JP2009225700A

JP2009225700A - ニワトリ由来試料のｄｎａ鑑定方法

Info

Publication number: JP2009225700A
Application number: JP2008073217A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Sakagami; 正行坂上
Original assignee: BIO REGENERATIONS KK
Current assignee: BIO REGENERATIONS KK
Priority date: 2008-03-21
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2009-10-08

Abstract

【課題】鶏肉、鶏卵又はその加工品が、名古屋コーチン由来か否かを厳密に識別する方法を提供する。
【解決手段】鶏肉、鶏卵又はその加工品から抽出したＤＮＡを含む試料を用いて、ニワトリゲノムにおける識別番号ＡＢＲ０２５７のマイクロサテライト多型を解析し、前記ＡＢＲ０２５７マイクロサテライト多型が、複数の特定の配列からなる塩基配列の何れとも異なる塩基配列を有するＤＮＡからなるとき、前記試料が名古屋コーチンとは異なる品種のニワトリ由来の細胞を含むことを示す。
【選択図】なし

Description

本発明は、ニワトリ由来試料のＤＮＡ鑑定方法に関し、より詳しくは、名古屋コーチンとその他の品種との違いを識別する方法に関する。

食物のトレーサビリティーは、特定の食物について、その生産から販売に至るまでのすべての段階を追跡する能力であると規定されている。そして、食物の安全性を確保するという観点から、農産物業界において益々必要な技術となっている。ＤＮＡ鑑定技術は、製品が由来する動物種まで追跡することができるため、現在の食肉の追跡システムを精密化する上において重要な役割を果たしている。

鶏肉及び鶏卵の両方を生産するための品種である名古屋コーチンは、わが国の愛知県における有名な地鶏である。名古屋コーチンは、その特徴的な外観と共に優れた食味でも有名であり、ニワトリの多様な品種の中でも特に高いブランド価値を持っていると言われている。近年、ニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいはニワトリの体細胞が名古屋コーチンであるか否かを識別できるＤＮＡマーカー、及びこれを利用して名古屋コーチンを識別する方法が報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照）。この方法は、ニワトリゲノムＤＮＡに存在する数多くのマイクロサテライト多型の中で、５つのマイクロサテライトマーカー（ＡＢＲ００１５、ＡＢＲ０２５７、ＡＢＲ０４１７、ＡＢＲ０４９５、及びＡＤＬ０２６２）が名古屋コーチンにおいて単一の対立遺伝子（アレル）を有するという事実に基づいている。市販されている名古屋コーチンはこれらのマーカーについて固定されているため、その均一性を検出することによって、これらのマーカーの少なくとも１つに多型性を有する他のすべてのニワトリと識別できることが報告されている。

本発明者も、これらの５つのマイクロサテライト多型を検出するための簡便法を開発し、すでに報告している（非特許文献２参照）。

特開２００７−２３６２９８号公報 Nakamura et al., Poult Sci. (2006) Vol. 85:2124-2129 Takahashi, H. and Sakagami M. Animal Science Journal (2008) Vol. 79, pp.138-141

しかしながら、これらのマーカーを用いて市場に出回る各種の鶏肉、鶏卵又はその加工品について、名古屋コーチン由来か否かのＤＮＡ鑑定を行うと、ニワトリゲノムの１７番染色体に存在する１つのマイクロサテライト多型ＡＢＲ０２５７を含むＤＮＡ断片長が、わずかではあるが極めて頻繁に不均一性を示すことを発見した。本発明者の分析によれば、この不均一性は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片の大きさが微妙に異なるか、あるいは想定外の大きさのＤＮＡ断片が複数出現するものであるが、市場に出回っている名古屋コーチンと称する製品の約６割において、再現性よく検出される。そこで、本発明は、これらの不均一性がどのような原因によるものであるかを解明し、名古屋コーチンとその他の品種との違いを厳密に識別する方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明者は名古屋コーチンの原種鶏、及び市場において名古屋コーチンと称される鶏肉から抽出したＤＮＡについて、そのＡＢＲ０２５７のマイクロサテライト多型をＤＮＡの塩基配列のレベルで解析した結果、名古屋コーチンの原種鶏には配列番号１と３に示した塩基配列の２種類のアレル（対立遺伝子）がホモ接合体にて存在すること、及び市場において名古屋コーチンと称される鶏肉から抽出したＤＮＡには配列番号１〜３の何れかに示す塩基配列が存在することを見出した。

