CN118147338A - 一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法及其检测试剂盒 - Google Patents

一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法及其检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN118147338A
CN118147338A CN202211548405.XA CN202211548405A CN118147338A CN 118147338 A CN118147338 A CN 118147338A CN 202211548405 A CN202211548405 A CN 202211548405A CN 118147338 A CN118147338 A CN 118147338A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
dao
long
snp
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211548405.XA
Other languages
English (en)
Inventor
肖玲
唐怡雯
龚漪雯
牛其文
李燕艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Original Assignee
Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd filed Critical Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority to CN202211548405.XA priority Critical patent/CN118147338A/zh
Publication of CN118147338A publication Critical patent/CN118147338A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了水稻龙稻208水稻SNP标记及其应用。其中，SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失。本发明的SNP标记与水稻品种紧密相关，能够有效用于定性或定量检测龙稻208水稻品种。

Description

一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法 及其检测试剂盒
技术领域
本发明涉及SNP标记及其应用，尤其涉及一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法及其检测试剂盒。
背景技术
龙稻208是黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所选育，属于粳型常规水稻，香稻品种，适宜在黑龙江省第一积温带≥10℃活动积温2800℃区域种植。该品种符合国家稻品种审定标准，2020年黑龙江审定，审定编号：黑审稻20200051。该品种主茎14片叶，长粒型，株高100.3厘米左右，穗长20.8厘米左右，每穗粒数130粒左右，千粒重26.5克左右。
该品种以五优稻4号为母本，绥粳4号为父本，系谱方法选育而成，粒型和五优稻4号一致，感官上不易和五优稻4号区分。五优稻4号即稻花香2号，品质好，在市场上深受广大消费者的青睐，需求量不断增加，但五优稻4号产量低，价格较高，使得有些人将粒型外观相近的龙稻208等稻米掺杂到五优稻4号稻米中销售。因此，如何简单、准确而又快速地鉴定五优稻4号中的龙稻208成为目前的难题。
一般辨别龙稻208的方法主要是通过口感咀嚼食味值等方法，但是这些方法的主观性强，准确性较差，更难以实现龙稻208纯度的定量检测。对水稻品种的鉴定可以通过标准NY/T 1433-2014水稻品种鉴定技术规程SSR标记，或NY/T 2745-2015水稻品种鉴定SNP标记法进行，但这两种鉴定方法不仅繁琐复杂，耗时长，而且也只能进行定性的纯度检测，无法进行掺伪的定量判断。米业公司在收购稻谷时对品种鉴定有明确需求，希望能有简单容易操作、用时短的方法鉴定水稻品种，来确保收购的稻谷纯度。
发明内容
本发明提出了一种与龙稻208水稻品种相关、能够有效用于水稻品种检测的SNP标记，利用该SNP标记设计高效灵敏的龙稻208水稻特异性引物和探针，对样本DNA进行检测，从而实现对龙稻208水稻品种纯度进行定量判断，有效地解决了龙稻208水稻品种中掺入其它水稻品种的定量鉴别的难题。
具体而言，本发明提供一种分离的来自水稻的核酸分子，其含有SNP标记，SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的长度至少5bp的片段。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度至少10bp、15bp、20bp、30bp、40bp、50bp、64bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、640bp、700bp、800bp、900bp、1kb。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度为10bp-640bp、50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列至少包括SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列包括在SEQ ID NO:6的一端或两端延伸的序列，所述序列优选具有103bp，所述序列例如可以是包含SEQ ID NO:7所示的序列。
