KR20130064197A - 한우 및 수입우 판별에 유용한 단일염기다형성마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한우 및 수입우 판별에 유용한 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커를 한우 및 수입우 판별에 이용하면 매우 간단하고 경제적인 방법으로 한우육과 수입우육을 정확하게 판별할 수 있다.

Description

한우 및 수입우 판별에 유용한 단일염기다형성마커 및 이의 용도{Single Nucleotide Polymorphism Marker Useful for Identification of Hanwoo from Imported Cow and Its Use}

본 발명은 한우 및 수입우 판별에 유용한 단일염기다형성(SNP)마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

한우는 오랫동안 우리나라에서 한국의 풍토에 적합하게 고정돼 온 한국의 재래 가축이다. 한우의 유전자원은 한국의 다른 재래가축들과 비교해 그 어느 축종보다도 외래 품종의 오염 없이 순수하게 보존되어 왔다. 그러나 순수 한우 집단의 특별한 보존과 격리 없이 과거 l0여년에 걸쳐 외국 소의 정액을 들여와 농가에 보급시킨 관계로 일부 한우에 외래 소품종의 유전적 요소가 섞이게 되었다. 이와 같이 해서 도입된 외래 유전 형질은 어떤 특성을 지니는지 파악하기가 불가능하기 때문에 불량 유전인자의 오염에 대해 방지할 수 있는 방법이 없다. 현재 한우 순종과 외래 소품종의 구별은 외형적 특징인 털 색깔 등의 표현형에 의존하는 방법이외는 없기 때문에 표현형으로 드러나지 않는 유전형질에 대해서는 파악할 길이 없다. 더욱이 표현형으로 구별되는 소의 품종이라 할지라도 소를 처리하여 고기의 상태로 변화시키게 되면 그 판별은 불가능하게 된다.

민병록 등(1995, Korean J. Anim. Sci., 37:p651)은 Random Amplified Polymorphic DNAs (RAPD) 기법을 이용하여 국내에서 소비되는 저가의 젓소, 수입소와 고가의 한우를 감별할 수 있는 방법, 특히 한우 특이적인 표지인자를 개발하였다. 이 연구에서는 특정 랜덤 프라이머(random primer)에 의해 한우와 수입소를 판별할 수 있으며, 한우와 젖소도 감별할 수 있음을 보고하였다.

정의룡 등(정의룡 et al, 2000, 동물 자원지, vol.42, p391-406) AFLP 유전자 지문 분석법을 이용하여 한우의 유전자 지문을 분석하고 품종 집단 내 유전적 변이성과 품종 특이적인 DNA 마커를 개발하여 중국 연변 황우 및 개량종(Holstein, Angus, Charolais, 및 Hereford)과의 품종 간 유전적 근연 관계의 분석을 수행하였다. 이 연구에서는 한우 특이적인 AFLP 밴드는 홀스타인(Holstein) 및 수입우 품종들과 명확히 구별되어 이들 품종 특이적인 DNA 밴드가 한우 품종 식별에 유용한 표지인자로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 김태중(김태중, 2004, J. Anim. Sci. Technol., 46:p897)은 한우와 홀스타인(Holstein) 및 블랙앵거스(Black angus) 수입소에 대한 감별법의 신속성, 편리성, 경제성 등의 단점을 보완하기 위해서 소의 MC1R 유전자의 SNP를 이용한 새로운 감별법을 보고하였다. 또한, 고바라다 등(고바라다, 2005, Korean J. Vet. Res. 45:p315)에 의하면 소의 모색관련 melanocortin 1 receptor (MC1R) 유전자와 관련된 한우와 홀스타인(Holstein) 품종을 간편하고 빠르게 구별할 수 있는 대립유전자특이적 다중 PCR(allele-specific multiplex PCR) 기법을 보고하였다. 즉, 대립유전자 특이적 프라이머(allele-specific primer)와 유니버설 프라이머(universal primer)를 이용하여 소의 MC1R 유전자 염기서열상에 존재하는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 확인하는 방법으로 한우와 젖소 고기를 구별하였다. 또한, 김상욱(김상욱, 2009, J. Anim. Sci. Technol., 51(4):273-282)은 초위성체 DNA 표지인자를 이용하여 국내 육우 집단의 품종특성 및 개체식별 체계 설정에 관한 연구로 마이크로새틀라이트 분석법을 이용하여 한우와 수입우의 식별방법을 보고하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 한우와 수입우를 구별할 수 있는 단일염기다형성(Single Polynucleotide Polymorphism, SNP) 마커를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 한우와 수입우에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 11개의 SNP 마커를 확인하여 선별하였고, 이 SNP 마커의 염기타입을 검출할 수 있는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머를 개발하였으며, 이를 사용한 대립유전자 특이적 PCR을 수행하면 한우와 수입우를 정확하게 판별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 SNP 마커 검출용 프라이머 또는 프로브를 포함하는 한우 및 수입우 판별용 키트(Kit)를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 SNP 마커를 이용한 한우 및 수입우 판별방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기를 포함하는 8-100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 및 수입우 판별에 사용하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 한우와 수입우에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 마커에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커는 소(bovine)에 적용되며, 가장 바람직하게는 한우와 수입우에 모두 적용된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "한우(韓牛, Korean Cattle, Hanwoo)" 는 종래부터 한반도에서 운반용이나 농경용으로 사육해오던 재래종의 역우(役牛)를 말하는 것으로 한국소(Bos taurus coreanae)를 의미한다.