すなわち、本発明のニワトリ由来試料のＤＮＡ鑑定方法は、鶏肉、鶏卵又はその加工品から抽出したＤＮＡを含む試料を用いて、ニワトリゲノムにおける識別番号ＡＢＲ０２５７のマイクロサテライト多型を解析し、前記ＡＢＲ０２５７マイクロサテライト多型が、配列番号１〜３に示した塩基配列の何れとも異なる塩基配列を有するＤＮＡを含むとき、前記試料が名古屋コーチンとは異なる品種のニワトリ由来の細胞を含むことを示すことを特徴とする。

前記マイクロサテライト多型の解析方法は、ＡＢＲ０２５７多型を含むニワトリゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて当該ＡＢＲ０２５７多型を含むＤＮＡを増幅し、当該増幅されたＤＮＡ断片長を解析することが好ましい。その際、前記増幅されたＤＮＡ断片長が、配列番号１〜３の何れかの塩基配列を含むニワトリゲノムＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片長と異なるとき、前記試料が名古屋コーチンとは異なる品種のニワトリ由来の細胞を含むことが示される。

本発明の他の実施形態においては、前記マイクロサテライト多型の解析方法が、ＡＢＲ０２５７多型を含むニワトリゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、配列番号１〜３に示した塩基配列の何れかと同一のＤＮＡ断片を含むか否かを判定することを特徴とする。

本発明の方法を用いることにより、名古屋コーチンと、その他の品種のニワトリ及び名古屋コーチンとその他の品種のニワトリの雑種とを厳密に識別できる食品のＤＮＡ鑑定方法が提供される。

［ニワトリゲノムにおけるＡＢＲ０２５７マイクロサテライト多型］
ニワトリゲノムの遺伝子解析の結果、ＣＡリピートを含む１９３個のマイクロサテライトマーカー（ＡＢＲマーカーと称する）を含む連鎖地図(linkage map)が報告されている(Takahashi et al. Anim Genet 2005, 36, 463-467)。これらの中で、ＡＢＲ０２５７と称されるマイクロサテライトマーカーは、ニワトリゲノムの１７番染色体に位置し、名古屋コーチンでは単一の対立遺伝子（アレル）に固定されているが、白色レグホンやロードアイランドレッド等の他の品種では多型性を有する。そして、このＡＢＲ０２５７を含む５つのマイクロサテライトマーカーを組み合わせることによって名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーが提供されている（上掲の特許文献１参照）。しかしながら、上記文献に開示されたＤＤＢＪ受け入れ番号ＡＢ１８６５８９に示された塩基配列は、名古屋コーチンに特徴的な３２７塩基対とは異なり、塩基位置１０５〜１２０に存在するＣＡリピートの数が８個である。

これに対し、本発明者が解析した名古屋コーチン由来のＡＢＲ０２５７マイクロサテライトの塩基配列を図１に示す。これによると、タイプＡ〜タイプＣまでの３種類の塩基配列が明らかとなり、上記ＣＡリピートに対応する位置におけるＣＡの繰り返し数は５回又は６回であることが分かった。さらに、これら３種類の配列のうち、タイプＢの塩基配列が共通配列（コンセンサス配列）であると認められ、タイプＡ及びＣの配列には１又は２塩基の欠失、置換、又は挿入が認められるが、全体の長さは２４１塩基対で同一である。

従って、当該ＡＢＲ０２５７マイクロサテライトの多型を解析し、タイプＡ〜タイプＣ（配列番号１〜３に示した塩基配列に相当する）の何れとも異なる塩基配列を有するＤＮＡは、名古屋コーチンとは異なる品種のニワトリに由来するということができる。他の品種のニワトリには、名古屋コーチンとその他の品種のニワトリの雑種も含まれる。