TTTAAATTAAACCGGTACATATAGGTTTGTCCCGTAGTGGCCGAATGAACTATAGATGCCTCTTTTTTTGTTAATAACCAGAACCTAAAGTATTGGTGCCGGTTTTGTCTCTAACCCGCACTTAATAATTGATAATAGGTGCCAGTTTTGCTTTAAACCTGTATCTTTAGGCTGGTACCTATTTAGAATTCCGTAGTAGCGGTGGTTACCGCGATAACTACGCGGTTATCGCGAGATATATCATGGTTTTAAAAACTGAAAAGGTTACCACACGTGATAACCGCGATAACCACACGGTCTGTTTCTGCGATCTTGTAAAATATAACCATGACAAACAATAGATCAATCCGGAGTTTCAACCTAATCGACCTAGCGGCCAACATCGCGAATGGGCTAGAATTGAAGTTTTCAACCGCACCAGCCTTTCCTAACCAAATCACAATGAATTTATGGGCATGTAATTTATACCCTTTTCATATAATATCATTGTTTTCCTTTTTTCTAAAAAAAAGCTCATACTACTATGCTTATATACTTATCTC TATAAATGTACACACATGTATCATACATTATAATTACCTCTGAAGATTAGA
本发明还提供用于检测水稻基因组中SNP标记的引物，其中，SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:1和2作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第42位核苷酸前的11个碱基TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述引物选自：(1)SEQ ID NO:1和2所示的序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:5或6杂交的序列或与其有至少90％相同性的序列；(2)(1)所述序列的混合物。
本发明还提供用于检测水稻基因组SNP标记的探针，其中，SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:1和2作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第42位核苷酸前的11个碱基TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，探针包括(1)识别SEQ ID NO:5或其片段的非龙稻208水稻探针，所述片段包含SEQ ID NO:5自5’端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG。
在一个或多个实施方案中，探针还包括(2)识别SEQ ID NO:6或其片段的龙稻208水稻探针，所述片段缺失SEQ ID NO:5自5’端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG。
在一个或多个实施方案中，探针识别SEQ ID NO:5或6或其片段，所述片段包含或缺失SEQ ID NO:5自5’端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG。示例性地，探针包括以下的一种或多种：(1)识别SEQ ID NO:5或其片段的探针，所述片段包含SEQ ID NO:5自5’端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG；(2)识别SEQ ID NO:6或其片段的探针，所述片段缺失SEQ IDNO:5自5’端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG，(3)(1)或(2)的互补序列。优选地，所述探针具有(1)SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列或在高度严谨条件下与SEQ ID NO:5-6中任一杂交的序列或与之具有70％序列相同性的突变体，或(2)(1)的互补序列。
本发明还提供一种试剂盒，其含有用于检测水稻基因组中SNP标记的试剂，其中，SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:1和2作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含检测SNP标记的引物和任选的检测SNP标记的探针和任选的具有SNP标记的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：本文任一实施方案所述的引物，任选的本文任一实施方案所述的探针和任选的本文任一实施方案所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：SEQ ID NO:1和2所示的序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:5或6杂交的序列或与之具有至少90％相同性的序列或其互补序列，和任选的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列至少包括SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或其互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含：SEQ ID NO:1和2所示的序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:5或6杂交的序列或与之有至少90％相同性的序列或其互补序列，和任选的SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:5-6中任一杂交的序列或与之具有70％序列相同性的突变体或其互补序列。
本发明还提供鉴别水稻品种的方法，包括(1)检测水稻基因组中的一SNP标记，该位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失，(2)根据SNP鉴定水稻品种，其中，所述SNP为缺失TATAAATCTTG则鉴定为龙稻208水稻，否则鉴定为非龙稻208水稻。
在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:1和2作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括根据检测到的SNP鉴别水稻品种，其中，龙稻208水稻的SNP为缺失TATAAATCTTG，非龙稻208水稻的SNP为不缺失TATAAATCTTG。