본 발명의 명세서에서 용어“수입우”는 한우를 제외한 외국으로부터 수입된 모든 외래 품종의 소를 의미한다. 수입우 품종의 구체적인 예로는 헤리퍼드(Hereford)종, 홀스타인(Holstein)종, 앵거스(Angus)종, 브라만(Brahman)종, 리무진(Limousin)종, 저지(Jersey)종을 들 수 있다. 본 명세서에서 용어 "비한우"는 상기 "수입우"와 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명에서 11개의 각 SNP 마커들이 한우와 수입우의 판별에 사용할 수 있는 것은 각 SNP 변이 위치에서 특정의 염기가 수입우 또는 한우 특이적으로 높은 빈도로 나타나는 것에 근거한 것이다.

구체적으로, 상기 SNP들은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 각각 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기에 위치하는 SNP 마커이다.

본 발명자들은 상기 SNP들의 SNP 위치에서 특정 염기 타입이 한우 및 수입우에 특이적으로 연관되어 있음을 확인하였다. 예를 들어, 서열번호 1에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 R(A/G)로 나타나며, 수입우에서는 A 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 2에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 Y(T/C)로 나타나며, 수입우에서는 T 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 R(A/G)로 나타나며, 수입우에서는 A 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 4에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 M(A/C)로 나타나며, 수입우에서는 A 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 5에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 R(A/G)로 나타나며, 수입우에서는 A 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 6에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 R(A/G)로 나타나며, 수입우에서는 A 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 7에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 R(A/G)로 나타나며, 수입우에서는 A 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 8에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 K(T/G)로 나타나며, 수입우에서는 T 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 9에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 K(T/G)로 나타나며, 수입우에서는 T 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 10에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 Y(T/C)로 나타나며, 수입우에서는 T 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 서열번호 11에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 Y(T/C)로 나타나며, 수입우에서는 T 염기타입이 한우에 비해 특이적으로 빈번히 나타난다. 따라서, 소의 생물학적 샘플로부터 얻은 지놈 DNA 상에서 본 발명의 SNP 마커의 염기 타입을 검출하면 한우육과 수입우육을 판별할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 본 발명의 키트에서 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 A 이고, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 T 이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 키트에서, 상기 8-100개의 연속된 뉴클레오티드는 핵산 증폭을 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 프라이머 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브이다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 한우 및 수입우를 판별하는 방법을 제공한다: (a) 소의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계; (b) 상기 지놈 DNA에서 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)의 염기 타입을 검출하는 단계로서, 상기 SNP는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기 위치에 존재하는 SNP로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 SNP인 단계; 및 (c) 상기 검출한 SNP 위치의 염기 타입으로부터 한우 및 수입우를 판별하는 단계.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 지놈(genomic) DNA는 우육의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있다. 지놈 DNA의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예컨대 페놀-클로로포름(Phenol-Chloroform) 추출 방법에 따라 실시될 수 있다(Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF., Nucleotic Acids Res. 16, p1215. 1998).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)의 SNP의 염기타입의 검출은 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오티드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립유전자-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 방법에서, 상기 SNP는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기가 A 인 SNP; 및 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기가 T 인 SNP이다. 상기 SNP들은 한우 보다 수입우에서 더 높은 비율로 나타나는 SNP 염기 변이이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 상기 방법의 단계 (c)에서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기가 A인 SNP; 및 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기가 T인 SNP로 이루어지는 SNP 군 중에서 2개 이상의 SNP, 바람직하게는 3개 이상의 SNP, 보다 바람직하게는 4개 이상의 SNP, 보다 더 바람직하게는 5개 이상의 SNP, 가장 바람직하게는 6개 이상의 SNP가 검출되는 경우 수입우로 판별한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 33의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 한우 및 수입우의 판별에 유용한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 1의 301번째의 R(A/G) 염기에서 A 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 A 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다(도 1 참조). 이 프라이머쌍에 의해 300bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 2의 301번째의 Y(T/C) 염기에서 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 270bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 3의 301번째의 R(A/G) 염기에서 A 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 A 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 250bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 4의 301번째의 M(A/C) 염기에서 A 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 A 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 230bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 5의 301번째의 R(A/G) 염기에서 A 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 A 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 210bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 6의 301번째의 R(A/G) 염기에서 A 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 A 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 190bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 7의 301번째의 R(A/G) 염기에서 A 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 A 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 175bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 8의 301번째의 K(T/G) 염기에서 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 160bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 9의 301번째의 K(T/G) 염기에서 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 145bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 10의 301번째의 Y(T/C) 염기에서 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 130bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명에서 서열번호 33의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 서열번호 11의 301번째의 Y(T/C) 염기에서 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 서열번호 33의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로써, 이 프라이머는 야생형의 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 이 프라이머쌍에 의해 115bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 프라이머세트는 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 내부대조군(internal control) 프라이머쌍을 더욱 포함한다.

