JP2008148612A - 鶏の品種識別のためのツールおよびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】鶏の品種を識別する技術を開発する。
【解決手段】単一のマーカーを用いるだけで、目的の品種を同定することができる品種特異的マーカーを提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は鶏の品種を識別するためのツールおよびその利用に関するものであり、特に、比内鶏、土佐地鶏、ニューハンプシャーをそれぞれ検出するためのツールおよびその利用に関するものである。

我が国では、鶏肉市場の大部分をブロイラー肉が占めているが、銘柄鶏や地鶏と呼ばれる鶏もまた流通している。銘柄鶏や地鶏は、生産過程において、品種、餌、飼養方法、出荷日令等について特別な基準が用いられている鶏であり、健康的であるというイメージが定着している。また、銘柄鶏や地鶏は、風味に優れた食肉を提供するので食肉の品質面で市場価値が高いものが多い。

鶏製品の流通において、鶏の品種を明示することは重要である。正確な品種識別方法は、鶏製品の信頼性を保つこと、および誤った表記による生産物の流通を防止することに寄与するので、簡便かつ高性能な分析方法の開発が強く求められている。

品種識別法として、ＤＮＡに基づく識別法の研究が行われている。ＤＮＡは、凍結または調理された食品等から簡単に抽出され、分析され得るので、原材料を証明するための有益なツールである。

ＤＮＡに基づく品種識別法としては、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅ＤＮＡ多型（ＲＡＰＤ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ＲＬＧＳ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、単純反復配列間増幅断片長多型（ＩＳＳＲ）、またはマイクロサテライトＤＮＡ多型等を利用した方法が挙げられる。

例えば、ＡＦＬＰ解析は、微生物、植物および動物の生物多様性の研究に用いられてきた（非特許文献１および２）。ＡＦＬＰ解析はゲノムにおいて特異的な多型を研究する方法として、他の方法と比較して、迅速かつ効率的に解析し得るとともに、再現性が高いという利点を有している。ＡＦＬＰ解析はイベリア豚の純系もしくは交雑種の識別に用いられた。系統特異的ＡＦＬＰマーカーがイベリア豚や、早成もしくは遅成の鶏の系統において見出された。品種特異的なマーカーは原産のベネト鶏において見出された。

また、マイクロサテライトＤＮＡ多型を利用した品種識別法として、名古屋コーチンを識別する方法が存在する（非特許文献３）。
Shan X, Blake TK and Talbert LE. Conversion of AFLP markers to sequence-specific PCR markers in barley and wheat. Theoretical and Applied Genetics, 98: 1072-1078. 1999. Fumiere O, Dubois M, Gregoire D, Thewis A and Berben G. Identification on Commercialized Products of AFLP Markers Able To Discriminate Slow- from Fast-Growing Chicken Strains. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51: 1115-1119. 2003. 中村明弘、「名古屋コーチンのＤＮＡ識別法を開発」、鶏卵肉情報、２００６年５月２５日号、ｐ１６−１９

しかしながら、上述した品種以外の鶏の品種を識別する方法は未だ開発されておらず、特に、鶏肉生産に用いられる鶏に関して、簡便に品種識別が可能となるようなマーカーは得られていない。

本発明の目的は、上述した品種以外の鶏の品種を簡便に識別する技術を確立することである。

本発明者は、鋭意検討の結果、識別すべき鶏が比内鶏か否かを識別することができる鶏ゲノムＤＮＡ上の一塩基多型、識別すべき鶏が土佐地鶏か否かを識別することができる鶏ゲノムＤＮＡ上の一塩基多型、および識別すべき鶏がニューハンプシャーか否かを識別することができる鶏ゲノムＤＮＡ上の一塩基多型を見出し、本発明を完成するに至った。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、該部分配列は、配列番号１に示される塩基配列の１７７番目の塩基を含みかつ、連続した１５個以上の塩基からなることを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号６に示される塩基配列からなることが好ましい。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、該部分配列は、配列番号２に示される塩基配列の１８０番目の塩基を含みかつ、連続した１５個以上の塩基からなることを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号９に示される塩基配列からなることが好ましい。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号３に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、該部分配列は、配列番号３に示される塩基配列の２４４番目の塩基を含みかつ、連続した１５個以上の塩基からなることを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１２に示される塩基配列からなることが好ましい。

本発明に係る比内鶏の検出方法は、第１のポリヌクレオチドを鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートする工程を包含することを特徴としている。

本発明に係る比内鶏の検出方法において、第１のポリヌクレオチドは配列番号６に示される塩基配列からなることが好ましい。また、本発明に係る比内鶏の検出方法において、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを、鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートしてもよい。