在一个或多个实施方案中，所述检测包含PCR，更优选地，所述检测是荧光定量PCR或HRM检测。
本发明还提供检测样品中龙稻208水稻含量或纯度的方法，所述方法包括扩增该水稻基因组中SNP标记的序列的步骤，其中，SNP位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:1和2作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括根据SNP标记的扩增结果确定龙稻208水稻含量或纯度。其中，SNP为缺失TATAAATCTTG的扩增结果指示龙稻208水稻的含量或纯度；SNP为包含TATAAATCTTG的扩增结果指示非龙稻208水稻的含量或比例。
在一个或多个实施方案中，所述扩增是荧光定量PCR，所述方法还包括根据扩增结果利用2-ΔΔCT方法确定龙稻208水稻的含量或纯度。
更优选地，所述2-ΔΔCT方法包括：比较样品中识别SNP标记的探针的CT值与内源参照探针的CT值，并将比较结果与对照的ΔCT相比，利用得到的ΔΔCT确定龙稻208水稻的含量或纯度。
具体地，检测样品中龙稻208水稻含量或纯度的方法包括：荧光定量PCR检测识别SNP标记的探针的CT值和识别内源参照的探针的CT值，二者相减后得到样品ΔCT，将样品ΔCT与对照的ΔCT相减得到ΔΔCT，所述对照是100％龙稻208水稻或100％非龙稻208水稻样品，和对ΔΔCT的负数进行2次方得到相对含量数值，用于样品中龙稻208水稻和非龙稻208水稻的定量判断。在一个或多个实施方案中，识别SNP标记的探针具有SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。在一个或多个实施方案中，识别内源参照的探针具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
本发明还提供检测水稻基因组中的SNP标记的试剂在鉴别水稻品种或检测水稻中龙稻208水稻含量或纯度中的用途，或在制备用于鉴别水稻品种或检测水稻中龙稻208水稻含量或纯度的试剂盒中的用途，其中，所述SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:1和2作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第42位前11个碱基TATAAATCTTG的缺失。
在一个或多个实施方案中，所述试剂包含本文任一实施方案所述的引物和任选的本文任一实施方案所述的探针和任选的本文任一实施方案所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，根据检测到的SNP鉴别水稻品种，其中，龙稻208水稻的SNP为缺失TATAAATCTTG，非龙稻208水稻的SNP为不缺失TATAAATCTTG。
附图说明
图1：龙稻208水稻和非龙稻208水稻HRM检测与荧光探针法检测引物探针位置图。
图2：龙稻208水稻和其它非龙稻208水稻品种HRM分型图。
图3：龙稻208水稻和非龙稻208水稻不同含量标样定量数据图。A图从左到右依次为：0％龙稻208水稻标样，5％龙稻208水稻标样，50％龙稻208水稻标样，95％龙稻208水稻标样，100％龙稻208水稻标样。B图从左到右依次为：100％非龙稻208水稻标样，95％非龙稻208水稻标样，50％非龙稻208水稻标样，5％非龙稻208水稻标样，0％非龙稻208水稻标样。
图4：龙稻208水稻盲样纯度检测。从左到右依次为：0％龙稻208标样，5％龙稻208标样，50％龙稻208标样，95％龙稻208标样，100％龙稻208标样，样品1。
具体实施方式
发明人通过对龙稻208水稻品种的SSR高通量测序，比对出龙稻208水稻区别与其它水稻品种的特异序列，通过龙稻208水稻与其它水稻品种特异位点核酸序列的特异性检测，来判断龙稻208水稻中是否掺入其它水稻，并引入内源参照基因与参照样本进行龙稻208水稻掺伪的定量分析。
具体地，本发明涉及与水稻品种相关的SNP标记，用于检测所述SNP标记的引物和试剂盒，所述SNP标记、引物、试剂盒在水稻品种检测中的用途，以及检测水稻品种的方法。
发明人发现水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失或不缺失的SNP与水稻品种相关。具体地，SNP是如下所示核苷酸序列自5’端起第42位前11个碱基的缺失。
具体地，可用如下序列来表示：
CACGTGATAACCGCGATAACCACACGGTCT###########GTTTCTGCGA TCTTGTAAAATATAACCATGACAAACAATAGATCAATCCGGAGTTTCAACC TAATCGACCTAG，其中“###########”代表“TATAAATCTTG”缺失或不缺失；
普通水稻基因组的序列包含“TATAAATCTTG”，如下所示：
CACGTGATAACCGCGATAACCACACGGTCTTATAAATCTTGGTTTCTGC GATCTTGTAAAATATAACCATGACAAACAATAGATCAATCCGGAGTTTCAA CCTAATCGACCTAG(SEQ ID NO:5)
龙稻208水稻基因组的序列缺失“TATAAATCTTG”，如下所示：
CACGTGATAACCGCGATAACCACACGGTCTGTTTCTGCGATCTTGTAAA ATATAACCATGACAAACAATAGATCAATCCGGAGTTTCAACCTAATCGACC TAG(SEQ ID NO:6)
本文中，SNP(single nucleotide polymorphism，SNP，即单核苷酸多态性)是一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性通常仅涉及到单个碱基的变异，例如转换、颠换、插入和缺失等。
本文中，水稻品种指经选育而具有不同性状的水稻品系。发明人发现，龙稻208水稻的SNP为缺失TATAAATCTTG，非龙稻208水稻的SNP为不缺失TATAAATCTTG。因此，通过检测样品中的上述SNP能够有效地确定水稻品种是龙稻208水稻还是非龙稻208水稻。
