gDNA的ddPCR。
实施例
实施例1：在“田块”中种植大麦植物。
如上文WS1所述，用NaN3诱变大麦谷粒。诱变的大麦谷粒在7.5m2的田块中繁殖。在每块中，播种250g谷粒并生长至成熟。
实施例2：收获单个“田块”中的谷粒。
收获时，将田块分成15-17个小块，每个小块包含约300株植物。植物通过镰刀收获并脱粒、装袋，每个小块单独进行。因此，一个“谷粒总量”袋中的谷粒来自300株植物。
实施例3：“子谷粒总量”中谷粒的描述。
使用谷粒样品分梳机将一个“谷粒总量”样品的所有谷粒分成4个相等大小的随机部分。每个部分代表一个“谷粒总量”样品的总谷粒量的25％。这些部分中的一个构成一个“子谷粒总量”。
实施例4：制备来自“子面粉总量”样品的谷粒面粉。
将一个“子谷粒总量”样品的所有谷粒放入谷粒研磨器(Retsch，GrindoMixGM200)中。将谷粒在10.000RPM下研磨30秒。将得到的面粉(“子面粉总量”；～75g)放入纸袋中并在23℃下储存。
实施例5：制备25g面粉等份试样(ASFT)。
从一个“子面粉总量”样品中，称出25g面粉的等份试样。将25g面粉等份试样(ASTF)转移到纸袋中并在23℃下储存。
实施例6：制备纯化的ASF的gDNA。
将一个25克面粉等份试样(ASTF)转移到250mL玻璃瓶中，重悬于30mL H2O中，然后加入65℃加热的70mL 2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液(含有1.4M NaCl、20mMNa2EDTA、100mM Tris-HCl，用1M NaOH调节至pH 8.0)。在溶液高压灭菌后，随后补充250μl10mg/mL RNase A和250μl蛋白酶K，常规混合下孵育以降解RNA和蛋白质。将50mL等份试样转移至50mL Falcon管中，然后通过4000rpm离心10分钟除去不溶性沉淀物，之后将24mL所得上清液转移至新的50mL管中。
用氯仿连续两次提取(第一次用15mL，第二次用12.5mL)后，将含有核酸(包括gDNA)的15mL水相转移到含有30mL 0.5％CTAB缓冲液的50mL试管中，所述缓冲液用0.04MNaCl、50mM Tris-HCl制备，用1M NaOH调节至pH8.0。将管倒置6-8×，在室温下温育1小时，然后4000rpm离心10分钟。弃去水相，同时将含有gDNA的沉淀物缓慢溶解在10mL 1.2M NaCl中，8℃，过夜。接下来，用10mL氯仿提取，然后4000rpm离心15分钟。在水相中，将9.5mL与5.5mL异丙醇合并，将所得样品轻轻倒转6-8×，然后室温下温育20分钟，然后4000rpm下离心10分钟沉淀gDNA。
含有gDNA的沉淀物用5mL 70％乙醇洗涤，预先以4000rpm离心10分钟，弃去所得上清液，同时将gDNA沉淀物在室温下干燥约40分钟。加入5mL H2O并在65℃温育30分钟以重悬gDNA后，将500μl来自“子面粉总量”的gDNA转移到相应微量滴定板的特定2mL深孔中。将具有来自“单个SFT等份试样”的不同gDNA样品的所述板标记为“经纯化的gDNA”，并用于长期储存或实验分析。
实施例7：用来自ASFT的gDNA进行的基于ddPCR的实验。
根据制造商提供的说明书，使用Droplet Digital PCR QX200系统(Bio-Rad)进行ddPCR。野生型和突变体等位基因的序列特异性引物和探针购自Bio Rad。
出于分析目的，5μL纯化的单独ASFT的gDNA(参见图2C)或来自酵母的gDNA(如Yeast WS3中所制备)加入17-μLPCR混合物中(含有11μL用于探针的2×ddPCR Supermix(No.dUTP；Bio-Rad)、900nM靶特异性PCR引物、250nM分别用6羧基荧光素-FAM和六氯荧光素-HEX探针标记的突变体检测和参考探针)。突变检测探针特异性结合包含突变的靶序列，而参考检测探针特异性结合野生型序列。将反应混合物加载到AutoDG Droplet Generator(Bio-Rad)上，并根据制造商的手册产生液滴。采用标准PCR条件对液滴乳液进行热循环：在95℃下变性10分钟，在94℃下30秒和55℃下1分钟实施40个PCR循环，并在98℃下最终延伸10分钟，之后将微量滴定板保存在8℃。使用QX200 Droplet Reader(Bio-Rad)确认液滴中的PCR扩增。通过比较野生型和非模板ddPCR结果确定分析阈值。所有数据均评估超过阈值。
使用软件QuantaSoft版本v1.7(Bio-Rad)分析数据。
实施例8：收集作为“谷粒文库池”的谷粒。
使用谷粒样品分梳机将一个“谷粒总量”样品的所有谷粒分成4个相等大小的随机部分。每个部分代表一个“谷粒总量”样品的总谷粒量的25％。一个“谷粒文库池”包含3个部分的集合谷粒。
实施例9：从“谷粒文库池”中获得“谷粒文库池的一部分”。
依次去除96个每个均来自“谷粒文库池”的12粒的样品建立“谷粒文库池的一部分”，其中12个谷粒的每个样品构成次级子池。
实施例10：对大麦谷粒进行钻孔
来自“谷粒文库池的一部分”的谷粒被分为96个等份试样，每个等份试样由12个谷粒组成。将每个12粒等份试样放在一张称重纸上，然后用一对钳子连续固定，同时使用装配有1.6mm钻头的雕刻机(Marathon-3，Saeyang Microtech)在胚乳上钻一个小的、2-3mm深的孔。旋转运动将面粉从胚乳移到谷粒顶部和周围的称重纸上。将12粒经钻孔的样品置于微量滴定板的单独的2mL孔中，产生钻孔大麦谷粒的次级子池，也称为“来自文库池的一部分的钻孔大麦粒池”。(图2D，动作3)。将钻孔的谷粒储存在20℃直至进一步分析。
实施例11：制备“来自钻孔谷粒的面粉池”。
将96个面粉样品(每个都含有来自12个钻孔大麦粒的面粉(如实施例10中详述))转移到1.5mL微量滴定板的单独孔中(“来自钻孔谷粒的面粉池”；参见图2D，动作4)，保持样品编号系统与钻孔谷粒的编号匹配。
实施例12：从钻孔谷粒的面粉中纯化gDNA(“gDNA池”)。
将如实施例11详述制备的钻孔大麦谷粒的面粉池采用半自动DNA提取方法进行gDNA提取，如NucleoSpin 96Plant II试剂盒(Macherey-Nagel)的说明书中所描述的。因此，微量滴定板的每个孔含有来自12个谷粒的面粉的gDNA(图2D，动作5)。
实施例13：钻孔谷粒面粉的基于ddPCR的gDNA分析。
虽然WS3试验(参见图2C和实施例3-7)被设计用于鉴定96个gDNA等份试样(总体上代表～6000个突变谷粒的gDNA)中的哪一个单独样品含有感兴趣的核苷酸突变，随后的WS4特异性工作(参见图2D)被设计用于精确定位特定的突变体谷粒。
如图2D动作6所示，主要工作是确定12个不同谷粒的哪个gDNA样品将在ddPCR分析中产生阳性测试结果。因此，通过采用与实施例7中提供的相同反应条件和分析参数，可能区分微量滴定板中哪个孔含有感兴趣的gDNA。包含一个杂合子突变体谷粒的样品定义为具有5％(±2.5％)的分数丰度，具有10％(±2.5％)的为包含纯合突变体谷粒的样品。
基于上述分析工作，可能鉴定和选择潜在的面粉池，并因此鉴定具有感兴趣核苷酸突变的相应谷粒池。将纯合和杂合突变体转移到大盆的土壤中并转移到温室中进行繁殖。弃去所有阴性小植株。
实施例14：潜在突变体植物的发芽。
只要对来自12个大麦谷粒面粉中的gDNA的分析产生突变信号(参见图2D，动作6)，则使“来自文库池一部分的钻孔谷粒池”的相应谷粒发芽(图2D，动作7和8)。
实施例15：通过基于ddPCR的筛选鉴定的突变体植物的细节。
将由12个钻孔谷粒组成的一个“来自文库池一部分的钻孔谷粒池”的内容物放入9mm培养皿中(用2张滤纸(8.5mm；Whatman)制成)，其中加入2mL H2O)。在16℃黑暗中发芽阶段96小时后，将谷粒放入土壤中并在受控条件下进一步生长7天。然后，从第一批叶子中取出2×5mm组织切片并置于0.2mL管中。将50μL提取溶液(Sigma)移液到每片叶子上并在95℃下孵育10分钟。将样品冷却至室温并与50μL稀释溶液(Sigma)混合。将10μL提取-稀释-混合物与30μL H2O合并最终确定gDNA样品。
出于分析目的，将5μL纯化的gDNA加入到17μL PCR混合物中(含有11μL用于探针的2×ddPCR Supermix(No.dUTP；Bio-Rad)，900nM靶特异性PCR引物，250nM突变体特异性(6羧基荧光素-FAM)和野生型特异性(六氯荧光素-HEX)探针)。将反应混合物加载到AutoDGDroplet Generator(Bio-Rad)上，并根据制造商的手册产生液滴。采用标准PCR条件对液滴乳液进行热循环：在95℃变性10分钟，在94℃下30秒和55℃下1分钟实施40个PCR循环，最后在98℃下延伸10分钟，在8℃下储存微量滴定板。使用QX200 Droplet Reader(Bio-Rad)确认液滴中的PCR扩增。通过比较野生型和无模板ddPCR结果确定测试阈值。评估获得的所有数据均高于阈值。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。当50％阳性ddPCR事件总数来自突变探针(FAM)时，一个单独的小植株被认为是杂合突变体。当100％阳性ddPCR事件总数来自突变探针(FAM)时，一个单独的小植株被认为是纯合突变体。使各个突变体植物生长至成熟(参见图1D，动作9)。
实施例16：制备gDNA“超级池”。
简单地，将一个文库板的所有94个“子池”的每个gDNA提取物的等份试样(例如50μL)合并到一个“超级池”中。
在一些实施方案中，在进行ddPCR分析之前，进一步富集gDNA超级池。
因此，例如超级池的2μl gDNA可以在标准PCR反应中扩增，包括例如10μl 5X Q5反应缓冲液(New England Biolabs)，200μM dNTP，0.02U/μl Q5高保真DNA聚合酶，100nM靶特异性正向PCR引物，100nM靶特异性反向PCR引物，100nM阻断探针和水。然后采用标准PCR条件将PCR混合物热循环约20个PCR循环。这产生富集的gDNA超级池。
实施例17：来自“超级池”的gDNA的ddPCR分析。
为了在突变大麦谷粒筛选工作中提高产率的同时减少化学品使用，开发了两种技术的组合使用，其中一种由RainDance Technologies(在液滴制造中较好)提供，另一种由Bio-Rad(在同时处理的样品数量上非常突出)提供。一般而言，RainDance技术用于鉴定含有来自众多突变体谷粒的gDNA模板的特定但复杂的样品(在下文“程序A”部分详述)，而后续的基于Bio-Rad的分析有助于鉴定其特征为感兴趣突变的单个谷粒(在下文“程序B”部分中描述)。
程序A：基于RainDance的ddPCR，具有16个gDNA“超级池”。
首先，使用RainDrop Source仪器生成各个“超级池”(例如4到8个超级池)的液滴。用于基于RainDance的ddPCR的gDNA可以是组合的gDNA提取物，或者其可以是如实施例16所述制备的经富集的gDNA超级池。例如，将来自一个“超级池”的20μL gDNA等份试样或10μl等份的经富集的gDNA超级池与25μL用于探针的Supermix(Bio-Rad)混合；液滴稳定剂(RainDance)；900nM靶特异性正向引物；900nM靶特异性反向引物；120-250nM的野生型检测探针(VIC)；250-440nM的突变检测探针(FAM)和H2O，将总反应体积调节为50μL。将总共4-8个单独的反应混合物(代表4-8个单独的gDNA“超级池”)添加到8通道源芯片(RainDance)中，并在Source Instrument(RainDance)上处理。针对另外的“超级池”可以重复上述的整个过程，使得用于后续分析的样品总数为8至16。
将含有由反应混合物产生的液滴(如上所述)的两个8孔条密封，并如本文实施例9中所述扩增内容物。此后，将扩增的混合物转移至Sense Instrument(RainDance)，并使用RainDrop Analyst数据分析软件进行分析。
与所有16个“超级池”中突变事件的平均信号相比，显示与感兴趣突变相关的更高信号的那些“超级池”被定义为包含潜在的突变体衍生的gDNA。
程序B：基于Bio-Rad的“超级池”的ddPCR分析。
如上文程序A中详述的，对构成感兴趣的“超级池”的96个gDNA样品中每一个的等份试样进行ddPCR分析，表明存在突变模板。如上文针对WS3和WS4所述进行分析。
特别地，数据分析旨在选择包含预定感兴趣突变的谷粒池。相对于整个板的所有数据点的图，单独定义阈值的数据集。分析类别-包括但不限于靶浓度、分数丰度和确定的突变事件的图表-被关于候选者选择而进行单独评估。
分数丰度可以确定为：[(“突变检测探针”)的信号]除以[(“参考检测探针”+“突变检测探针”)的信号]。
如果观察到以下性质，则假定样品含有突变体DNA：
-分数丰度增加；
-突变体液滴水平增加，或；
-突变体事件的数量增加为平均水平的50％以上或更高。
实施例18：基于ddPCR筛选大麦突变体，其具有谷氨酰胺合成酶GS1-3基因中的特定突变。
使用上文工作流和实施例中描述的方法鉴定携带特定突变的大麦植物。如上所述，该方法可用于鉴定任何突变体。鉴定特定突变G→A，其导致大麦谷氨酰胺合成酶1同种型3(HvGS1-3)的序列第287位的Gly取代为Asp残基。
谷氨酰胺合成酶