本発明に係る比内鶏の検出方法は、二本鎖ＤＮＡを検出する工程をさらに包含することが好ましい。

本発明に係る土佐地鶏の検出方法は、第２のポリヌクレオチドを鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートする工程を包含することを特徴としている。

本発明に係る比内鶏の検出方法において、第２のポリヌクレオチドは配列番号９に示される塩基配列からなることが好ましい。また、本発明に係る比内鶏の検出方法において、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを、鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートしてもよい。

本発明に係る土佐地鶏の検出方法は、二本鎖ＤＮＡを検出する工程をさらに包含することが好ましい。

本発明に係るニューハンプシャーの検出方法は、第３のポリヌクレオチドを鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートする工程を包含することを特徴としている。

本発明に係る比内鶏の検出方法において、第３のポリヌクレオチドは配列番号１２に示される塩基配列からなることが好ましい。また、本発明に係る比内鶏の検出方法において、配列番号１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを、鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートしてもよい。

本発明に係るニューハンプシャーの検出方法は、二本鎖ＤＮＡを検出する工程をさらに包含することが好ましい。

本発明に係る比内鶏の検出キットは、第１のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。

本発明に係る比内鶏の検出キットにおいて、第１のポリヌクレオチドは配列番号６に示される塩基配列からなることが好ましい。また、本発明に係る比内鶏の検出キットは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。

本発明に係る比内鶏の検出キットは、二本鎖ＤＮＡを検出するための検出試薬をさらに備えていることが好ましい。

本発明に係る土佐地鶏の検出キットは、第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。

本発明に係る比内鶏の検出キットにおいて、第２のポリヌクレオチドは配列番号９に示される塩基配列からなることが好ましい。また、本発明に係る比内鶏の検出キットは、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。

本発明に係る土佐地鶏の検出キットは、二本鎖ＤＮＡを検出するための検出試薬をさらに備えていることが好ましい。

本発明に係るニューハンプシャーの検出キットは、第３のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。

本発明に係る比内鶏の検出キットにおいて、第３のポリヌクレオチドは配列番号１２に示される塩基配列からなることが好ましい。また、本発明に係る比内鶏の検出キットは、配列番号１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。

本発明に係るニューハンプシャーの検出キットは、二本鎖ＤＮＡを検出するための検出試薬をさらに備えていることが好ましい。

本発明は、複雑な統計学的な計算を必要としない簡便な技術であり、本発明を用いれば、単一のマーカーを用いるだけで、目的の品種を容易に同定することができる。

（１：比内鶏）
本発明は、比内鶏の検出に用いることができるポリヌクレオチド（第１のポリヌクレオチド）を提供する。本発明に係る第１のポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、該部分配列は、配列番号１に示される塩基配列の１７７番目の塩基を含むことを特徴としている。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「ＤＮＡ配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用される。

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

なお、本明細書中で使用される場合、「ゲノムＤＮＡ」は、ゲノム全長に限定されず、目的の領域を含む部分断片であってもよく、ゲノムに由来するＤＮＡ全般が意図される。目的の領域を含む部分断片を得るためには、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、目的の領域を増幅し得るように設計したプライマーセットを用いて増幅反応を行えばよい。

「配列番号１に示される塩基配列の１７７番目の塩基」とは、比内鶏に特異的な一塩基多型が存在する塩基である。比内鶏においては、上記位置の塩基はチミンであるが、他の品種においてはアデニンである。

本発明に係る第１のポリヌクレオチドは、比内鶏のゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするので、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡおよび第１のポリヌクレオチドがハイブリダイズするか否かを調べることにより、対象の鶏が比内鶏であるか否かを知ることができる。具体的には、本発明に係る第１のポリヌクレオチドは、増幅用プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）またはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。

なお、第１のポリヌクレオチドが標的（例えば、比内鶏のゲノムＤＮＡ）とハイブリダイズしたか否かを検出するためには、当該分野において周知の二本鎖ＤＮＡ検出技術を利用すればよい。また、第１のポリヌクレオチドがプライマーである場合は、増幅産物が得られるか否かによって、ハイブリダイズしたか否かを検出することができる。

本発明はまた、比内鶏を検出するための方法およびキットを提供する。

上述したように、本発明に係る第１のポリヌクレオチドを、比内鶏特異的ＳＮＰを含むポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、比内鶏に由来する組織（例えば、食肉）を容易に検出することができる。

本発明に係る比内鶏の検出方法は、識別すべき鶏が比内鶏であるか否かを識別する方法であって、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡと第１のポリヌクレオチドをインキュベートさせる工程を包含することを特徴としている。第１のポリヌクレオチドが、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズすれば、該鶏は比内鶏であると判別することができる。

また、本発明に係る比内鶏の検出キットは、識別すべき鶏が比内鶏であるか否かを識別するために用いるキットであって、第１のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本発明に係る比内鶏の検出キットは、第１のポリヌクレオチドを備えているので、本発明に係る比内鶏の検出方法に好適に用いることができる。なお、本発明に係る比内鶏の検出キットはプライマーセットであってもよく、この場合、一方のプライマーが第１のポリヌクレオチドであればよい。

本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、目的のヌクレオチド配列を有する遺伝子（例えば、ＤＮＡ）の存在を検出するためのポリヌクレオチドが意図され、適切な条件下で目的の遺伝子とハイブリダイズすることが好ましい。プローブとしての好ましい長さは、ハイブリダイゼーション条件に応じて適宜変更され得るが、一般的には、１７〜１０００の間の任意の塩基数からなるヌクレオチドであり得、好ましくは２０〜６００塩基からなり、より好ましくは５０〜５００塩基からなる。配列番号１〜３に示される塩基配列の全長配列からなるポリヌクレオチドは、何れも塩基数が６００個以下であるので、当該ポリヌクレオチドがプローブとして好適に用いられ得ることを当業者は容易に理解する。

本明細書において使用される場合、用語「プライマー」は、適切な条件下での鋳型指向性ＤＮＡ合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドが意図される。プライマーとしての好ましい長さは、意図される用途に応じて適宜変更され得るが、一般的には、１５〜５０の間の任意の数の塩基からなるヌクレオチドであり得、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。プライマーは、鋳型配列に完全に一致する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするに十分相補的であるべきである。用語「プライマー対」は、増幅される核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一組のプライマーセットが意図される。

なお、本明細書において、核酸増幅反応として「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いて例示的に説明しているが、本実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ以外の核酸増幅反応にもまた適用可能である。

第１のポリヌクレオチドを比内鶏のゲノムＤＮＡを特異的に増幅するためのプライマーとして用いる場合、その３’末端が、比内鶏に特異的な一塩基多型部位であることが好ましい。このようなプライマーを用いて鶏ゲノムＤＮＡを増幅することにより、比内鶏のゲノムＤＮＡのみを増幅することができる。

さらに、ゲノムＤＮＡをテンプレートとした増幅反応に用いるための、第１のポリヌクレオチドを増幅し得るように設計したプライマーセットもまた本発明の範囲内に含まれ得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。この場合、ＰＣＲ産物としての扱い易さの観点から、第１のポリヌクレオチドは１００〜４００塩基からなることが好ましいが、これに限定されない。

（２：土佐地鶏）
本発明は、土佐地鶏の検出に用いることができるポリヌクレオチド（第２のポリヌクレオチド）を提供する。本発明に係る第２のポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、該部分配列は、配列番号１に示される塩基配列の１８０番目の塩基を含むことを特徴としている。

「配列番号２に示される塩基配列の１８０番目の塩基」とは、土佐地鶏に特異的な一塩基多型が存在する塩基である。土佐地鶏においては、上記位置の塩基はグアニンであるが、他の品種においてはアデニンである。

本発明に係る第２のポリヌクレオチドは、土佐地鶏のゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするので、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡおよび第２のポリヌクレオチドがハイブリダイズするか否かを調べることにより、対象の鶏が土佐地鶏であるか否かを知ることができる。具体的には、本発明に係る第２のポリヌクレオチドは、増幅用プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）またはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。

なお、第２のポリヌクレオチドが標的（例えば、土佐地鶏のゲノムＤＮＡ）とハイブリダイズしたか否かを検出するためには、当該分野において周知の二本鎖ＤＮＡ検出技術を利用すればよい。また、第２のポリヌクレオチドがプライマーである場合は、増幅産物が得られるか否かによって、ハイブリダイズしたか否かを検出することができる。

本発明はまた、比内鶏を検出するための方法およびキットを提供する。

本発明に係る土佐地鶏の検出方法は、識別すべき鶏が土佐地鶏であるか否かを識別する方法であって、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡと第２のポリヌクレオチドをインキュベートさせる工程を包含することを特徴としている。第２のポリヌクレオチドが、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズすれば、該鶏は土佐地鶏であると判別することができる。

また、本発明に係る土佐地鶏の検出キットは、識別すべき鶏が土佐地鶏であるか否かを識別するために用いるキットであって、第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本発明に係る土佐地鶏の検出キットは、第２のポリヌクレオチドを備えているので、本発明に係る土佐地鶏の検出方法に好適に用いることができる。なお、本発明に係る土佐地鶏の検出キットはプライマーセットであってもよく、この場合、一方のプライマーが第２のポリヌクレオチドであればよい。

第２のポリヌクレオチドを土佐地鶏のゲノムＤＮＡを特異的に増幅するためのプライマーとして用いる場合、その３’末端が、土佐地鶏に特異的な一塩基多型部位であることが好ましい。このようなプライマーを用いて鶏ゲノムＤＮＡを増幅することにより、土佐地鶏のゲノムＤＮＡのみを増幅することができる。

さらに、ゲノムＤＮＡをテンプレートとした増幅反応に用いるための、第２のポリヌクレオチドを増幅し得るように設計したプライマーセットもまた本発明の範囲内に含まれ得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。この場合、ＰＣＲ産物としての扱い易さの観点から、第２のポリヌクレオチドは１００〜４００塩基からなることが好ましいが、これに限定されない。

（３：ニューハンプシャー）
本発明は、ニューハンプシャーの検出に用いることができるポリヌクレオチド（第３のポリヌクレオチド）を提供する。本発明に係る第３のポリヌクレオチドは、配列番号３に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、該部分配列は、配列番号１に示される塩基配列の２４４番目の塩基を含むことを特徴としている。

「配列番号３に示される塩基配列の２４４番目の塩基」とは、ニューハンプシャーに特異的な一塩基多型が存在する塩基である。ニューハンプシャーにおいては、上記位置の塩基はグアニンであるが、他の品種においてはシトシンである。

本発明に係る第３のポリヌクレオチドは、ニューハンプシャーのゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするので、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡおよび第３のポリヌクレオチドがハイブリダイズするか否かを調べることにより、対象の鶏がニューハンプシャーであるか否かを知ることができる。具体的には、本発明に係る第３のポリヌクレオチドは、増幅用プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）またはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。

なお、第３のポリヌクレオチドが標的（例えば、ニューハンプシャーのゲノムＤＮＡ）とハイブリダイズしたか否かを検出するためには、当該分野において周知の二本鎖ＤＮＡ検出技術を利用すればよい。また、第３のポリヌクレオチドがプライマーである場合は、増幅産物が得られるか否かによって、ハイブリダイズしたか否かを検出することができる。

本発明はまた、ニューハンプシャーを検出するための方法およびキットを提供する。

本発明に係るニューハンプシャーの検出方法は、識別すべき鶏がニューハンプシャーであるか否かを識別する方法であって、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡと第３のポリヌクレオチドをインキュベートさせる工程を包含することを特徴としている。第３のポリヌクレオチドが、識別すべき鶏由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズすれば、該鶏はニューハンプシャーであると判別することができる。

また、本発明に係るニューハンプシャーの検出キットは、識別すべき鶏がニューハンプシャーであるか否かを識別するために用いるキットであって、第３のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本発明に係るニューハンプシャーの検出キットは、第３のポリヌクレオチドを備えているので、本発明に係るニューハンプシャーの検出方法に好適に用いることができる。なお、本発明に係る土佐地鶏の検出キットはプライマーセットであってもよく、この場合、一方のプライマーが第３のポリヌクレオチドであればよい。

第３のポリヌクレオチドをニューハンプシャーのゲノムＤＮＡを特異的に増幅するためのプライマーとして用いる場合、その３’末端が、ニューハンプシャーに特異的な一塩基多型部位であることが好ましい。このようなプライマーを用いて鶏ゲノムＤＮＡを増幅することにより、ニューハンプシャーのゲノムＤＮＡのみを増幅することができる。

さらに、ゲノムＤＮＡをテンプレートとした増幅反応に用いるための、第３のポリヌクレオチドを増幅し得るように設計したプライマーセットもまた本発明の範囲内に含まれ得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。この場合、ＰＣＲ産物としての扱い易さの観点から、第３のポリヌクレオチドは１００〜４００塩基からなることが好ましいが、これに限定されない。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

〔実施例１：ＡＦＬＰ解析〕
ホワイトコーニッシュ２１羽、レッドコーニッシュ２２羽、ホワイトプリマスロック２２羽、ニューハンプシャー２２羽、ロードアイランドレッド２０羽、横斑プリマスロック２０羽、比内鶏２０羽、土佐地鶏３０羽、および対馬地鶏４２羽から、血液を採取した。なお、鶏は以下から入手した：家畜改良センター（ホワイトコーニッシュ、レッドコーニッシュ、ホワイトプリマスロック、およびニューハンプシャー）；畜産草地研究所（横斑プリマスロック、比内鶏、土佐地鶏１０羽、および対馬地鶏２０羽）；高知県畜産試験場（土佐地鶏２０羽）；および、長崎県畜産試験場（対馬地鶏２２羽）。