本文所述“样品”是来自对象的任意类型的含多核苷酸的样品。优选地，本文所述样品来自或包含水稻植物器官、组织、细胞、核酸或包含水稻植物器官、组织、细胞、核酸的产品，包括但不限于水稻叶片、根、茎、花、果实、种子、细胞、DNA、RNA、大米、碎米、米糠、稻壳、加工或未加工的大米食物例如米粉、米线。DNA可以是基因组DNA。
术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸聚合物(RNA)，及其互补物。核酸含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式。本文考虑的多核苷酸的示例包括单链和双链DNA，单链和双链RNA，以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。DNA可以是编码链或非编码链。在一个或多个实施方案中，所述样品包含经片段化的基因组DNA。获取基因组DNA并片段化的方法本领域周知。
DNA基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。每个脱氧核糖核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基组成。DNA的碱基(bp)主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在双链DNA的双螺旋结构中，A与T经氢键配对，G与C经氢键配对。DNA形式包括cDNA、基因组DNA、片段化DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以为任意长度，例如50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
本文所述“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，引导合成的一种具有特定核苷酸序列的核酸分子。引物组合物包含一种或多种引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(PCR)、qPCR、测序和探针合成等。引物可以为任意长度，例如5-200bp，10-100bp，20-800bp或25-50bp。
本发明引物用于检测SNP。所述引物可以是识别SEQ ID NO:5-6中任一的核酸分子。在一些实施方式中，引物具有(1)SEQ ID NO:1-2中任一项所示的核苷酸序列或与之具有至少70％序列相同性的突变体，或(2)(1)的互补序列。在一个或多个实施方案中，引物是引物对，引物对分别具有SEQ ID NO:1和2所示序列。在讨论引物时，本文所述“识别”指引物与模板序列在严谨或高度严谨条件下杂交，并且成对引物所扩增的片段涵盖或缺失SEQ IDNO:5自5’端起第42位前的碱基TATAAATCTTG。本文所述核酸杂交的严谨条件本领域技术人员已知。优选地，所述条件是使得序列彼此至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％同源，通常保持彼此杂交。严谨杂交条件的非限制性实例是在含有6xSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1m MEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficolll、0.02％BSA和500mg/ml变性鲑鱼精子DNA的高盐缓冲剂中在65℃杂交，和任选的在0.2xSSC、0.01％BSA中50℃洗涤一次或两次。
本发明也可采用探针来检测本发明所述的SNP。本文所述“探针”是识别目的序列(与目的序列互补)的核酸序列(DNA或RNA)。探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，从而显示目的基因。探针可以包括整个目的序列，也可以是目的序列的片段。探针可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。通常，探针带有检测标记，例如荧光标记。所述荧光标记包括但不限于FAM、CY5和VIC。本领域知晓适用于本文探针的荧光标记以及将其与探针连接的方法。
本文中，探针包括识别SEQ ID NO:5或其片段的非龙稻208水稻探针，所述片段包含SEQ ID NO:5自5’端起第42位前的碱基TATAAATCTTG。任选地，探针还可包括识别SEQ IDNO:6或其片段的龙稻208水稻探针，所述片段缺失SEQ ID NO:5自5’端起第42位前的碱基TATAAATCTTG。
在一个或多个实施方案中，探针包括(1)识别SEQ ID NO:5或其片段的非龙稻208水稻探针，所述片段包含SEQ ID NO:5自5’端起第42位前的碱基TATAAATCTTG。探针还可包括(2)识别SEQ ID NO:6或其片段的龙稻208水稻探针，所述片段缺失SEQ ID NO:5自5’端起第42位前的碱基TATAAATCTTG。
示例性地，探针包括选自以下的一种或多种：(1)识别SEQ ID NO5或其片段的探针，所述片段包含SEQ ID NO:5自5’端起第42位前的碱基TATAAATCTTG，(2)识别SEQ ID NO:6或其片段的探针，所述片段缺失SEQ ID NO:5自5’端起第42位前的碱基TATAAATCTTG，(3)(1)或(2)的互补序列。在讨论探针时，本文所述“识别”指探针与模板序列在严谨或高度严谨条件下杂交，并且所述杂交涵盖或缺失SEQ ID NO:5自5’端起第42位前的碱基TATAAATCTTG。