谷氨酰胺合成酶1(GS1)是一种关键酶，其通过催化铵或氨和谷氨酸缩合成谷氨酰胺而参与高等植物氮同化。在富氮土壤中，氮过量可导致大麦谷粒灌浆期间氮素积累增加，从而对麦芽质量产生负面影响。GS1的敲除突变可导致严重的生长缺陷，突出了该酶对整体植物健康的重要性(Tomoyuki Yamaya和Miyako Kusano，2014)。在大麦中已知三种GS1同种型(HvGS1-1、HvGS1-2、HvGS1-3)。在这三种大麦同种型中，HvGS1-3主要在发育中的谷粒中具有活性并且在高铵条件下上调。设计了一种突变策略，旨在保持植物的最佳发育，同时降低谷粒氮积累能力。该突变策略聚焦于氨基酸取代以降低GS1-3酶活性。在蛋白序列的第287位鉴定出合适的氨基酸取代(Protein Seq ID，NCBI：AFX60877.1，本文以SEQ ID NO：2提供)。将密码子GGC(核苷酸859、860、861；GenBank编号NCBI CDS：JX878491.1-本文提供为SEQ ID NO：1)改变为GAC，导致蛋白序列在287位从甘氨酸变为天冬氨酸(Protein Seq ID，NCBI：AFX60877.1)。该氨基酸变化将带负电荷的氨基酸引入蛋白序列。GS1-3是由包含5个亚基的两个环构成的十聚体，氨基酸残基287位于两个环之间的界面并远离活性位点。因此，引入带负电荷的氨基酸被认为不会影响催化其反应的总体能力，但却可以通过十聚体装配中的结构变化降低酶活性。
ddPCR测定
设计了独特的ddPCR测定法，具体用于在野生型编码序列(GenBank编号NCBI：JX878491.1)的第860位核苷酸处区分HvGS1-3的突变体等位基因和野生型等位基因。突变检测探针与编码序列互补，在第860位核苷酸处含有A碱基。参考检测探针与编码序列互补，在第860位核苷酸处含有G碱基。设计两个侧翼引物以扩增编码序列第860位核苷酸周围的基因组序列。
以下引物和探针特别设计用于HvGS1-3基因座：
-靶特异性正向引物(SEQ ID NO：3)：
5′-GTGATCAAGAGGGCGATCAA-3'；
-靶特异性反向引物(SEQ ID NO：4)：
5′-CAAGTCTCAACTCGCCGTAT-3′；
-突变体特异性检测探针(SEQ ID NO：5)：
5′-AAGACAACGAGCGC-3′–用6-羧基荧光素(FAM)标记；
-参考特异性检测探针(SEQ ID NO：6)：
5′-AAGGCAACGAGCGC-3′-用六氯荧光素(HEX)标记。
如上文WS1中所述制备随机诱变的大麦谷粒池，然后制备有序文库。
确定文库样品是否含有突变谷粒(WS3)
通常，下一步是确定文库是否含有突变谷粒，基本如上文WS3和实施例7中所述，具有以下细节：
-用总量为376个GLP(即376个子池)进行筛选，代表约120,000个突变的大麦植物。基本如实施例7中所述实施ddPCR；
-将来自gDNA(GT#377-GT#470)的5μL gDNA样品加入到含有17μl PCR反应混合物的每个孔中，并通过上下吸液彻底混合。
将用于PCR的微量滴定板加载到QX200液滴读数器(Bio-Rad)上进行液滴分析。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析获得的数据。使用2-D曲线确定阈值，通道1和通道2的幅度(amplitude)分别设置为2700和1500用于扩增。分数丰度的各个值的比较显示，相对于突变体检测，gDNA(GT#380)提供比任何其他样品更高的信号。与0.0077％相比，gDNA的分数丰度(GT#380)为0.089％，0.0077％代表所有94个测试的gDNA样品的平均分数丰度。
发现以感兴趣的突变为特征的单个谷粒(WS4)
基本如上文在WS4中所述鉴定携带基因突变的单个大麦谷粒，包括以下连续次序的细节：
1.基于对来自GT#377-GT#470的gDNA进行的HvGS1-3特异性ddPCR分析，4500粒GLP#380[对应于阳性样品gDNA(GT#380)]被认为极有可能包含一个或多个具有感兴趣的基因突变的谷粒。
2.通过从GLP#380中依次去除96×12谷粒样品建立FGLP#380。将每个12粒等份试样放在一张称重纸上，然后用一对钳子连续固定，同时使用配有1.6mm钻头的雕刻机(Marathon-3，Saeyang Microtech)在胚乳上钻一个小的、2-3mm深的孔。旋转运动将面粉从胚乳移到谷物顶部和周围的称重纸上。将12粒钻孔样品置于微量滴定板的单独2mL孔中，得到钻孔大麦粒的次级子池PDGLP#380。将96个面粉样品(每个样品都含有来自12个钻孔大麦粒的面粉)转移到1.5mL微量滴定板(PFGLP#380)的单独孔中，保持样品编号系统与钻孔谷粒的编号相匹配。
3.接下来，使用如NucleoSpin 96Plant II试剂盒(Macherey-Nagel)的说明书中详述的半自动DNA提取方法对PFGLP#380进行gDNA提取。因此，微量滴定板的每个孔含有来自12个谷粒面粉的gDNA。
4.如上所述分析来自PFGLP#380的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，对于通道1幅度设置为2700，对于通道2幅度设置为1500。对分数丰度各个值的比较显示，PFGLP#380的样品中没有一个含有突变谷粒。由于GLP#380被认为很可能含有突变谷粒，因此决定通过建立第二个FGLP(FGLP#380-2)来制备和分析其他样品。由此制备PDGLP#380-2和PFGLP#380-2。如上所述分析PFGLP#380-2的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，并且对于通道1幅度设置为2700，对于通道2幅度设置为1500。在微量滴定板中鉴定出三个单独的孔(C02、F04、F05)，其显示4.02％、4.11％和5.55％的分数丰度，均表明PDGLP#380-2的3个独立孔中存在三个单独的杂合突变体。
5.将来自PDGLP#380-2的孔C02和F04的所有12个谷粒发芽。收集所有24个小植株的叶材料并使用REDExtract(Sigma Aldrich)进行DNA提取。如上所述分析来自叶样品的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，并且对于通道1幅度设置为2700，对于通道2幅度设置为1500。来自PDGLP#380-2的孔C02的一个小植株显示41％的分数丰度，证实存在杂合突变体。来自PDGLP#380-2的孔F04的一个小植株显示39.6％的分数丰度，证实存在杂合突变体。
6.采用对鉴定的突变体和参考样品的直接测序进行另外的性状验证。使用REDExtract DNA提取方法(Sigma Aldrich)从叶材料中提取DNA。对于测序分析，制备50μlPCR反应，其包含1μl纯化的gDNA，20μl REDExtract(Sigma Aldrich)，500nM靶特异性正向引物，500nM靶特异性反向引物和水。使用以下PCR条件对样品进行热循环：94℃变性2分钟，94℃45秒、58℃45秒和72℃45秒实施38个循环，以及在72℃下最终延伸5分钟，之后在8℃下储存PCR板。使用NucleoSpin Gel和PCR清洗试剂盒纯化单个PCR产物。使用靶特异性正向引物和靶特异性反向引物对所有样品进行测序。
7.相对于预定基因组位置的基因型，在ddPCR分析中鉴定为突变阳性的两个小植株是杂合的。参考样品在相同位置显示纯合的野生型基因型。
实施例19：重组形式的大麦谷氨酰胺合酶的分析。
利用大肠杆菌宿主细胞合成三种重组HvGS1-3变体，然后通过亲和纯化将酶富集至高纯度。以下变体在大肠杆菌中表达：
-Q：野生型参考-SEQ ID NO：1；
-3864：具有G287D氨基酸交换的SEQ ID NO：1，即对应于由突变体大麦植物表达的突变蛋白(如实施例18中所述鉴定)。
-LR：具有氨基酸交换D300N的SEQ ID NO：1，即预期变化对酶活性几乎没有影响的酶变体。
在酶存在下由谷氨酸、羟胺和ATP合成谷氨酰基羟肟酸酯来确定三种HvGS1-3变体的活性。测定不同浓度的谷氨酸和羟胺下所有三种HvGS1-3变体的酶动力学，结果分别显示在表1和表2中。
虽然HvGS1-3 Q和LR的kcat和kcat/KM相似，但HvGS1-3 3864显示的值始终比其他两个变体低一个或两个数量级。动力学数据表明，在HvGS1-3 3864中鉴定的突变即Gly 287变为Asp对该变体中任一底物的结合和利用具有严重影响。由于在核苷酸的高底物浓度处吸光度的高度可变性，不能确定ATP结合和利用的动力学值。
表1.不同浓度谷氨酸存在下HvGS1-3变体的酶动力学。关于Q、LR和3864，括号中的数字是指反应的蛋白总量，以μg计。
表2.不同浓度底物羟胺存在下HvGS1-3变体的酶动力学。关于Q、LR和3864，括号中的数字是指反应的蛋白总量，以μg计。
为了确定与Q相比两种变体中的任一种中GS1-3复合物的寡聚化是否受影响，首先使纯化的HvGS1-3等分流经尺寸排阻柱。所有三种变体在相同的洗脱体积处具有主峰。
下面描述了获得本实施例所述结果的实验的6步骤详细说明。
步骤1：设计HvGS1-3基因序列用于异源基因表达
保藏于GenBank、登录号为JX878491.1的大麦谷氨酰胺合成酶同种型GS1-3(HvGS1-3)的编码序列用作合成3个相应基因序列(GenScript，中国)的基础，代表野生型HvGS1-3(Q)和两种含有突变的形式(3864或LR)。野生型GS1-3基因和蛋白序列在本文中分别提供为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。将所有三种变体的蛋白编码DNA序列插入购自MerckMillipore(德国)的大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)中，然后使用标准方法转化大肠杆菌株BL21(DE3)。
步骤2：HvGS1-3的异源表达
使用经pET-28a(+)中的HvGS1-3Q或其变体转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在标准条件下，在含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养细菌。加入250μM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma-Aldrich)诱导基因表达。在37℃下、120rpm 4小时，进行表达。在8℃下4,000×g离心15分钟收获细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10mL缓冲液A(20mMTris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl，1mM MgCl2)中。将重悬的细胞-20℃冷冻直至进一步使用。
步骤3：重组基因表达后大肠杆菌BL21(DE3)细胞的细胞裂解
首先将转化的冷冻大肠杆菌BL21(DE3)细胞解冻，然后在湿冰上，使用Vibra细胞超声波仪(Sonics&Materials Inc.，USA)以30％振幅破碎90秒，5秒脉冲和5秒钟休息。超声处理后，用5μg/mL DNaseI(Sigma-Aldrich)将DNA消化10分钟。在13,000×g和4℃下离心10分钟除去裂解的细胞。将上清液通过注射器的0.45μm过滤器注入新管中。
步骤4：通过固定化金属亲和层析富集HvGS1-3
用5倍柱体积的双蒸水洗涤装有镍溶液的1mL固定化金属亲和色谱(IMAC)，并用相同体积的缓冲液A(其组成如上所述)平衡。使用注射器将过滤的可溶部分手动注入平衡的柱中，收集未结合的材料并保持在4℃。使用含有50mM咪唑(Sigma-Aldrich)的缓冲液A用10个柱体积(CV)洗掉松散结合的柱材料。在相似的条件下，使用含有400mM咪唑的缓冲液A，10个CV洗脱并收集HvGS1-3。将洗脱的蛋白溶液在离心过滤器单元上用缓冲液A[通过在8℃3,000×g下离心(SL-16R)20分钟，去除多余的咪唑]渗滤4×，所述离心过滤器单元由标称分子截留值为10,000(Millipore，爱尔兰)的再生纤维素制成。
步骤5：重组HvGS1-3的体外活性测定
对Wellner和Meister(1966)描述的活性测定进行适当改变，用于确定两种HvGS1-3变体活性的变化(与HvGS1-3 Q的活性相比)。50μL反应含有100mM Tris-HCl，pH 8.0，50mMMgCl2，20mM ATP，不同浓度的γ-谷氨酸羟胺(当L-谷氨酸变化时；否则为50mM)，不同浓度的L-谷氨酸(当谷氨酸羟胺变化时；否则为50mM)。将反应置于一半面积、平底96孔微量培养板(Corning，USA)中，平衡至37℃。通过加入终浓度为1或5μg/mL的纯化HvGS1-3引发反应。30分钟后，加入50μL 370mM Fe(III)Cl3，200mM TCA，670mM HCl终止反应。然后在SpectraMax 340PC384酶标仪(Molecular Devices，USA)上从底部测量A540nm，使用路径校正来考虑体积的微小差异。使用GraphPad Prism(版本4，GraphPad Software，USA)绘制数据。
步骤6：尺寸排阻色谱
将等量的三种HvGS1-3变体分别加载到含有Superdex 200(GE Life Sciences，USA)的10/300尺寸排阻柱上，并在
FPLC(GE Life Sciences)上在缓冲液A中平衡。结合蛋白的洗脱以0.5mL/min进行，蛋白洗脱后测量A280。
实施例20：对来自诱变酵母细胞的gDNA进行ddPCR分析。
出于描述清楚的目的，而不是作为限制，在本实施例中详细描述了以下主题：
-第1部分：制备随机诱变的酵母培养物
-第2部分：制备有序文库
-第3部分：鉴定含有具有预定突变的gDNA的孔
-第4部分：富集以预定突变为特征的酵母细胞
WS1：制备随机诱变的酵母培养物
步骤1.1：诱变程序
为了诱导突变，根据Methods in Molecular Biology，Yeast Protocols，V.313，2006中描述的方案，用MNNG(甲基亚硝基胍)对酵母菌株进行处理。
MNNG是一种突变剂，已知可以将gDNA的胍或胸腺嘧啶烷基化，然后在gDNA复制时将G·C对转变为A·T。本节中描述的方法旨在鉴定感兴趣基因的点突变，其将定义的氨基酸密码子改变为过早终止密码子。本领域技术人员将能够使该方法适应于其他种类突变的鉴定。因此，点突变导致截短的和相应的无功能或缺陷的蛋白。基于靶基因/蛋白的序列定义所需的点突变，以产生终止密码子。影响感兴趣基因调控区的其他点突变也可通过该方法鉴定。
对酵母培养物进行诱变，例如细胞总数为2×107。确定并调整用于诱变的酵母细胞的突变状态以确保所需的突变率。通常调节诱变条件以提供60-70％的存活率。突变剂浓度和暴露时间根据酵母菌株而变化。
WS2：制备有序文库
步骤2.1：细胞活力
测定活细胞滴度，并使用Biomek FXp机器人将所有诱变的酵母细胞等分接种到具有YPD的96孔板中。每孔接种3000-5000个活细胞。
WS3：鉴定含有具有预定突变的gDNA的孔
步骤3.1：制备诱变酵母细胞文库
步骤1.1的接种于96孔板中的诱变酵母细胞被认为是含有靶向突变酵母的总文库。将酵母细胞孵育3天以使生长饱和。用Biomek FXp机器人(复制步骤)重新接种到最小生长培养基中来扩增文库，生长3天后用于gDNA分离。将96孔板中剩余的酵母细胞悬浮液用甘油(15％终浓度)保存在-80℃下用于下游应用以分离所需的突变酵母。
步骤3.2：从酵母中分离gDNA
为了制备gDNA，将酵母细胞转移到DNA分离96孔板中，并使用机器人技术(BiomekFXp，Agencourt DNAdvance试剂盒和来自Beckman Coulter的方案)进行DNA分离步骤。该程序遵循制造商的说明，具有使用裂解酶消化酵母细胞壁并破坏细胞的额外步骤。该方案采用磁珠进行gDNA沉淀。96孔板中的gDNA用于下游应用以鉴定预定突变的阳性池。使用96孔板读数器测量DNA浓度，将DNA浓度调节至25ng/5μL并直接用于ddPCR。将96孔板中的原始浓缩DNA储存起来供以后使用。
步骤3.3：通过ddPCR分析样品
对步骤2.2中制备的96孔板形式的gDNA进行定量，并将浓度调节至25ng/5μL。包括阳性和阴性对照DNA样品。基本如实施例7中所述对每个gDNA样品随后进行ddPCR分析。在该阶段，可以采用识别基因序列中几个或所有可能位置处的不同点突变的探针阵列，其产生过早的终止密码子，以增加突变体鉴定的机会。该方法允许鉴定所需突变呈阳性的孔，即包含携带所需突变的酵母的孔。
WS4：富集以预定突变为特征的酵母细胞
步骤4.1：制备酵母文库池
将包含突变阳性孔的96孔板解冻，通过将阳性孔的内容物接种到新鲜的YPD肉汤(1:10)中使酵母细胞复苏，并在室温下旋转孵育4-6小时。为了确保酵母细胞不进一步增殖，将复苏的酵母培养物储存在冰箱中直至下游铺板并且完成纯突变体培养物的成功分离。在铺板之前，计数活酵母细胞并用含有1mM EDTA的PBS稀释，随后用YPD琼脂在Qpix方形皿上铺板，得到每板2000-3000个菌落。以这种方式制备的平板的数量取决于从冷冻原种复苏后的活酵母细胞的滴度和突变体鉴定的进展。例如，10-12个Qpix平板可以接种多达50,000个单细胞，这些细胞产生单个菌落。第3部分中描述的阳性池鉴定(其中野生型：突变体的比例高达1：5000)，表明在50,000个单细胞中至少10个细胞是靶突变体。监测菌落的生长以确保菌落之间的适当大小和距离，以便能够用Qpix机器人挑选单个菌落。一旦菌落准备好采集，以下列方式产生具有YPD生长酵母细胞的96孔板的文库：将所有Qpix板的菌落随机收集到10个96孔板中，因此每个孔含有50个菌落的池，具有最小的野生型：突变体的潜在比例为1:50。如步骤3.1(WS3)中所述，进一步处理这些板以分离gDNA并制备冷冻原液并在-80℃下储存以进一步下游应用。
步骤4.2：从文库池中分离酵母gDNA
为了从50个分离的菌落池中制备gDNA，将步骤3.1中获得的96孔板中的酵母培养物重新接种到新鲜的最小生长培养基中。一旦生长充足，使用机器人技术对酵母培养物进行DNA分离，如步骤3.2(WS3)中所述。使用96孔板读数器测量DNA浓度，并将DNA浓度调节至25ng/5μl，将等份试样直接用于ddPCR。保留96孔板形式的原始浓缩gDNA。96孔板中的gDNA用于下游应用以鉴定具有预定突变的阳性池/孔。制备总共10个具有gDNA的96孔板。
步骤4.3：用ddPCR分析样品
对步骤3.2中制备的96孔板形式的gDNA进行定量，并将浓度调节至25ng/5μL。包括阳性和阴性对照DNA样品。如实施例7中所述对每个gDNA样品随后进行ddPCR分析。如果在步骤3.3中使用多个探针，则在该阶段仅采用在步骤3.3给出阳性池阳性鉴定的探针。该方法允许鉴定具有预定突变的阳性子池。
步骤4.4：制备单菌落酵母文库
在步骤4.3中鉴定的具有阳性孔的冷冻96孔板用于平板化供单菌落生长。将来自阳性孔的酵母培养物接种到新鲜的YPD肉汤中并培养过夜。将1000个细胞接种在YPD琼脂(Qpix方盘形式)上以产生单菌落。用Qpix机器人将生长的菌落挑选到10个96孔板中，其中YPD肉汤作为生长培养基。如步骤3.1(WS3)中所述，进一步处理这些板以分离gDNA并制备冷冻原料用于进一步的下游应用。
步骤4.5：从单菌落文库中分离gDNA
如步骤4.2中所述制备gDNA。
步骤4.6：通过ddPCR分析样品
对步骤4.5中制备的96孔板形式的gDNA进行定量，并将浓度调节至25ng/5μL。包括阳性和阴性对照DNA样品。如实施例7中所述对每个gDNA样品随后进行ddPCR分析。在该阶段，仅应用在步骤3.1中给出阳性鉴定的探针。该方法允许鉴定具有预定突变的纯酵母培养物。该方法允许确定分离物的纯合或杂合状态。
步骤4.7：分离突变体酵母的纯培养物
为了制备突变酵母的原种，将来自阳性孔的酵母悬浮液铺在YPD琼脂上以使分离的菌落生长。手动挑取3个菌落并进一步作为生物复制品加工。
步骤4.8：靶基因或感兴趣的gDNA段的测序
将来自步骤4.7(WS4)的具有经鉴定的突变的酵母突变体分离物用于分离gDNA，然后进行特异性PCR，克隆获得的DNA片段并进行DNA测序以确认突变的身份。
步骤4.9：突变的功能性
具有感兴趣的纯合突变的酵母突变体直接用于证实突变具有预期的效果。如果确定杂合状态，并且发现不足以提供预期效果，则重复诱变，或者酵母分离物经历孢子形成，然后分离突变以确认纯合状态和突变体表型。具有感兴突变的酵母分离物直接用于应用目的，或者用于酵母育种以控制所需的表型。
实施例21
在酿酒酵母中，阿魏酸脱羧酶Fdc1对于芳族羧酸(包括肉桂酸或香豆酸)的脱羧是必需的。脱羧反应将底物转化为其相应的乙烯基衍生物，其中一些已知是风味活性化合物。例如，在啤酒发酵期间，Fdc1将来自麦芽汁的阿魏酸转化为4-乙烯基愈创木酚，其使最终的啤酒显著具有丁香样气味。虽然这些气味对于某些啤酒来说是典型的，特别是德国小麦啤酒，但在其他啤酒包括贮藏啤酒中，它们被认为是酚类异味(POF)。本文描述了通过非GMO方法鉴定携带基因ScFDC1中无义突变的酿酒酵母。经鉴定的酵母预计是POF阴性酵母菌株。
在食品工业中，使用分子遗传技术来修饰所选择的生物是不希望的，并且人们依赖于使用经典随机诱变技术和耗时的筛选来鉴定感兴趣的菌株。下面描述的方法描述了耗时较小的技术以在随机诱变的生物体群体中鉴定携带选定的感兴趣突变的菌株。更具体地，在该实施例中，描述了携带特定无义突变(W159*)的酵母菌株，该基因将酿酒酵母变种diastaticus菌株FS0105中ScFDC1基因第+476位从G变为A。ScFDC1基因的序列可在GenBank编号NCBI：NM_001180847获得，cDNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：26，fdc1的氨基酸序列提供为SEQ ID NO：7。
WS1：制备随机诱变的FS0105酵母细胞群。
步骤1.1：菌株FS0105的EMS突变。
为了诱导突变，根据“Methods in Yeast Genetics”(CSHL Press，2000)中描述的方案，用甲磺酸乙酯(EMS)对酵母菌株FS0105进行处理。简而言之，菌株FS0105在YPD培养基中生长过夜进入稳定期。离心收集细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次，用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7)洗涤一次。最后将细胞重悬于0.1M磷酸盐缓冲液中至约2×108个细胞/ml。在2ml安全锁反应管中将30μl EMS加入1ml细胞中，并将细胞在Eppendorf Thermomixer设备(1.5ml)中于30℃和1000rpm温育约75分钟，这通常导致菌株FS0105的杀灭率为约60-80％。为了停止诱变，通过短暂离心沉淀细胞，并用新鲜制备的无菌5％硫代硫酸钠溶液洗涤三次，并用无菌蒸馏水洗涤一次。最后将细胞重悬于1ml YPD中，并在Eppendorf Thermomixer设备(1.5ml)中于30℃和1000rpm温育1小时。在此步骤中，细胞可以在4℃下储存，或者立即用于下游过程，例如，通过在复杂介质上铺板确定杀灭率。
文献表明，诱变后立即将诱变的酵母细胞置于选择压力下会导致每个细胞突变数量显著增加(Lada等人，2013；Den Abt等人，2016)，这可能会显著减少酵母细胞的数量，这些细胞被筛选以鉴定感兴趣的突变。因此，将每个平板中约2×107个活的但诱变的细胞接种在含有2μg/ml除草剂甲磺隆的SD培养基平板上，并将培养板在30℃温育几天直至在选定板上显示除草剂抗性菌落。我们的目标是总共约50,000个除草剂抗性菌落。为了进一步增加每个细胞的突变数量，我们用无菌0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7)将除草剂抗性细胞从板上洗脱，将它们稀释至～2×108个细胞/ml，如上所述重复EMS诱变。该诱变和选择循环总共重复四次。
WS2：制备随机诱变的FS0105酵母细胞的随机文库。
步骤2.1：产生诱变的FS0105酵母细胞的总随机文库。
在第四轮和最后一轮EMS诱变(参见步骤1.1)后，通过在复合培养基板上铺板各自的稀释液来测定活细胞滴度。随后，将约1,200-1,500个活细胞/板平铺在YPD板上，并将培养皿在30℃温育3天。从96个单独的平板中，每板用3ml 0.1M磷酸钠缓冲液洗离细胞，形成96“文库池”。随后将来自这些文库池的约5×107个细胞用于DNA分离(参见下文)，同时将剩余的细胞离心，重悬于40％甘油/10％YP中，并在-80℃下冷冻以建立96个文库的“总随机池”，其包含总共约120,000-150,000个EMS诱变的FS0105克隆。
WS3：鉴定FS0105总随机池中包含具有选定Scfdc1无义突变的克隆的文库池。
步骤3.1：从FS0105总随机文库中分离酵母基因组DNA。
根据制造商的说明，使用
Pro 96基因组DNA试剂盒(invitrogen)和EveryPrepTM Universal Vacuum Manifold(invitrogen)分离来自总随机文库的每个池的基因组DNA。使用NanoDrop 1000 3.8.1测定每个样品的DNA浓度，并用无菌的无DNA酶水将DNA溶液调节至5ng DNA/μl的终浓度。将DNA样品储存在96孔PCR板中，-20℃，直至进一步使用。
步骤3.2：通过ddPCR分析文库池gDNA样品。
设计了独特的ddPCR测定法，特别用于区分菌株FS0105的野生型编码序列中第+476处核苷酸的ScFDC1突变体等位基因和野生型等位基因。相应的TGG密码子与该位置的常见实验室参考菌株S288C的ScFDC1序列相同(GenBank编号NCBI：NM_001180847)。突变检测探针与编码序列互补，在+476核苷酸位置含有A碱基。参考检测探针与编码序列互补，在+476核苷酸位置含有G碱基。设计两个侧翼引物以扩增编码序列+476核苷酸周围的基因组序列。使用BioRads Droplet Digital PCR Assays设计工具设计该测定，以检测突变。针对特定ScFDC1基因座开发了以下引物和探针：
靶特异性正向引物(5′-CATGTTTCAGACGGTGG-3′)(SEQ ID NO：13)
靶特异性反向引物(5′-CATACCTCTAGCAATTGACC-3′)(SEQ ID NO：14)
突变检测探针(5′-ACGTACGGAATGTAGATTCT-3')(SEQ ID NO：15)-用6-羧基荧光素-FAM标记
参比检测探针(5'-ACGTACGGAATGTGGATT-3')(SEQ ID NO：16)-用六氯荧光素-HEX标记。
通常，下一步是确定文库是否含有突变的酵母菌株。用总共96个酵母文库池进行筛选，每个池包含1200-1500个诱变的酵母菌落，并且代表总共约120,000-150,000个突变的酵母菌株。基本如实施例7所述进行ddPCR。将含有17μl PCR反应混合物的微量滴定板的每个孔中加入5μL的96个诱变酵母菌株池的gDNA的gDNA样品，并通过上下移液充分混合。
将用于PCR的微量滴定板加载到QX200液滴读数器(Bio-Rad)上以进行液滴分析。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析获得的数据。使用2-D曲线确定阈值，通道1和通道2的幅度分别设置为2700和1500，用于扩增。比较分数丰度的各个值表明，对于突变体检测，平板坐标G01的gDNA比任何其他样品具有更高的信号。与0.030％相比，gDNA池G01的分数丰度为0.190％，0.030％代表所有96个测试的gDNA样品的平均分数丰度。
WS4：通过创建后续子池来鉴定携带选定Scfdc1突变的单个酵母克隆。
步骤4.1：从FS0105总随机库创建100er子池。
基于用ScFDC1特异性ddPCR测定的96个gDNA文库池样品的分析，池G01中的1,200-1,500个酵母菌株被认为很可能含有携带感兴趣基因突变的一个或多个克隆。
通过在YPD琼脂平板上铺板各自的稀释液，测定步骤3.2中鉴定的阳性文库池G01的细胞滴度。随后，接种含有3ml液体YPD培养基的48个15ml培养管，每个用来自文库池G01的约100个细胞接种。将培养管在旋转培养箱中于30℃温育3天，得到来自文库池G01的48个100er子池，代表来自文库池G01的约4800个单独克隆。
步骤4.2：从FS0105 100er子池中分离酵母基因组DNA。
根据步骤3.1从48个100er子池中的每一个分离基因组DNA(参见之前步骤)，并再次将最终浓度调节至约5ng gDNA/μl。
步骤4.3：通过ddPCR分析100er子池gDNA样品。
来自48个100er子池的gDNA(每个含有来自池G01的约100个菌落)进行如上所述的分析(参见步骤3.2)。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，将通道1幅度设置为2000，将通道2幅度设置为2500。鉴定出微量滴定板中的四个单独孔(G07、C08、C09、G10)显示高于1％的分数丰度，表明在100个菌落的特定池中存在至少1个突变菌落。
步骤4.4：从FS0105总随机池创建10er子池。
在ddPCR分析中，100er子池C09显示出最高的分数丰度(2.99％)，并且被选择用于进一步分析。
与步骤4.1类似，通过在YPD琼脂平板上铺板各自的稀释液来确定步骤3.2中所鉴定的阳性100er子池C09的细胞滴度。随后，接种含有3ml液体YPD培养基的24个15ml培养管，每个用来自100er子池C09的约10个细胞接种。将培养管在旋转培养箱中于30℃温育3天，得到来自文库C09的24个100er子池，代表来自100er子池G01的约240个单独克隆。
步骤4.5：从FS0105 100er子池中分离酵母基因组DNA。
根据步骤3.1从24个10er子池的每一个分离基因组DNA(参见步骤4.4)，并再次将最终浓度调节至约5ng gDNA/μl。
步骤4.6：通过ddPCR分析10er子池gDNA样品。
如上所述分析来自24个单独的10er子池的gDNA。如上所述，使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据(参见步骤3.2)。使用2-D曲线确定阈值，通道1幅度设置为1500，通道2幅度设置为2000。三个单独的池(A02、C03和D03)显示高于10％的分数丰度，证实在10个菌落的三个池中的每一个存在至少一个突变菌落。
步骤4.7：从携带所引入的感兴趣突变的FS0105 10er子池中鉴定单个克隆。
选择在ddPCR分析(步骤4.6)中显示最高分数丰度的10er子池D03用于进一步分析。从来自10er子池D03的16个单独酵母菌落中分离gDNA，并进行与上述相同的分析(参见步骤4.3和4.6)。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，通道1幅度设置为2000，通道2幅度设置为2500。两个单独的池(C02和D02)显示高于99.9％的分数丰度，证实在16个测试的单个菌落中存在两个突变酵母菌落。
步骤4.8：分离突变体酵母纯培养物。
菌株FS0105显示出形成更大细胞聚集体的趋势。为了确保感兴趣的突变体酵母的未来原种来自单个细胞而不是细胞团，我们使用Singer MSM 400Dissecting显微镜从两个单独的池C02和D02中分离单个细胞。就此而言，将来自各个池的细胞悬浮液在TE缓冲液中稀释1000倍，其支持某些细胞团块的释放，并将10μl稀释液点在复合培养基琼脂平板上。然后根据制造商的建议/手册分离单个细胞。
步骤4.9：通过DNA序列分析确认所选择的感兴趣突变。
使用标准酵母基因组DNA制备方案分离来自步骤4.8的单细胞分离物的基因组DNA，并利用使用ScFDC1特异性寡核苷酸的标准PCR技术扩增覆盖靶基因ScFDC1的区域。使用
SV Gel和PCR Clean-up System(Promega)清洁所得的DNA片段，并对感兴趣的核苷酸(ScFDC1的+476)周围区域进行测序(LGC Genomics)。对回收的DNA序列的分析表明，源自个体池C02和D03(见4.7和4.8)的单细胞克隆均含有所需的无义突变W159*，其由ScFDC1基因的核苷酸+476处的G到A转换引起。
实施例22
采用上文工作流和实施例中描述的方法鉴定携带特定突变的小麦植物。使用图2中所示的命名进行各种池等的命名。尽管大麦是具有14条染色体的自授粉二倍体物种，多倍体在小麦中是常见的。本实施例表明，本发明的方法甚至可以用于多倍体生物，例如小麦。如上所述，该方法可用于鉴定任何突变体。本实施例描述了特定突变(鸟嘌呤至腺嘌呤)的鉴定，其导致A基因组位置91处的小麦基因GASR7(TaGASR7-A1)密码子区域从氨基酸色氨酸变为翻译终止。GASR7-A1基因的序列在GenBank编号NCBI：KJ000052中可得，cDNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：25，GASR7的氨基酸序列提供为SEQ ID NO：8。
ddPCR测定
设计了特异性ddPCR测定，其特异性地区分野生型编码序列(GenBank编号NCBI：KJ000052)中核苷酸位置273处的TaGASR7-A1的突变体等位基因和野生型等位基因。突变检测探针与核苷酸位置273处含有腺嘌呤的编码序列互补。参考检测探针与核苷酸位置273处为鸟嘌呤的编码序列互补。设计两个侧翼引物以扩增编码序列中第273核苷酸周围的基因组序列。针对特定TaGASR7-A1基因座开发了以下引物和探针：
靶特异性正向引物(5′-CGCCTGCCCCTGCTA -3′)(SEQ ID NO：9)
靶特异性反向引物(5′-AGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA AACCAAGAA-3′)(SEQ ID NO：10)
突变检测探针(5′-CAACAACTGAAAGACCA-3′)(SEQ ID NO：11)-用6-羧基荧光素-FAM标记
参考检测探针(5'-CAACAACTGGAAGACCA-3′)(SEQ ID NO：12)-用荧光团VIC标记
将谷粒在0.6％EMS中浸泡17小时制备随机诱变的小麦谷粒池。然后用水冲洗谷粒并在滤纸上干燥45分钟。在干燥后立即种植诱变的谷粒。
WS3：确定库样品是否包含突变谷粒
然后确定文库中是否含有突变的谷粒，基本如上文WS3和实施例7中所述，具有以下细节：
对总共94个GLP(94个子池)进行筛选，其代表约30,000个突变的小麦植物。基本如实施例7所属实施ddPCR。
将来自gDNA(GT#10001-GT#10094)的一个5μl gDNA样品加入到含有17μl PCR反应混合物的每个孔中，并通过上下吸移充分混合。
将PCR板加载到QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories)上进行液滴分析。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad Laboratories)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，将通道1幅度设置为3000，通道2幅度设置为2000。比较分数丰度的各个值表明，来自突变体检测的gDNA(GT#10072)的信号比任何其他样品更高。与0.024％相比，gDNA(GT#10072)的分数丰度为0.130％，0.024％代表所有94个测试gDNA样品的平均分数丰度。
WS4：发现以感兴趣的突变为特征的单个谷粒
基本如上文WS4所述鉴定携带突变的单个小麦谷粒，具有以下细节：
基于用TaGASR7-A1特异性ddPCR测定的子池(GT#10001-GT#10094)的gDNA分析，GLP#10072的4500个谷粒(对应于阳性样品gDNA(GT#10072))极有可能包含具有相同感兴趣突变的一个或多个谷粒。
从GLP#10072中每次均依次去除10个谷粒的96个样品来建立FGLP#10072。将每10粒等份试样放在一张称重纸上，然后用一对钳子持续固定，同时使用配有1.6mm钻头的雕刻机(Marathon-3，Saeyang Microtech)在胚乳上钻一个小的、2-3mm深的孔。旋转运动将面粉从胚乳移到谷物顶部和周围的称重纸上。将10粒钻孔样品置于微量滴定板的单个2ml孔中，得到钻孔小麦粒PDGLP#10072的次级子池。将96个面粉样品(每个都含有来自10个钻孔小麦谷粒的面粉)转移到1.5ml微量滴定板的单独孔(PFGLP#10072)中，保持样品编号系统与钻孔谷粒的编号相匹配。
通过使用NucleoSpin 96Plant II试剂盒(Macherey-Nagel)的说明书中详述的半自动DNA提取方法对PFGLP#10072进行gDNA提取。因此，微量滴定板的每个孔含有来自10粒谷物面粉的gDNA。
如上所述分析源自PFGLP#10072的DNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-RadLaboratories)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，通道1幅度设置为2500，通道2幅度设置为1700。鉴定微量滴定板中的两个单独孔(B10和G05)，其显示7.6％和5.2％的分数丰度，均表明在PDGLP#10072的2个单独孔中存在两个单独的突变体。
将来自PDGLP#10072的孔B10的所有10个谷粒都发芽。收获来自所有10个小植株的叶材料，并使用REDExtract(Sigma Aldrich)进行DNA提取。如上所述分析叶样品的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad Laboratories)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，通道1幅度设置为2000，通道2幅度设置为1600。来自PDGLP#10072的孔C03的一个小植株显示99％的分数丰度，证实存在纯合突变体。
对经鉴定的突变体和参考样品进行直接测序进行另外的性状验证。使用REDExtract DNA提取方法(Sigma Aldrich)从叶材料中提取DNA。对于测序分析，制备50μlPCR反应，其包含1μl纯化的gDNA，20μl REDExtract(Sigma Aldrich)，500nM靶特异性正向引物，500nM靶特异性反向引物和水。使用以下PCR条件对样品进行热循环：94℃变性2分钟，在94℃45秒、58℃45秒和72℃45秒下实施38个循环，以及在72℃下最终延伸5分钟，然后在8℃下储存PCR板。使用NucleoSpin Gel和PCR清洗试剂盒纯化单个PCR产物。使用靶特异性正向引物和靶特异性反向引物对所有样品进行测序。
在ddPCR分析中对突变呈阳性的小植株在预定的基因组位置还显示杂合突变体基因型。参考样品在相同位置显示纯合野生型基因型。
实施例23
通过结合使用两种技术鉴定携带特定突变的大麦植物，其中一种由RainDanceTechnologies提供，另一种由Bio-Rad Laboratories提供。一般而言，RainDance技术用于鉴定含有来自众多突变体谷粒的gDNA模板的特定但复杂的样品，而随后基于BioRad的分析有助于鉴定以感兴趣的突变为特征的单个谷粒。使用图2所示的命名完成各种池等的命名。
如上所述，该方法可用于鉴定任何突变体。本实施例描述了特异性突变(鸟嘌呤至腺嘌呤)的鉴定，其导致编码推定的BAHD酰基转移酶(HvBADH1)的大麦基因的密码子区域在位置31处由氨基酸色氨酸转变至翻译终止。
ddPCR测定
设计特异性ddPCR测定法，其特异性地区分HvBADH1核苷酸位置93处的突变体等位基因和野生型等位基因。野生型编码序列(cDNA序列)在本文中提供为SEQ ID NO：17，突变体编码序列在本文中提供为SEQ ID NO：18。HvBADH1的氨基酸序列提供为SEQ ID NO：19。突变检测探针与在SEQ ID NO：17的核苷酸位置93处含有腺嘌呤的编码序列部分互补。参考检测探针与在核苷酸位置93处含有鸟嘌呤的编码序列部分互补。设计两个侧翼引物以扩增编码序列中核苷酸位置93周围的基因组序列。另外，使用参考检测探针的核苷酸序列开发了阻断探针，其补充有3'间隔物，其在PCR期间通过DNA聚合酶防止参考序列的延伸。针对特定的HvBADH1基因座开发了以下引物和探针：
靶特异性正向引物(5'-CCCGACCACACGC-3')(SEQ ID NO：20)
靶特异性反向引物(5'-ACTCCACCAGGCCG-3')(SEQ ID NO：21)
突变检测探针(5′-CTGGCGTGAGTGGAC-3')(SEQ ID NO：22)-用6-羧基荧光素-FAM标记
参考检测探针(5′-CTGGCGTGGGTGGA-3')(SEQ ID NO：23)-用四氯荧光素标记-TET
阻断探针(5′-CTGGCGTGGGTGGA-3′)(SEQ ID NO：24)-用2',3'-双脱氧C间隔物标记
制备gDNA“超级池”。
简单地说，将一个96孔板上代表的所有94个“单个子面粉总量的等份试样(ASFT)”的每个gDNA提取物50μl合并到一个“超级池”中。
确定“超级池”是否包含突变的谷粒
然后确定包含来自94个ASFT的DNA的“超级池”是否含有突变的谷粒，基本如上文实施例案17中所述，具有以下细节：
首先，将来自超级池的2μl gDNA添加至50μl富集和阻断PCR中，其含有10μl 5×Q5反应缓冲液(New England Biolabs)，200μM dNTP，0.02U/μl Q5高保真DNA聚合酶，100nM靶特异性正向PCR引物，100nM靶特异性反向PCR引物，100nM阻断探针(2',3'-双脱氧C间隔物)和水。使用标准PCR条件对PCR混合物进行热循环：在98℃下变性2分钟，在98℃下10秒、在57℃下20秒和72℃下10秒实施20个PCR循环，以及最后在72℃下保持5分钟，然后在8℃下储存。
其次，使用RainDrop Source仪器为4个单独富集和阻断的“超级池”生成液滴。将来自每个“超级池”的经富集和阻断PCR产物的10μl等份分别与下述结合：用于探针的25μlSupermix(Bio-Rad)；1×液滴稳定剂(RainDance)；900nM靶特异性正向引物；900nM靶特异性反向引物；120nM参考检测探针(TET)；440nM的突变检测探针(FAM)，和用于调节总反应体积至50μl的H2O。将共4个单独的反应混合物(代表4个单独的“超级池”gDNA)添加到源芯片(RainDance)中，并在Source Instrument(RainDance)上处理。
将含有经Source Instrument(RainDance)由反应混合物生成的液滴的8孔PCR条密封并使用标准PCR条件进行热循环：在95℃变性10分钟，在95℃下15秒、55℃下1分钟实施40个PCR循环，最后在98℃下延伸10分钟，然后在8℃下储存。此后，将扩增的混合物转移至Sense Instrument(RainDance)，并使用RainDrop Analyst数据分析软件进行分析。
4个超级池的平均分数丰度为0.0115％。超级池SP-gDNA#05的分数丰度为0.0228％，表明该超级池很大可能包含突变体谷粒的DNA。
确定文库样品是否含有突变的谷粒
然后确定对应于SP-gDNA#05的94个ASFT的平板是否含有突变的谷粒，基本如上文实施例7中所述，具有以下细节：
对共94个SGT(子谷粒总数)进行筛选，其代表大约30.000个突变大麦植物。用于筛选的该部分的gDNA是从ASFT中纯化的gDNA-即未富集的DNA。出于分析目的，将来自gDNA(GT#377-GT#470)的5μl纯化gDNA加入到含有11μl用于探针的11μlddPCR Supermix的17μlPCR混合物中(No.dUTP；Bio-Rad Laboratories)，900nM靶特异性PCR引物，250nM突变检测探针(6-羧基荧光素-FAM)和野生型检测探针(四氯荧光素-TET)探针。将反应混合物加载到AutoDG Droplet Generator(Bio-Rad)上，并根据制造商的手册产生液滴。使用标准PCR条件对液滴乳液进行热循环：在95℃下变性10分钟，在94℃下30秒、55℃下1分钟实施40个PCR循环，最后在98℃下延伸10分钟，然后在8℃下储存微量滴定板。使用QX200 DropletReader(Bio-Rad Laboratories)确认液滴中的PCR扩增。
将PCR板加载到QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories)上进行液滴分析。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad Laboratories)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，通道1幅度设置为2200，通道2幅度设置为2700。分数丰度的各个值的比较显示，gDNA(GT#416)相对于任何其他样品包含更多的来自突变体检测的信号。与0.073％相比，gDNA(GT#416)的分数丰度为0.4％，0.073％代表所有94个测试的gDNA样品的平均分数丰度。
发现以感兴趣突变为特征的单个谷粒
基本如上文实施例9-15中所述鉴定携带突变的单个大麦谷粒，具有如下细节：
基于对具有HvBADH1特异性ddPCR测定的gDNA(GT#416)的分析，4500粒GLP#416(对应于阳性样品gDNA(GT#416))被认为很可能包含相同感兴趣突变的一个或多个谷粒。
通过从GLP#416中依次去除96个每个均12粒的样品来建立FGLP#416。将每个12粒的等份试样放在一张称重纸上，然后用一对钳子持续固定，同时使用装有1.6mm钻头的雕刻机(Marathon-3，Saeyang Microtech)在胚乳上钻一个小的、2-3mm深的孔。旋转运动将面粉从胚乳移到谷物顶部和周围的称重纸上。将10粒钻孔样品置于微量滴定板的单独2ml孔中，得到钻孔大麦粒PDGLP#416的次级子池。将96个面粉样品(每个面粉来自12个钻孔的大麦谷粒)转移到1.5ml微量滴定板的单独孔(PFGLP#416)中，保持样品编号系统与钻孔谷粒的编号匹配。
通过使用NucleoSpin 96Plant II试剂盒(Macherey-Nagel)的说明书中详述的半自动DNA提取方法对PFGLP#416进行gDNA提取。因此，微量滴定板的每个孔含有来自12个谷粒的面粉的gDNA。
使用与上述相同的PCR混合物和PCR反应条件(确定文库样品是否含有突变的谷粒)分析来自PFGLP#416的DNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad Laboratories)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，通道1幅度设置为3000，通道2幅度设置为2500。经鉴定，微量滴定板中的两个单独孔(D10和F02)显示3.4％和13.7％的分数丰度，表明在PDGLP#416的2个独立孔中存在两个单独的突变体。
将来自PDGLP#416的孔F02的所有12个谷粒发芽。收集来自所有12个小植物的叶材料并使用REDExtract(Sigma Aldrich)提取DNA。使用与上述相同的PCR混合物和PCR反应条件(确定文库样品是否含有突变的谷粒)分析叶样品的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad Laboratories)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，通道1幅度设置为5000，通道2幅度设置为3200。来自PDGLP#416的孔F02的一个小植株显示39％的分数丰度，证实存在杂合突变体。
参考文献
Andrew J.Goodall,Pankaj Kumar and Alyson K.Tobin(2013).Identificationand expression analyses of cytosolic glutamine synthetase genes in barley(Hordeum vulgare L.).Plant Cell Physiol.54:492-505.
Botticella,E.,Sestili,F.,Hernandez-Lopez,A.,Phillips,A.,&Lafiandra,D.(2011).High resolution melting analysis for the detection of EMS inducedmutations in wheat SbeIIa genes.BMC Plant Biology 11:156.
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Jiang,F.et al.(2016).Structues of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primedfor DNA cleavage.Science 351:867-871.
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序列表
<110> 嘉士伯有限公司（Carlsberg A/S）
<120> 通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法
<130> 2205435DK01
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1089
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 1
atgtctcggc tcgccgacct tctcagcctc gacctgtccg gctgcaccgg caagatcatc 60
gccgagtaca tatgggtcgg cggcaccggg atggacgtca ggagcaaagc caggacgctt 120
cccggacccg tggacgaccc cagcaagctt ccaaagtgga atttcgacgg ctccagcacc 180
ggccaagcca cgggcgacga cagcgaagtc atcctccgac cccaagccat cttcagggac 240
ccgttcagga aagggaacaa catcctggtc atctgtgact gctatgcgcc taccggagag 300
ccgattccga gcaacaagcg gtacaacgcg gcgaggatat tcggccatcc tgatgtcaag 360
tctgaagaac catggtatgg gattgagcag gagtacaccc ttctccagaa ggacaccaac 420
tggcccattg gctggccact agggggttac cctggccctc aggggcctta ctactgcgcc 480
gcgggtgcgg agaaatctta cgggcgcgac atcgtcgacg cccactacaa ggcctgcctc 540
tacgccggca tcaacatcgg cggcatcaat gcagaagtca tgccagggca gtgggagttc 600
caagtcggcc cttccgtcgg yatctccgcc ggcgacgagc tctgggcggc tcgctacatt 660
ctcgagagga tcactgagat cgccggcgtc gtcgtctcct tcgaccccaa accgatcccg 720
ggagagtgga acggtgccgg tgcccacaca aactacagca ccaagtcgat gaggagcgag 780
ggcgggtacg aggtgatcaa gagggcgatc aagaagctcg aggcgcggca cacggagcac 840
atagccgcct acggggaagg caacgagcgc cggctcaccg gccgccacga gaccgccgac 900
atcaacacct tcgtatgggg cgtggcaaac cgcggcgcgt cggtgcgggt ggggcgcgac 960
accgagaagg aaggcagggg ctacttcgag gaccggaggc cggcgtccaa catggatccc 1020
tacgtcgtca cctccatgat cgccgagacc accatcctct ggaaggccgg tctctccaat 1080
ggcaagtag 1089
<210> 2
<211> 362
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 2
Met Ser Arg Leu Ala Asp Leu Leu Ser Leu Asp Leu Ser Gly Cys Thr
1 5 10 15
Gly Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Val Gly Gly Thr Gly Met Asp
20 25 30
Val Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Pro Gly Pro Val Asp Asp Pro Ser
35 40 45
Lys Leu Pro Lys Trp Asn Phe Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Thr
50 55 60
Gly Asp Asp Ser Glu Val Ile Leu Arg Pro Gln Ala Ile Phe Arg Asp
65 70 75 80
Pro Phe Arg Lys Gly Asn Asn Ile Leu Val Ile Cys Asp Cys Tyr Ala
85 90 95
Pro Thr Gly Glu Pro Ile Pro Ser Asn Lys Arg Tyr Asn Ala Ala Arg
100 105 110
Ile Phe Gly His Pro Asp Val Lys Ser Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile
115 120 125
Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Thr Asn Trp Pro Ile Gly
130 135 140
Trp Pro Leu Gly Gly Tyr Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Ala
145 150 155 160
Ala Gly Ala Glu Lys Ser Tyr Gly Arg Asp Ile Val Asp Ala His Tyr
165 170 175
Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Gly Gly Ile Asn Ala Glu
180 185 190
Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ser Val Gly Ile
195 200 205
Ser Ala Gly Asp Glu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Ile Leu Glu Arg Ile
210 215 220
Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Ser Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro
225 230 235 240
Gly Glu Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Lys Ser
245 250 255
Met Arg Ser Glu Gly Gly Tyr Glu Val Ile Lys Arg Ala Ile Lys Lys
260 265 270
Leu Glu Ala Arg His Thr Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn
275 280 285
Glu Arg Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe
290 295 300
Val Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg Asp
305 310 315 320
Thr Glu Lys Glu Gly Arg Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser
325 330 335
Asn Met Asp Pro Tyr Val Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile
340 345 350
Leu Trp Lys Ala Gly Leu Ser Asn Gly Lys
355 360
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 3
gtgatcaaga gggcgatcaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 4
caagtctcaa ctcgccgtat 20
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 5
aagacaacga gcgc 14
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 6
aaggcaacga gcgc 14
<210> 7
<211> 503
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 7
Met Arg Lys Leu Asn Pro Ala Leu Glu Phe Arg Asp Phe Ile Gln Val
1 5 10 15
Leu Lys Asp Glu Asp Asp Leu Ile Glu Ile Thr Glu Glu Ile Asp Pro
20 25 30
Asn Leu Glu Val Gly Ala Ile Met Arg Lys Ala Tyr Glu Ser His Leu
35 40 45
Pro Ala Pro Leu Phe Lys Asn Leu Lys Gly Ala Ser Lys Asp Leu Phe
50 55 60
Ser Ile Leu Gly Cys Pro Ala Gly Leu Arg Ser Lys Glu Lys Gly Asp
65 70 75 80
His Gly Arg Ile Ala His His Leu Gly Leu Asp Pro Lys Thr Thr Ile
85 90 95
Lys Glu Ile Ile Asp Tyr Leu Leu Glu Cys Lys Glu Lys Glu Pro Leu
100 105 110
Pro Pro Ile Thr Val Pro Val Ser Ser Ala Pro Cys Lys Thr His Ile
115 120 125
Leu Ser Glu Glu Lys Ile His Leu Gln Ser Leu Pro Thr Pro Tyr Leu
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Lys Tyr Leu Gln Thr Tyr Gly Met Trp Ile
145 150 155 160
Leu Gln Thr Pro Asp Lys Lys Trp Thr Asn Trp Ser Ile Ala Arg Gly
165 170 175
Met Val Val Asp Asp Lys His Ile Thr Gly Leu Val Ile Lys Pro Gln
180 185 190
His Ile Arg Gln Ile Ala Asp Ser Trp Ala Ala Ile Gly Lys Ala Asn
195 200 205
Glu Ile Pro Phe Ala Leu Cys Phe Gly Val Pro Pro Ala Ala Ile Leu
210 215 220
Val Ser Ser Met Pro Ile Pro Glu Gly Val Ser Glu Ser Asp Tyr Val
225 230 235 240
Gly Ala Ile Leu Gly Glu Ser Val Pro Val Val Lys Cys Glu Thr Asn
245 250 255
Asp Leu Met Val Pro Ala Thr Ser Glu Met Val Phe Glu Gly Thr Leu
260 265 270
Ser Leu Thr Asp Thr His Leu Glu Gly Pro Phe Gly Glu Met His Gly
275 280 285
Tyr Val Phe Lys Ser Gln Gly His Pro Cys Pro Leu Tyr Thr Val Lys
290 295 300
Ala Met Ser Tyr Arg Asp Asn Ala Ile Leu Pro Val Ser Asn Pro Gly
305 310 315 320
Leu Cys Thr Asp Glu Thr His Thr Leu Ile Gly Ser Leu Val Ala Thr
325 330 335
Glu Ala Lys Glu Leu Ala Ile Glu Ser Gly Leu Pro Ile Leu Asp Ala
340 345 350
Phe Met Pro Tyr Glu Ala Gln Ala Leu Trp Leu Ile Leu Lys Val Asp
355 360 365
Leu Lys Gly Leu Gln Ala Leu Lys Thr Thr Pro Glu Glu Phe Cys Lys
370 375 380
Lys Val Gly Asp Ile Tyr Phe Arg Thr Lys Val Gly Phe Ile Val His
385 390 395 400
Glu Ile Ile Leu Val Ala Asp Asp Ile Asp Ile Phe Asn Phe Lys Glu
405 410 415
Val Ile Trp Ala Tyr Val Thr Arg His Thr Pro Val Ala Asp Gln Met
420 425 430
Ala Phe Asp Asp Val Thr Ser Phe Pro Leu Ala Pro Phe Val Ser Gln
435 440 445
Ser Ser Arg Ser Lys Thr Met Lys Gly Gly Lys Cys Val Thr Asn Cys
450 455 460
Ile Phe Arg Gln Gln Tyr Glu Arg Ser Phe Asp Tyr Ile Thr Cys Asn
465 470 475 480
Phe Glu Lys Gly Tyr Pro Lys Gly Leu Val Asp Lys Val Asn Glu Asn
485 490 495
Trp Lys Arg Tyr Gly Tyr Lys
500
<210> 8
<211> 101
<212> PRT
<213> 小麦（Triticum aestivum）
<400> 8
Met Ala Lys Ile Ser Phe Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ala Val
1 5 10 15
Gly Phe Pro Val Glu Val Met Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Asn Leu Lys Pro Trp Glu Cys Ser Ser Lys Cys Ser
35 40 45
Ser Arg Cys Ser Gly Thr Gln Tyr Lys Lys Ala Cys Leu Thr Tyr Cys
50 55 60
Asn Lys Cys Cys Ala Thr Cys Leu Cys Val Pro Pro Gly Thr Tyr Gly
65 70 75 80
Asn Lys Gly Ala Cys Pro Cys Tyr Asn Asn Trp Lys Thr Lys Glu Gly
85 90 95
Gly Pro Lys Cys Pro
100
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 9
cgcctgcccc tgcta 15
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 10
agaagaagaa gaagaagaag aaaaccaaga a 31
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 11
caacaactga aagacca 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 12
caacaactgg aagacca 17
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 13
catgtttcag acggtgg 17
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 14
catacctcta gcaattgacc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 15
acgtacggaa tgtagattct 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 16
acgtacggaa tgtggatt 18
<210> 17
<211> 1260
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 17
atggcgtcgt cgagcttcaa ggtgacgcgg atctcggagg gcgcggtgaa gccggcgtcg 60
gagacgcccg accacacgct gccgctggcg tgggtggacc ggtacccgac ccaccgcggc 120
ctggtggagt cgatgcacat cttccggtcc ggcgccgacg cggcccccgg cgtgatccgc 180
gaggcgctgg gcaaggcgct ggccttcttc tacccgctgg cggggcgcat cgtggagcag 240
ccggagaagg ggtgccccgc catccgctgc accgccgacg gcgtctactt cgcggaggcc 300
gtcgccgagt gcagcctgga ggacgtccgg ttcctggagc gccccctgct gctccccaag 360
gaggacctcg tcccctaccc cgccgccgat ctctgggccg tcgagcccca caacaccatc 420
atgatgatgc agatcacgaa attcacatgc ggcgggttcg tgatgggcct ccggttcaac 480
cacgcgtcgg cggacggcat gggcgcggcg cagttcatca aggcggtcgg cgacatggcc 540
cgggggctcc cggagccgac ggtgaagccg gtgtgggaca gggagaagtt ccccaacccg 600
agcatcaagc cgggccctct cccggagctc ccggtgctgg cgctggacta catcgtgctc 660
gacttcccca cgggctacat cgacgggctc aagacgcagt acaaggcgca cagcggcaag 720
ttctgctccg gcttcgacgt gctgacggcc aagctgtggc agtgccgtac ccgggcgctg 780
aacctggagc cggacgccac ggtgaagctg tgcttcttcg ccagcgtgcg ccacctgctg 840
aagctggacg ccgggtacta cggcaactcc atcttccccg tgaagatgtc cgggacgagc 900
aagaaggtgc tggagtcgtc ggtgatggag gtgatcgaca tgatccggga ggccaagcag 960
cggatggcgg tggagttctt ccagttcgcc aaggaggaga cgcggcagga ccccttccag 1020
atgaccttcg actacgagtc catctacgtc tccgactgga gcaagctggg gttctccgac 1080
gtggactacg gcttcggccc gcccatgttc gccggaccgc tcgtcaacaa cgacttcatc 1140
gcctccgtcg tcatcctcaa ggcgccgctg ccgctggacg gcaccaggat gctcgccagc 1200
tgcgtcacca aggagcactc gcaggagttc gcccgcggca tgaaggagga cctgccatga 1260
<210> 18
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 突变体cDNA
<400> 18
atggcgtcgt cgagcttcaa ggtgacgcgg atctcggagg gcgcggtgaa gccggcgtcg 60
gagacgcccg accacacgct gccgctggcg tgagtggacc ggtacccgac ccaccgcggc 120
ctggtggagt cgatgcacat cttccggtcc ggcgccgacg cggcccccgg cgtgatccgc 180
gaggcgctgg gcaaggcgct ggccttcttc tacccgctgg cggggcgcat cgtggagcag 240
ccggagaagg ggtgccccgc catccgctgc accgccgacg gcgtctactt cgcggaggcc 300
gtcgccgagt gcagcctgga ggacgtccgg ttcctggagc gccccctgct gctccccaag 360
gaggacctcg tcccctaccc cgccgccgat ctctgggccg tcgagcccca caacaccatc 420
atgatgatgc agatcacgaa attcacatgc ggcgggttcg tgatgggcct ccggttcaac 480
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cgggggctcc cggagccgac ggtgaagccg gtgtgggaca gggagaagtt ccccaacccg 600
agcatcaagc cgggccctct cccggagctc ccggtgctgg cgctggacta catcgtgctc 660
gacttcccca cgggctacat cgacgggctc aagacgcagt acaaggcgca cagcggcaag 720
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gtggactacg gcttcggccc gcccatgttc gccggaccgc tcgtcaacaa cgacttcatc 1140
gcctccgtcg tcatcctcaa ggcgccgctg ccgctggacg gcaccaggat gctcgccagc 1200
tgcgtcacca aggagcactc gcaggagttc gcccgcggca tgaaggagga cctgccatga 1260
<210> 19
<211> 419
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 19
Met Ala Ser Ser Ser Phe Lys Val Thr Arg Ile Ser Glu Gly Ala Val
1 5 10 15
Lys Pro Ala Ser Glu Thr Pro Asp His Thr Leu Pro Leu Ala Trp Val
20 25 30
Asp Arg Tyr Pro Thr His Arg Gly Leu Val Glu Ser Met His Ile Phe
35 40 45
Arg Ser Gly Ala Asp Ala Ala Pro Gly Val Ile Arg Glu Ala Leu Gly
50 55 60
Lys Ala Leu Ala Phe Phe Tyr Pro Leu Ala Gly Arg Ile Val Glu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Lys Gly Cys Pro Ala Ile Arg Cys Thr Ala Asp Gly Val Tyr
85 90 95
Phe Ala Glu Ala Val Ala Glu Cys Ser Leu Glu Asp Val Arg Phe Leu
100 105 110
Glu Arg Pro Leu Leu Leu Pro Lys Glu Asp Leu Val Pro Tyr Pro Ala
115 120 125
Ala Asp Leu Trp Ala Val Glu Pro His Asn Thr Ile Met Met Met Gln
130 135 140
Ile Thr Lys Phe Thr Cys Gly Gly Phe Val Met Gly Leu Arg Phe Asn
145 150 155 160
His Ala Ser Ala Asp Gly Met Gly Ala Ala Gln Phe Ile Lys Ala Val
165 170 175
Gly Asp Met Ala Arg Gly Leu Pro Glu Pro Thr Val Lys Pro Val Trp
180 185 190
Asp Arg Glu Lys Phe Pro Asn Pro Ser Ile Lys Pro Gly Pro Leu Pro
195 200 205
Glu Leu Pro Val Leu Ala Leu Asp Tyr Ile Val Leu Asp Phe Pro Thr
210 215 220
Gly Tyr Ile Asp Gly Leu Lys Thr Gln Tyr Lys Ala His Ser Gly Lys
225 230 235 240
Phe Cys Ser Gly Phe Asp Val Leu Thr Ala Lys Leu Trp Gln Cys Arg
245 250 255
Thr Arg Ala Leu Asn Leu Glu Pro Asp Ala Thr Val Lys Leu Cys Phe
260 265 270
Phe Ala Ser Val Arg His Leu Leu Lys Leu Asp Ala Gly Tyr Tyr Gly
275 280 285
Asn Ser Ile Phe Pro Val Lys Met Ser Gly Thr Ser Lys Lys Val Leu
290 295 300
Glu Ser Ser Val Met Glu Val Ile Asp Met Ile Arg Glu Ala Lys Gln
305 310 315 320
Arg Met Ala Val Glu Phe Phe Gln Phe Ala Lys Glu Glu Thr Arg Gln
325 330 335
Asp Pro Phe Gln Met Thr Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Tyr Val Ser Asp
340 345 350
Trp Ser Lys Leu Gly Phe Ser Asp Val Asp Tyr Gly Phe Gly Pro Pro
355 360 365
Met Phe Ala Gly Pro Leu Val Asn Asn Asp Phe Ile Ala Ser Val Val
370 375 380
Ile Leu Lys Ala Pro Leu Pro Leu Asp Gly Thr Arg Met Leu Ala Ser
385 390 395 400
Cys Val Thr Lys Glu His Ser Gln Glu Phe Ala Arg Gly Met Lys Glu
405 410 415
Asp Leu Pro
<210> 20
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 20
cccgaccaca cgc 13
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 21
actccaccag gccg 14
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 22
ctggcgtgag tggac 15
<210> 23
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 23
ctggcgtggg tgga 14
<210> 24
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 探针
<400> 24
ctggcgtggg tgga 14
<210> 25
<211> 306
<212> DNA
<213> 小麦（Triticum aestivum）
<400> 25
atggccaaga tctccttcct cctcgtggcg ctcctcgtcc tcgccgtcgg gttccccgtg 60
gaggtgatgg gaggtggggg cggcggcggc ggtggcggtg gcggcggcaa cctcaagcca 120
tgggagtgct cgtccaagtg ctcgtcgcgg tgctcgggga cgcagtacaa gaaggcgtgc 180
ctgacctact gcaacaagtg ctgcgccacc tgcctctgcg tgccgccggg cacctacggc 240
aacaagggcg cctgcccctg ctacaacaac tggaagacca aggagggagg ccccaagtgc 300
ccctag 306
<210> 26
<211> 1512
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 26
atgaggaagc taaatccagc tttagaattt agagacttta tccaggtctt aaaagatgaa 60
gatgacttaa tcgaaattac cgaagagatt gatccaaatc tcgaagtagg tgcaattatg 120
aggaaggcct atgaatccca cttaccagcc ccgttattta aaaatctcaa aggtgcttcg 180
aaggatcttt tcagcatttt aggttgccca gccggtttga gaagtaagga gaaaggagat 240
catggtagaa ttgcccatca tctggggctc gacccaaaaa caactatcaa ggaaatcata 300
gattatttgc tggagtgtaa ggagaaggaa cctctccccc caatcactgt tcctgtgtca 360
tctgcacctt gtaaaacaca tatactttct gaagaaaaaa tacatctaca aagcctgcca 420
acaccatatc tacatgtttc agacggtggc aagtacttac aaacgtacgg aatgtggatt 480
cttcaaactc cagataaaaa atggactaat tggtcaattg ctagaggtat ggttgtagat 540
gacaagcata tcactggtct ggtaattaaa ccacaacata ttagacaaat tgctgactct 600
tgggcagcaa ttggaaaagc aaatgaaatt cctttcgcgt tatgttttgg cgttccccca 660
gcagctattt tagttagttc catgccaatt cctgaaggtg tttctgaatc ggattatgtt 720
ggcgcaatct tgggtgagtc ggttccagta gtaaaatgtg agaccaacga tttaatggtt 780
cctgcaacga gtgagatggt atttgagggt actttgtcct taacagatac acatctggaa 840
ggcccatttg gtgagatgca tggatatgtt ttcaaaagcc aaggtcatcc ttgtccattg 900
tacactgtca aggctatgag ttacagagac aatgctattc tacctgtttc gaaccccggt 960
ctttgtacgg atgagacaca taccttgatt ggttcactag tggctactga ggccaaggag 1020
ctggctattg aatctggctt gccaattctg gatgccttta tgccttatga ggctcaggct 1080
ctttggctta tcttaaaggt ggatttgaaa gggctgcaag cattgaagac aacgcctgaa 1140
gaattttgta agaaggtagg tgatatttac tttaggacaa aagttggttt tatagtccat 1200
gaaataattt tggtggcaga tgatatcgac atatttaact tcaaagaagt catctgggcc 1260
tacgttacaa gacatacacc tgttgcagat cagatggctt ttgatgatgt cacttctttt 1320
cctttggctc cctttgtttc gcagtcatcc agaagtaaga ctatgaaagg tggaaagtgc 1380
gttactaatt gcatatttag acagcaatat gagcgcagtt ttgactacat aacttgtaat 1440
tttgaaaagg gatatccaaa aggattagtt gacaaagtaa atgaaaattg gaaaaggtac 1500
ggatataaat aa 1512
Claims (29)
1.一种鉴定预定物种生物体或其繁殖部分的子池的方法，其中所述子池包括在靶序列中携带感兴趣核苷酸(NOI)的一种或多种预定突变的预定物种生物体，所述方法包括以下步骤：
a)提供代表多个基因型的所述物种的生物体或其繁殖部分的池；
b)将所述池划分为一个或多个生物体或其繁殖部分的子池，其中每个子池均包括多于一个的每种基因型的单个生物或其繁殖部分，其中来自所述池的一个生物体或其繁殖部分的所有后代都包括在一个子池中；
c)以如下方式将每个子池随机分成多个部分：使得每个部分理论上包括代表所述子池的每种基因型的生物体或其繁殖部分；
d)从每个子池的所述多个部分之一制备基因组DNA(gDNA)样品，同时在保持繁殖潜力的条件下保存生物体或其繁殖部分的剩余部分；
e)进行多个PCR扩增，每个PCR扩增均包含来自一个子池的gDNA样品，一组或多组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列的侧翼；
f)检测包含一个或多个靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI中的突变，从而鉴定包含所述突变的子池。
2.根据权利要求1所述的方法，其中物种是单细胞生物体，例如酵母。
3.根据权利要求1所述的方法，其中物种是植物，并且所述方法的步骤a)和b)包括以下步骤：
I.提供植物的多个繁殖部分；
II.随机诱变所述繁殖部分，从而获得M0代的繁殖部分；
III.使所述M0代的繁殖部分生长为成熟植物，并从所述成熟植物获得繁殖部分，其中所述繁殖部分是M1代繁殖部分；
IV.任选地，重复步骤III.X次，以获得包含M(1+X)代繁殖部分的植物；
V.从所述成熟植物中获得M1或M(1+X)代的繁殖部分，从而获得繁殖部分池；
VI.将步骤V.中获得的所述繁殖部分池分成子池，其中来自给定成熟植物的所有繁殖部分被放入相同的子池中。
4.一种鉴定预定植物物种的植物或其繁殖部分的子池的方法，其中所述子池包括在靶序列中携带感兴趣核苷酸(NOI)的一种或多种预定突变的植物，所述方法包括以下步骤：
-提供植物的多个繁殖部分；
-随机诱变所述繁殖部分，从而获得M0代的繁殖部分；
-使所述M0代的繁殖部分生长为成熟植物，并从所述成熟植物获得繁殖部分，其中所述繁殖部分是M1代繁殖部分；
-任选地，重复前述步骤X次，以获得包含M(1+X)代繁殖部分的植物；
-从所述成熟植物中获得M1或M(1+X)代的繁殖部分，从而获得繁殖部分池；
-将所述繁殖部分池分成子池，其中来自给定成熟植物的所有繁殖部分被放入相同的子池中
-制备基因组DNA(gDNA)样品，每个样品均包含来自一个子池内每个基因型的gDNA，同时保持所述子池内每个基因型的植物的增殖潜力；
-进行多个PCR扩增，每个PCR扩增均包含来自一个子池的gDNA样品，一组或多组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列的侧翼；
-检测包含一个或多个靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI中的突变，从而鉴定包含所述突变的子池。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中物种是植物，并且所述方法的步骤a)和b)包括以下步骤：
I.提供植物的多个繁殖部分；
II.随机诱变所述繁殖部分，从而获得M0代的繁殖部分；
III.使所述M0代的繁殖部分生长为成熟植物，并从所述成熟植物获得繁殖部分，其中所述繁殖部分是M1代繁殖部分；
V.从所述成熟植物中获得M1代的繁殖部分，从而获得繁殖部分池；
VI.将步骤V.中获得的所述繁殖部分池分成子池，其中来自给定成熟植物的所有繁殖部分被放入相同的子池中。
6.根据权利要求1和3-5任一项所述的方法，其中物种是植物，例如大麦。
7.根据权利要求1和3-5任一项所述的方法，其中繁殖部分是种子。
8.根据权利要求1和3-5任一项所述的方法，其中将M0代的繁殖部分池分成子池的步骤包括以下步骤：
-在不同田块中培育M0代繁殖部分，使其生长为成熟植物，其中所述成熟植物的繁殖部分构成了繁殖部分池；
-将所述区域划分为小田块；
-在一个小田块中收获所有植物的所有繁殖部分，从而获得繁殖部分子池。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在分开的容器中培养繁殖部分，例如在温室中。
10.一种鉴定预定单细胞生物物种的生物体的子池的方法，其中所述子池包括在靶序列中携带感兴趣核苷酸(NOI)的一种或多种预定突变的预定单细胞物种的生物体，所述方法包括以下步骤：
a)提供代表多个基因型的所述单细胞生物物种的生物体的池；
b)将所述池划分为一个或多个生物体的子池；
c)使每个子池经历繁殖步骤；
d)以如下方式将每个子池随机分成多个部分：使得每个部分理论上包括代表所述子池的每种基因型的生物体；
e)从每个子池的所述多个部分之一制备基因组DNA(gDNA)样品，同时在保持繁殖潜力的条件下保存生物体的剩余部分；
f)进行多个PCR扩增，每个PCR扩增均包含来自一个子池的gDNA样品，一组或多组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列的侧翼；
g)检测包含一个或多个靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI中的突变，从而鉴定包含所述突变的子池。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中预定突变是一个或多个NOI的缺失或取代。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中预定突变是单个核苷酸的取代。
13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中每个子池的10至50％的生物体或其繁殖部分被用于制备gDNA样品。
14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中子池的生物体或其繁殖部分被随机分成2、3或4个部分。
15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤e)的PCR扩增通过包括以下步骤的方法进行：
-制备一个或多个PCR扩增，其包含gDNA样品、一组或多组引物和PCR试剂，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列侧翼；
-将所述PCR扩增分成多个空间分离的区室；
-进行PCR扩增；
-检测PCR扩增产物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述空间分离的区室是液滴，例如水-油乳液液滴。
17.根据权利要求15所述的方法，其中每个液滴的平均体积范围为0.1至10nL。
18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将每个PCR区室化为1,000至100,000个范围内的空间分离的区室。
19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述生物体的池通过使所述物种的生物体或其繁殖部分经历随机诱变而制备。
20.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述生物体的池包含具有不同基因型的至少50,000个生物体或其繁殖部分。
21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述生物体的池包含具有不同基因型的至少100,000个生物体或其繁殖部分。
22.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述生物体的池包含具有不同基因型的至少500,000个生物体或其繁殖部分。
23.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述生物体的池包含具有不同基因型的至少1,000,000个生物体或其繁殖部分。
24.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述生物体的池包含具有不同基因型的1,000,000至100,000,000个范围内的生物体或其繁殖部分。
25.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中每个子池包含具有不同基因型的至少100个生物体或其繁殖部分。
26.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中每个子池包含具有不同基因型的至少500个生物体或其繁殖部分。
27.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在对来自一个子池的gDNA样品进行多个PCR扩增的步骤前进行的下述步骤：
-从每个子池获取每个gDNA样品的一部分；
-将多个gDNA样品的部分组合并成超级池，从而获得包含来自多个子池的gDNA样品的gDNA超级池；
-进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包含gDNA样品超级池，其中每个PCR扩增包含多个区室化PCR扩增，每个PCR区室化扩增包含所述gDNA样品的一部分、一组或多组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列侧翼；
-检测包含一个或多个靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI的突变，从而鉴定包含所述突变的超级池。
28.根据权利要求27所述的方法，其中包含gDNA样品超级池的PCR扩增通过包括以下步骤的方法进行：
-制备PCR扩增，其包含gDNA样品、一组或多组引物和PCR试剂，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列侧翼；
-将所述PCR扩增分成多个空间分离的区室，其中每个区室的平均体积为0.1至10pL；
-进行PCR扩增；
-检测PCR扩增产物。
29.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
-将经鉴定的子池的生物体或其繁殖部分划分为次级子池；
-制备gDNA样品，每个样品包含来自次级子池中的每个基因型的gDNA，同时保持所述次级子池内每个基因型生物体的增殖潜力；
-进行多个PCR扩增，每个PCR扩增包含来自一个次级子池的gDNA样品、一组或多组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列侧翼；
-检测包含一个或多个靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI的预定突变，从而鉴定包含所述突变的步骤i)的次级子池；
-鉴定携带所述突变的所述次级子池内的生物体或其繁殖部分。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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