さらに、タイプＡ〜タイプＣのプライマー設計部位を除いた配列を、米国の国立バイオテクノロジー情報センターに登録されている、赤色野鶏の遺伝子配列と比較したところ、６〜９塩基の違いが確認された。赤色野鶏は、全ての鶏の祖先と考えられていることから、当該ＡＢＲ０２５７マイクロサテライトの多型解析により、全ての鶏の固体識別・親子鑑定・品種識別ができる。したがって、本発明の別の観点では、ニワトリゲノムにおける識別番号ＡＢＲ０２５７のマイクロサテライト多型を解析し、当該配列が配列番号１〜３に示す塩基配列の何れか１つと同一であるか否かを判定することを含む、ニワトリの個体識別、親子鑑定、又は品種識別方法が提供される。

［ＤＮＡ試料の調製方法］
本発明の方法に用いるＤＮＡ試料の調製方法は、鶏肉、鶏卵又はその加工品から通常用いられる方法に従って調製することができる。例えば、ニワトリ個体の末梢血から分離した白血球を用いる場合は、白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行なうことによりゲノムＤＮＡを得る。ただし、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行ってもよい。本明細書において「加工品」とは、鶏肉を含む加工食品のことであり、例えば、焼き鳥やチキンカレーの具等を含む。

［多型ＤＮＡの解析及び判定］
マイクロサテライト多型の解析方法も特に制限されることなく、上記ＤＮＡ試料を用いてＡＢＲ０２５７マイクロサテライト多型を含むＤＮＡ領域を増幅し、そのＤＮＡ断片の長さを測定するか、あるいは直接塩基配列を決定してもよい。増幅したＤＮＡを更に、ゲル電気泳動、サザンハイブリダイゼーション、一本鎖立体配置多型（ＳＳＣＰ）の解析及び制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の解析等の技術を用いて比較することもできる。ＤＮＡの増幅法としては、一般的なＰＣＲ法のほか、均一な温度における遺伝子増幅法を用いても行うことができる。このような遺伝子増幅に用いるプライマーとしては、ＡＢＲ０２５７マイクロサテライト多型を含むＤＮＡ領域の両端部分に存在する単一な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成して用いることができる。ＡＢＲ０２５７マイクロサテライト多型を含むＤＮＡ領域の塩基配列は、本明細書に添付した図面やＤＤＢＪデータベースの受け入れ番号ＡＢ１８６５８９などに開示されている。

本発明の好ましい態様において、増幅されたＤＮＡ断片は、その長さを同定することによって検出され得る。例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動や、高性能ポリマーで作成されたキャピラリー電気泳動装置を用いる方法である。適切な分子量マーカーを使用することによって、このような電気泳動の結果からそのＤＮＡ断片の大きさを正確に同定することは当業者において容易に行うことができる。

ダイレクトシークエンス法は、ＡＢＲ０２５７マイクロサテライト多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を直接ジデオキシ法により解析する方法である。決定された塩基配列が、配列番号１〜３の何れかの塩基配列と同一か否かは、比較対象となる２つの塩基配列の同一性を解析するプログラム、例えばＢＬＡＳＴなどを用いて容易に判定することができる。とりわけ、配列番号１〜３に示した塩基配列の１２５番目から始まるＣＡリピートの数が７回以上のものは名古屋コーチンとは異なる品種と考えられる。

［ニワトリ検体からのゲノムＤＮＡの調製］
愛知県で商業生産に利用している名古屋コーチンの原種鶏２系統（ＮＧ１系、及びＮＧ３系）、及び市場で名古屋コーチン由来と称して販売されている種々の鶏肉からゲノムＤＮＡを調製した。各検体（鶏肉）をＦＴＡクラシックカード（FTA Classic Card：ワットマン社製）に塗りつけ、風乾した。これを直径数ミリの大きさにパンチでくり抜きスカート付き９６ウェルＰＣＲプレート（バイオ・リジェネレーションズ社製）に入れ、１００μｌの精製水（ミリＱ水）で５分間洗浄した。これを３回繰り返した後、ＤＮＡｓｏｌ（ギブコ社製）を５０μｌ加え、１０分間室温に置いた。これを精製水で３回洗浄した後、水分を除去した。この状態でゲノムＤＮＡはＦＴＡクラシックカードに絡みついたままでＰＣＲによる増幅が可能である。