本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸杂交能力的多核苷酸。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列(如本文所述的SEQ ID NO:1-8)具有至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性的核苷酸序列。可采用例如NCBI的BLASTn计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在参照序列的和核苷酸序列中具有一个或多个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多个突变通常指1-10个以内，例如1-8个、1-5个或1-3个。取代可以是嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸之间的取代，也可以是嘌呤核苷酸之间或嘧啶核苷酸之间的取代。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的核苷酸进行保守性取代时，通常不会改变多核苷酸的稳定性和功能。保守性取代例如嘌呤核苷酸之间的(A与G)的互换，嘧啶核苷酸之间的(T或U与C)的互换。因此，在本发明多核苷酸中用来自同一残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。当提及与本发明所述的引物(如SEQ ID NO:1-2)或探针(如SEQ ID NO:3-4)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％序列相同性的突变体时，优选地，这些突变体在高严谨条件下可与包含SEQ ID NO:5或6的相对应的DNA序列杂交。所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
本发明另一方面提供检测样品中水稻品种的方法，包括通过对待测样品进行本文所述的SNP标记的检测，确定或定量水稻品种。所述方法进一步包括：(1)提取待测样品的DNA；(2)利用本文所述的引物和/或探针，确定或定量所述DNA中的本文所述SNP标记的基因型；和(3)基于(2)的结果，确定或定量水稻品种。其中，SNP为缺失TATAAATCTTG的水稻品种为龙稻208水稻，用本领域检测SNP的常规方法即可检测并鉴定龙稻208水稻，例如荧光定量探针法或HRM高分辨率溶解曲线法，这些方法的过程和所用试剂本领域周知。
在一个或多个实施方案中，非龙稻208水稻组包括：五优稻4号、辽星1号，龙洋16，绥粳18，盐丰47，松粳22，北稻7，通院香518，富尔稻1号，龙庆稻21，齐粳10和南粳9108等。
本文中，提取样品中DNA的方法不受特别限制，本领域周知适用于本文的DNA提取方法。
本领域周知适用于本文的SNP标记检测方法，包括但不限于：测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)、实时荧光定量PCR与高分辨率熔解曲线分析(HRM)、荧光探针法定量PCR、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)及飞行时间质谱等。本领域知晓SNP标记检测方法中所需的除引物和/或探针以外的其他试剂。
根据本发明的一些具体示例，通过对待测样品进行本文所述的SNP标记的检测来确定或定量水稻品种的方法，进一步包括：提取样品中的DNA；利用引物SEQ ID NO:1和2，进行DNA的荧光定量PCR，获得扩增产物；对所述扩增产物进行HRM分析，获得所述DNA中的本文所述SNP标记的基因型；以及基于所述SNP标记的基因型，确定或定量水稻品种。
根据本发明的另一些具体示例，通过对待测样品进行本文所述的SNP标记的检测来确定或定量水稻品种的方法，进一步包括：提取样品中的DNA；利用引物SEQ ID NO:1和2，探针SEQ ID NO:3和4，以及参照探针SEQ ID NO:10，进行DNA的荧光定量PCR；分析PCR结果，获得所述DNA中的本文所述SNP标记的基因型；以及基于所述SNP标记的基因型，确定或定量水稻品种。
例如，检测样品中龙稻208水稻含量或纯度的方法包括：荧光定量PCR检测识别SNP标记的探针的CT值和识别内源参照的探针的CT值，二者相减后得到样品ΔCT，将样品ΔCT与对照的ΔCT相减得到ΔΔCT，所述对照是100％龙稻208水稻或100％非龙稻208水稻样品，和对ΔΔCT的负数进行2次方得到相对含量数值，用于样品中龙稻208水稻和非龙稻208水稻的定量判断。在一个或多个实施方案中，识别SNP标记的探针具有SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。在一个或多个实施方案中，识别内源参照的探针具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种试剂盒，其含有用于检测本发明所述的水稻基因组中的SNP标记的试剂，其中，所述水稻基因组SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:1和2作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的包含或缺失SEQ ID NO:5自5’末端起第42位前的碱基TATAAATCTTG。所述试剂可以是本文任一实施方案所述的引物和/或探针。任选地，该试剂盒还包括本发明所述的核酸分子(即扩增产物)，该核酸分子可用作内标或阳性对照。优选地，所述引物选自：(1)SEQ ID NO:1和2所示的序列或与其有至少90％相同性的序列；(2)(1)所述序列的混合物或互补序列。所述探针选自：(1)SEQ ID NO:3和4所示的序列或与其有至少90％相同性的序列；(2)(1)所述序列的互补序列。优选地，所述探针具有荧光标记，如分别被FAM荧光、VIC荧光和CY5荧光标记。试剂盒中还可含有实施PCR所需的各种试剂，如缓冲液、酶、dNTP等。
在一优选的实施方案中，本发明的试剂盒含有：SEQ ID NO:1和2所示的引物序列。在另一优选的实施方案中，本发明的试剂盒含有：SEQ ID NO:3所示的探针，其由FAM荧光标记；SEQ ID NO:4所示的探针，其由VIC荧光标记；SEQ ID NO:10所示的探针，其由CY5荧光标记。
本发明SNP标记及其应用的优点：
本发明可以定性或定量检测龙稻208水稻品种中其它水稻品种的掺入量。本发明利用分子生物学方法定量检测龙稻208水稻掺伪，适用水稻种子，水稻和大米等产品，从样本中快速提取DNA，用开发的高效灵敏的龙稻208水稻特异荧光探针和引物进行荧光定量PCR扩增，通过设置内源参照基因与参照样本再对扩增数据进行定量分析，从而对龙稻208水稻纯度进行定量判断。结果直观客观，可避免人为判断，操作方便快捷，定量限达到5％，可大大减少错误判断的概率，且不受品种、地域、环境等带来的影响，检测更灵敏更高效。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中未具体描述的材料、试剂和方法，均未本领域常规的材料、试剂和方法。
