CN114657274A - 水稻野香优莉丝snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻野香优莉丝SNP标记及其应用。其中，SNP标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第64位碱基的T或C。本发明的SNP标记与水稻品种紧密相关，能够有效用于定性或定量检测水稻品种。

Description

水稻野香优莉丝SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及SNP标记及其应用。

背景技术

野香优莉丝是有广西绿海种业有限公司培育而成的一种新型优质水稻品 种，审定编号为桂稻审2017045号，属于优质香型杂交水稻品种。该品种在2017 年通过审定，2018年获得全国首届优质稻(籼稻)品种食味品质鉴评金奖。2019 年荣获江西省首届优质稻食味品质鉴评金奖，2020年通过江西省审定。其特点 在于适应性强、适口性好、优质高产。

野香优莉丝是一种优质水稻新品种，生育期通常是110d左右，每667m²平均产量能够达到564.22kg，高产地区每667m²平均产量甚至可以达到650kg。 该品种稻瘟病综合抗性指数为4.00，中感。在各地中籼迟熟区，除了一些高海 拔山区等特殊地区以外，一般均适宜种植该品种。该品种在实际种植过程中， 苗期、破口期、齐穗期应当注重对稻瘟病的防治；在分蘖期、孕穗期应当注重 对螟虫、稻飞虱及其他病虫害的防治。此外，还应注意在稻瘟病常发地区需要 谨慎种植。

野香优莉丝属于香稻，品质好，营养丰富，在市场上深受广大消费者的青 睐，需求量不断增加，价格较高，使得有些不法分子通过弄虚作假，将粒型外 观相近的其它稻米掺杂到野香优莉丝稻米中销售以牟取暴利。因此，如何简单、 准确而又快速地鉴定野香优莉丝稻米纯度一直是大家关注的难题。

一般辨别野香优莉丝主要是通过闻香味和口感咀嚼等方法，但是这些方法 主要依靠人的感官来判定粒型与香味强弱，准确性较差，更难以实现野香优莉 丝纯度的定量检测。米业公司在收购野香优莉丝稻谷时对品种鉴定有明确需求， 希望能有简单容易操作、用时短的方法鉴定水稻品种，来确保收购的稻谷的确 是高纯度的野香优莉丝。

我们通过对野香优莉丝水稻品种的SSR高通量测序，比对出野香优莉丝 区别与其它水稻品种的特异序列，通过野香优莉丝与其它水稻品种特异位点核 酸序列的特异性检测，来判断野香优莉丝中是否掺入其它水稻，并引入内源参 照基因与参照样本进行野香优莉丝稻米掺伪的定量分析。

本发明是利用分子生物学方法定量检测野香优莉丝稻米掺伪，从样本中快 速提取DNA，用开发的高效灵敏的野香优莉丝特异荧光探针和引物进行荧光 定量PCR扩增，再对扩增数据进行定量分析，从而对野香优莉丝稻米纯度进 行定量判断。这种方法的优势在于可以定量检测野香优莉丝水稻品种中其它水 稻品种的掺入量。

发明内容

本发明提出了一种与野香优莉丝品种相关、能够有效用于水稻品种检测的 SNP标记，利用该SNP标记设计高效灵敏的野香优莉丝水稻特异性引物和探 针，对样本DNA进行检测，从而实现对野香优莉丝水稻品种纯度进行定量判 断，有效地解决了野香优莉丝水稻品种中掺入其它水稻品种的定量鉴别的难题。

具体而言，本发明提供一种分离的来自水稻的核酸分子，其含有SNP标 记，其位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的长度至少5bp的片段。在一个 或多个实施方案中，所述核酸分子长度至少10bp、15bp、20bp、30bp、40bp、 50bp、64bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、640bp、 700bp、800bp、900bp、1kb。在一个或多个实施方案中，所述核酸分子长度为 10bp-640bp、50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列至少包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或至少包括SEQ ID NO:8或10所示的核苷酸序列， 或至少包括SEQ IDNO:9或11所示的核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列包括在SEQ ID NO:**的一端或两端延伸的序列，所述序列优选具有**-**bp、或**-**bp、 或**-**bp、或**-**bp长度，所述序列例如可以是或包含SEQ ID NO:12 所示的序列。

在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板， 采用SEQID NO:2和3作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端 起第37位核苷酸，其为T或C，或以水稻基因组DNA为模板。

本发明还提供用于检测水稻基因组中SNP标记的引物，其中，SNP标记 位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板， 采用SEQID NO:4和5作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端 起第64位核苷酸，其为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述引物选自：(1)SEQ ID NO:2和3所示 的序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:8或10杂交的序列或与其有至少90％相 同性的序列；(2)SEQ IDNO:4和5所示的序列或在严谨条件下与SEQ ID NO: 9或11杂交的序列或与其有至少90％相同性的序列；和(3)(1)和(2)所 述序列的混合物。

本发明还提供用于检测水稻基因组SNP标记的探针，其中，SNP标记位 于水稻基因组第3号染色体第10101815位，其为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板， 采用SEQID NO:4和5作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起 第64位核苷酸，其为T或C，或以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:2 和3作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第37位核苷酸， 其为T或C。