본 발명에서 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍은 25번 염색체의 MDH2 (Malate DeHydrogenase 2) 유전자, 보다 구체적으로 서열번호 12에 나타내는 MDH2 유전자 서열의 일부 서열을 증폭할 수 있도록 설계한 프라이머쌍이다. 이 프라이머쌍은 100bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 생성하고, PCR 반응의 내부대조군으로 사용된다. 이 프라이머쌍에 의한 PCR 증폭산물 생성은 중합효소연쇄반응(PCR)이 정상적으로 수행되었음을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 한우 및 수입우의 판별에 유용한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공한다.

본 발명의 PCR용 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 한우 및 수입우를 판별하는 방법을 제공한다: (a) 소의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계; (b) 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 상기 프라이머세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계; 및 (c) 상기 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 분석하여 한우 및 수입우 여부를 판별하는 단계.

이하에서 본 발명의 방법을 더욱 상세히 설명한다.

단계 (a): 소의 생물학적 샘플로부터 지놈( genomic ) DNA 를 얻는 단계

소의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는다. 소의 생물학적 샘플은 예를 들어 소의 다양한 세포 또는 조직으로부터 얻을 수 있으며, 이러한 세포 또는 조직의 원천의 예로는 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기 등이 있다. 본 발명의 방법에서 지놈 DNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예컨대, 페놀-클로로포름(Phenol-Chloroform) 추출 방법에 따라 실시될 수 있다(Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF., Nucleotic Acids Res. 16, p1215. 1998).

단계 (b) : 지놈 DNA 를 주형으로 사용하고, 상기 프라이머세트를 사용하여 중합효소연쇄반응( PCR)을 행하는 단계

상기 단계 (a)에서 준비한 지놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 설명된 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행한다. 상기 중합효소연쇄반응은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 중합효소연쇄반응에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 본 발명에서 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다. 한편, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성 (pre-denaturation) 과정, (ⅱ) 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 행한다.

단계 (c) : 상기 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 분석하여 한우 및 수입우 여부를 판별하는 단계

상술된 본 발명의 11종 또는 12종의 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 산물은 모두 다른 크기의 DNA 증폭산물 밴드를 형성한다. PCR 증폭된 DNA 증폭산물은 당업계의 공지된 방법, 예를 들어 아가로스 젤에서의 전기영동 및 EtBr 염색 및 자외선 조사에 의한 시각화에 의해 관찰할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 서열번호 13 내지 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍에 의해 증폭되는 증폭산물생성 확인은 수입우일 가능성을 나타낸다. 즉, 본 발명의 프라이머세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 생성되는 증폭산물의 개수가 많아질수록 수입우일 가능성이 높다. 본 발명 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머세트를 사용한 PCR 증폭에 의해, 2개 이상의 증폭산물의 생성, 바람직하게는 3개 이상의 증폭산물의 생성, 보다 바람직하게는 4개 이상의 증폭산물의 생성, 보다 더 바람직하게는 5개 이상의 증폭산물의 생성, 가장 바람직하게는 6개 이상의 증폭산물이 생성되어 확인된 경우 수입우로 판단한다.

본 발명은 한우 및 수입우 판별에 유용한 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커를 한우 및 수입우 판별에 이용하면 매우 간단하고 경제적인 방법으로 한우육과 수입우육을 정확하게 판별할 수 있다.

도 1은 서열번호 1에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 2은 서열번호 2에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 3은 서열번호 3에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 4은 서열번호 4에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 5는 서열번호 5에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 6은 서열번호 6에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 7은 서열번호 7에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 8은 서열번호 8에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 9은 서열번호 9에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 10은 서열번호 10에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 11은 서열번호 11에 표시되는 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 12는 서열번호 12에 의해 표시되는 내부대조군 증폭부위(MDH2) 유전자 증폭부위)와 이 부위를 증폭하여 검출할 수 있는 서열번호 35 및 36의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 13은 본 발명의 SNP 대립유전자 특이적 프라이머의 작용 메카니즘 모식도이다.
도 14는 본 발명의 SNP 대립유전자 특이적 프라이머, 이를 이용한 다중 PCR 및 아가로스젤 상의 PCR 증폭산물의 밴드 패턴을 모식적으로 보여준다.
도 15는 본 발명의 프라이머세트를 사용하여 다중 대립유전자 특이 PCR (multiple allele specific PCR)을 수행한 결과를 보여준다. M: 1 kb ladder, 1: 미국산 수입우, 2: 호주산 수입우 1, 3: 호주산 수입우 2, 4: 한우 1, 5: 한우 2, 6: 한우 3, 7: NTC (non template control).
도 16은 본 발명의 다중 대립유전자 특이적 PCR의 재현성 테스트를 수행한 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험의 재료 및 방법

1. 공시 재료

본 발명 실험에 사용한 공시재료는 국립 농산물 품질관리원 시험연구소에서 제공한 한우 48두, 수입우 384두를 사용하였다. 지놈(genomic) DNA 추출을 위해 시료로부터 세포를 포함하는 시료를 채취하였다.