实施例
实施例1：材料和方法
1.材料
龙稻208水稻种子、其它水稻品种种子与水稻样本均市购获得。
2.酶与试剂
2×GoldStar Best MasterMix酶购自康为世纪公司，SsoAdvancedTMGreen Supermix酶购自Bio-Rad公司，试剂购自国药集团化学试剂有限公司，荧光定量PCR仪Bio-Rad CFX96；实验中用到的引物和探针均由上海生工生物工程公司合成。
3.实验方法
3.1水稻种子DNA提取
使用研磨机把20克水稻种子磨碎，称取50mg粉末到2mL样品裂解管中，加入500μLBuffer 1(0.4M NaCl，0.1％ SDS，0.1M Tris，0.5％高温淀粉酶(购自山东隆大生物工程有限公司)，pH8.0)，涡旋仪振荡混匀30s，52℃下孵育30min，转速12000rpm；加入500μLBuffer 2(0.1M Tris-HCL ph 7.0)，涡旋仪振荡混匀30s，将混合物离心5min(12000rpm)，吸取500μL上清备用，提取所得DNA溶液用灭菌纯水稀释10倍为模板DNA，置于样品稀释管中备用，4℃短期存放，-20℃长期保存。
3.2龙稻208水稻特异性引物与探针设计
针对龙稻208水稻品种特异片段序列，primer5设计特异性引物。
HRM高分辨率熔解曲线法检测引物：
LD208-209-DF2：5’-CACGTGATAACCGCGATAAC-3’(SEQ ID NO:1)；
LD208-209-DR2：5’-CTAGGTCGATTAGGTTGAAACTC-3(SEQ ID NO:2)；
探针检测法引物：
LD208-209-DF2：5’-CACGTGATAACCGCGATAAC-3’(SEQ ID NO:1)；
LD208-209-DR2：5’-CTAGGTCGATTAGGTTGAAACTC-3(SEQ ID NO:2)；
设计探针：
FLD208-209-FAM-P2：5’-FAM–CACGGTCTTATAAATCTTGGTTTCTG–BHQ1 -3’(SEQ IDNO:3)；
LD208-209-VIC-P3:5’-VIC–CACGGTCTGTTTCTGCGATC–BHQ1 -3’(SEQ ID NO:4)。
HRM高分辨率熔解曲线法检测引物扩增片段：
非龙稻208水稻核酸序列(114bp)：
CACGTGATAACCGCGATAACCACACGGTCTTATAAATCTTGGTTTCTG CGATCTTGTAAAATATAACCATGACAAACAATAGATCAATCCGGAGTTTCA ACCTAATCGACCTAG(SEQ ID NO:5，图1)
龙稻208水稻核酸序列(103bp)：
CACGTGATAACCGCGATAACCACACGGTCTGTTTCTGCGATCTTGTAA AATATAACCATGACAAACAATAGATCAATCCGGAGTTTCAACCTAATCGAC CTAG(SEQ ID NO:6，图1)
探针法检测引物扩增片段：
非龙稻208水稻核酸序列(114bp)：
CACGTGATAACCGCGATAACCACACGGTCTTATAAATCTTGGTTTCTG CGATCTTGTAAAATATAACCATGACAAACAATAGATCAATCCGGAGTTTCA ACCTAATCGACCTAG(SEQ ID NO:5，图1)
龙稻208水稻核酸序列(103bp)：
CACGTGATAACCGCGATAACCACACGGTCTGTTTCTGCGATCTTGTAA AATATAACCATGACAAACAATAGATCAATCCGGAGTTTCAACCTAATCGAC CTAG(SEQ ID NO:6，图1)
水稻内源基因PLD引物：
PLD-F：5’-TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT-3’(SEQ ID NO:8)；
PLD-R：5’-CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC-3’(SEQ ID NO:9)。
水稻内源基因actin探针：
PLD-CY5-P：5’-CY5-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1 -3’。(SEQ ID NO:10)。
实施例2：HRM高分辨率熔解曲线法实时荧光定量PCR检测
以提取的DNA为模板，采用HRM高分辨率熔解曲线法检测引物对LD208-209-DF2和LD208-209-DR2进行实时荧光定量PCR扩增。PCR反应体系为20μL，其中SsoAdvancedTMGreen Supermix 10μL，LD208-209-DF2和LD208-209-DR2引物(浓度为10μM)各0.5μL，模板DNA(浓度为50-100ng/μL)2μL，无菌水补齐至20μL。空白对照以无菌水代替模板DNA。每个反应做三个重复，PCR扩增程序采用两步法：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火延伸1分钟，共45个循环。
实时荧光PCR扩增完成后，将扩增产物直接应用Bio-Rad进行HRM高分辨率熔解曲线读取，HRM高分辨率熔解曲线熔解过程：95℃1min，70℃1min，然后以0.2℃/0.1s的速度从70℃升温至95℃，收集熔解曲线数据，用于Precision Melt Analysis Software分析软件进行HRM高分辨率熔解曲线分型。
以提取的不同水稻品种样品的DNA为模板，使用HRM高分辨率熔解曲线法检测引物对LD208-209-DF2和LD208-209-DR2进行实时荧光定量PCR扩增，再进行HRM高分辨率熔解曲线读取，用Precision Melt Analysis Software分析软件进行HRM高分辨率熔解曲线分型，结果显示(图2)，龙稻208水稻品种有特异的HRM曲线，和其它水稻的HRM分型不同，非龙稻208水稻其它品种水稻组包括的水稻有：五优稻4号、辽星1号，龙洋16，绥粳18，盐丰47，松粳22，北稻7，通院香518，富尔稻1号，龙庆稻21，齐粳10和南粳9108等。