在一个或多个实施方案中，探针包括(1)识别SEQ ID NO:8或9或其片 段的野香优莉丝探针，所述片段包含SEQ ID NO:8自5’端起第37位碱基，或 包含SEQ ID NO:9自5’端起第64位碱基。

在一个或多个实施方案中，探针还包括(2)识别SEQ ID NO:10或11或 其片段的非野香优莉丝探针，所述片段包含SEQ ID NO:10自5’端起第37位碱 基，或包含SEQ ID NO:11自5’端起第64位碱基。

在一个或多个实施方案中，探针识别SEQ ID NO:9或11或其片段，所述 片段包含SEQ ID NO:9或11自5’端起第64位碱基和第64位碱基。示例性 地，探针包括以下的一种或多种：(1)识别SEQ ID NO:9或其片段的探针， 所述片段包含SEQ ID NO:9自5’端起第64位碱基，所述碱基是T，(2)识 别SEQ ID NO:11或其片段的探针，所述片段包含SEQ ID NO:11自5’端起第 64位碱基，所述碱基是C，(3)(1)或(2)的互补序列。优选地，所述探 针具有(1)SEQ ID NO:6或7所示的核苷酸序列或在高度严谨条件下与SEQ ID NO:8-11中任一杂交的序列或与之具有70％序列相同性的突变体，或(2)(1) 的互补序列。

本发明还提供一种试剂盒，其含有用于检测水稻基因组中SNP标记的试 剂，其中，SNP标记位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，其为T或 C。

在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板， 采用SEQID NO:4和5作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起 第64位核苷酸，其为T或C，或以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:2 和3作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第37位核苷酸， 其为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含检测SNP标记的引物和任选 的检测SNP标记的探针和任选的具有SNP标记的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：本文任一实施方案所述的引 物，任选的本文任一实施方案所述的探针和任选的本文任一实施方案所述的核 酸分子。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含：SEQ ID NO:2和3所示的序 列或在严谨条件下与SEQ ID NO:8或10杂交的序列或与之具有至少90％相同 性的序列或其互补序列，和任选的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列至少 包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其互补序列，或至少包括SEQ ID NO:8 或10所示的核苷酸序列或其互补序列，或至少包括SEQ ID NO:9或11所示的 核苷酸序列或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含：SEQ ID NO:4和3所示的 序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:9或11杂交的序列或与之有至少90％相同 性的序列或其互补序列，和任选的SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或在严 谨条件下与SEQ ID NO:8-11中任一杂交的序列或与之具有70％序列相同性的 突变体或其互补序列。

本发明还提供鉴别水稻品种的方法，包括(1)检测水稻基因组中的一SNP 标记，其位于第3号染色体第10101815位，(2)根据SNP鉴定水稻品种， 其中，所述SNP为TT则鉴定为野香优莉丝，否则鉴定为非野香优莉丝。

在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板， 采用SEQID NO:2和3作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起 第37位核苷酸，其为T或C，或以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:4 和5作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第64位核苷酸， 其为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括根据检测到的SNP鉴别水稻 品种，其中，野香优莉丝的SNP为TT，非野香优莉丝的SNP为CC。

在一个或多个实施方案中，所述检测包含PCR，更优选地，所述检测是 荧光定量PCR或HRM检测。

本发明还提供检测样品中野香优莉丝含量或纯度的方法，所述方法包括扩 增该水稻基因组中SNP标记的序列的步骤，其中，SNP标记位于水稻基因组 第3号染色体第10101815位，其为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板， 采用SEQID NO:4和5作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起 第64位核苷酸，其为T，或以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:2 和3作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第37位核苷酸， 其为T。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括根据SNP标记的扩增结果确 定野香优莉丝含量或纯度。其中，SNP为TT的扩增结果指示野香优莉丝的含 量或纯度；SNP为CC的扩增结果指示非野香优莉丝的含量或比例。

在一个或多个实施方案中，所述扩增是荧光定量PCR，所述方法还包括 根据扩增结果利用2^-ΔΔCT方法确定野香优莉丝的含量或纯度。

更优选地，所述2^-ΔΔCT方法包括：比较样品中识别SNP标记的探针的CT 值与内源参照探针的CT值，并将比较结果与对照的ΔCT相比，利用得到的 ΔΔCT确定野香优莉丝的含量或纯度。

具体地，检测样品中野香优莉丝含量或纯度的方法包括：荧光定量PCR 检测识别SNP标记的探针的CT值和识别内源参照的探针的CT值，二者相减 后得到样品ΔCT，将样品ΔCT与对照的ΔCT相减得到ΔΔCT，所述对照是 100％野香优莉丝或100％非野香优莉丝样品，和对ΔΔCT的负数进行2次方 得到相对含量数值，用于样品中野香优莉丝和非野香优莉丝的定量判断。在一 个或多个实施方案中，识别SNP标记的探针具有SEQ ID NO:5或6所示的核 苷酸序列。在一个或多个实施方案中，识别内源参照的探针具有SEQ ID NO:7 所示的核苷酸序列。