上記のようにして調製したＦＴＡカードを含む各ウェルに１５μｌの反応溶液を添加してＰＣＲを行った。反応溶液組成は、各２．５ｐｍｏｌのＡＢＲ０２５７増幅用プライマー、すなわち、正方向プライマー：5’-CCAGGCATACTCATTCCAGC-3’（配列番号４）及び逆方向プライマー：5’-AGAGGTGAGATCCCTCAGTGC-3’（配列番号５）、２００μＭのｄＮＴＰｓ、０．８ｍＭの硫酸マグネシウム、０．５ユニットのＫＯＤプラスポリメラーゼ（ＫＯＤ−２０１：東洋紡）及び１×反応バッファーである。９６穴プレートをｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（バイオラッド社製）に装着し、９４℃、２分間のホットスタートの後、９４℃で１５秒、５８℃で３０秒及び６８℃で３０秒を１サイクルとして４０サイクル繰り返した後、最後に６８℃で９分３０秒間伸長反応を行った。

このようにして増幅したＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングキットを用いてｐＴＡ２ベクター（東洋紡社製）にクローニングし、増幅された断片の塩基配列を決定した。また、ＰＣＲ産物の長さの違いを検出するためには、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１００ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー社製）を用い、解析プログラムはＧｅｎｅＭａｐｐｅｒで行った。

名古屋コーチンの原種鶏から抽出したＤＮＡを用いて上記方法により塩基配列を決定した結果、図１に示したタイプＡ及びＣの２種類の塩基配列のホモ接合体が検出された。図１において四角で囲んだ領域はＣＡリピート配列に相当する。名古屋コーチンの原種鶏では、これらのＣＡリピート数は５回又は６回である。また、市場における名古屋コーチン由来のニワトリではタイプＡ〜Ｃの３種類の何れかの塩基配列が見出された。したがって、これら３種類以外の塩基配列を有する試料には名古屋コーチン以外の品種のニワトリ由来細胞が含まれると考えられる。これら３種類の塩基配列を比較した結果、タイプＢの塩基配列がコンセンサス配列と考えられ、これに対して、タイプＡ及びＣの塩基配列において置換又は挿入された塩基に下線を付した。これら３種類の配列は、それぞれ塩基置換、欠失、又は挿入を有するが、全体の長さは２４１塩基対で同一の長さであった。

名古屋コーチンの原種鶏におけるＡＢＲ０２７５マイクロサテライト多型領域のＤＮＡ塩基配列を示す。

Claims

鶏肉、鶏卵又はその加工品から抽出したＤＮＡを含む試料を用いて、ニワトリゲノムにおける識別番号ＡＢＲ０２５７のマイクロサテライト多型を解析し、そして
前記ＡＢＲ０２５７マイクロサテライト多型が、配列番号１〜３に示した塩基配列の何れとも異なる塩基配列を有するＤＮＡからなるとき、前記試料が名古屋コーチンとは異なる品種のニワトリ由来の細胞を含むことを示す、
ニワトリ由来試料のＤＮＡ鑑定方法。
前記マイクロサテライト多型の解析方法が、ＡＢＲ０２５７多型を含むニワトリゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて当該ＡＢＲ０２５７多型を含むＤＮＡを増幅し、当該増幅されたＤＮＡ断片長を解析する方法である請求項１に記載の方法。
前記増幅されたＤＮＡ断片長が、配列番号１〜３の何れかの塩基配列を含むニワトリゲノムＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片長と異なるとき、前記試料が名古屋コーチンとは異なる品種のニワトリ由来の細胞を含むことを示す請求項２に記載の方法。
前記マイクロサテライト多型の解析方法が、ＡＢＲ０２５７多型を含むニワトリゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、配列番号１〜３に示した塩基配列の何れかと同一のＤＮＡ断片を含むか否かを判定することである請求項１に記載の方法。
前記名古屋コーチンとは異なる品種のニワトリが、名古屋コーチンと他の品種のニワトリとの雑種である請求項１〜４何れか記載の方法。