实施例3：探针法实时荧光定量PCR检测
以提取的DNA为模板，使用龙稻208水稻探针法检测引物：LD208-209-DF2和LD208-209-DR2，龙稻208水稻特异探针LD208-209-VIC-P3，和非龙稻208水稻特异探针FLD208-209-FAM-P2，与内源参照基因PLD探针PLD-F和PLD-R进行实时荧光PCR检测。PCR反应体系为20μL，其中2×GoldStar Best MasterMix 10μL，LD208-209-DF2和LD208-209-DR2引物(浓度为10μM)1μL，PLD-F和PLD-R引物(浓度为10μM)各0.4μL，FLD208-209-FAM-P2探针(浓度为10μM)和LD208-209-VIC-P3探针(浓度为10μM)各0.25μL，PLD-CY5-P探针(浓度为10μM)0.2μL，模板DNA 2μL，无菌水补齐至20μL。空白对照以无菌水代替模板DNA。每个反应做三个重复，PCR扩增程序采用两步法：95℃预变性10min；95℃变性15s；60℃退火延伸45s，共45个循环。
首先对探针法进行特异性分析，龙稻208水稻特异性探针LD208-209-VIC-P3只在龙稻208水稻品种中有扩增信号，其它水稻品种均没有扩增信号，非龙稻208水稻探针FLD208-209-FAM-P2在非龙稻208水稻的水稻品种中有扩增信号，龙稻208水稻中没有扩增信号。对荧光定量PCR数据进行分析，可分别进行水稻样品中龙稻208水稻和非龙稻208水稻品种含量的定量。基因表达数据处理采用2-ΔΔCT方法进行，以水稻PLD基因的PLD-CY5-P探针为内源参照基因，将样品中LD208-209-VIC-P3和FLD208-209-FAM-P2探针的CT值与PLD-CY5-P探针的CT值相减后的值ΔCT，再与100％龙稻208水稻或100％非龙稻208水稻含量的参照样本的ΔCT相减，得到的ΔΔCT的负数进行2次方得到一个相对含量的数值，分别用于水稻样品中龙稻208水稻和非龙稻208水稻品种含量的定量判断。
以提取的不同含量标准样品的DNA为模板，使用引物LD208-209-DF2和LD208-209-DR2，非龙稻208水稻特异探针FLD208-209-FAM-P2和龙稻208水稻特异探针LD208-209-VIC-P3，与内源参照基因PLD引物PLD-F和PLD-R，探针PLD-CY5-P进行实时荧光PCR检测，对荧光定量PCR数据进行分析，结果显示(图3)，0％龙稻208水稻标样，5％龙稻208水稻标样，50％龙稻208水稻标样，95％龙稻208水稻标样，100％龙稻208水稻标样，5个标样按龙稻208水稻含量递增，相对基因表达量也呈现递增关系，可以用标样定量未知检测样品龙稻208水稻的含量(图3A)。100％非龙稻208水稻标样，95％非龙稻208水稻标样，50％非龙稻208水稻标样，5％非龙稻208水稻标样，0％非龙稻208水稻标样，5个标样按非龙稻208水稻含量递减，相对基因表达量也呈现递减关系，可以用标样定量未知检测样品非龙稻208水稻的含量(图3B)。
实施例4：龙稻208水稻盲样纯度检测
对配置的1个龙稻208水稻产品的盲样样品进行检测，按龙稻208水稻品种纯度检测试剂盒操作说明进行DNA提取、荧光定量PCR扩增和数据分析，结果显示(图4)，龙稻208水稻在盲样中的含量为：样品1为52％，盲样的检测结果和配比基本一致，配比的含量：样品1为50％龙稻208水稻。
结论：本发明是利用分子生物学方法定量检测龙稻208水稻掺伪，从水稻样本中快速提取DNA，用开发的高效灵敏的龙稻208水稻特异荧光探针和引物进行荧光定量PCR扩增，通过设置内源参照基因与参照样本再对扩增数据进行定量分析，从而对龙稻208水稻纯度进行定量判断，结果直观，操作方便快捷，且不受品种、地域、环境等带来的影响，检测更灵敏更高效。

Claims (9)

1.一种分离的来自水稻的核酸分子，其含有SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子长度为10bp-640bp；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列至少包括SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列。
3.用于检测水稻基因组中的SNP标记的引物，其特征在于，所述SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失，
更优选地，所述引物选自：
(1)SEQ ID NO:1和2所示的序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:5或6杂交的序列或与其有至少90％相同性的序列；和
(2)(1)所述序列的混合物。
4.用于检测水稻基因组SNP标记的探针，其特征在于，所述SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失，
优选地，所述探针具有(1)SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列或在严谨条件下与SEQID NO:5-6中任一杂交的序列或与之具有70％序列相同性的变体，或(2)(1)的互补序列。
5.一种试剂盒，其含有用于检测水稻基因组中SNP标记的试剂，其特征在于，所述SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失，
优选地，所述试剂盒包含检测所述SNP标记的引物和任选的检测所述SNP标记的探针和任选的包含所述SNP标记的核酸分子；
更优选地，所述试剂盒包含：权利要求3所述的引物和任选的权利要求4所述的探针和任选的权利要求1-2中任一项所述的核酸分子。
6.鉴别水稻品种的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)检测水稻基因组中的SNP标记，其中，所述SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失；