本发明还提供检测水稻基因组中的SNP标记的试剂在鉴别水稻品种或检 测水稻中野香优莉丝含量或纯度中的用途，或在制备用于鉴别水稻品种或检测 水稻中野香优莉丝含量或纯度的试剂盒中的用途，其中，所述SNP标记位于 水稻基因组第3号染色体第10101815位，为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述SNP标记为：以水稻基因组DNA为模板， 采用SEQID NO:4和5作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端 起第64位核苷酸，其为T或C，或以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:2 和3作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第37位核苷酸， 其为T或C。

在一个或多个实施方案中，所述试剂包含本文任一实施方案所述的引物和 任选的本文任一实施方案所述的探针和任选的本文任一实施方案所述的核酸 分子。

在一个或多个实施方案中，根据检测到的SNP鉴别水稻品种，其中，野 香优莉丝的SNP为TT，非野香优莉丝的SNP为CC。

附图说明

图1：野香优莉丝和非野香优莉丝HRM检测与荧光探针法检测引物探针 位置图。

图2：野香优莉丝和其它非野香优莉丝水稻品种HRM分型图。

图3：野香优莉丝和非野香优莉丝不同含量标样定量数据图。A图从左到 右依次为：0％非野香优莉丝标样，5％非野香优莉丝标样，50％非野香优莉丝 标样，80％非野香优莉丝标样，95％非野香优莉丝标样，100％非野香优莉丝标 样。B图从左到右依次为：100％野香优莉丝标样，95％野香优莉丝标样，50％ 野香优莉丝标样，5％野香优莉丝标样，0％野香优莉丝标样。

图4：野香优莉丝盲样纯度检测。从左到右依次为：0％非野香优莉丝标样， 5％非野香优莉丝标样，50％非野香优莉丝标样，95％非野香优莉丝标样，100％ 非野香优莉丝标样，米样1，米样2。

具体实施方式

发明人通过对野香优莉丝水稻品种的SSR高通量测序，比对出野香优莉 丝区别与其它水稻品种的特异序列，通过野香优莉丝与其它水稻品种特异位点 核酸序列的特异性检测，来判断野香优莉丝水稻中是否掺入其它水稻，并引入 内源参照基因与参照样本进行野香优莉丝稻米掺伪的定量分析。

具体地，本发明涉及与水稻品种相关的SNP标记，用于检测所述SNP标 记的引物和试剂盒，所述SNP标记、引物、试剂盒在水稻品种检测中的用途， 以及检测水稻品种的方法。

发明人发现第3号染色体第10101815位的SNP与水稻品种相关。具体地， SNP是SEQID NO:1所示核苷酸序列自5’端起第64位碱基T或C。SEQ ID NO:1所示核苷酸序列如下：

GGTAACTATATACTCCCTCCGTCAAAAAAAACTTAACTTCTAGAGT CCAATTTATCTTCAGCAYATAAAACGAGAAGTTATATCCCTTAAATATC ATTTACCTACCTATCACTATTACTACATT。

本文中，SNP(single nucleotide polymorphism，SNP，即单核苷酸多态性) 是一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA序列多态性。SNP表现出的多态性通常仅涉及到单个碱基的变异，例如 转换、颠换、插入和缺失等。

本文中，水稻品种指经选育而具有不同性状的水稻品系。发明人发现，野 香优莉丝的SNP为纯合TT，非野香优莉丝的SNP为纯合CC。因此，通过检 测样品中的上述SNP能够有效地确定水稻品种是野香优莉丝还是非野香优莉 丝。

本文所述“样品”是来自对象的任意类型的含多核苷酸的样品。优选地， 本文所述样品来自或包含水稻植物器官、组织、细胞、核酸或包含水稻植物器 官、组织、细胞、核酸的产品，包括但不限于水稻叶片、根、茎、花、果实、 种子、细胞、DNA、RNA、大米、碎米、米糠、稻壳、加工或未加工的大米食 物例如米粉、米线。DNA可以是基因组DNA。

术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA) 或核糖核苷酸聚合物(RNA)，及其互补物。核酸含有合成的、非天然的或改 变的核苷酸碱基。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式。 本文考虑的多核苷酸的示例包括单链和双链DNA，单链和双链RNA，以及具 有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。DNA可以是编码链或非编 码链。在一个或多个实施方案中，所述样品包含经片段化的基因组DNA。获 取基因组DNA并片段化的方法本领域周知。

DNA基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，经磷酸二酯键缩合而成长链状分 子。每个脱氧核糖核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基组成。DNA的碱基(bp) 主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在双链DNA的双螺 旋结构中，A与T经氢键配对，G与C经氢键配对。DNA形式包括cDNA、 基因组DNA、片段化DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链 的。DNA可以为任意长度，例如50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。

本文所述“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，引导合成的一种具有特 定核苷酸序列的核酸分子。引物组合物包含一种或多种引物。引物通常是人工 合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补， 另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸 聚合作用的起始点。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(PCR)、 qPCR、测序和探针合成等。引物可以为任意长度，例如5-200bp，10-100bp， 20-800bp或25-50bp。