2. DNA 추출 및 농도 측정

시료로부터 지놈(gnomic) DNA의 추출 및 정제는 Miller 등의 방법(Miller EU SS, Dykes ADD, Peoples HF. Nucleonic Acids Res. 16, p1215.(1998))을 일부 보완하여 실시하였다. 추출 및 정제한 지놈 DNA의 정량 분석은 Spectrophotometer AND-1000(Nanodrop, USA)을 이용하였으며, 260 - 280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도와 순도를 확인하였다. 멸균증류수를 이용하여 모두 25 ng/㎕로 보정한 후 실험 사용 전까지 -20℃에 보관하였다. 재현성 테스트에 사용한 한우 1000 여두는 농협 축산물 연구소에서 지놈 DNA 상태로 받아 사용하였고, 수입우 1000 여두는 국립 농산물 품질관리원에서 고기상태의 시료를 받아 사용하였다.

3. SNP 마커의 1차 선별

Bovine SNP 50K chip(Illumina, Inc. San Diego, CA 92121 USA)를 사용하여 총 52677개의 SNP 마커중에서 수입우 특이적인 SNP 마커를 1차 선별하였다(하기 표 1 참조).

4. SNP 마커의 Mass Array 분석

1차 선별된 15개의 SNP 마커에 대해서 한우 558두에 대해 SNP 타이핑(typing)을 수행하였다. 또한, 한우 및 수입우에 대한 SNP 타이핑 결과를 얻기 위하여, 농산물 품질관리원으로부터 받은 한우 48두 및 수입우 384두를 대상으로 Mass Array를 행하였다.

5. SNP 마커 및 대조군 마커 선별

기존 한우 SNP 타이핑 결과와 Mass Array 분석 결과를 바탕으로 15개의 SNP 마커 중에서 11개의 SNP 마커를 한우 및 수입우 판별 마커로 확정하였다(하기 표 2 참조). 한편, PCR이 정상적으로 수행되었는지 여부를 확인하기 위하여 MDH2 (Malate dehydrogenase 2) 유전자를 양성 대조군 타겟 유전자로 설정하였다.

6. SNP 마커 검출용 대립유전자 특이 PCR 프라이머 디자인

최종 선별된 11개의 SNP 마커에 대해, 다중 대립유전자 특이 PCR을 수행하기 위한 전방향 및 역방향 프라이머를 디자인하였다. 11개의 각각의 SNP 마커에 대해 300bp 이하, 100 bp 이상의 각기 다른 크기의 PCR 증폭산물이 생성될 수 있도록, 대립유전자 특이적 프라이머를 디자인하였고, 양성대조군으로 사용할 MDH2(Malate DeHydrogenase 2) 유전자 서열에 대해서는 100 bp의 PCR 증폭산물이 생성되도록 디자인하였다(하기 표 4 참조).

7. 최종 SNP 마커의 다중 대립유전자 특이 PCR 반응 조건

다중 대립유전자 특이 PCR 반응은 주형 DNA (25 ng/㎕) 2 ㎕, 프라이머 믹스 3 ㎕(표 4 참조), 2X multiplex-pre mix (SolGent, Korea) 12.5 ㎕, 증류수 8.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕의 반응액을 사용하였다. PCR 반응에는 PTC-200 (MJ research, USA)을 사용하였고, PCR 반응조건은 95℃에서 15분간 전-변성(pre-denaturation)을 실시한 후 95℃에서 20초간 변성, 64℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1 분간 연장(extention)을 30 사이클 수행한 후 마지막으로 72℃에서 3분간 최종 연장 과정을 수행하였다. 주형(template)은 한우 3두와 미국산 1두, 호주산 2두의 지놈 DNA를 이용하였으며, 음성 대조군(negative control)로는 증류수를 사용하여 교차오염을 확인하였다. PCR 증폭 산물은 증폭된 단편의 크기가 예상된 대립유전자 크기 범위 내에 존재하는지, PCR 조건의 적정성 여부를 확인하기 위하여 EtBr(ethidium bromide)이 포함된 3％ 아가로스 젤에 전기영동하고 UV상에서 관찰하였다.

8. SNP 마커의 다중 대립유전자 특이 PCR - 재현성 테스트

재현성 테스트에 사용한 한우 1037두는 농협 축산물 연구소에서 지놈 DNA 상태로 받아 사용하였고, 수입우 1112두는 국립 농산물 품질관리원의에서 소고기 시료를 받아 사용하였다. 소고기 시료는 지놈 DNA prep. kit (SolGent, Korea)을 이용하여 지놈 DNA를 준비하였다.

실험결과

1. SNP 마커의 1차 선별

총 52677개의 SNP 마커 중에서 수입우 특이적인 마커를 선별하였다. SNP의 빈도(frequency)가 한우에서는 낮고 수입우에서는 높은 15개의 마커를 선별하였다(하기 표 1 참조).

2. SNP 마커의 확정

15개의 1차 선별 SNP 마커를 대상으로 한우와 수입우의 SNP 빈도를 알아보기 위하여 Mass array 실험을 수행하였다. 한우는 558두와 48두, 총 606두를 대상으로 수행하였으며, 수입우는 384두를 대상으로 수행하였다. 실험 결과 총 15개의 마커중에서 수입우에서 특이적으로 높은 빈도를 나타내지만, 한우에서는 낮은 빈도를 보이는 11개 마커를 최종 확정하였다(하기 표 2 참조). 최종 확정한 11개 SNP 마커는 각각 52956, 57585, 7563, 49078, 20572, 7581, 56027, 23765, 15562, 57585, 49615 이었다. 또한 PCR의 정상적인 실행 여부를 확인하기 위한 양성 내부대조군(positive internal control)로서는 House keeping 유전자인 MDH2(Malate DeHydrogenase 2)를 타겟 유전자로 사용하였다.

3. 한우 및 수입우 판별에 대한 기준값 설정

내부 양성 대조군 마커를 포함하여, 총 11개의 마커를 대상으로 한우와 수입우를 구분할 수 있는 기준은 기존의 한우 타이핑 결과와 Mass Array 결과를 함께 통계 분석하여 설정하였다(표 3 참조).

PCR 산물 개수	한우(％)	수입우 (％)
11/11	0.0	14.3
10/11	0.0	23.4
9/11	0.0	21.4
8/11	0.0	15.4
7/11	0.0	7.0
6/11	0.0	8.6
5/11	0.0	4.7
4/11	0.2	2.6
3/11	4.5	1.0
2/11	14.9	1.0
1/11	36.9	0.5
0/11	43.5	0.0

기준값을 1개의 마커(marker) 중에서 '4'으로 설정하여, 4개 이하의 PCR 증폭산물이 나타는 경우에는 한우로 판별하며, 5개 이상으로 나올 경우에는 수입우로 판별한다. 이러한 기준값에 의한 판별의 판별율은 한우의 경우 100.0％ 한우 판별율을 가지며, 수입우는 94.9％의 수입우 판별율을 갖는다.

4. 최종 SNP 마커의 다중 대립유전자 특이적 PCR 프라이머 디자인

최종 선별된 SNP 마커를 이용하여 한우 및 수입우를 판별하기 위하여, 수입우에서만 특이적으로 반응하는 대립유전자 특이적 프라이머를 디자인하였다. 예를 들어 '52956' SNP 마커(서열번호 1에 개시된 염기서열에서 301번째 염기)에서 수입우 특이적인 ‘A’대립유전자 특이적 프라이머를 디자인하였다. 나머지 10개의 SNP 마커에 대해서도, 수입우 특이 대립유전자 특이적 프라이머를 디자인하였다(표 4).

상기 표 4에서 서열번호 13의 프라이머(SNP No. 52956의 전방향 프라이머)는 고정된 대립유전자 특이적 PCR 프라이머이다. 상기 프라이머들은 SNP 변이염기에 대한 결합 특이도를 향상시키기 위해 야생형(wild type)의 염기 위치에 미스매치(mismatch) 염기가 삽입되어 있다. 각 프라이머에서 미스매치 염기는 대문자로 표기되어 있다. 한편, 디자인한 대립유전자 특이적 PCR 프라이머들의 경우 PCR 증폭산물의 강도를 고려하여 반응당 프라이머의 농도를 조절하였다.

5. SNP 마커에 대한 다중 대립유전자 특이적 PCR

수입우 3두(미국산 1두, 호주산 2두)와 한우 3두를 대상으로, 상술한 바에 따라 디자인한 프라이머 세트를 사용하여 다중 대립유전자 특이적 PCR을 진행한 후, 3％ 아가로스 젤 상에서 증폭산물을 확인하였다. 도 12에 나타낸 결과를 보면, 한우의 경우 100bp의 내부대조군(MDH2 유전자) 증폭산물을 제외한 다른 PCR 증폭산물을 검출되지 않은 반면, 수입우의 경우 다수의 SNP 마커에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출됨을 확인할 수 있다.

6. SNP 마커의 다중 대립유전자 특이적 PCR의 재현성 테스트

재현성 테스트에 사용된 한우 1037두는 농협 축산물 연구소에서 지놈 DNA 상태로 받아 사용하였고, 수입우 1112두는 국립 농산물 품질관리원에서 우육 시료를 받아 이로부터 지놈 DNA를 추출 정제하여 사용하였다. 아래 표 5는 본 발명의 키트 및 방법을 사용하여 한우와 수입우의 판별을 수행한 결과를 정리하였다. 이 결과에 의하면, 본 발명에 의해 한우와 수입우를 98％ 이상의 정확도로 판별할 수 있음을 알 수 있다.

도 16은 본 발명의 다중 대립유전자 특이적 PCR의 재현성 테스트를 수행한 결과를 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> National Agricultural Products Quality Management Service Solgent Co. Ltd. <120> Single Nucleotide Polymorphism Marker Useful for Identification of Hanwoo from Imported Cow and IIts Use <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 1 aggactgatg tcctttagga tggactggtt ggatctcctt gtagtccaag ggactctcaa 60 gagtcttctc caacaccaca gttcaaaacc atcaattgat gggagaaact ggatgtggga 120 aaaactgggt cttgctctag tggacggggc catgctcagt aaatcgttaa tccaattgtc 180 ttctgatggg tgcagctgtg ctccctcctt gttcattgtt tgacctaagg tgatgcagtt 240 ccagattcta taggcaataa cttaatatat actgacagtt ccttttggtg tgtttcactt 300 rcttggtatt ggctagcttt gtacatctca ctcctctttt gctcaagaca tatgaaaaaa 360 attaaaagtt ttattcccat aatttttgga aagataaata taaacataaa tatctatctt 420 tctaaaatga agaaaaatta gtccatgggg attctccagg caagaatact ggagtgagtt 480 gccatgccct cctccaggag atcttcccaa cccagggatc aaaccaaggt ctcccacatt 540 gcaggcagat tctttatctg agccaccaag gaagccttta tgaatgttta gtaaaagtta 600 a 601 <210> 2 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 aaccttgcta ataataaact agattaaagc caacaacaaa ccaaatgact tttaactctc 60 gtggaagcag aaaggaaaaa aacaacagtt taagagaaag aaggcttgtg gagaatcaat 120 aaattaagaa ctgcagattg tgacattatt atcctgtaaa tactcctttg tggtactttc 180 aggatctctt caaacaaaga aatagaaaat taacaaactc atccaatatt atcatggaac 240 aaatgcaatc aaggtgaaat actggtgctc tcagagcctg aagaggggcc cggggcaaac 300 yactgagtgt tctcatcccc taacattttt aatagcatta gaagtggcca tcaagagcag 360 ccttgagagg aggcatggag aactccgaaa tggacggcag accttctgga cattgtatcc 420 ggcagccagc cctgataccc ccatgtatat aactcactaa ccactgcata agtatagact 480 ttgggtattt atgagcactt gtggcatctc ctttgcccta cttgtcacct gtctagccat 540 tgcaacctct ggtcatcaat gatcagcaaa taccaagaac agtaccttcc aatgaaaaga 600 a 601 <210> 3 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 3 gtcgctaggt catgttcgac tctttgtgac cccatgcact atagcacgcc aggcttccct 60 gtccttcacc atctcccgga gtttgctcct ggagcaaact tggatgttgc cacccaaccg 120 tctcatcgtc tgttgtcccc ttcttctcct gctctcaatc tttcccagca tcagggtctt 180 ttccagtgag tcagttcttc acatcaggtg gccgaataat tggaacttca gctttagcat 240 cagtccttcc agtgaatatc caggattgat ttcctttttg cttataaaaa tgatactcct 300 rtttttctga taagcaaaca gtggcccaga aaaaaattca tcattctgtg caaccagagc 360 cacacaaggg actgggggtg gaacccagat acaaattcag gtgtgtctgg ctgcaaagac 420 cgtttcagaa aacctacagt gtccacagga tcagggcttc tcctcttggg aatttcctct 480 tagcccttca ggctggagct gttcagagac atctgtgtta gttgaggaaa tggcctcagg 540 gctgaaaagg ccctcagaga agggaagtga cttgccacac agccagtttg tggcgcagct 600 t 601 <210> 4 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 4 attgccaggt gggtatagaa atcaagattc tccactctgg ctccactgac ccaccaggtg 60 caagccttca tgtttccaca ggcagaactt ggagttttgg ctctccacta ggactctgaa 120 aacactgccc aagctgggag aggagaaaca cctccatttc cacaagatct caaaggatgc 180 ctatttatat tgatgacatt aatggtcaga tcaaaggatg cctatttata ttgatgacat 240 taatggtcag aaaagtcata ccttctgaaa tgtcattgtc ctagtgtaca attctgcccc 300 maaatcagat tcaccccatg agaggtgggg agagagacct agaaacagta ttgtactgaa 360 acagtctcca ttgtccatcc tagacatcat attaaaaagg agagacatga ctttgctgac 420 aaaggtccaa acagtcaaag ctatggtttt tccagtaatc atgtatggat gtgaccatta 480 gaccataaat aaggccgagc actgaagaat cgatgctttt gaactgtggt gctggagaag 540 actcttgaga gtctcttgag agcaaggaga tcaaaccagt caatcctaaa ggatatcaac 600 c 601 <210> 5 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 5 cacaggttta atccctgatc caggaaaacc ccacatgctg ggcggcaacc aagcccatgc 60 gccacaacta ctgagcctgt gctccagaac ccaggagcca caactactga gcctgtgctc 120 cagaacccag gagccacact actgagcctg tgctccagaa cccaggagcc acactactga 180 gcctgtgctc cagaacccag gagccacact actgagccta cgtgccgtca ctactgaggc 240 ctgagcacct agagcccgta ggcgacaaga gaagccacta cagtgagaag cccgtgtgcc 300 rcaactagag gaggcccggc acagccaaaa agaaagaaat aaattaaatt ttaaaaaaga 360 aagaacactt gagggacttc cccggtggtc cagtggctaa gactccgtgc gcccaatgca 420 ggggcccagg ttcaatcccg ggtcagggaa ctagatgcca caaccaagac ccagtgcagc 480 caaataaata aatgaaataa atattcaaga ggaaataaaa aagaatactt gagatatgag 540 agaacatcag ctagccgaca tttgctgaac tctatttcag aaaactaaac ttccacaaac 600 a 601 <210> 6 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 6 catcttgggc tgcatgcatc cctggaccct gcccgccgcc tcatttcctg ccgtgccact 60 tctggtgcac ctggaaagca gccttccctc ttcagggctg gccttgcctg ctcccctcct 120 tcctgcctcc cggggctgtc cttggcctct ctgcctttcc catcaggagc tccgtctcca 180 cagcgtgggc agagtggagc ttgctgcagg ggcttgtgaa ggatgcaggt ggactgtttg 240 caacactggt cccaacggac cccaccccag gtgcagaggc agggcctccc ggagacaggc 300 rcctccatcc ccagaactcc caaatccctc ttgtttgtcc tccgtctgtc ctcccagctc 360 agacctcatc atctctggcc taccctgcat cagtcttttg cctcttaacc ccctcaatcc 420 ctatcatttc aggaagaact cagaaccaaa atgctgattg cagaatcccc taattgttga 480 ccctcctctt ttcccagatg aagcccaagc ttcttgacct ttaagtcccc tcctcccttt 540 ccaccctaaa tccatgctca gcccccatat ctcagaggag cttctgtgct cctacagccc 600 t 601 <210> 7 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 7 tccattcatc tatccattgt ccaaagaaga gtcactgagc acctcccatg tgctaggctc 60 tgctgaaaag ttggtgctgt aggatgaagc tttctggtac ggtgacacag ataataacaa 120 aataggaagc aaggttatag aaggtgctct gtcatgagga agaccaggag agttagtgat 180 gggatgcagc agaatgctgg ccaagaaaca attcacaaac acgctctcca agggagtggg 240 tttagacccg aaggagccag gtaggcttgg agacttggca gtggaattct gggcagaaag 300 rgctgcaggt cctaagacta ggggctggag cagctcttgg aactatagga gcctgagtct 360 ctgagtttga tgatcagggg caaggtcaga aacgtaggtg aggatcaggt caagatgctt 420 tgggtctgga agtgagtttg ggttttgttc taacctgaga gggccccttt ggggggctta 480 catctcctgt tcacatcagg ctctgattga cacgggcaga gagcacactg gctagtgctg 540 gagggtggtt tgtggggggc agaatgccaa cagcaggagc agctcagaaa ctcttctgca 600 c 601 <210> 8 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 8 tgttacgggg ctgaaccaac cagagccctc ccctgctcct gcctgagccc ttttgtcagg 60 gcccgggaac cttcctttcc agattcccgc tgcagactac catctctctt gctctttcca 120 cggacgaaat atttggggaa aaatattaca gtttcactgc actgtgtttt ttcttgttgg 180 ttgtataaag ataaatatat tcttatctta aataagataa gtgttcctga cacttgactg 240 agatgtcttg gtaaaaataa aatgaagaac tgagcacagc atctggtttt ggggcccctt 300 kcgggttcat caggggctgg gtccatgaac aagcccaaat ccaaccacag gagctcccag 360 aaaggagacg gaggccgggg tcccacagcc tcagacatcc tgggagaaac 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<211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 10 cagagtgtca cctgacacca gccctgcccg gtgcgtgggg ccctggccag agccgtccgc 60 gggccctcac cctggccgcg ctgcgggcct gctccccagc cctgcgcgcg ctcaccgcct 120 tccgcagggt cctgtccctg cagcgtgcct gccgcaccat gtgtgggggg cacctgagcc 180 tccacggggg aagcacccca acatgtggaa ggacaggcgt gatgagtgac ggccagagac 240 gagacggggg cggtgggggc gggggagctg gcaggaggag gaggaacacc atcaagcaag 300 ycaacgcttt ccaagcgcga gctcatgcct gctgagcagt ttggcccttt ctgattaata 360 aacaagcttt accatcctcc gggccagtta ttcttcataa aaccctacaa ggcaggtcaa 420 tatttttaca ttcaatttta tggatgagaa aacagaggtt tttgatgtct ccaaggtcac 480 aaggcaaaca ggctgagact tgggctgatc agctccggga cctcgaggca ggcctggccc 540 tcggcctgtc ccctgaccac ccgaccagct gacctggggt ggcgctgggg accgcagggt 600 g 601 <210> 11 <211> 601 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 11 tcttccttca ggaggtcaca gtttctggca tcagaaaaac tcactgtgat tcactagcta 60 ggtgaccttg ggacagatta cttaaggcct ctgagtcttg gattcctgtt gagtaaaatg 120 gggctaataa tacctggcaa agctgatatt aggactgact gggataatgc atgcacagtg 180 ggctggctct gggcccactc taggccggaa gcatcattgc cattattatt attattatct 240 gatatttcat gaagagatga agaggatggt ggtggtggta atgatgagag ctccaggtac 300 ytgagagttc gctgtgttct gcggcctctg acgtggtctc tttatgtccc ttttatatgt 360 aggtagaaaa actgagacag ggagaactta aataattcac tcccgttcac actctgaaat 420 tctagagcag aggatttgaa acaagcatct ccaatccaga accctcatcc ttaaccatgg 480 caaattcttc ataaacatca tttgcagtgg ttgcctgatt tctacgaaag agaatattgc 540 atcaagtgtc tttgtcttat tgttagatat tttgagtgtt tcccctttat tacaaacaac 600 a 601 <210> 12 <211> 400 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 12 gtaggaatac cttcgcctct tcgtttggga ccactgcagt aaaagaggcc aggggccgca 60 gtctgcagtt tttacgtgtg aatcctttta atgctgagtc cgtcttcaga gtcctctctc 120 tctgcctctt tctagaacaa tgctaaagta gccgtgctgg gggcctctgg aggaattggg 180 cagccgcttt cgcttcttct gaagaacagc ccgttggtga gccgcctgac cctctacgat 240 atcgctcaca cgcccggagt ggccgccgac ctgagccaca tcgagaccag agcgaccgtg 300 aaaggtactg ggcccgctga ccccacagac ctttcacctc ttctccccag gagaccagga 360 tccaggttta gagtgagatt cttgggtgga actaggtgtt 400 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 tgacagttcc ttttggtgtg tttcgatta 29 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 cttccttggt ggctcagata aag 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 cgtggaagca gaaaggaaaa aaac 24 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 atgttagggg atgagaacac tcaata 26 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 ccggagtttg ctcctggagc 20 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 gccactgttt gcttatcaga aagat 25 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 tcattgtcct agtgtacaat tctgaacca 29 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 gtgctcggcc ttatttatgg tc 22 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 actacagtga gaagcccgtg tgaca 25 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 tatttggctg cactgggtct tg 22 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 gtccttggcc tctctgcctt t 21 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 ggatttggga gttctgggga tgacggt 27 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 ggcagtggaa ttctgggcag aacga 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 26 agaacaaaac ccaaactcac ttcc 24 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 atctggtttt ggggccccat t 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 gaagataccc actgcatcgc ag 22 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 29 acgcccctgg cctggtccc 19 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 ccagtagtct ttgtgcagca ggata 25 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 gaggaggagg aacaccatca agacagt 27 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 32 gttttatgaa gaataactgg cccg 24 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 tggtaatgat gagagctcca ggtgct 26 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 aagttctccc tgtctcagtt tttc 24 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 35 ggggcctctg gaggaattgg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 36 ctccgggcgt gtgagcgata 20

Claims (9)

1. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기를 포함하는 8-100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한우 및 수입우 판별에 사용하기 위한 키트.
   
2. 제 1 항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 A 이고, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기는 T 인 것을 특징으로 하는 키트.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 8-100개의 연속된 뉴클레오티드는 핵산 증폭을 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브인 것을 특징으로 하는 키트.
   
4. 다음의 단계를 포함하는 한우 및 수입우를 판별하는 방법:
   (a) 소의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
   (b) 상기 지놈 DNA에서 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)의 염기 타입을 검출하는 단계로서, 상기 SNP는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드에서 301번째 염기 위치에 존재하는 SNP로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP인 단계; 및
   (c) 상기 검출한 SNP 위치의 염기 타입으로부터 한우 및 수입우를 판별하는 단계.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 SNP는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기가 A인 SNP; 및 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기가 T인 SNP인 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 33의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 한우 및 수입우의 판별에 유용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 프라이머 세트.
   
7. 제 6 항에 있어서, 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 내부대조군(internal control) 프라이머쌍을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 한우 및 수입우의 판별에 유용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 프라이머 세트.
   
8. 제 6 항 또는 제 7 항의 프라이머 세트를 포함하는 한우 및 수입우의 판별에 유용한 중합효소연쇄반응((polymerase chain reaction, PCR)용 키트.
   
9. 다음의 단계를 포함하는 한우 및 수입우를 판별하는 방법:
   (a) 소의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
   (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 상기 제 6 항 또는 제 7 항의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계; 및
   (c) 상기 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 분석하여 한우 및 수입우 여부를 판별하는 단계.
   

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