(2)根据所述SNP鉴定水稻品种，其中，SNP为缺失TATAAATCTTG则鉴定为龙稻208水稻，否则鉴定为非龙稻208水稻。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测包括进行PCR；优选地，所述检测是荧光定量PCR或HRM检测。
8.检测样品中龙稻208水稻含量或纯度的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)扩增该水稻基因组中含SNP标记的序列的步骤，其中，所述SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失，
(2)根据SNP标记的扩增结果确定龙稻208水稻含量或纯度，其中，SNP为缺失TATAAATCTTG的扩增结果指示龙稻208水稻的含量或纯度，优选地，所述扩增是荧光定量PCR，所述方法还包括根据扩增结果利用2-ΔΔCT方法确定龙稻208水稻的含量或纯度，
更优选地，所述2-ΔΔCT方法包括：利用荧光定量PCR比较样品中的权利要求4所述的探针的CT值与内源参照探针的CT值，并将比较结果与对照的ΔCT相比得到ΔΔCT，和利用ΔΔCT确定龙稻208水稻的含量或纯度。
9.检测水稻基因组中的SNP标记的试剂在鉴别水稻品种或检测水稻中龙稻208水稻含量或纯度中的用途，或在制备用于鉴别水稻品种或检测水稻中龙稻208水稻含量或纯度的试剂盒中的用途，其中，所述SNP标记位点为水稻基因组第5号染色体第6372872位前TATAAATCTTG的缺失，
优选地，所述试剂包含权利要求3所述的引物和任选的权利要求4所述的探针和任选的权利要求1-2中任一项所述的核酸分子。
CN202211548405.XA 2022-12-05 2022-12-05 一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法及其检测试剂盒 Pending CN118147338A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211548405.XA CN118147338A (zh) 2022-12-05 2022-12-05 一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法及其检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211548405.XA CN118147338A (zh) 2022-12-05 2022-12-05 一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法及其检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118147338A true CN118147338A (zh) 2024-06-07

Family

ID=91291337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211548405.XA Pending CN118147338A (zh) 2022-12-05 2022-12-05 一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法及其检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118147338A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4938824B2 (ja) イネの品種鑑別法
CN107916299B (zh) 普通小麦snp位点标记及其在小麦相关性状检测中的应用
CN109628628B (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用
KR101788989B1 (ko) 벼멸구 저항성 벼 품종 판별용 마커 및 이의 용도
KR101047322B1 (ko) 앵귈라 뱀장어 종들의 판별을 위한 ｄｎａ 마커
EP2017336A1 (en) Marker for selecting aphanomyces cochlioides-resistant variety and selection method therefor
EP2569448B1 (en) Use of brown midrib-3 gene specific markers in maize for trait introgression
CN111471787A (zh) 一种鉴定水稻耐高温tt1基因型的pcr/ldr分子标记和方法
CN116377082B (zh) 绵羊lcorl基因单核苷酸多态性标记在生长性状选择中的应用
KR20050024321A (ko) 벼의 품종 감별법
KR101955074B1 (ko) 무 판별용 snp 마커
EP1639135A2 (en) Splice site aflp
CN118147338A (zh) 一种基于分子生物学的龙稻208水稻品种纯度定量检测方法及其检测试剂盒
CN118064619A (zh) 小麦永良4号snp标记及其应用
CN114717349B (zh) 水稻株型和基因型的分子标记及其应用
CN111778346A (zh) 一种用于检测抗条锈病QTL QYr.hbaas-4BL.1的分子标记及使用方法
WO1998010073A1 (fr) Procede et materiau de detection de champignons
CN114317794A (zh) 水稻snp标记及其应用
CN114657274A (zh) 水稻野香优莉丝snp标记及其应用
CN114350830A (zh) 水稻snp标记及其应用
CN114717350B (zh) 水稻株型的分子标记及其应用
KR102625086B1 (ko) 밀의 성숙기 판별용 바이오마커
CN114350762A (zh) 一种基于分子生物学的香米纯度定量检测方法及其检测试剂盒
CN113136436B (zh) 大鼠遗传背景相关snp及其用途
KR20130064197A (ko) 한우 및 수입우 판별에 유용한 단일염기다형성마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication