WO2011024563A1 - プロテインｚ７含有量に基づいた大麦種の選抜方法及び麦芽発酵飲料 - Google Patents

プロテインｚ７含有量に基づいた大麦種の選抜方法及び麦芽発酵飲料 Download PDF

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WO2011024563A1
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protein
genotype
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selection
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隆 飯牟礼
誠 木原
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サッポロビール株式会社
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting barley seeds based on protein Z7 content and a fermented malt beverage.
  • Protein Z7 belongs to the barley serine protease inhibitor (serpin) subfamily together with protein Z4 and protein Zx. These proteins belonging to the serpin subfamily are thought to be involved in a mechanism that protects living organisms when barley seeds are infected with mold or the like. However, the function still has many unclear points (Non-patent Document 1).
  • Patent Document 1 There has been little research on the relationship between protein Z7 and beer froth, and there are only a few reports (Patent Document 1 and Non-Patent Document 5).
  • Patent Document 1 there is a correlation between the protein Z7 concentration contained in barley seeds, malt, wort, malt fermented beverage or malt fermented raw material liquid or fermented raw material liquid and NIBEM value serving as an index of foam retention It is described that there is a relationship, and a method for determining the goodness of foam based on the protein Z7 concentration is disclosed.
  • Non-Patent Document 5 describes that as a result of investigating the relationship between malt protein Z7 content and foam retention, no significant correlation was found between protein Z7 and foam retention. A conclusion different from 1 is obtained.
  • Protein Z7 has been suggested to be involved in industrially useful functions, such as being involved in biological defense mechanisms when barley is infected, and in beer foam retention, but sufficient research has been conducted. I cannot say that. In order to accurately analyze the effect of protein Z7 content on the traits of barley, it is necessary to establish a method that can accurately select barley with high and / or low protein Z7 content.
  • the method for determining the beer persistence disclosed in Patent Document 1 is based on measuring the protein Z7 concentration at the protein level. Compared to methods based on NIBEM value measurements, the effects of temperature, weather, and man-made factors can be eliminated, but can be affected by variations in protein levels. When trying to apply to the breeding of barley suitable for beer with good foam, it is necessary to screen several hundred barley individuals, especially closer to the early stage of barley breeding, the method disclosed in Patent Document 1 Is not suitable for processing such large quantities of specimens.
  • the molecular selection technology has advanced in the breeding of various crops, not limited to barley.
  • selection by DNA markers using DNA polymorphism is actively researched because it is possible to select in the early generation of breeding, it is excellent in operability, and can be analyzed in leaves. Development is underway.
  • a DNA marker serving as an index for the content of barley protein Z7 is not known.
  • the present invention is suitable for application to barley breeding, which is easy to work, can process multiple specimens in a short time, and can accurately select barley seeds based on protein Z7 content.
  • the purpose is to provide a method for selecting barley varieties.
  • the present invention also aims to provide a method for producing a malt fermented beverage made from barley seeds selected based on the protein Z7 content, and a malt fermented beverage.
  • the present invention relates to a selection method for selecting barley varieties based on the content of protein Z7, and in the test barley varieties, multiple alignments of base sequences in the region surrounding the Haruna and Kendall barley protein Z7 loci Identify one or more genotypes for each of the identified polymorphic marker A and the polymorphic marker B identified by multiple alignment of the base sequence of the Haruna and Barke barley protein Z7 loci And the selection method which implements the following (i) and / or (ii) is provided.
  • a test barley species whose identified genotype matches the Haruna type genotype is selected as a barley species having a high protein Z7 content.
  • the identified genotype is a Kendall type or Barke type genotype.
  • Test barley varieties that match the above are selected as barley varieties with low protein Z7 content
  • the “Haruna type” refers to a genotype of a selection polymorphic marker selected from the group consisting of the polymorphic marker A and the polymorphic marker B present in the region around the barley protein Z7 locus.
  • Barley represents a barley species that matches the genotype of Haruna Nijo.
  • SEQ ID NO: 1 As an example of the base sequence of the “Haruna type” barley protein Z7 locus peripheral region, there may be mentioned the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • “Kendall type” and “Barke type” mean that the genotypes of the selection polymorphic markers existing in the region around the barley protein Z7 locus are barley CDC Kendall species and barley, respectively. Represents a barley species consistent with the genotype of Barke species.
  • Examples of the base sequences of the “Kendall-type” and “Barke-type” barley protein Z7 locus peripheral regions include the base sequences shown by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • a polymorphic marker A By aligning the base sequence of the “Haruna-type” barley protein Z7 locus and the base sequence of the “Kendall-type” barley protein Z7 locus, a polymorphic marker A can be specified. Similarly, the base sequence where the bases do not match can be obtained by multiple alignment of the base sequence of the “Haruna type” barley protein Z7 locus and the base sequence of the “Barke type” barley protein Z7 locus. It can be specified as polymorphic marker B.
  • the genotype is identified for one or more of the polymorphic markers A, and the genotype is identified for one or more of the polymorphic markers B.
  • the genotype is identified for one or more of the polymorphic markers A
  • the genotype is identified for one or more of the polymorphic markers B.
  • the selection method described above utilizes a novel selection polymorphic marker that correlates with the barley protein Z7 content in the barley tissue, it is possible to accurately select the test barley species based on the protein Z7 content. it can.
  • the selection method described above can be a selection method that is excellent in operability and can simultaneously process multiple samples in a short time.
  • the present invention also relates to a selection method for selecting barley varieties having a low protein Z7 content, wherein, in the test barley varieties, multiple alignments of nucleotide sequences in the vicinity of the Haruna and Kendall barley protein Z7 loci Identification of at least one genotype of polymorphic marker A identified by, and polymorphic marker B identified by multiple alignment of base sequences in the region surrounding the Haruna and Barke barley protein Z7 loci A selection method for carrying out the following (iii) or (iv) is provided. (Iii) A test barley species whose genotype of the identified polymorphic marker A matches the Kendall genotype is selected as a barley species having a low protein Z7 content. (Iv) The genotype of the identified polymorphic marker B Selects barley varieties that match the Barke genotype as barley varieties with low protein Z7 content
  • the genotype is identified for at least one of the polymorphic marker A and polymorphic marker B. Selecting a test barley species whose genotype of the identified polymorphic marker A matches the Kendall type, or selecting a test barley species whose genotype of the identified polymorphic marker B matches the genotype of the Barke type Can select barley varieties with low protein Z7 content.
  • the genotype is identified by at least one polymorphic marker for selection selected from the group consisting of the polymorphic marker A and the polymorphic marker B amplified by PCR using the genomic DNA of the test barley species as a template. Preferably, this is done with a polynucleotide comprising one.
  • the above polynucleotide reproduces the base sequence of genomic DNA, it can be preferably used for genotype identification.
  • the amount of plant tissue sample required for analysis is small, it is particularly suitable for selection at the initial stage of breeding.
  • the genotype can be identified more easily because there are a large number of base sequences to be analyzed in the sample. it can.
  • the polymorphic marker A is the 62nd, 93th to 94th positions (representing a gap), 94th, 96th, 98th, 113th, 116th of the nucleotide sequence identified by SEQ ID NO: 1. , 123rd, 148th, 151st, 153rd, 156th, 159th, 160th-186th, 217th, 231st, 239th, 246-247th, It can be a base site corresponding to the 253rd, 305-306th, 378th or 422nd base.
  • the polymorphic marker B is the 260 th, 262 th, 305 to 306 th, 343 th, 378 th, 386 th or 422 th position of the base sequence identified by SEQ ID NO: 1. It can be a base site corresponding to a base.
  • a polynucleotide containing at least one of the selection polymorphic markers is digested with one or more restriction enzymes containing at least one of the selection polymorphic markers in a recognition sequence. It is preferable to carry out based on the number and / or size of the fragments obtained.
  • the step of discriminating the base type of the polymorphic marker for selection can be carried out only by basic and easy operations such as restriction enzyme digestion and detection of the number and / or size of fragments after digestion. Further, since the genotype of the selection polymorphic marker can be identified in a short time, it is more suitable for the treatment of multiple specimens. Furthermore, the cost for genotype identification can be kept low.
  • the restriction enzyme containing at least one of the selection polymorphic markers in the recognition sequence recognizes the selection polymorphic marker corresponding to the 253rd and 343rd bases of the base sequence specified by SEQ ID NO: 1.
  • the restriction enzyme contained therein may be BglII or HinfI.
  • a primer pair having the base sequences specified by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 is used for PCR, and a polynucleotide containing the selection polymorphic marker corresponding to the 253rd and 343rd bases is amplified. be able to.
  • the present invention also provides a barley seed selection kit based on the content of protein Z7, which includes a primer pair having the base sequences specified by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • a polynucleotide comprising a selection polymorphic marker corresponding to the 253rd and 343rd bases by the PCR method Amplification can be performed efficiently.
  • the present invention provides a barley seed of a progeny line that can be obtained by crossing a barley seed selected as a barley seed having a low protein Z7 content by the above selection method.
  • the barley varieties selected by the above selection method are barley varieties whose genotype of the selection polymorphic marker is “Kendall type” or “Barke type”, and when they are crossed between the selected barley varieties, the progeny line
  • the barley seed genotype is almost certainly identical to the parent barley seed genotype. Therefore, traits relating to protein Z7 content are also passed on to progeny lines.
  • the present invention is a method for producing a malt fermented beverage comprising at least a preparation step and a fermentation step, wherein the barley seed used in the preparation step matches the Kendall type or Barke type genotype by the selection method.
  • a method for producing a malt fermented beverage which is a barley seed of a progeny line that can be obtained by crossing the barley seed selected as a barley seed and / or the barley seed.
  • the present invention also provides a malt fermented beverage obtainable by the above production method.
  • the barley seeds selected as test barley seeds that match the Kendall type or Barke type genotypes by the selection method of the present invention have a low protein Z7 content, so malt produced from the raw materials derived from these barley seeds
  • the fermented beverage can be made excellent in foam retention.
  • the selection method of the present invention it is excellent in operability, easy to work, can process many samples in a short time, and can accurately select barley varieties based on the content of protein Z7 at the initial stage of breeding. it can.
  • the selection method of the present invention enables selection of barley varieties having good foaminess based on the content of protein Z7, the selected barley varieties, and barley varieties of mating progenies that can be obtained by crossing them.
  • a fermented malt fermented beverage can be produced.
  • the breeded varieties are required to have high quality in all aspects of barley, malt, and malt fermented drinks (for example, beer).
  • a certain amount or more of a sample is required for the evaluation of beer quality, it can be evaluated only at the later stage of the breeding process.
  • foam retention the quality of foam retention is judged in the brewing test, but it generally takes about 10 years to reach the brewing test. Therefore, the selection method of the present invention, which allows selection of barley seeds for properties relating to beer quality (foam retention) at the initial stage of breeding, is very effective.
  • the present invention provides a selection method for selecting barley seeds having a high protein Z7 content and low barley seeds.
  • the region around the barley protein Z7 locus of the polymorphic marker A, the Haruna type and the Barke type identified by multiple alignment of the nucleotide sequences of the region around the Haruna and Kendall barley protein Z7 gene loci A polymorphic marker B identified by multiple alignment of the nucleotide sequences is obtained.
  • test barley species one or more genotypes are identified for each of the polymorphic marker A and polymorphic marker B, and the test barley species whose genotype matches the Haruna type genotype contains protein Z7 A barley species having a high amount is selected, or a test barley species whose genotype matches the Kendall type or Barke type genotype is selected as a barley species having a low protein Z7 content.
  • the region around the barley protein Z7 gene locus includes not only the region where exons and introns of the barley protein Z7 gene are present, but also the region where DNA sequences involved in transcriptional control are present and the surrounding region.
  • the region around the barley protein Z7 locus can be within 5 cM upstream of the ATG sequence corresponding to the initiation codon, preferably within 1 cM, preferably within 0.01 cM. More preferably, it is more preferably within a range of 0.0001 cM. Further, it can be within 5 cM downstream of the TAG sequence corresponding to the stop codon, preferably within 1 cM, more preferably within 0.01 cM, and within 0.0001 cM. More preferably.
  • cM centiorgan
  • the probability of recombination is 5% or less, if it is within 1 cM, the probability is 1% or less, and if it is within 0.01 cM, the probability is 0.01. %, And if it is within 0.0001 cM, the probability is 0.0001% or less. Therefore, the correlation between the polymorphic marker for selection within this range and the content of protein Z7 was kept at a high probability. Will be. Therefore, by setting the selection polymorphic marker within this range, the test barley species can be selected based on the protein Z7 content in a statistically significant manner.
  • Base sequence information of the region around the barley protein Z7 locus is obtained by, for example, amplifying a polynucleotide from the region around the barley protein Z7 locus by PCR using DNA extracted from barley seeds as a template, and the amplified polynucleotide is used as necessary. And the nucleotide sequence of this polynucleotide is determined by sequence analysis.
  • DNA may be extracted from any part of barley, and barley leaves, stems, roots, seeds and the like can be used as a DNA source.
  • a method for extracting DNA from these tissues an extraction method widely used for DNA extraction of plants can be used.
  • commercially available DNA extraction kits can also be used suitably.
  • the base sequence of the primer pair used for PCR using the extracted DNA as a template obtain the (partial) base sequence of the genome corresponding to the region around the barley protein Z7 locus registered in databases such as NCBI and Gene Bank. It can design based on the base sequence information. Parameter settings such as the base sequence length, base sequence, and GC content of each primer are within the range of ordinary trial and error by those skilled in the art and can be determined as appropriate.
  • a PCR method a method for purifying an amplified polynucleotide, and a sequence analysis method, methods widely used in the technical field can be applied, and can be carried out according to a conventional method.
  • the base sequence can be changed.
  • Polynucleotides corresponding to flanking regions that are unknown can be amplified.
  • Base sequence information that is not registered in the database can be obtained by sequence analysis of the amplified polynucleotide.
  • a method such as Inverse PCR can be used as a method for obtaining an adjacent region whose base sequence is unknown.
  • the polymorphic marker A of the present invention can be identified by multiple alignment of the base sequence of the Haruna-type barley protein Z7 locus and the base sequence of the Kendall-type barley protein Z7 locus.
  • the polymorphic marker B can be identified by multiple alignment of the base sequence of the Haruna type barley protein Z7 locus and the base sequence of the Barke type barley protein Z7 locus.
  • the base sequence of the region around the Haruna-type barley protein Z7 gene locus can be obtained by the above-described method for determining base sequence information, typically using two kinds of barley Haruna species. It is also possible to use barley varieties other than Haruna Nijo varieties, and such barley varieties are not limited to these, but include, but are not limited to, Saitama Nijo, Tone Nijo, Nasu Nijo, Kinu Yutaka, Mikamo Golden , Ryofu, Ryoun, Commander, Keel, Nijo Nijo, Asaka Gold, Misato Golden, Hokkaido Shiveri, Harlington, CDC Reserve, CDC Copeland, CDC Meredith, CDC Aurora Nijo, CDC Select, Gaid etc.
  • the base sequence of the region around the Kendall-type barley protein Z7 gene locus can be typically obtained by the method for determining the base sequence information described above using the barley CDC Kendall species.
  • Barley varieties other than CDC Kendall can also be used, and such barley varieties include, but are not limited to, Hoshimari, Betses, AC Metcalf, CDC Polar Star, Newdale, SloopSA, Scarlett, Cellar, Examples include Prior, Chevallier, Hanna, Golden Melon, Amagi Nijo, Akagi Nijo, Seijo No.1, Asahi No.5, Clipper, Schooner, Franklin, Lofty Nijo, Baudin, and Timori.
  • the base sequence of the region around the Barke-type barley protein Z7 gene locus can be typically obtained by the method for determining the base sequence information described above using a barley Barke species.
  • species can also be used, although such barley seed
  • multiple alignment refers to a sequence in which base sequences are aligned with appropriate blanks (gaps) so that corresponding base sequence portions are aligned so that the base sequences can be compared with each other. .
  • a known multiple alignment creation program can be used. For example, Clustal W, Clustal X, etc. can be suitably used.
  • ⁇ ⁇ Multiple alignment can identify base sites where bases do not match.
  • the identified base site can be used as a polymorphic marker for selection.
  • transduced in order to optimize alignment in this invention, it specifies as a base site
  • Figure 1 shows an example of multiple alignment.
  • Barley Haruna Nijo species (labeled Harun; SEQ ID NO: 1), Harrington species (labeled Harri), CDC Copelland species (labeled Copel), CDC Kendall species (labeled Kenda; labeled SEQ ID NO: 2), Barke species (labeled Barke)
  • SEQ ID NO: 3 The base sequence of the region surrounding the protein Z7 locus of SEQ ID NO: 3) is multiple aligned.
  • the 62nd, 93th to 94th (representing a gap), 94th, 96th, 98th, 113th, 116th, 123rd, 148th, 151st, 153rd, 156th, 159th, 160-186th, 217th, 231st, 239th,
  • the base site corresponding to the 246-247th, 253rd, 305-306th, 378th or 422nd base can be identified.
  • the 260th, 262nd, 305-306th, 343th, 378th, 386th, or 422th position of the base sequence identified by SEQ ID NO: 1 A base site corresponding to the base can be identified.
  • corresponding used in the base site corresponding to the 422nd base means that when multiple alignments are made, the bases are aligned or can be aligned.
  • Identification of the genotype of the selection polymorphic marker in the test barley varieties can be achieved by, for example, determining the base type of the base site to be the selection polymorphic marker, determining the presence or absence of the selection polymorphic marker, etc. It can be carried out.
  • determine the base type for example, determine the base type by sequence analysis, determine the base type based on the presence or absence of a restriction enzyme recognition sequence, and determine the base type by hybridization using a perfect match probe or mismatch probe. Etc.
  • the selection polymorphic markers can be classified into three types (Table 1).
  • the type 1 selection polymorphic marker is different from the Haruna genotype (genotype 1), the Kendall type and the Barke type genotype (genotype 2), and the Kendall type and Barke type genotypes (genes).
  • the type 2 selection polymorphic marker has a Haruna type and a Barke type genotype (genotype 1) that match, and only the Kendall genotype (genotype 2) differs from the others. That is, the type 2 selection polymorphic marker can be used only as the polymorphic marker A.
  • the type 3 selection polymorphic marker has a Haruna type and a Kendall type genotype (genotype 1) that are identical, and only the Barke type genotype (genotype 2) is different from the others. That is, the type 3 selection polymorphic marker can be used only as the polymorphic marker B.
  • Abbreviations in the genotype 1 and genotype 2 columns of Table 1 mean H: Haruna type, K: Kendall type, and B: Barke type, respectively.
  • Haruna type and Kendall type test barley species can be classified. However, in this case, the Barke type test barley varieties can be classified as either Haruna type or Kendall type. Similarly, Haruna type and Barke type test barley species can be classified by selecting the test barley species based on the genotype of the polymorphic marker B, but the Kendall type test barley species is Haruna. It can be classified as either a type or a Barke type.
  • the test barley variety at least one genotype is identified for polymorphic marker A, and at least one genotype is identified for polymorphic marker B, and these identified genotypes are:
  • Haruna type, Kendall type, and Barke type genotypes the test barley species can be classified into Haruna type, Kendall type or Barke type. That is, based on the genotype, the test barley varieties are accurately classified into barley varieties with high protein Z7 content (matched with Haruna type) and barley varieties with low protein Z7 content (matched with Kendall type or Barke type). It becomes possible to classify into.
  • one or more genotypes are identified for each of polymorphic marker A and polymorphic marker B.
  • at least one polymorphic marker for selection of type 1 shown in Table 1 is used.
  • Genotype identification may be performed for at least one, or at least one genotype identification may be performed for each of type 2 and type 3 shown in Table 1. Since the polymorphic marker for selection of type 1 is polymorphic marker A and polymorphic marker B, by identifying the genotype of at least one, each of polymorphic marker A and polymorphic marker B One or more genotypes will be identified.
  • one or more genotypes may be identified for at least one of polymorphic marker A and polymorphic marker B.
  • the test barley seed can be selected as a barley seed having a low protein Z7 content.
  • Protein Z7 content may vary depending on the year of barley breed even in the same variety. Therefore, when comparing the protein Z7 content between barley varieties of different production years, it is difficult to judge with an absolute numerical value.
  • barley haruna Nijo varieties that are representative of barley varieties with a high protein Z7 content It is desirable to compare the protein Z7 content with respect to the total amount of protein in the seeds.
  • the barley seed having a high protein Z7 content is a barley seed having a numerical value of 0.50 or more with respect to the protein Z7 content of Baruna Haruna Nijo, for example, preferably 0.60. It is the barley seed
  • barley varieties having a low protein Z7 content are barley varieties having a protein Z7 content of 0.50 or less with respect to the total amount of protein in the seeds for the barley Haruna Nijo varieties, preferably 0.40. It is the barley seed
  • DNA may be extracted from sites such as leaves, stems, roots, seeds, etc. of barley seeds to be tested, but it is preferable to extract from leaves in consideration of selection at the breeding stage. By extracting from the leaves, barley having desirable traits can be selected at an early stage.
  • a primer pair for PCR can be designed based on the base sequence in the peripheral region.
  • the length of the polynucleotide amplified by this primer pair can be 20 to 30000 bp.
  • the upper limit is preferably 10,000 bp, more preferably 3000 bp, and still more preferably 2000 bp .
  • the lower limit is preferably 100 bp, more preferably 200 bp, and still more preferably 300 bp.
  • a method for identifying the base type of the polymorphic marker for selection using the above-mentioned polynucleotide a method of decoding the base sequence by sequence analysis can be suitably used.
  • genotype is identified by digesting the polynucleotide with one or more restriction enzymes containing the polymorphic marker for selection in the recognition sequence, and determining the number and / or size of the fragments obtained. Can also be done.
  • the genotype can be identified based on whether or not the polynucleotide is cleaved by the restriction enzyme, depending on the genotype of the selection polymorphic marker. . Whether or not a polynucleotide is cleaved by a restriction enzyme can be judged from the number and / or size of fragments by fractionating the polynucleotide digested with the restriction enzyme.
  • the primer pair used in the PCR method may be designed according to a general method, as described above. It can be carried out.
  • the length of the polynucleotide amplified by the primer pair is preferably 5000 bp, more preferably 3000 bp, considering that fragments are detected by size fractionation after digestion with a restriction enzyme. And more preferably 2000 bp.
  • the lower limit is preferably 100 bp, more preferably 200 bp, and still more preferably 300 bp.
  • the digestion reaction with restriction enzymes can be performed at an optimal reaction temperature using a buffer solution optimal for each restriction enzyme.
  • a method for detecting a fragment after restriction enzyme digestion by size fractionation agarose gel electrophoresis commonly used by those skilled in the art can be suitably employed.
  • fragments can be detected by size fractionation by HPLC using a known appropriate column.
  • a base identified by SEQ ID NO: 1 containing the above-described selection polymorphic marker in the recognition sequence of BglII and HinfI examples thereof include a method using a selection polymorphic marker corresponding to the 253rd and 343rd bases of the sequence.
  • the polynucleotide was amplified by PCR using a primer pair having the base sequences specified by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, and the amplified poly Nucleotides are digested with restriction enzymes BglII and restriction enzyme HinfI.
  • restriction enzymes BglII and restriction enzyme HinfI restriction enzymes
  • the Haruna-type test barley seeds yield three fragments of 251 bp, 91 bp and 59 bp in size.
  • the Kendall-type test barley varieties yields two fragments of 389 bp and 59 bp in size
  • the Barke-type test barley varieties yields two fragments of sizes 251 bp and 150 bp.
  • kits including a primer pair having the base sequences specified by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • the kit can be suitably used in an embodiment in which a polynucleotide containing the selection polymorphic marker is amplified by a PCR method.
  • the kit may further contain a restriction enzyme. Moreover, you may further include the kit for extracting DNA from the structure
  • the present invention also provides a progeny line of barley seeds that can be obtained by crossing barley seeds selected as barley seeds having a low protein Z7 content by the above selection method.
  • the progeny line can be obtained by crossing between Kendall type and Kendall type or Barke type and Barke type barley species among the barley types selected as barley types having low protein Z7 content, and Kendall type. And can also be obtained by crossing between Barke-type barley varieties.
  • species of a progeny system with low protein Z7 content can be obtained from the barley seed
  • the barley seed selected by the selection method described above can be used in a method for producing a malt fermented beverage comprising at least a preparation step and a fermentation step.
  • the barley seed used in the preparation step is preferably barley seed selected as a barley seed having a low protein Z7 content by the above selection method or a barley seed of a progeny line thereof.
  • the malt can be obtained by producing barley seeds selected as barley seeds having a low protein Z7 content by the above-mentioned selection method or barley seeds of progenies of the crosses. Malting can be performed by a generally used method. Specifically, for example, after malting until the degree of soaking reaches 40% to 45%, germination can be performed at 10 to 20 ° C. for 3 to 6 days and dried to obtain malt.
  • the above charging step is a step of mixing the raw material containing malt and barley and water for charging, heating the resulting mixture to saccharify the malt and barley, and collect wort from the saccharified malt and barley. is there.
  • this charging step not only malt obtained from barley seeds selected as barley seeds having a low protein Z7 content by the above-described selection method or barley seeds of the progenies of these crosses, but also these barley seeds themselves are used. You can also.
  • auxiliary materials such as corn starch, corn grits, rice, and sugars may be added to the raw materials.
  • the fermentation step is a step of adding a hop to the wort, adding yeast to the boiled and cooled cold wort and fermenting it to obtain a malt fermented beverage (intermediate) product.
  • yeast used here include Saccharomyces patrianus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ubalum and the like.
  • the malt fermented beverage is not particularly limited in the proportion of malt used in its production, and may be any beverage that is produced by fermentation using malt as a part of the raw material. Specific examples include beer and sparkling liquor. Also, so-called non-alcohol beer and non-alcohol sparkling liquor are malt fermented beverages because they use the same production method as beer and the like.
  • Example 1 Determination of unknown sequence of protein Z7 locus region
  • Barley Haruna Nijo, CDC Copeland, Harrington, CDC Kendall, and Barke were used in the following examples.
  • DNA was extracted with the following method by using a leaf as a DNA source.
  • Extraction buffer 200 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, pH 7.5
  • zirconia balls were added to the leaves, shaken, and kept at 60 ° C. for 30 minutes. Centrifugation was performed, and an equal amount of isopropanol was added to the resulting supernatant to precipitate DNA. Centrifugation was performed, and 70% ethanol was added to the resulting precipitate, followed by centrifugation again. The obtained DNA precipitate was dissolved in sterilized water, and this DNA solution was used as a PCR template.
  • TAIL PCR In order to obtain an unknown sequence 5 ′ from the translation initiation codon (ATG) of protein Z7, TAIL PCR was used.
  • the TAIL PCR method is a method for obtaining an amplification product containing an unknown sequence adjacent to a known sequence, and a random primer having a random base sequence is paired with a primer having a base sequence that can specifically bind to the known sequence.
  • the low annealing temperature (44 ° C) and the high annealing temperature (68 ° C) variably, the amplification of non-specific products is suppressed and products containing unknown sequences adjacent to known sequences are preferentially used.
  • Random primer (SEQ ID NO: 4); 5′-GTNCGA (G / C) (A / T) CANA (A / T) GTT-3 ′ Specific primer 1 (SEQ ID NO: 5); 5'-CGTTGGGTGGCAGCACTACTGGGG-3 ' Specific primer 2 (SEQ ID NO: 6); 5'-GGTCGGAGGAGATGGGCGAGGGCG-3 ' Specific primer 3 (SEQ ID NO: 7); 5'-GGTCGGGTGGTGAGGGTGGTGCCA-3 '
  • the specific primers 1 to 3 are designed to be “nested”, and by using a nested PCR method, a polynucleotide having an unknown sequence 5 ′ from the translation start codon (ATG) of protein Z7 is used. I got it.
  • the PCR product obtained by the first PCR was used as a template, random primer and specific primer 2 were used, and the second PCR was performed according to the PCR program shown below.
  • a cycle consisting of 9 steps of heat denaturation for 2 seconds, annealing at 44 ° C. for 1 minute, and extension reaction at 72 ° C. for 3 minutes was performed 13 cycles.
  • an extension reaction was performed at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the second PCR product was used as a template, random primers and specific primer 3 were used, and the third PCR was performed according to the same PCR program as the second PCR.
  • This PCR amplification product was analyzed by agarose gel electrophoresis, and the detected amplified polynucleotide was excised from the gel.
  • a continuous unknown sequence region spanning 290 to 337 bp upstream from the translation initiation codon (ATG) of the protein Z7 gene could be amplified as a polynucleotide by the TAIL PCR method described above.
  • the cut out amplified polynucleotide was purified using QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN, cat. No.
  • sequence analysis was performed by using a contract analysis service provided by Sigma.
  • the nucleotide sequences derived from Haruna Nijo species, CDC Kendall species and Barke species are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the 260 th base, the 262 th base, the 305 th 306 th base, the 343 th base, the 378 th base, the 386 th base, the base position corresponding to the 422 th base is there.
  • Haruna Nijo species, the CDC Copeland species, and the Harrington species had the same genotype in all polymorphic markers.
  • the 26 polymorphic markers identified were classified according to the classification in Table 1 (Table 2).
  • Abbreviations in the genotype 1 and genotype 2 columns of Table 2 mean H: Haruna type, K: Kendall type, and B: Barke type genotype, respectively.
  • CAPS Cleared Amplified Polymorphic Sequence
  • the genotype 1 barley seed (Table 2) is a restriction enzyme BglII recognition sequence (AGATCT).
  • BglII restriction enzyme BglII recognition sequence
  • barley seeds of genotype 1 (Table 2) have a recognition sequence for restriction enzyme HinfI (GANTC) at the base site corresponding to the 343rd base.
  • CAPS markers were constructed using these polymorphic markers.
  • a polynucleotide containing a polymorphic marker corresponding to the 253rd base of the nucleotide sequence specified by SEQ ID NO: 1 is amplified by PCR, and the PCR product is digested with the restriction enzyme BglII, so that the genotype can be changed with or without cleavage. Can be identified.
  • the PCR product is cleaved from barley seeds having genotype 1 (Table 2), and the PCR product is not cleaved from barley seeds having genotype 2 (Table 2).
  • DNA was extracted by the same method as in Example 1. Using this DNA as a template, PCR was performed using primers CAPS1 and CAPS2. About 0.4 kbp PCR products were obtained for each. The PCR product was digested with BglII, and electrophoresis was performed after digestion.
  • the PCR product In the sample in which the PCR product was cleaved with BglII, two DNA fragments having a size of about 250 bp and about 150 bp were detected. As a result, the PCR product could be classified into barley seeds that were cleaved by BglII and barley seeds that were not cleaved.
  • CAPS1 (SEQ ID NO: 8); 5'-GGTCACATGACGGTTATAATCTCC-3 ' CAPS2 (SEQ ID NO: 9); 5'-CGTTGGGTGGCAGCACTACTGGGG-3 '
  • Protein Z7 ELISA was performed according to the method of Evans et al. (Non-patent Document 5). In order to take into account the variation in protein content of seeds, the content of protein Z7 was set to (ng / ⁇ g-protein). Table 3 shows the measurement results of the protein Z7 content.
  • the test barley species belonging to genotype 1 in which the PCR product was cleaved with BglII was selected, the phenomenon that the protein Z7 content of all the selected barley species was not necessarily high was observed. That is, the polymorphic marker corresponding to the 253rd base of the base sequence specified by SEQ ID NO: 1 reliably classifies the test barley seeds into barley seeds with a high protein Z7 content and low barley seeds. It was not enough as a selection marker for.
  • a polynucleotide containing a polymorphic marker corresponding to the 343rd base of the base sequence identified by SEQ ID NO: 1 is amplified by PCR, and the PCR product is digested with the restriction enzyme HinfI, so that the genotype can be detected with or without PCR cleavage. Can be identified.
  • the PCR product is cleaved from barley seeds having genotype 1 (Table 2), and the PCR product is not cleaved from barley seeds having genotype 2 (Table 2).
  • DNA was extracted by the same method as in Example 1. Using this DNA as a template, PCR was performed using primers CAPS1 and CAPS2. About 0.4 kbp PCR products were obtained for each. The PCR product was digested with HinfI and subjected to electrophoresis after digestion.
  • the PCR product In the sample obtained by cleaving the PCR product with HinfI, two DNA fragments having a size of about 350 bp and about 60 bp were detected. As a result, the PCR product could be classified into barley seeds that were cleaved by HinfI and barley seeds that were not cleaved.
  • Protein Z7 content was measured as described above. The average value of protein Z7 content of barley seeds (genotype 1) whose PCR products were cleaved with HinfI and barley seeds (genotype 2) that were not cleaved was compared (FIG. 4). As a result, although the average value of the protein Z7 content was higher in the genotype 1 barley varieties than the genotype 2 barley varieties in all of the 2000, 2004, and 2008 varieties, There was no significant difference.
  • the polymorphic markers identified in Example 1 are restricted by each from the results of Example 2. Based on the presence or absence of cleavage by the enzyme, it was not sufficient as a selection marker for accurately classifying the test barley varieties into barley varieties with high protein Z7 content and barley varieties with low protein Z7 content.
  • Example 4 Verification of the selection effect of barley varieties based on protein Z7 content of CAPS markers using a plurality of polymorphic markers
  • 23 varieties of barley Haruna Nijo, Myougi Nijo, Satsuki Nijo, Golden Melon, Akagi Nijo, Ryofu, Ryoun, Hoshimari, CDC Kendall, AC Metcalf, Harlington, CDC Copeland, SloopSA, Schoner, Clipper, Clipper, Clipper, As shown in Example 3, the genotype of the CAPS marker was identified for Scallett, Betzes, Braemar, Triumph, Hanna and Prior types, and was classified into three types: Kendall type, Haruna type, and Barke type. The relationship between the genotype and protein Z7 content was examined.
  • Example 3 [Comparison of genotype classification and protein Z7 content] As shown in Example 3, by identifying the genotype of the CAPS marker and comparing the average value of the protein Z7 content of each barley variety classified into Kendall type, Haruna type, and Barke type, The effectiveness of the CAPS marker was verified (FIG. 5). Haruna-type barley varieties produced in 2000, 2004, and 2008 were significantly higher in protein Z7 content at a 1% risk compared to Kendall-type and Barke-type barley varieties ( FIG. 5).
  • test barley seeds are classified into three types of Haruna type, Kendall type and Barke type as described above.
  • Haruna type test barley seeds are definitely barley seeds with a high protein Z7 content
  • the test barley varieties of Kendall type and Barke type were certainly barley varieties having a low protein Z7 content, and a sufficient selection effect was shown.
  • the present CAPS marker is based on the discrimination of two genotypes of polymorphic markers corresponding to the 253rd and 343rd bases of the base sequence specified by SEQ ID NO: 1, the test barley species has a protein Z7 content. It is effective as a selection marker for reliably classifying a high barley variety and a low barley variety.
  • Example 4 show that the test barley species whose genotype matches the Haruna type can be selected as a barley species having a high protein Z7 content, and the test barley species whose genotype matches the Kendall type or the Barke type Indicates that it can be selected as a barley variety having a low protein Z7 content. That is, based on the knowledge obtained in Example 4, genotype identification was performed for only one of the two polymorphic markers corresponding to the 253rd and 343rd bases of the base sequence specified by SEQ ID NO: 1.
  • test barley species is selected as a barley species that matches the Kendall type, or the test barley species whose PCR product is not cut with HinfI is selected as the barley type that matches the Barke type.
  • species with low protein Z7 content can be selected.
  • Example 5 Relationship between protein Z7 content and NIBEM value in beer
  • a single 400-liter pilot plant with 11 varieties (Haruna Nijo, Amagi Nijo, Mikamo Golden, Nitta Nijo 21, Ryofu, Ryoun, Kitaiku 41, CDC Kendall, CDC Copeland, CDC Reserve, Lofty Nijo)
  • a total of 42 test beers brewed for use were used as samples (Table 5).
  • Protein Z7 in beer was quantified by the ELISA method described above.
  • the NIBEM value was measured using a NIBEM-T apparatus manufactured by HAFFMANS, INPACK2000, and a standard glass for NIBEM value measurement. Specifically, each of the above test beers is brought to a temperature of 20 ° C., poured into a standard glass using a carbon dioxide gas with a foam pourer, and the drop in the height of the generated foam is tracked with a NIBEM-T apparatus. It was measured by.
  • Non-patent Document 5 Non-patent Document 5
  • the ratio of the minimum and maximum values of protein Z7 in the sample population used by Evans et al. Is 4.81, which is significantly lower than the ratio of the minimum and maximum values of the sample used in this study (16.73).
  • the sample population used by Evans et al. May not have clarified the relationship between protein Z7 and foam retention.
  • the selection method of the present invention using the polymorphic marker for selection described above to select barley seeds based on the protein Z7 content is useful for breeding barley with good foaminess. It was.

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Abstract

　本発明は、被検大麦種において、Ｈａｒｕｎａ型及びＫｅｎｄａｌｌ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＡ、並びにＨａｒｕｎａ型及びＢａｒｋｅ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＢのそれぞれについて１つ以上の遺伝子型を同定し、Ｈａｒｕｎａ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の高い大麦種として選抜するか、Ｋｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜する、選抜方法を提供する。

Description

プロテインＺ７含有量に基づいた大麦種の選抜方法及び麦芽発酵飲料
　本発明は、プロテインＺ７含有量に基づいた大麦種の選抜方法及び麦芽発酵飲料に関する。
　プロテインＺ７は、プロテインＺ４やプロテインＺｘなどと共に、大麦セリンプロテアーゼインヒビター（ｓｅｒｐｉｎ）サブファミリーに属する。ｓｅｒｐｉｎサブファミリーに属するこれらのタンパク質は、大麦種がカビ等に感染した際に、生体を防御する機構に関与していると考えられている。しかしながら、その機能には未だ不明な点が多い（非特許文献１）。
　一方、プロテインＺとビールの泡持ちとの関係が示唆されている。泡持ちはビールの重要な品質の一つであるため、泡持ちに関与する要因についてはこれまでに多くの研究結果が報告されている。泡持ちの良し悪しには様々な要因が関与しているが、その一つとしてタンパク質そのものの関与が考えられており、これまでに、泡持ちに関与するタンパク質としてプロテインＺ（プロテインＺ４、プロテインＺ７）やｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＬＴＰ１）が取り上げられてきた（非特許文献２－４）。
　プロテインＺ７とビールの泡持ちとの関係については、これまでほとんど研究が進んでおらず、数少ない報告があるのみである（特許文献１及び非特許文献５）。
　特許文献１には、大麦の種子、麦芽、麦汁、麦芽発酵飲料又は麦芽発酵飲料の発酵前原料液若しくは発酵中原料液に含まれるプロテインＺ７濃度と泡持ちの指標となるＮＩＢＥＭ値には相関関係があると記載され、プロテインＺ７濃度に基づいて泡持ちの良さを判定する方法が開示されている。
　一方、非特許文献５には、麦芽プロテインＺ７含量と泡持ちの関連を調査した結果、プロテインＺ７と泡持ちの間には有意な相関関係は見られなかったと記載されており、上述した特許文献１とは異なる結論が得られている。
特開２００８－２４９７０４公報
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，３９４巻，１６５－１６８頁，１９９６年 Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，５６巻，１４５８－１４６４頁，２００８年 Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，５６巻，８６６４－８６７１頁，２００８年 Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，６０巻，４７－５７頁，２００２年 Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，１０５巻，１７１－１７７頁，１９９９年
　プロテインＺ７については、大麦が感染した際の生体防御機構に関与すること、ビールの泡持ちに関与することなど、産業上有用な機能への関与が示唆されているが、未だ充分な研究がなされているとはいえない。プロテインＺ７含有量が大麦の形質に及ぼす影響を正確に解析するためには、プロテインＺ７含有量の高い大麦及び／又は低い大麦を正確に選別できる方法の確立が必要である。
　特許文献１に開示されたビールの泡持ちを判定する方法は、プロテインＺ７濃度をタンパク質レベルで測定することに基づいている。ＮＩＢＥＭ値の測定に基づく方法と比較すると、温度、天候、人為的な要因の影響を排除できるが、タンパク質レベルの変動の影響を受け得る。泡持ちのよいビールに適した大麦の育種へと応用しようとした場合、特に大麦育種の初期段階に近いほど、数百もの大麦個体をスクリーニングする必要があるが、特許文献１に開示された方法は、そのような大量の検体を処理するのには向いていない。
　大麦に限らず様々な作物の育種において分子選抜技術が進歩している。分子選抜技術の中でもＤＮＡの多型を用いたＤＮＡマーカーによる選抜は、育種初期世代での選抜が可能であること、操作性に優れること、葉で解析が可能なことなどの理由から盛んに研究開発が進められている。しかしながら、大麦プロテインＺ７の含有量の指標となるＤＮＡマーカーは知られていない。
　そこで本発明は、作業が容易で、多検体を短時間で処理することができ、かつプロテインＺ７含有量に基づいて正確に大麦種を選抜することができる、大麦育種への応用に適した、大麦種の選抜方法の提供を目的とする。
　本発明は、また、プロテインＺ７含有量に基づいて選抜した大麦種を原料とした麦芽発酵飲料の製造方法、及び麦芽発酵飲料の提供も目的とする。
　本発明は、プロテインＺ７含有量に基づいて大麦種を選抜する選抜方法であって、被検大麦種において、Ｈａｒｕｎａ型及びＫｅｎｄａｌｌ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＡ、並びにＨａｒｕｎａ型及びＢａｒｋｅ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＢ、のそれぞれについて１つ以上の遺伝子型を同定し、以下の（ｉ）及び／又は（ｉｉ）を実施する選抜方法を提供する。
（ｉ）同定した遺伝子型が、Ｈａｒｕｎａ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の高い大麦種として選抜する
（ｉｉ）同定した遺伝子型が、Ｋｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜する
　本明細書中において、「Ｈａｒｕｎａ型」とは、大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域に存在する、上記多型マーカーＡ及び多型マーカーＢからなる群より選ばれる選抜用多型マーカーの遺伝子型が、大麦はるな二条種の遺伝子型と一致する大麦種を表す。「Ｈａｒｕｎａ型」の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列の一例としては、配列番号１で示される塩基配列が挙げられる。
　同様に、本明細書中において、「Ｋｅｎｄａｌｌ型」及び「Ｂａｒｋｅ型」とは、大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域に存在する上記選抜用多型マーカーの遺伝子型が、それぞれ、大麦ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ種及び大麦Ｂａｒｋｅ種の遺伝子型と一致する大麦種を表す。「Ｋｅｎｄａｌｌ型」及び「Ｂａｒｋｅ型」の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列の一例としては、配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列が挙げられる。
　「Ｈａｒｕｎａ型」の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列と、「Ｋｅｎｄａｌｌ型」の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列とを多重整列することにより、塩基が一致しない塩基部位を多型マーカーＡとして特定することができる。同様に、「Ｈａｒｕｎａ型」の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列と、「Ｂａｒｋｅ型」の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列とを多重整列することにより、塩基が一致しない塩基部位を多型マーカーＢとして特定することができる。
　被検大麦種において、上記多型マーカーＡのうちから１つ以上について遺伝子型を同定し、かつ上記多型マーカーＢのうちから１つ以上について遺伝子型を同定する。同定したこれらの遺伝子型がＨａｒｕｎａ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を選抜することによって、プロテインＺ７含有量の高い大麦種を選抜することができる。また、同定したこれらの遺伝子型がＫｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を選抜することによって、プロテインＺ７含有量の低い大麦種を選抜することができる。
　上述した選抜方法は、大麦組織中の大麦プロテインＺ７含有量と相関する新規な選抜用多型マーカーを利用しているため、被検大麦種をプロテインＺ７含有量に基づいて正確に選抜することができる。また、遺伝子型の同定には、分子生物学的手法を採用できるため、上述した選抜方法は、操作性に優れ、かつ多検体を同時に短時間で処理できる選抜方法とすることができる。
　本発明は、また、プロテインＺ７含有量の低い大麦種を選抜する選抜方法であって、被検大麦種において、Ｈａｒｕｎａ型及びＫｅｎｄａｌｌ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＡ、並びにＨａｒｕｎａ型及びＢａｒｋｅ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＢ、の少なくとも１つの遺伝子型の同定を行い、以下の（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）を実施する選抜方法を提供する。
　（ｉｉｉ）同定した多型マーカーＡの遺伝子型が、Ｋｅｎｄａｌｌ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜する
　（ｉｖ）同定した多型マーカーＢの遺伝子型が、Ｂａｒｋｅ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜する
　被検大麦種において、上記多型マーカーＡ及び多型マーカーＢのうち、少なくとも１つについて遺伝子型を同定する。同定した多型マーカーＡの遺伝子型がＫｅｎｄａｌｌ型に一致する被検大麦種を選抜すること又は同定した多型マーカーＢの遺伝子型がＢａｒｋｅ型の遺伝子型に一致する被検大麦種を選抜することによって、プロテインＺ７含有量の低い大麦種を選抜することができる。
　上記遺伝子型の同定は、上記被検大麦種のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法で増幅された、上記多型マーカーＡ及び多型マーカーＢからなる群より選ばれる選抜用多型マーカーの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドにより行なわれることが好ましい。
　上記ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡの塩基配列を再現しているため、遺伝子型の同定に好ましく利用できる。また、解析に要する植物組織試料量が少量ですむため、育種初期段階での選抜に特に適している。そのうえ、多くの解析非対象ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡそのものから遺伝子型を同定するのに比べて、検体中に解析対象となる塩基配列が多量に存在するため、より容易に遺伝子型を同定することができる。更に、被検大麦からＤＮＡを抽出する工程、ＰＣＲ法により選抜用多型マーカーを含むポリヌクレオチドを増幅する工程、選抜用多型マーカーの塩基種を判別する工程、といった基本的かつ容易な操作のみで短時間で選抜用多型マーカーの遺伝子型を同定することができるため、多検体を処理することにより適している。
　上記多型マーカーＡは、配列番号１で特定される塩基配列の第６２番目、第９３－９４番目（ギャップを表す）、第９４番目、第９６番目、第９８番目、第１１３番目、第１１６番目、第１２３番目、第１４８番目、第１５１番目、第１５３番目、第１５６番目、第１５９番目、第１６０－１８６番目、第２１７番目、第２３１番目、第２３９番目、第２４６－２４７番目、第２５３番目、第３０５－３０６番目、第３７８番目又は第４２２番目の塩基に相当する塩基部位とすることができる。同様に、上記多型マーカーＢは、配列番号１で特定される塩基配列の第２６０番目、第２６２番目、第３０５－３０６番目、第３４３番目、第３７８番目、第３８６番目又は第４２２番目の塩基に相当する塩基部位とすることができる。
　上記遺伝子型の同定は、上記選抜用多型マーカーの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドを、認識配列中に上記選抜用多型マーカーの少なくとも１つを含む１種又は２種以上の制限酵素で消化して得られる断片の数及び／又はサイズに基づいて行うことが好ましい。
　この場合、上記選抜用多型マーカーの塩基種を判別する工程を、制限酵素消化、消化後の断片の数及び／又はサイズの検出といった基本的かつ容易な操作のみで実施することができる。また、短時間で選抜用多型マーカーの遺伝子型を同定することができるため、多検体の処理により適している。更に、遺伝子型の同定にかかるコストを低く抑えることができる。
　認識配列中に上記選抜用多型マーカーの少なくとも１つを含む制限酵素は、配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する選抜用多型マーカーを認識配列中に含む制限酵素である、ＢｇｌＩＩ又はＨｉｎｆＩとすることができる。また、ＰＣＲ法に配列番号８及び配列番号９で特定される塩基配列を有するプライマー対を用い、上記第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する選抜用多型マーカーを含むポリヌクレオチドを増幅することができる。
　本発明は、また、配列番号８及び配列番号９で特定される塩基配列を有するプライマー対を含むプロテインＺ７含有量に基づく大麦種選抜用キットを提供する。
　上述した配列番号８及び配列番号９で特定される塩基配列を有するプライマー対を用いることにより、ＰＣＲ法による上記第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する選抜用多型マーカーを含むポリヌクレオチドの増幅を効率よく行うことができる。
　本発明は、上記選抜方法によってプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦種を提供する。
　上記選抜方法によって選抜された大麦種は、選抜用多型マーカーの遺伝子型が「Ｋｅｎｄａｌｌ型」又は「Ｂａｒｋｅ型」の大麦種となっており、選抜された大麦種間で交配した場合、後代系統の大麦種の遺伝子型はほぼ確実に親の大麦種の遺伝子型と同一となる。したがって、プロテインＺ７含有量に関する形質も後代系統に引き継がれる。
　本発明は、仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、上記仕込工程で使用される大麦種が、上記選抜方法によりＫｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型の遺伝子型に一致する被検大麦種として選抜された大麦種及び／又はその大麦種を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦種である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。本発明はまた、上記製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料を提供する。
　後述するように、ビール中のプロテインＺ７含有量とＮＩＢＥＭ値との間には相関関係がある。本発明の選抜方法によってＫｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型の遺伝子型に一致する被検大麦種として選抜された大麦種は、プロテインＺ７含有量が低いため、これらの大麦種に由来する原料から製造される麦芽発酵飲料を、泡持ちに優れるものとすることができる。
　本発明の選抜方法により、操作性に優れ、作業が容易で、多検体を短時間で処理することができ、育種の初期段階でプロテインＺ７含有量に基づいて正確に大麦種を選抜することができる。
　また、本発明の選抜方法により、プロテインＺ７含有量に基づいて泡持ちのよい大麦種を選抜することができ、その選抜した大麦種、それらを交配して得ることのできる交配後代系統の大麦種を原料として、泡持ちのよい麦芽発酵飲料を製造することができる。
　麦芽発酵飲料用の大麦育種では、育種した品種には大麦、麦芽、麦芽発酵飲料（例えば、ビール等）の全ての面において高い品質が求められる。しかしながら、ビール品質の評価には一定量以上の試料が必要となるため、育種過程後期の段階でしか評価できないのが現状である。例えば泡持ちに関しては、醸造試験において泡持ちの良し悪しが判断されることとなるが、醸造試験に到達するまでにおよそ１０年の歳月を要するのが一般的である。そのため育種の初期段階でビール品質（泡持ち）に関する性質について大麦種の選抜ができる本発明の選抜方法は非常に有効である。
プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列した例を示す図である。 選抜用多型マーカーを含むポリヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅し、制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動した写真である。 ２０００年、２００４年、２００８年度産の大麦種を表１のタイプ２の選抜用多型マーカーを用いて選抜し、遺伝子型１、遺伝子型２に属する大麦種それぞれの平均プロテインＺ７含有量を測定した結果を示すグラフである。 ２０００年、２００４年、２００８年度産の大麦種を表１のタイプ３の選抜用多型マーカーを用いて選抜し、遺伝子型１、遺伝子型２に属する大麦種それぞれの平均プロテインＺ７含有量を測定した結果を示すグラフである。 ２０００年、２００４年、２００８年度産の大麦種を本発明の選抜方法により選抜し、Ｈａｒｕｎａ型、Ｋｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型に属する大麦種それぞれの平均プロテインＺ７含有量を測定した結果を示すグラフである。 ビールのプロテインＺ７含有量とＮＩＢＥＭ値との関係を示すグラフである。
　本発明は、プロテインＺ７含有量の高い大麦種、低い大麦種を選抜する選抜方法を提供する。上記選抜方法では、まず、Ｈａｒｕｎａ型及びＫｅｎｄａｌｌ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＡ、Ｈａｒｕｎａ型及びＢａｒｋｅ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＢを得る。被検大麦種において、上記多型マーカーＡ及び多型マーカーＢのそれぞれについて１つ以上の遺伝子型を同定し、その遺伝子型が、Ｈａｒｕｎａ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の高い大麦種として選抜するか、遺伝子型が、Ｋｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜する。
　大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域とは、大麦プロテインＺ７遺伝子のエキソン、イントロンが存在する領域のみならず、転写制御に関わるＤＮＡ配列が存在する領域及びその周辺領域をも含むものである。具体的には、大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域としては、開始コドンに相当するＡＴＧ配列の上流５ｃＭ以内の範囲とすることができ、１ｃＭ以内の範囲とすることが好ましく、０．０１ｃＭ以内の範囲とすることがより好ましく、０．０００１ｃＭ以内の範囲とすることが更に好ましい。また、終止コドンに相当するＴＡＧ配列の下流５ｃＭ以内の範囲とすることができ、１ｃＭ以内の範囲とすることが好ましく、０．０１ｃＭ以内の範囲とすることがより好ましく、０．０００１ｃＭ以内の範囲とすることが更に好ましい。
　ここで、ｃＭ（センチモルガン）とは、遺伝学的方法によって定まる染色体上での遺伝子間の距離を表す単位であって、減数分裂１回当たり、相同染色体間に平均１回の交叉が起こる距離を１Ｍとし、その１／１００の距離を１ｃＭという。
　すなわち、プロテインＺ７遺伝子座から５ｃＭ以内であれば、組換えが生じる確率が５％以下となり、１ｃＭ以内であればその確率が１％以下となり、０．０１ｃＭ以内であればその確率が０．０１％以下となり、更に０．０００１ｃＭ以内であればその確率が０．０００１％以下となるため、この範囲内にある選抜用多型マーカーとプロテインＺ７含有量との相関関係は、高い確率で保たれることになる。したがって、上記選抜用多型マーカーをこの範囲内で設定することで、統計上有意に、プロテインＺ７含有量に基づいて被検大麦種を選抜することができる。
　大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列情報は、例えば、大麦種から抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域からポリヌクレオチドを増幅し、増幅したポリヌクレオチドを必要に応じて精製し、このポリヌクレオチドの塩基配列をシークエンス解析により決定することで、得ることができる。
　ここで、ＤＮＡは大麦のどの部位から抽出されてもよく、大麦の葉、茎、根、種子等をＤＮＡソースとして利用することができる。これらの組織からのＤＮＡ抽出方法としては、植物のＤＮＡ抽出に汎用されている抽出方法を用いることができる。また、市販されているＤＮＡ抽出キット類も好適に使用することができる。
　抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲに用いるプライマー対の塩基配列は、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されている大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域に相当するゲノムの（部分）塩基配列を入手し、その塩基配列情報に基づいて設計することができる。各プライマーの塩基配列長、塩基配列、ＧＣ含有量等のパラメーター設定については、当業者の通常の試行錯誤の範囲内であり、適宜決定され得る。また、ＰＣＲ法、増幅したポリヌクレオチドの精製法、シークエンス解析法については、当該技術分野で汎用されている手法が適用可能であり、常法に従って実施することができる。
　また、データベースに登録されている（部分）塩基配列を基にプロテインＺ７遺伝子配列特異的プライマーを設計し、ランダムプライマーと組み合わせてＴｈｅｒｍａｌ　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ（ＴＡＩＬ）ＰＣＲ法等を実施することによって、塩基配列が未知である隣接領域に対応するポリヌクレオチドを増幅することができる。増幅されたポリヌクレオチドのシークエンス解析により、データベースに登録されていない塩基配列情報の取得が可能である。塩基配列が未知の隣接領域を取得する方法としては、ＴＡＩＬ　ＰＣＲ法以外にも、例えば、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ等の方法が挙げられる。
　本発明の多型マーカーＡは、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列と、Ｋｅｎｄａｌｌ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列とを多重整列することにより特定することができる。同様に、多型マーカーＢは、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列と、Ｂａｒｋｅ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列とを多重整列することにより特定することができる。
　ここで、Ｈａｒｕｎａ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦はるな二条種を用いて、上述した塩基配列情報を決定する方法により得ることができる。また、はるな二条種以外の大麦種を用いることも可能であり、そのような大麦種として、これらに限定されるものではないが、さきたま二条、とね二条、なす二条、きぬゆたか、ミカモゴールデン、りょうふう、りょううん、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ、Ｋｅｅｌ、みょうぎ二条、アサカゴールド、ミサトゴールデン、北海道シバリー、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＤＣ　Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ、ＣＤＣ　Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、ＣＤＣ　Ａｕｒｏｒａ　Ｎｉｊｏ、ＣＤＣ　Ｓｅｌｅｃｔ、Ｇａｉｒｄｎｅｒ種などを例示できる。
　Ｋｅｎｄａｌｌ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ種を用いて、上述した塩基配列情報を決定する方法により得ることができる。ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ種以外の大麦種を用いることもでき、そのような大麦種として、これらに限定されるものではないが、ほしまさり、Ｂｅｔｚｅｓ、ＡＣ　Ｍｅｔｃａｌｆ、ＣＤＣ　Ｐｏｌａｒ　Ｓｔａｒ、Ｎｅｗｄａｌｅ、ＳｌｏｏｐＳＡ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、Ｃｅｌｌａｒ、Ｐｒｉｏｒ、Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ、Ｈａｎｎａ、ゴールデンメロン、あまぎ二条、あかぎ二条、成城１号、アサヒ５号、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｌｏｆｔｙ　Ｎｉｊｏ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｔｉｍｏｒｉ種などを例示できる。
　Ｂａｒｋｅ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦Ｂａｒｋｅ種を用いて、上述した塩基配列情報を決定する方法により得ることができる。また、Ｂａｒｋｅ種以外の大麦種を用いることもでき、そのような大麦種として、これらに限定されるものではないが、Ｂｒａｅｍａｒ、Ｏｐｔｉｃ、Ｔｒｉｕｍｐｈ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｐｏｗｅｒ種などを例示できる。
　本発明において多重整列（マルチプルアラインメント）とは、塩基配列を相互に比較可能なものにするため、対応する塩基配列部分が並ぶよう、適宜空白（ギャップ）を入れて塩基配列を整列したものをいう。本明細書中においては、塩基配列が２つの場合にも、多重整列という。多重整列にあたっては、公知の多重整列作成プログラムを利用することができる。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘなどが好適に利用可能である。
　多重整列により、塩基が一致しない塩基部位を特定することができる。特定された塩基部位を、選抜用多型マーカーとして利用することができる。なお、整列を最適化するために導入されるギャップ部分については、本発明においては塩基が一致しない塩基部位、すなわち選抜用多型マーカーとして特定する。
　図１に多重整列の一例を示した。大麦はるな二条種（Ｈａｒｕｎと表示；配列番号１）、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種（Ｈａｒｒｉと表示）、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ種（Ｃｏｐｅｌと表示）、ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ種（Ｋｅｎｄａと表示；配列番号２）、Ｂａｒｋｅ種（Ｂａｒｋｅと表示；配列番号３）のプロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列したものである。
　図１より、多型マーカーＡの一例として、配列番号１で特定される塩基配列の第６２番目、第９３－９４番目（ギャップを表す）、第９４番目、第９６番目、第９８番目、第１１３番目、第１１６番目、第１２３番目、第１４８番目、第１５１番目、第１５３番目、第１５６番目、第１５９番目、第１６０－１８６番目、第２１７番目、第２３１番目、第２３９番目、第２４６－２４７番目、第２５３番目、第３０５－３０６番目、第３７８番目又は第４２２番目の塩基に相当する塩基部位を特定することができる。同様に、多型マーカーＢの一例として、配列番号１で特定される塩基配列の第２６０番目、第２６２番目、第３０５－３０６番目、第３４３番目、第３７８番目、第３８６番目又は第４２２番目の塩基に相当する塩基部位を特定することができる。
　なお、第４２２番目の塩基に相当する塩基部位等で使われる「相当する」とは、多重整列した際に、その塩基の列に整列される又は整列できることをいう。
　被検大麦種における上記選抜用多型マーカーの遺伝子型の同定は、例えば、選抜用多型マーカーとなる塩基部位の塩基種を判別すること、選抜用多型マーカーの有無を判別することなどにより行うことができる。塩基種の判別は、例えば、シークエンス解析により塩基種を決定すること、制限酵素認識配列の有無によって塩基種を決定すること、完全マッチプローブやミスマッチプローブを利用したハイブリダイゼーションにより塩基種を決定することなどにより行うことができる。
　上記選抜用多型マーカーは３つのタイプに分類することができる（表１）。タイプ１の選抜用多型マーカーは、Ｈａｒｕｎａ型の遺伝子型（遺伝子型１）とＫｅｎｄａｌｌ型及びＢａｒｋｅ型の遺伝子型（遺伝子型２）とが異なり、かつ、Ｋｅｎｄａｌｌ型とＢａｒｋｅ型の遺伝子型（遺伝子型２）が一致するものである。すなわち、タイプ１の選抜用多型マーカーは、多型マーカーＡとしても多型マーカーＢとしても利用できるものである。タイプ２の選抜用多型マーカーは、Ｈａｒｕｎａ型とＢａｒｋｅ型の遺伝子型（遺伝子型１）が一致し、Ｋｅｎｄａｌｌ型の遺伝子型（遺伝子型２）のみ他と異なるものである。すなわち、タイプ２の選抜用多型マーカーは、多型マーカーＡとしてのみ利用できるものである。また、タイプ３の選抜用多型マーカーは、Ｈａｒｕｎａ型とＫｅｎｄａｌｌ型の遺伝子型（遺伝子型１）が一致し、Ｂａｒｋｅ型の遺伝子型（遺伝子型２）のみ他と異なるものである。すなわち、タイプ３の選抜用多型マーカーは、多型マーカーＢとしてのみ利用できるものである。
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 表１の遺伝子型１及び遺伝子型２欄中の略号は、それぞれ、Ｈ：Ｈａｒｕｎａ型、Ｋ：Ｋｅｎｄａｌｌ型、Ｂ：Ｂａｒｋｅ型を意味する。
　多型マーカーＡの遺伝子型に基づいて被検大麦種を選抜することにより、Ｈａｒｕｎａ型とＫｅｎｄａｌｌ型の被検大麦種を分類することができる。しかしながら、この場合、Ｂａｒｋｅ型の被検大麦種はＨａｒｕｎａ型、Ｋｅｎｄａｌｌ型のいずれにも分類され得る。同様に、多型マーカーＢの遺伝子型に基づいて被検大麦種を選抜することにより、Ｈａｒｕｎａ型とＢａｒｋｅ型の被検大麦種を分類することができるが、Ｋｅｎｄａｌｌ型の被検大麦種はＨａｒｕｎａ型、Ｂａｒｋｅ型のいずれにも分類され得る。
　したがって、被検大麦種において、多型マーカーＡについて少なくとも１つ以上の遺伝子型を同定し、かつ多型マーカーＢについても少なくとも１つ以上の遺伝子型を同定し、同定したこれらの遺伝子型を、Ｈａｒｕｎａ型、Ｋｅｎｄａｌｌ型、Ｂａｒｋｅ型の遺伝子型と比較することで、被検大麦種をＨａｒｕｎａ型、Ｋｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型のいずれかに分類することができる。すなわち、遺伝子型に基づいて、プロテインＺ７含有量の高い大麦種（Ｈａｒｕｎａ型と一致）と、プロテインＺ７含有量の低い大麦種（Ｋｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型と一致）とに、被検大麦種を正確に分類することが可能となる。
　被検大麦種において、多型マーカーＡ及び多型マーカーＢのそれぞれについて１つ以上の遺伝子型の同定を行う実施形態としては、表１に示したタイプ１の選抜用多型マーカーの少なくとも１つについて遺伝子型の同定を行うか、表１に示したタイプ２及びタイプ３それぞれについて少なくとも１つ遺伝子型の同定を行う形態とすることができる。タイプ１の選抜用多型マーカーは、多型マーカーＡであり、かつ多型マーカーＢでもあるため、少なくとも１つについて遺伝子型を同定することにより、多型マーカーＡ及び多型マーカーＢのそれぞれについて１つ以上の遺伝子型を同定することとなる。
　一方、プロテインＺ７含有量の低い被検大麦種のみを選抜する場合、多型マーカーＡ及び多型マーカーＢの少なくとも一方について１つ以上の遺伝子型を同定すればよい。被検大麦種において、同定した多型マーカーＡの遺伝子型が、Ｋｅｎｄａｌｌ型の遺伝子型と一致する場合、又は同定した多型マーカーＢの遺伝子型が、Ｂａｒｋｅ型の遺伝子型と一致する場合、その被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜することができる。
　プロテインＺ７含有量は、同一品種でも大麦種の産年度によって異なることがある。そのため、異なる産年度の大麦種間でプロテインＺ７含有量を比較する場合において、絶対的な数値で判断することは難しいため、例えば、プロテインＺ７含有量の高い大麦種の代表である大麦はるな二条種に対する種子中のタンパク質全量に対するプロテインＺ７含有量として比較するのが望ましい。この場合において、プロテインＺ７含有量の高い大麦種とは、その数値が、例えば、大麦はるな二条種のプロテインＺ７含有量に対して、０．５０以上である大麦種であり、好ましくは０．６０以上である大麦種であり、より好ましくは０．７０以上である大麦種である。他方、プロテインＺ７含有量の低い大麦種とは、その大麦種の大麦はるな二条種に対する種子中のタンパク質全量に対するプロテインＺ７含有量が、０．５０以下である大麦種であり、好ましくは０．４０以下である大麦種であり、より好ましくは０．３０以下である大麦種である。
　被検大麦種からのＤＮＡの抽出方法は、植物の組織からのＤＮＡ抽出に常用される、ＣＴＡＢ法、後述する方法等を一般に適用可能である。また、市販されているキット類も好適に使用可能である。一方、ＤＮＡは被検大麦種の葉、茎、根、種子等の部位から抽出されてもよいが、育種段階での選抜を考慮すれば、葉から抽出するのが好ましい。葉から抽出することにより、早い段階で望ましい形質を有する大麦を選抜することができる。
　被検大麦種から抽出したＤＮＡを用いて、上記選抜用多型マーカーを含むポリヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅する場合においては、上記選抜用多型マーカーを特定する際に決定した大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を基にＰＣＲ用プライマー対を設計することができる。このプライマー対により増幅されるポリヌクレオチドの長さとしては、２０～３００００ｂｐとすることができる。ＰＣＲ法での増幅効率、増幅されたポリヌクレオチドを解析する際の取り扱いの容易さ等を勘案すれば、上限値は１００００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３０００ｂｐであり、更に好ましくは２０００ｂｐである。同様に下限値は１００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは２００ｂｐ、更に好ましくは３００ｂｐである。ＰＣＲ法に用いるポリメラーゼの種類を当業者に良く知られたものの中から適宜選択することにより、上述した長さを有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
　上記ポリヌクレオチドを用いて選抜用多型マーカーの塩基種を同定する方法としては、シークエンス解析により塩基配列を解読する方法などが好適に利用可能である。
　また、上記遺伝子型の同定を、認識配列中に上記選抜用多型マーカーを含む１種又は２種以上の制限酵素で、上記ポリヌクレオチドを消化し、得られる断片の数及び／又はサイズを判別することによって行うこともできる。
　制限酵素の認識配列中に上記選抜用多型マーカーが含まれる場合、上記選抜用多型マーカーの遺伝子型によって、制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かで遺伝子型を同定することができる。制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かは、制限酵素で消化したポリヌクレオチドをサイズ分画することにより、断片の数及び／又はサイズから判断することができる。
　制限酵素の認識配列中に含まれる上記選抜用多型マーカーを含むポリヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅するにあたり、ＰＣＲ法に用いるプライマー対の設計は、一般的な方法に従えばよく、上記したとおりに行うことができる。プライマー対により増幅されるポリヌクレオチドの長さとしては、制限酵素で消化した後に、断片をサイズ分画によって検出することを考慮すれば、上限値は、５０００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３０００ｂｐであり、更に好ましくは２０００ｂｐである。同様に下限値は、１００ｂｐが好ましく、より好ましくは２００ｂｐであり、更に好ましくは３００ｂｐである。ＰＣＲ法に用いるポリメラーゼの種類を当業者によく知られたものの中から適宜選択することにより、上述した長さを有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
　制限酵素による消化反応は、各制限酵素に至適な緩衝液を用い、至適な反応温度において実施することができる。また、制限酵素消化後の断片をサイズ分画して検出する方法としては、当業者に常用されるアガロースゲル電気泳動を好適に採用することができる。また、公知の適切なカラムを用いたＨＰＬＣ法により、断片をサイズ分画して検出することもできる。
　制限酵素によりポリヌクレオチドの切断が生じるか否かで遺伝子型を同定する方法の一例としては、ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｆＩの認識配列中に上記選抜用多型マーカーが含まれる、配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する選抜用多型マーカーを利用した方法が挙げられる。より具体的には、被検大麦種から抽出したＤＮＡを鋳型として、配列番号８及び配列番号９で特定される塩基配列を有するプライマー対を用いたＰＣＲ法によりポリヌクレオチドを増幅し、増幅したポリヌクレオチドを制限酵素ＢｇｌＩＩ及び制限酵素ＨｉｎｆＩで消化する。消化後の断片を４．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画すると、Ｈａｒｕｎａ型の被検大麦種は、サイズが２５１ｂｐ、９１ｂｐ及び５９ｂｐの３断片を生じる。一方、Ｋｅｎｄａｌｌ型の被検大麦種は、サイズが３８９ｂｐ及び５９ｂｐの２断片を生じ、Ｂａｒｋｅ型の被検大麦種は、サイズが２５１ｂｐ及び１５０ｂｐの２断片を生じる。
　本発明の一実施形態には、配列番号８及び配列番号９で特定される塩基配列を有するプライマー対を含むキットが挙げられる。上記選抜方法において、上記選抜用多型マーカーを含むポリヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅する態様において、本キットを好適に利用することができる。
　上記キットは、更に制限酵素を含むものであってよい。また、大麦種の組織からＤＮＡを抽出するためのキットを更に包含していてもよい。
　本発明はまた、上記選抜方法によってプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦種を提供する。後代系統は、上記プロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種のうち、Ｋｅｎｄａｌｌ型とＫｅｎｄａｌｌ型、又はＢａｒｋｅ型とＢａｒｋｅ型の大麦種間の交配によって得ることができ、また、Ｋｅｎｄａｌｌ型及びＢａｒｋｅ型の大麦種間の交配によっても得ることができる。これにより、プロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜した大麦種から、プロテインＺ７含有量の低い後代系統の大麦種を得ることができる。
　上述した選抜方法によって選抜された大麦種を、仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法において使用することができる。仕込工程で使用される大麦種は、上述の選抜方法によってプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種又はその交配後代系統の大麦種とすることが好ましい。
　上述の選抜方法によってプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種又はその交配後代系統の大麦種を製麦することにより麦芽を得ることができる。製麦は、一般に用いられている方法で行うことができる。具体的には、例えば、浸麦度が４０％～４５％に達するまで浸麦後、１０～２０℃で３～６日間発芽させ、焙燥して麦芽を得ることができる。
　上記仕込工程は、麦芽や大麦を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽や大麦を糖化させ、糖化された麦芽や大麦から麦汁を採取する工程である。この仕込工程には、上述の選抜方法によってプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種又はその交配後代系統の大麦種から得られた麦芽のみならず、これらの大麦種そのものを使用することもできる。また、原料には、上記麦芽や大麦以外に、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加してもよい。
　上記発酵工程は、前記麦汁にホップを添加し、煮沸、冷却した冷麦汁に酵母を添加して発酵させ麦芽発酵飲料（中間）品を得る工程である。ここで用いられる酵母は、例えば、サッカロミセス・パトリアヌス、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
　麦芽発酵飲料は、その製造に用いられる麦芽の使用比率の多少は特に制限されず、麦芽を原料の一部として発酵により製造される飲料であればよい。具体的には例えば、ビールや発泡酒が挙げられる。また、いわゆるノンアルコールビールやノンアルコール発泡酒も、ビール等と同様の製法を用いることから、麦芽発酵飲料である。
　後述するように、プロテインＺ７含有量とＮＩＢＥＭ値との間には負の相関関係があることが確認できており、上述の選抜方法によってプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種又はその交配後代系統の大麦種を原料として用いることにより、泡持ちのよい麦芽発酵飲料を製造することができる。
　以下、本発明を実施例に従って更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１：プロテインＺ７遺伝子座領域の未知配列の決定）
　大麦はるな二条種、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ種、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種、ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ種及びＢａｒｋｅ種の５種を、以下の実施例に用いた。
［ＤＮＡの抽出］
　上述したそれぞれの大麦種について、葉をＤＮＡソースとして、以下の方法でＤＮＡを抽出した。葉に抽出バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２５０ｍＭ　ＮａＣｌ，２５ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）とジルコニアボールを添加し、振とうした後、６０℃で３０分間保持した。遠心分離し、得られた上清に等量のイソプロパノールを添加してＤＮＡを析出させた。遠心分離し、得られた沈殿に７０％エタノールを添加して、再び遠心分離した。得られたＤＮＡの沈殿を滅菌水に溶解させ、このＤＮＡ溶液をＰＣＲの鋳型に用いた。
［プロテインＺ７遺伝子及びその上流域の塩基配列解析］
　プロテインＺ７の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）より５’側の未知配列を取得するため、ＴＡＩＬ　ＰＣＲ法を用いた。ＴＡＩＬ　ＰＣＲ法は、既知配列に隣接する未知配列を含む増幅産物を取得する方法の一つで、ランダムな塩基配列を有するランダムプライマーと既知配列に特異的に結合可能な塩基配列を有するプライマーを対とし、低アニーリング温度（４４℃）と高アニーリング温度（６８℃）を変化的に制御することで、非特異的産物の増幅を抑制し、既知配列に隣接する未知配列を含む産物を優先的に増幅させる方法である（例えば、植物のＰＣＲ実験プロトコール，７３－７９頁，秀潤社，１９９５年）。ＴＡＩＬ　ＰＣＲ法には以下のプライマーを用いた。なお特異的プライマー１～３はＮＣＢＩデータベースのプロテインＺ７遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ９５２７７）を参考にして決定した。
ランダムプライマー（配列番号４）；
　５’－ＧＴＮＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＴＴ－３’
特異的プライマー１（配列番号５）；
　５’－ＣＧＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＧＧＧＧ－３’
特異的プライマー２（配列番号６）；
　５’－ＧＧＴＣＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧ－３’
特異的プライマー３（配列番号７）；
　５’－ＧＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＣＡ－３’
　なお、特異的プライマー１～３は、“入れ子”となるように設計されており、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ法の利用により、プロテインＺ７の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）より５’側の未知配列を有するポリヌクレオチドを取得した。
　まず、上述した大麦種から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ランダムプライマーと特異的プライマー１を用い、以下に示すＰＣＲプログラムに従って、１回目のＰＣＲを行った。
　９４℃で１分間保持後、更に９５℃で１分間保持した。次に、９４℃で１分熱変性し、６５℃で１分間アニーリングした後、７２℃で３分間伸長反応を行うサイクルを５サイクル実施し、９４℃で１分間熱変性、３０℃で３分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応を行うサイクルを１サイクル実施した。次に、９４℃で３０秒間熱変性、６８℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、９４℃で３０秒間熱変性、６８℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、９４℃で３０秒間熱変性、４４℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、という９ステップで構成されるサイクルを、１５サイクル実施した。最後に７２℃で５分間伸長反応を実施した。
　１回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、ランダムプライマーと特異的プライマー２を用い、以下に示すＰＣＲプログラムに従って、２回目のＰＣＲを行った。
　９４℃で３０秒間熱変性、６８℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、９４℃で３０秒間熱変性、６８℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、９４℃で３０秒間熱変性、４４℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、という９ステップで構成されるサイクルを、１３サイクル実施した。最後に７２℃で５分間伸長反応を実施した。
　２回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、ランダムプライマーと特異的プライマー３を用い、２回目のＰＣＲと同様のＰＣＲプログラムに従って、３回目のＰＣＲを行った。このＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により解析し、検出された増幅ポリヌクレオチドをゲルから切り出した。プロテインＺ７遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から上流２９０～３３７ｂｐに渡る連続した未知配列領域を、上述したＴＡＩＬ　ＰＣＲ法により、ポリヌクレオチドとして増幅することができた。切り出した増幅ポリヌクレオチドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６）を用いて精製した後、これを鋳型としてシークエンス解析を行い、塩基配列を決定した。シークエンス解析は、Ｓｉｇｍａ社の委託解析サービスの利用により行った。はるな二条種、ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ種及びＢａｒｋｅ種に由来する塩基配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示した。
［プロテインＺ７遺伝子塩基配列の多重整列］
　はるな二条種、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ種、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種、ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ種及びＢａｒｋｅ種について、上記で決定した塩基配列を多重整列した（図１）。多重整列には、ＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．８（ＧＥＮＥＴＹＸ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）のアラインメント解析ツールを利用した。列の下に＊印のある列は、これら５種の大麦種全てで塩基種が一致した部位を示しており、＊印のない列はこれら５種の大麦種のいずれかで塩基種が異なっている部位を示している。
［多型マーカー］
　図１に示した多重整列の結果、５種類の大麦種間で塩基種が一致しない塩基部位が合計２６ヶ所存在しており、これらを多型マーカーとして特定した。具体的には、配列番号１で特定される塩基配列の第６２番目の塩基、第９３－９４番目の塩基の間（図１中のギャップに対応する）、第９４番目の塩基、第９６番目の塩基、第９８番目の塩基、第１１３番目の塩基、第１１６番目の塩基、第１２３番目の塩基、第１４８番目の塩基、第１５１番目の塩基、第１５３番目の塩基、第１５６番目の塩基、第１５９番目の塩基、第１６０－１８６番目の塩基の間、第２１７番目の塩基、第２３１番目の塩基、第２３９番目の塩基、第２４６－２４７番目の塩基の間、第２５３番目の塩基、第２６０番目の塩基、第２６２番目の塩基、第３０５－３０６番目の塩基、第３４３番目の塩基、第３７８番目の塩基、第３８６番目の塩基、第４２２番目の塩基に相当する塩基部位である。
　なお、はるな二条種、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ種、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ種は、全ての多型マーカーにおいて、同一の遺伝子型を有していた。
　特定した２６個の多型マーカーを表１の分類に従って分類した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 表２の遺伝子型１及び遺伝子型２欄中の略号は、それぞれ、Ｈ：Ｈａｒｕｎａ型、Ｋ：Ｋｅｎｄａｌｌ型、Ｂ：Ｂａｒｋｅ型の遺伝子型を意味する。
（実施例２：ＣＡＰＳマーカーの構築）
　選抜用多型マーカーの遺伝子型の判別を、特定の制限酵素により切断が生じるか否かにより行うことができれば、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）マーカーとして有用である。上述した多型マーカーのうち、配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目の塩基に相当する塩基部位において、遺伝子型１の大麦種（表２）は制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列（ＡＧＡＴＣＴ）を有している。同様に、第３４３番目の塩基に相当する塩基部位において、遺伝子型１の大麦種（表２）は制限酵素ＨｉｎｆＩ（ＧＡＮＴＣ）の認識配列を有している。これらの多型マーカーを用いてＣＡＰＳマーカーの構築を行った。
［配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目の塩基に相当する多型マーカー］
　配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目の塩基に相当する多型マーカーを含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化することにより、切断の有無で遺伝子型を同定できる。ＰＣＲ産物が切断されるのは、遺伝子型１（表２）を有する大麦種であり、ＰＣＲ産物が切断されないのは、遺伝子型２（表２）を有する大麦種である。
　大麦２３品種（はるな二条、みょうぎ二条、さつき二条、ゴールデンメロン、あかぎ二条、りょうふう、りょううん、ほしまさり、ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ　Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ、ＳｌｏｏｐＳＡ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、Ｂｅｔｚｅｓ、Ｂｒａｅｍａｒ、Ｔｒｉｕｍｐｈ、Ｈａｎｎａ、Ｐｒｉｏｒ種）について、実施例１と同様の方法によりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型とし、プライマーＣＡＰＳ１及びＣＡＰＳ２を用いてＰＣＲを行った。それぞれ約０．４ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩで消化し、消化後に電気泳動を行った。ＰＣＲ産物がＢｇｌＩＩで切断されたサンプルでは、サイズが約２５０ｂｐと約１５０ｂｐである、２つのＤＮＡ断片が検出された。これにより、ＰＣＲ産物がＢｇｌＩＩにより切断された大麦種と、切断されない大麦種とに分類することができた。
ＣＡＰＳ１（配列番号８）；
　５’－ＧＧＴＣＡＣＡＴＧＡＣＧＴＧＴＡＴＴＡＡＴＣＴＣＣ－３’
ＣＡＰＳ２（配列番号９）；
　５’－ＣＧＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＧＧＧＧ－３’
　［プロテインＺ７含有量の定量］
　２０００年、２００４年、２００８年に群馬県のサッポロビール社圃場で栽培された大麦種子をそれぞれミルで粉砕し、ＥＬＩＳＡ法でプロテインＺ７含有量を定量した。ＥＬＩＳＡ法は、タスマニア大学Ｅｖａｎｓ博士より提供されたプロテインＺ７特異的抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。ミルで粉砕した大麦種子５０ｍｇを２ｍＬスクリューキャップ付きチューブにとり、０．２８％Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）１ｍＬを添加し、一晩振とうした。この液の遠心上清を大麦種子タンパク質抽出液とした。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した後、ＥＬＩＳＡに供した。プロテインＺ７のＥＬＩＳＡはＥｖａｎｓらの方法に従って行った（非特許文献５）。種子のタンパク質含量のばらつきを考慮するため、プロテインＺ７含有量は（ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ）とした。表３にプロテインＺ７含有量の測定結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　ＮＡ：Ｎｏｔ　Ａｖａｉｌａｂｌｅ
　ＰＣＲ産物がＢｇｌＩＩにより切断された大麦種（遺伝子型１）と、切断されない大麦種（遺伝子型２）のプロテインＺ７含有量の平均値を比較することで、本ＣＡＰＳマーカーの有効性を検証した（図３）。その結果、２０００年産、２００４年産、２００８年産のいずれにおいても遺伝子型１の大麦種は、遺伝子型２の大麦種と比較して、危険率１％で有意にプロテインＺ７含有量が高かった。
プロテインＺ７含有量の平均値（２０００年）
　遺伝子型１；１８．５１±８．２６ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　遺伝子型２；８．６６±３．３０ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
プロテインＺ７含有量の平均値（２００４年）
　遺伝子型１；１９．３７±７．７９ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　遺伝子型２；８．８３±３．２０ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
プロテインＺ７含有量の平均値（２００８年）
　遺伝子型１；２２．９０±１１．９０ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　遺伝子型２；９．７６±３．４４ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　しかしながら、ＰＣＲ産物がＢｇｌＩＩで切断された遺伝子型１に属する被検大麦種を選抜しても、必ずしも全ての被選抜大麦種のプロテインＺ７含有量が高くはないという現象が観察された。すなわち、配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目の塩基に相当する多型マーカーは、被検大麦種をプロテインＺ７含有量の高い大麦種と、低い大麦種とに、確実に分類するための選抜マーカーとしては十分ではなかった。
［配列番号１で特定される塩基配列の第３４３番目の塩基に相当する多型マーカー］
　配列番号１で特定される塩基配列の第３４３番目の塩基に相当する多型マーカーを含むポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｆＩで消化することにより、ＰＣＲ切断の有無で遺伝子型を同定できる。ＰＣＲ産物が切断されるのは、遺伝子型１（表２）を有する大麦種であり、ＰＣＲ産物が切断されないのは、遺伝子型２（表２）を有する大麦種である。
　大麦２３品種（はるな二条、みょうぎ二条、さつき二条、ゴールデンメロン、あかぎ二条、りょうふう、りょううん、ほしまさり、ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ　Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ、ＳｌｏｏｐＳＡ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、Ｂｅｔｚｅｓ、Ｂｒａｅｍａｒ、Ｔｒｉｕｍｐｈ、Ｈａｎｎａ、Ｐｒｉｏｒ種）について、実施例１と同様の方法によりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型とし、プライマーＣＡＰＳ１及びＣＡＰＳ２を用いてＰＣＲを行った。それぞれ約０．４ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物をＨｉｎｆＩで消化し、消化後に電気泳動を行った。ＰＣＲ産物がＨｉｎｆＩで切断されたサンプルでは、サイズが約３５０ｂｐと約６０ｂｐである２つのＤＮＡ断片が検出された。これにより、ＰＣＲ産物がＨｉｎｆＩにより切断された大麦種と、切断されない大麦種とに分類することができた。
　プロテインＺ７含有量を上述のとおり測定した。ＰＣＲ産物がＨｉｎｆＩにより切断された大麦種（遺伝子型１）と、切断されない大麦種（遺伝子型２）のプロテインＺ７含有量の平均値を比較した（図４）。その結果、２０００年産、２００４年産、２００８年産のいずれにおいても遺伝子型１の大麦種の方が遺伝子型２の大麦種に比べてプロテインＺ７含有量の平均値が高い傾向が窺えたものの、統計上、有意な差はなかった。
プロテインＺ７含有量の平均値（２０００年）
　遺伝子型１；１３．７９±７．８６ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　遺伝子型２；７．３１±１．９８ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
プロテインＺ７含有量の平均値（２００４年）
　遺伝子型１；１３．５７±７．７４ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　遺伝子型２；８．８３±４．５６ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
プロテインＺ７含有量の平均値（２００８年）
　遺伝子型１；１７．４５±１１．５４ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　遺伝子型２；１０．７２±３．６３ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　実施例１で特定した多型マーカーのうち、配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する多型マーカーは、実施例２の結果より、それぞれ単独では制限酵素による切断の有無に基づいて、被検大麦種をプロテインＺ７含有量の高い大麦種と、低い大麦種とに、正確に分類するための選抜マーカーとしては十分ではなかった。
（実施例３：複数の多型マーカーの利用によるＣＡＰＳマーカーの構築）
　プライマーＣＡＰＳ１、ＣＡＰＳ２を用いてＰＣＲを行った産物をＢｇｌＩＩとＨｉｎｆＩの２種類の制限酵素で消化することによって、得られるＤＮＡ断片の数及びサイズが異なる３つのタイプに分類できると予想される（表４）。
　実施例２と同様に被検大麦種からＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを鋳型として、プライマーＣＡＰＳ１及びＣＡＰＳ２を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を２種類の制限酵素（ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｆＩ）で消化した。制限酵素消化後のＤＮＡ断片の４．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動の結果を図２に示した。約４００ｂｐにバンドが検出された大麦種をＫｅｎｄａｌｌ型とし、約２５０ｂｐ及び約９０ｂｐにバンドが検出された大麦種をＨａｒｕｎａ型とし、約２５０ｂｐ及び約１５０ｂｐにバンドが検出された大麦種をＢａｒｋｅ型とした。以上の結果から、本ＣＡＰＳマーカーで大麦プロテインＺ７の遺伝子型をＫｅｎｄａｌｌ型、Ｈａｒｕｎａ型、Ｂａｒｋｅ型の３種に分類できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例４：複数の多型マーカーを利用したＣＡＰＳマーカーの、プロテインＺ７含有量に基づく大麦種の選抜効果の検証）
　大麦２３品種（はるな二条、みょうぎ二条、さつき二条、ゴールデンメロン、あかぎ二条、りょうふう、りょううん、ほしまさり、ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ　Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ、ＳｌｏｏｐＳＡ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｂａｒｋｅ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、Ｂｅｔｚｅｓ、Ｂｒａｅｍａｒ、Ｔｒｉｕｍｐｈ、Ｈａｎｎａ、Ｐｒｉｏｒ種）について、実施例３で示したようにＣＡＰＳマーカーの遺伝子型を同定し、Ｋｅｎｄａｌｌ型、Ｈａｒｕｎａ型、Ｂａｒｋｅ型の３種に分類した。その遺伝子型とプロテインＺ７含量の関係を調べた。
［遺伝子型の分類とプロテインＺ７含有量の比較］
　実施例３で示したとおりに、ＣＡＰＳマーカーの遺伝子型を同定し、Ｋｅｎｄａｌｌ型、Ｈａｒｕｎａ型、Ｂａｒｋｅ型の３種に分類した各大麦種のプロテインＺ７含有量の平均値を比較することで、本ＣＡＰＳマーカーの有効性を検証した（図５）。２０００年産、２００４年産、２００８年産のいずれにおいてもＨａｒｕｎａ型の大麦種は、Ｋｅｎｄａｌｌ型の大麦種及びＢａｒｋｅ型の大麦種と比較して、危険率１％で有意にプロテインＺ７含有量が高かった（図５）。
プロテインＺ７含有量の平均値（２０００年）
　Ｈａｒｕｎａ型の大麦種；２３．３０±３．３７ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ｋｅｎｄａｌｌ型の大麦種；８．６６±３．３０ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ｂａｒｋｅ型の大麦種；７．３０±１．９８ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
プロテインＺ７含有量の平均値（２００４年）
　Ｈａｒｕｎａ型の大麦種；２２．３８±５．４７ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ｋｅｎｄａｌｌ型の大麦種；８．８３±３．２０ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ｂａｒｋｅ型の大麦種；８．８０±４．５６ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
プロテインＺ７含有量の平均値（２００８年）
　Ｈａｒｕｎａ型の大麦種；２８．９９±９．３７ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ｋｅｎｄａｌｌ型の大麦種；９．７６±３．４４ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ｂａｒｋｅ型の大麦種；１０．７０±３．６３ｎｇ／μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ
　また、被検大麦種を、上述したように、Ｈａｒｕｎａ型、Ｋｅｎｄａｌｌ型及びＢａｒｋｅ型の３種類に分類した結果、Ｈａｒｕｎａ型の被検大麦種は確実にプロテインＺ７含有量の高い大麦種であり、Ｋｅｎｄａｌｌ型及びＢａｒｋｅ型の被検大麦種は確実にプロテインＺ７含有量の低い大麦種であり、十分な選抜効果が示された。
　したがって、配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する多型マーカー２つの遺伝子型の判別に基づく、本ＣＡＰＳマーカーは、被検大麦種をプロテインＺ７含有量の高い大麦種と、低い大麦種とに、確実に分類するための選抜マーカーとして有効である。
　さらに、本実施例４の結果は、Ｈａｒｕｎａ型と遺伝子型が一致する被検大麦種はプロテインＺ７含有量の高い大麦種として選抜できること、Ｋｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型と遺伝子型が一致する被検大麦種はプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜できること、を示している。すなわち、本実施例４で得られた知見により、配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する多型マーカー２つのうち一方についてのみ遺伝子型の同定を行った場合でも、ＰＣＲ産物がＢｇｌＩＩで切断されない被検大麦種をＫｅｎｄａｌｌ型と一致する大麦種として選抜する、又はＰＣＲ産物がＨｉｎｆＩで切断されない被検大麦種をＢａｒｋｅ型と一致する大麦種として選抜することにより、プロテインＺ７含有量が低い被検大麦種を選抜することができる。
（実施例５：ビール中のプロテインＺ７含有量とＮＩＢＥＭ値の関係）
　４００Ｌパイロットプラントで１１品種（はるな二条、あまぎ二条、ミカモゴールデン、新田二条２１号、りょうふう、りょううん、北育４１号、ＣＤＣ　Ｋｅｎｄａｌｌ、ＣＤＣ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ、ＣＤＣ　Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｌｏｆｔｙ　Ｎｉｊｏ）の麦芽それぞれから単用で醸造された試験ビール合計４２点をサンプルとして用いた（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［試験ビール中のプロテインＺ７濃度の測定］
　ビール中プロテインＺ７の定量は、上述したＥＬＩＳＡ法によって行った。
［試験ビールのＮＩＢＥＭ値の測定］
　ＮＩＢＥＭ値の測定は、ＨＡＦＦＭＡＮＳ社のＮＩＢＥＭ－Ｔ装置、ＩＮＰＡＣＫ２０００及びＮＩＢＥＭ値測定用の標準グラスを用いて行った。具体的には、上記の試験ビールをそれぞれ２０℃の状態にし、泡注ぎ出し機により炭酸ガスを用いて標準グラスに注ぎ出し、生じた泡の高さの降下をＮＩＢＥＭ－Ｔ装置で追尾することにより測定した。
［ビール中プロテインＺ７濃度とＮＩＢＥＭ値の関係］
　麦芽単用ビール中のプロテインＺ７含量を測定し、ＮＩＢＥＭ値との関係を調べた（図６）。プロテインＺ７濃度とＮＩＢＥＭ値には有意な負の相関関係が見られた。一方、製麦工程中に蛋白質がどの程度分解されたかを示す指標の一つであるコールバッハ値（ＫＩ）及び、苦味の程度を表す指標で、ホップ中のイソα酸が関与しているとされるＢＵは泡持ちと深い関係があるとされている（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，６０巻，４７－５７頁，２００２年）。本解析に用いたビールサンプルはサンプル数が４２、用いた麦芽品種が１１、また表１のように麦芽ＫＩやビールＢＵのばらつきも大きい。麦芽ＫＩやＢＵは泡持ちと関係が深いと報告されているが、このようにＫＩやＢＵのばらつきの大きいサンプル集団でプロテインＺ７含量とＮＩＢＥＭ値が有意な相関関係を示したことから、プロテインＺ７はＮＩＢＥＭ値の有効なマーカーになることが示唆された。
　これまでにプロテインＺ７と泡持ちについて論じている報告は少ないが、Ｅｖａｎｓらは麦芽プロテインＺ７含量を調べた結果、泡持ちと有意な相関は見られなかったと報告している（非特許文献５）。統計解析を行う場合には用いるサンプル集団が非常に重要であることはよく知られている。Ｅｖａｎｓらが用いたサンプル集団のプロテインＺ７の最小値と最大値の比は４．８１であり、本研究で用いたサンプルの最小値と最大値の比（１６．７３）よりかなり低い。Ｅｖａｎｓらの用いたサンプル集団ではプロテインＺ７と泡持ちの関係を解明するには至らなかった可能性がある。
　すなわち、上記選抜用多型マーカーを利用して、プロテインＺ７含有量に基づいて大麦種を選抜する本発明の選抜方法は、泡持ちの良い大麦を育種する上でも、有用であることが示された。
　配列番号１；Ｈａｒｕｎａ型
　配列番号２；Ｋｅｎｄａｌｌ型
　配列番号３；Ｂａｒｋｅ型
　配列番号４～９；合成プライマー

Claims (14)

  1. 　プロテインＺ７含有量に基づいて大麦種を選抜する選抜方法であって、
    　被検大麦種において、
    　Ｈａｒｕｎａ型及びＫｅｎｄａｌｌ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＡ、並びに
    　Ｈａｒｕｎａ型及びＢａｒｋｅ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＢ、のそれぞれについて１つ以上の遺伝子型の同定を行い、以下の（ｉ）及び／又は（ｉｉ）を実施する選抜方法。
    　（ｉ）該同定した遺伝子型が、Ｈａｒｕｎａ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の高い大麦種として選抜する
    　（ｉｉ）該同定した遺伝子型が、Ｋｅｎｄａｌｌ型又はＢａｒｋｅ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜する
  2. 　プロテインＺ７含有量の低い大麦種を選抜する選抜方法であって、
    　被検大麦種において、
    　Ｈａｒｕｎａ型及びＫｅｎｄａｌｌ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＡ、並びに
    　Ｈａｒｕｎａ型及びＢａｒｋｅ型の大麦プロテインＺ７遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定される多型マーカーＢ、の少なくとも１つの遺伝子型の同定を行い、以下の（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）を実施する選抜方法。
    　（ｉｉｉ）該同定した多型マーカーＡの遺伝子型が、Ｋｅｎｄａｌｌ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜する
    　（ｉｖ）該同定した多型マーカーＢの遺伝子型が、Ｂａｒｋｅ型の遺伝子型と一致する被検大麦種をプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜する
  3. 　前記遺伝子型の同定は、
    　前記被検大麦種のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法で増幅された、前記多型マーカーＡ及び多型マーカーＢからなる群より選ばれる選抜用多型マーカーの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドにより行なわれる、請求項１又は２に記載の選抜方法。
  4. 　前記多型マーカーＡが、配列番号１で特定される塩基配列の第６２番目、第９３－９４番目、第９４番目、第９６番目、第９８番目、第１１３番目、第１１６番目、第１２３番目、第１４８番目、第１５１番目、第１５３番目、第１５６番目、第１５９番目、第１６０－１８６番目、第２１７番目、第２３１番目、第２３９番目、第２４６－２４７番目、第２５３番目、第３０５－３０６番目、第３７８番目又は第４２２番目の塩基に相当する塩基部位である、請求項１～３のいずれか一項に記載の選抜方法。
  5. 　前記多型マーカーＢが、配列番号１で特定される塩基配列の第２６０番目、第２６２番目、第３０５－３０６番目、第３４３番目、第３７８番目、第３８６番目又は第４２２番目の塩基に相当する塩基部位である、請求項１～４のいずれか一項に記載の選抜方法。
  6. 　前記選抜用多型マーカーの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドを、認識配列中に前記選抜用多型マーカーの少なくとも１つを含む１種又は２種以上の制限酵素で消化して得られる断片の数及び／又はサイズに基づいて、前記遺伝子型の同定を行う、請求項３に記載の選抜方法。
  7. 　前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する選抜用多型マーカーを含み、前記制限酵素が、ＢｇｌＩＩ及び／又はＨｉｎｆＩである、請求項６に記載の選抜方法。
  8. 　前記ポリヌクレオチドが、配列番号８及び配列番号９で特定される塩基配列を有するプライマー対を用いて被検大麦種のゲノムＤＮＡからＰＣＲ法により増幅されるものであり、前記制限酵素が、ＢｇｌＩＩ及び／又はＨｉｎｆＩである、請求項６又は７に記載の選抜方法。
  9. 　配列番号１で特定される塩基配列の第２５３番目及び第３４３番目の塩基に相当する選抜用多型マーカーを含む、被検大麦種のゲノムＤＮＡからＰＣＲ法により増幅されるポリヌクレオチド。
  10. 　前記ＰＣＲ法が、配列番号８及び配列番号９で特定される塩基配列を有するプライマー対を用いるものである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
  11. 　配列番号８及び配列番号９で特定される塩基配列を有するプライマー対を含むプロテインＺ７含有量に基づく大麦種選抜用キット。
  12. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の選抜方法によってプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦種。
  13. 　仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、
    　前記仕込工程で使用される大麦種が、請求項１～８のいずれか一項に記載された選抜方法によりプロテインＺ７含有量の低い大麦種として選抜された大麦種及び／又は請求項１２に記載の交配後代系統の大麦種である、麦芽発酵飲料の製造方法。
  14. 　請求項１３に記載の製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料。
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