本发明引物用于检测SNP。所述引物可以是识别SEQ ID NO:8-11中任一 的核酸分子。在一些实施方式中，引物具有(1)SEQ ID NO:2-5中任一项所示 的核苷酸序列或与之具有至少70％序列相同性的突变体，或(2)(1)的互补 序列。在一个或多个实施方案中，引物是引物对，引物对分别具有SEQ ID NO:2 和3所示序列或SEQ ID NO:4和5所示序列。在讨论引物时，本文所述“识别” 指引物与模板序列在严谨或高度严谨条件下杂交，并且成对引物所扩增的片段 涵盖SEQ ID NO:8或10自5’端起第37位碱基，或涵盖SEQ ID NO:9或11 自5’端起第64位碱基。本文所述核酸杂交的严谨条件本领域技术人员已知。 优选地，所述条件是使得序列彼此至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、 98％或99％同源，通常保持彼此杂交。严谨杂交条件的非限制性实例是在含有 6xSSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficolll、 0.02％BSA和500mg/ml变性鲑鱼精子DNA的高盐缓冲剂中在65℃杂交，和 任选的在0.2xSSC、0.01％BSA中50℃洗涤一次或两次。

本发明也可采用探针来检测本发明所述的SNP。本文所述“探针”是识别 目的序列(与目的序列互补)的核酸序列(DNA或RNA)。探针通过分子杂交 与目的基因结合，产生杂交信号，从而显示目的基因。探针可以包括整个目的 序列，也可以是目的序列的片段。探针可以是DNA，也可以是由之转录而来 的RNA。通常，探针带有检测标记，例如荧光标记。所述荧光标记包括但不 限于FAM、CY5和VIC。本领域知晓适用于本文探针的荧光标记以及将其与探针连接的方法。

本文中，探针包括识别SEQ ID NO:8或9或其片段的野香优莉丝探针， 所述片段包含SEQ ID NO:8自5’端起第37位碱基，或包含SEQ ID NO:9自5’ 端起第64位碱基。任选地，探针还可包括识别SEQ ID NO:10或11或其片段 的非野香优莉丝探针，所述片段包含SEQID NO:10自5’端起第37位碱基，或 包含SEQ ID NO:11自5’端起第64位碱基。

在一个或多个实施方案中，探针包括(1)识别SEQ ID NO:8或9或其片 段的野香优莉丝探针，所述片段包含SEQ ID NO:8自5’端起第37位碱基， 或包含SEQ ID NO:9自5’端起第64位碱基。探针还可包括(2)识别SEQ ID NO:10或11或其片段的非野香优莉丝探针，所述片段包含SEQ ID NO:10自5’ 端起第37位碱基，或包含SEQ ID NO:11自5’端起第64位碱基。

示例性地，探针包括选自以下的一种或多种：(1)识别SEQ ID NO:9或 其片段的探针，所述片段包含SEQ ID NO:9自5’端起64位碱基，所述碱基是 T，(2)识别SEQ ID NO:11或其片段的探针，所述片段包含SEQ ID NO:11 自5’端起第64位碱基，所述碱基是C，(3)(1)或(2)的互补序列。在讨 论探针时，本文所述“识别”指探针与模板序列在严谨或高度严谨条件下杂交， 并且所述杂交涵盖SEQ ID NO:8或10自5’端起第37位碱基，或涵盖SEQ ID NO:9或11自5’端起第64位碱基。

本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个核 苷酸的插入、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸杂交能力 的多核苷酸。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列(如本文所述的 SEQ ID NO:1-12)具有至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少 90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学 活性的核苷酸序列。可采用例如NCBI的BLASTn计算两条比对的序列之间的 序列相同性。突变体还包括在参照序列的和核苷酸序列中具有一个或多个突变 (插入、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多 个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代可以是嘌 呤核苷酸与嘧啶核苷酸之间的取代，也可以是嘌呤核苷酸之间或嘧啶核苷酸之 间的取代。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的 核苷酸进行保守性取代时，通常不会改变多核苷酸的稳定性和功能。保守性取 代例如嘌呤核苷酸之间的(A与G)的互换，嘧啶核苷酸之间的(T或U与C) 的互换。因此，在本发明多核苷酸中用来自同一残基替换一个或几个位点，将 不会在实质上影响其活性。当提及与本发明所述的引物(如SEQ ID NO:2-5) 或探针(如SEQ ID NO:6-7)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、 至少95％、至少97％序列相同性的突变体时，优选地，这些突变体在高严谨 条件下可与包含SEQ ID NO:8、9、10或11的相对应的DNA序列杂交。所述 高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下 杂交并洗膜。

本发明另一方面提供检测样品中水稻品种的方法，包括通过对待测样品进 行本文所述的SNP标记的检测，确定或定量水稻品种。所述方法进一步包括：

(1)提取待测样品的DNA；(2)利用本文所述的引物和/或探针，确定或定 量所述DNA中的本文所述SNP标记的基因型；和(3)基于(2)的结果，确 定或定量水稻品种。其中，SNP为TT的水稻品种为野香优莉丝，用本领域检 测SNP的常规方法即可检测并鉴定野香优莉丝，例如荧光定量探针法或HRM 高分辨率溶解曲线法，这些方法的过程和所用试剂本领域周知。

在一个或多个实施方案中，非野香优莉丝水稻组包括：绥粳18，盐丰47， 松粳22，北稻7，通院香518，富尔稻1号，龙庆稻3，南粳9108和俆稻9号。

本文中，提取样品中DNA的方法不受特别限制，本领域周知适用于本文 的DNA提取方法。

本领域周知适用于本文的SNP标记检测方法，包括但不限于：测序、单 链构象多态性聚合酶链式反应(PCR single strand conformation polymorphism， PCR-SSCP)、实时荧光定量PCR与高分辨率熔解曲线分析(HRM)、荧光探 针法定量PCR、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)及飞行时间质谱等。本领域知晓 SNP标记检测方法中所需的除引物和/或探针以外的其他试剂。

根据本发明的一些具体示例，通过对待测样品进行本文所述的SNP标记 的检测来确定或定量水稻品种的方法，进一步包括：提取样品中的DNA；利 用引物SEQ ID NO:2和3，进行DNA的荧光定量PCR，获得扩增产物；对所 述扩增产物进行HRM分析，获得所述DNA中的本文所述SNP标记的基因型； 以及基于所述SNP标记的基因型，确定或定量水稻品种。

根据本发明的另一些具体示例，通过对待测样品进行本文所述的SNP标 记的检测来确定或定量水稻品种的方法，进一步包括：提取样品中的DNA； 利用引物SEQ ID NO:4和5，探针SEQ ID NO:6和7，以及参照探针SEQ ID NO:15，进行DNA的荧光定量PCR；分析PCR结果，获得所述DNA中的本 文所述SNP标记的基因型；以及基于所述SNP标记的基因型，确定或定量水 稻品种。

例如，检测样品中野香优莉丝含量或纯度的方法包括：荧光定量PCR检 测识别SNP标记的探针的CT值和识别内源参照的探针的CT值，二者相减后 得到样品ΔCT，将样品ΔCT与对照的ΔCT相减得到ΔΔCT，所述对照是100％ 野香优莉丝或100％非野香优莉丝样品，和对ΔΔCT的负数进行2次方得到相 对含量数值，用于样品中野香优莉丝和非野香优莉丝的定量判断。在一个或多 个实施方案中，识别SNP标记的探针具有SEQ ID NO:6或7所示的核苷酸序 列。在一个或多个实施方案中，识别内源参照的探针具有SEQ ID NO:15所示 的核苷酸序列。

本发明还提供一种试剂盒，其含有用于检测本发明所述的水稻基因组中的 SNP标记的试剂，其中，所述水稻基因组SNP标记为：以水稻基因组DNA为 模板，采用SEQ ID NO:4和5作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’ 末端起第64位核苷酸，其为T或C，或以水稻基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:2和3作为引物进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第37位 核苷酸，其为T或C。所述试剂可以是本文任一实施方案所述的引物和/或探针。任选地，该试剂盒还包括本发明所述的核酸分子(即扩增产物)，该核酸 分子可用作内标或阳性对照。优选地，所述引物选自：(1)SEQ ID NO:2和3 所示的序列或与其有至少90％相同性的序列；(2)SEQ ID NO:4和5所示的 序列或与其有至少90％相同性的序列；和(3)(1)和(2)所述序列的混合 物。所述探针选自：(1)SEQ ID NO:6和7所示的序列或与其有至少90％相 同性的序列；(2)(1)所述序列的互补序列。优选地，所述探针具有荧光标 记，如分别被FAM荧光、VIC荧光和CY5荧光标记。试剂盒中还可含有实施 PCR所需的各种试剂，如缓冲液、酶、dNTP等。

在一优选的实施方案中，本发明的试剂盒含有：SEQ ID NO:2和3所示的 引物序列。在另一优选的实施方案中，本发明的试剂盒含有：SEQ ID NO:4和 5所示的引物序列；SEQ ID NO:6所示的探针，其由FAM荧光标记；SEQ ID NO:7所示的探针，其由VIC荧光标记；SEQ ID NO:15所示的探针，其由CY5 荧光标记。

本发明SNP标记及其应用的优点：

本发明可以定性或定量检测野香优莉丝水稻品种中其它水稻品种的掺入 量。本发明利用分子生物学方法定量检测野香优莉丝稻米掺伪，适用水稻种子， 大米和米粉等产品，从样本中快速提取DNA，用开发的高效灵敏的野香优莉 丝特异荧光探针和引物进行荧光定量PCR扩增，通过设置内源参照基因与参 照样本再对扩增数据进行定量分析，从而对野香优莉丝纯度进行定量判断。结 果直观客观，可避免人为判断，操作方便快捷，定量限达到5％，可大大减少 错误判断的概率，且不受品种、地域、环境等带来的影响，检测更灵敏更高效。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述 性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中未具体描述的材料、试剂和方法， 均未本领域常规的材料、试剂和方法。

实施例

实施例1：材料和方法

1.材料

野香优莉丝-水稻种子、其它水稻品种种子与大米样本均市购获得。

2.酶与试剂

2×GoldStar Best MasterMix酶购自康为世纪公司，SsoAdvancedTM

Green Supermix酶购自Bio-Rad公司，试剂购自国药集团化学试剂有 限公司，荧光定量PCR仪Bio-Rad CFX96；实验中用到的引物和探针均由上 海生工生物工程公司合成。

3.实验方法

3.1水稻种子(米样)DNA提取

使用研磨机把20克水稻种子(米样)磨碎，称取50mg粉末到2mL样 品裂解管中，加入500μL Buffer 1(0.4M NaCl，0.1％SDS，0.1M Tris，0.5％ 高温淀粉酶(购自山东隆大生物工程有限公司)，pH8.0)，涡旋仪振荡混 匀30s，52℃下孵育30min，转速1200rpm；加入500μL Buffer 2 (0.1M Tris-HCL ph 7.0)，涡旋仪振荡混匀30s，将混合物离心5min(12000rpm)，吸取500μL上清备用，提取所得DNA溶液用灭菌纯水稀释10倍为模 板DNA，置于样品稀释管中备用，4℃短期存放，-20℃长期保存。

3.2野香优莉丝水稻特异性引物与探针设计

针对野香优莉丝水稻品种特异片段序列，primer5设计特异性引物。

HRM高分辨率熔解曲线法检测引物：

YXYLS-HRM-F：5’-AAAACTTAACTTCTAGAGTCCAATTT-3’(SEQ ID NO:2)；

YXYLS-HRM-R：5’-ATTTAAGGGATATAACTTCTCGTTT-3’(SEQ ID NO:3)；

探针检测法引物：

YXYLS-DF：5’-GGTAACTATATACTCCCTCCGTC-3’(SEQ ID NO:4)； YXYLS-DR：5’-CGAGAAGTTATATCCCTTAAAT-3’(SEQ ID NO:5)；

设计探针：

FYXYLS-FAM-P1：5’-FAM-ATCTTCAGCACATAAAACGA-MGB-3’ (SEQ ID NO:6)；

YXYLS-VIC-P2：5’-VIC-ATCTTCAGCATATAAAACGA-MGB-3’(SEQ ID NO:7)。

HRM高分辨率熔解曲线法检测引物扩增片段65bp：

野香优莉丝核酸序列：

AAAACTTAACTTCTAGAGTCCAATTTATCTTCAGCATATAAAACG AGAAGTTATATCCCTTAAAT(SEQ ID NO:8，图1)

其它水稻核酸序列：

AAAACTTAACTTCTAGAGTCCAATTTATCTTCAGCACATAAAACG AGAAGTTATATCCCTTAAAT(SEQ ID NO:10，图1)

探针检测法引物扩增片段83bp：

野香优莉丝核酸序列：

GGTAACTATATACTCCCTCCGTCAAAAAAAACTTAACTTCTAGAG TCCAATTTATCTTCAGCATATAAAACGAGAAGTTATATCCCTTAAATA TCATTTACCTACCTATCACTATTACTACATT(SEQ ID NO:9，图1)

其它水稻核酸序列：

GGTAACTATATACTCCCTCCGTCAAAAAAAACTTAACTTCTAGAG TCCAATTTATCTTCAGCACATAAAACGAGAAGTTATATCCCTTAAATA TCATTTACCTACCTATCACTATTACTACATT(SEQ ID NO:11，图1)

内源基因PLD引物：

PLD-F：5’-TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT-3’(SEQ ID NO:13)；

PLD-R：5’-CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC-3’(SEQ ID NO:14)。

内源基因PLD探针：

PLD-CY5-P：5’-CY5-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO:15)。

实施例2：HRM高分辨率熔解曲线法实时荧光定量PCR检测

以提取的DNA为模板，采用HRM高分辨率熔解曲线法检测引物对 YXYLS-HRM-F和YXYLS-HRM-R进行实时荧光定量PCR扩增。PCR反应体 系为20μL，其中SsoAdvancedTM

Green Supermix 10μL， YXYLS-HRM-F和YXYLS-HRM-R引物(浓度为10μM)各0.5μL，模板DNA (浓度为50-100ng/μL)2μL，无菌水补齐至20μL。空白对照以无菌水代替 模板DNA。每个反应做三个重复，PCR扩增程序采用两步法：95℃预变性3 分钟；95℃变性15秒，64℃退火延伸1分钟，共45个循环。

实时荧光PCR扩增完成后，将扩增产物直接应用Bio-Rad进行HRM高分 辨率熔解曲线读取，HRM高分辨率熔解曲线熔解过程：95℃1min，70℃1min， 然后以0.2℃/0.1s的速度从70℃升温至95℃，收集熔解曲线数据，用于Precision Melt Analysis Software分析软件进行HRM高分辨率熔解曲线分型。

以提取的不同水稻品种样品的DNA为模板，使用HRM高分辨率熔解曲 线法检测引物对YXYLS-HRM-F和YXYLS-HRM-R进行实时荧光定量PCR扩 增，再进行HRM高分辨率熔解曲线读取，用Precision Melt Analysis Software 分析软件进行HRM高分辨率熔解曲线分型，结果显示(图2)，野香优莉丝 水稻品种有特异的HRM曲线，和其它水稻的HRM分型不同，非野香优莉丝 其它品种水稻包括的水稻有：绥粳18，盐丰47，松粳22，北稻7，通院香518，富尔稻1号，龙庆稻3，南粳9108和俆稻9号等。

实施例3：探针法实时荧光定量PCR检测

以提取的DNA为模板，使用野香优莉丝探针法检测引物：YXYLS-DF和 YXYLS-DR，野香优莉丝特异探针：YXYLS-VIC-P2，和非野香优莉丝特异探针FYXYLS-FAM-P1，与内源参照基因PLD引物PLD-F和PLD-R，内源参照基因 PLD探针PLD-CY5-P进行实时荧光PCR检测。PCR反应体系为20μL，其中 2×GoldStar Best MasterMix 10μL，YXYLS-DF和YXYLS-DR引物(浓度为10μM) 各1μL，PLD-F和PLD-R引物(浓度为10μM)各0.4μL，YXYLS-VIC-P2和 FYXYLS-FAM-P1探针(浓度为10μM)各0.25μL，PLD-CY5-P探针(浓度为 10μM)0.2μL，模板DNA 2μL，无菌水补齐至20μL。空白对照以无菌水代替 模板DNA。每个反应做三个重复，PCR扩增程序采用两步法：95℃预变性10min； 95℃变性15s；58℃退火延伸45s，共45个循环。

首先对探针法进行特异性分析，野香优莉丝特异性探针YXYLS-VIC-P2 只在野香优莉丝水稻品种中有扩增信号，其它水稻品种均没有扩增信号，非野 香优莉丝探针FYXYLS-FAM-P1在非野香优莉丝的水稻品种中有扩增信号，野 香优莉丝中没有扩增信号。对荧光定量PCR数据进行分析，可分别进行水稻 样品中野香优莉丝和非野香优莉丝水稻品种含量的定量。基因表达数据处理采 用2^-ΔΔCT方法进行，以水稻PLD-CY5-P探针为内源参照基因，将样品中 YXYLS-VIC-P2和FYXYLS-FAM-P1探针的CT值与PLD-CY5-P探针的CT 值相减后的值ΔCT，再与100％野香优莉丝或100％非野香优莉丝含量的参照 样本的ΔCT相减，得到的ΔΔCT的负数进行2次方得到一个相对含量的数值， 分别用于水稻样品中野香优莉丝和非野香优莉丝水稻品种含量的定量判断。

以提取的不同含量标准样品的DNA为模板，使用引物YXYLS-DF和 YXYLS-DR，野香优莉丝特异探针YXYLS-VIC-P2，和非野香优莉丝特异探针 FYXYLS-FAM-P1，与内源参照基因PLD-CY5-P探针进行实时荧光PCR检测， 对荧光定量PCR数据进行分析，结果显示(图3)，0％非野香优莉丝标样，5％ 非野香优莉丝标样，50％非野香优莉丝标样，95％非野香优莉丝标样，100％非野 香优莉丝标样，5个标样按非野香优莉丝含量递增，相对基因表达量也呈现递增 关系，可以用标样定量未知检测样品非野香优莉丝的含量(图3A)。100％野香 优莉丝标样，95％野香优莉丝标样，50％野香优莉丝标样，5％野香优莉丝标样， 0％野香优莉丝标样，5个标样按野香优莉丝含量递减，相对基因表达量也呈现递 减关系，可以用标样定量未知检测样品野香优莉丝的含量(图3B)。

实施例4：野香优莉丝盲样纯度检测

对配置的两个野香优莉丝大米产品的盲样样品进行检测，按野香优莉丝水 稻品种纯度检测试剂盒操作说明进行DNA提取、荧光定量PCR扩增和数据分 析，结果显示(图4)，野香优莉丝在盲样中的含量为：样品1为4.3％，样品 2含48％，两个盲样的检测结果和配比基本一致，配比的含量：样品1为5％ 野香优莉丝，米样2含50％野香优莉丝。

结论：本发明是利用分子生物学方法定量检测野香优莉丝稻米掺伪，从稻 米样本中快速提取DNA，用开发的高效灵敏的野香优莉丝特异荧光探针和引 物进行荧光定量PCR扩增，通过设置内源参照基因与参照样本再对扩增数据 进行定量分析，从而对野香优莉丝纯度进行定量判断，结果直观，操作方便快 捷，且不受品种、地域、环境等带来的影响，检测更灵敏更高效。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 水稻野香优莉丝SNP标记及其应用

<130> 123

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> DNA

<213> 水稻()

<400> 1

ggtaactata tactccctcc gtcaaaaaaa acttaacttc tagagtccaa tttatcttca 60

gcayataaaa cgagaagtta tatcccttaa atatcattta cctacctatc actattacta 120

catt 124

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aaaacttaac ttctagagtc caattt 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atttaaggga tataacttct cgttt 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ggtaactata tactccctcc gtc 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cgagaagtta tatcccttaa at 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atcttcagca cataaaacga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atcttcagca tataaaacga 20

<210> 8

<211> 65

<212> DNA

<213> 水稻()

<400> 8

aaaacttaac ttctagagtc caatttatct tcagcatata aaacgagaag ttatatccct 60

taaat 65

<210> 9

<211> 124

<212> DNA

<213> 水稻()

<400> 9

ggtaactata tactccctcc gtcaaaaaaa acttaacttc tagagtccaa tttatcttca 60

gcatataaaa cgagaagtta tatcccttaa atatcattta cctacctatc actattacta 120

catt 124

<210> 10

<211> 65

<212> DNA

<213> 水稻()

<400> 10

aaaacttaac ttctagagtc caatttatct tcagcacata aaacgagaag ttatatccct 60

taaat 65

<210> 11

<211> 124

<212> DNA

<213> 水稻()

<400> 11

ggtaactata tactccctcc gtcaaaaaaa acttaacttc tagagtccaa tttatcttca 60

gcacataaaa cgagaagtta tatcccttaa atatcattta cctacctatc actattacta 120

catt 124

<210> 12

<211> 501

<212> DNA

<213> 水稻()

<400> 12

tgctggaacc agttcttgac agtggacttg taggaaagag gatcagtcga actcgactcc 60

gtacttgact gcttctgatt gaagctttgg ttcttaacta ttccatggat aaacaggatc 120

ggctctgttt aaacactcgc gttcatgcat tactcaagaa tttgatggtg atttatctgt 180

gggtgagggt aactatatac tccctccgtc aaaaaaaact taacttctag agtccaattt 240

atcttcagca tataaaacga gaagttatat cccttaaata tcatttacct acctatcact 300

attactacat tttctattga tgagggttat ttgggtcatt tttactcccc actaaatttg 360

ccttgggatg ttaggaatct ttttttttag gacagaggga gtacgagtta ttgatagaaa 420

tagatggact catagaatga gtgctttcgt cactttgttc catttccacc caagtacggg 480

aaatgagagg ccatgctaac t 501

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tggtgagcgt tttgcagtct 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ctgatccact agcaggaggt cc 22

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

tccgagccgt ccgtgcgtc 19

Claims (9)

1.一种分离的来自水稻的核酸分子，其含有SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于水稻基因组第3号染色体第10101815位。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子长度为10bp-640bp；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列至少包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或至少包括SEQID NO:8或10所示的核苷酸序列，或至少包括SEQ ID NO:9或11所示的核苷酸序列。

3.用于检测水稻基因组中的SNP标记的引物，其特征在于，所述第一SNP标记位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，

更优选地，所述引物选自：

(1)SEQ ID NO:2和3所示的序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:8或10杂交的序列或与其有至少90％相同性的序列；

(2)SEQ ID NO:4和5所示的序列或在严谨条件下与SEQ ID NO:9或11杂交的序列或与其有至少90％相同性的序列；和

(3)(1)和(2)所述序列的混合物。

4.用于检测水稻基因组SNP标记的探针，其特征在于，所述SNP标记位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，

优选地，所述探针具有(1)SEQ ID NO:6或7所示的核苷酸序列或在严谨条件下与SEQID NO:8-11中任一杂交的序列或与之具有70％序列相同性的变体，或(2)(1)的互补序列。

5.一种试剂盒，其含有用于检测水稻基因组中SNP标记的试剂，其特征在于，所述SNP标记位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，

优选地，所述试剂盒包含检测所述SNP标记的引物和任选的检测所述SNP标记的探针和任选的包含所述SNP标记的核酸分子，

更优选地，所述试剂盒包含：权利要求3所述的引物和任选的权利要求4所述的探针和任选的权利要求1-2中任一项所述的核酸分子。

6.鉴别水稻品种的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)检测水稻基因组中的SNP标记，其中，所述SNP标记位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，

(2)根据所述SNP鉴定水稻品种，其中，SNP为TT则鉴定为野香优莉丝，否则鉴定为非野香优莉丝。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测包括进行PCR；优选地，所述检测是荧光定量PCR或HRM检测。

8.检测样品中野香优莉丝含量或纯度的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)扩增该水稻基因组中含SNP标记的序列的步骤，其中，所述SNP标记位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，

(2)根据SNP标记的扩增结果确定野香优莉丝含量或纯度，其中，SNP为TT的扩增结果指示野香优莉丝的含量或纯度，优选地，所述扩增是荧光定量PCR，所述方法还包括根据扩增结果利用2^-ΔΔCT方法确定野香优莉丝的含量或纯度，

更优选地，所述2^-ΔΔCT方法包括：利用荧光定量PCR比较样品中的权利要求4所述的探针的CT值与内源参照探针的CT值，并将比较结果与对照的ΔCT相比得到ΔΔCT，和利用ΔΔCT确定野香优莉丝的含量或纯度。

9.检测水稻基因组中的SNP标记的试剂在鉴别水稻品种或检测水稻中野香优莉丝含量或纯度中的用途，或在制备用于鉴别水稻品种或检测水稻中野香优莉丝含量或纯度的试剂盒中的用途，其中，所述SNP标记位于水稻基因组第3号染色体第10101815位，

优选地，所述试剂包含权利要求3所述的引物和任选的权利要求4所述的探针和任选的权利要求1-2中任一项所述的核酸分子。

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