採取した血液から、定法を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを品種ごとに混合した。

得られたゲノムＤＮＡに対し、ＡＦＬＰ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ＫｉｔおよびＳｔａｒｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ Ｋｉｔ（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の説明書に従ってＡＬＦＰ解析を行った。具体的には、まず、各品種のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＭｓｅＩにより断片化し、ＥｃｏＲＩアダプターおよびＭｓｅＩアダプターをライゲーションさせた。次にユニバーサルプライマーセットを用いて予備増幅した後、ＡＦＬＰプライマーを用いて増幅することにより選択的ＡＦＬＰ増幅産物を得た。

得られた増幅産物を、７Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル中にて、２００Ｖの電圧を印加して電気泳動した。バッファーにはＴＢＥを用いた。電気泳動後、上記増幅産物をナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ）に転写し、ＧＥＮＧＯＬＤ（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．）を用いた銀増幅により可視化した。

各品種についての上記増幅産物のバンドを比較することにより、品種間で異なる長さを示すバンド（多型バンド）を約２００本見出した。

〔実施例２：ＰＣＲ用プライマーの設計〕
実施例１において得られた多型バンドは、品種ごとに混合されたゲノムＤＮＡに対して行ったＡＦＬＰ解析によって得られたものである。この多型バンドを実際に鶏個体または鶏組織等の品種識別に用いることが可能であるかは定かではない。品種識別に用いることが可能であるか否かを確かめるためには、一定数の各品種の鶏個体に対して検証する必要がある。しかし、ＡＦＬＰ解析はコストが高くかつ煩雑であるため、このような検証を行うのは困難である。さらに、市場等において実際に使用する段階においても、ＡＦＬＰ解析を日常のルーチンワークとして用いるのは難しい。そこで、ＡＦＬＰ解析によって得られた多型を検出することができるＰＣＲ用のプライマーを設計することを試みた。ＰＣＲ反応による多型の検出は、一般に特定のマーカーが増幅されたか否かを確かめるだけであるので、簡便であり、大量のスクリーニングに適している。

まず、実施例１において得られた各多型バンドに係るＤＮＡの塩基配列を以下のように解読した。

各多型バンドから、定法を用いてＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを、ｐＣＲ ２．１−ＴＯＰＯベクター（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、該ベクターを用いてＴＯＰ１０コンピテント細胞（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。形質転換した細胞を増殖させた後、定法を用いてＤＮＡを抽出及び精製し、シークエンス反応を行った。

ＣＥＱ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｆ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて行い、ＣＥＱ ８０００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて塩基配列の解読を行った。

ここで、従来、ＡＦＬＰ解析によって得られた多型を検出することができるＰＣＲ用のプライマーを設計する際には、多型バンドに係るＤＮＡの塩基配列のうち、ＡＦＬＰプライマーに対応する部分の内側の塩基配列に基づいて設計が行われていた。このようなプライマーは、多くの場合、多型を検出する能力またはゲノムＤＮＡを増幅する能力を失う（非特許文献１および２）。

本発明者は、鋭意検討の結果、上記のようなプライマーが、多型を検出する能力またはゲノムＤＮＡを増幅する能力を失うのは、ＡＦＬＰ解析によって検出される多型が、ＡＦＬＰプライマーに含まれる特異的な塩基の違い、または制限酵素部位の違いの結果として生じることを見出した。そこで、以下の方法を採用することにより、適切なプライマーを設計することに成功した。

まず、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ ｃｈｉｃｋｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを参照して、各多型バンドの塩基配列のゲノム上の位置を同定した。次に、公開された鶏のドラフトシークエンス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｇａｌｌｕｓ＿ｇａｌｌｕｓ／およびｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｅｓｅ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｏｒｇ＝Ｃｈｉｃｋｅｎ＆ｄｂ＝０＆ｈｇｓｉｄ＝３０９４８９０８にて公開）を基に、多型バンドに係るＤＮＡの塩基配列の外側を増幅し得るプライマーセットを設計した。

このプライマーを用いて、各品種につき５羽ずつの鶏から得たゲノムＤＮＡに対し、ＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をシークエンスし、配列を比較することにより多型部位を検出することができた。

そして、この多型部位を検出し得るプライマーを設計することによって、適切なＰＣＲ用プライマーを設計することができた。具体的には、多型部位を増幅するように設計した共通プライマーセットと、多型部位を３’末端に有する品種特異的プライマーを設計した。

〔実施例３：対立遺伝子の品種間における分布の調査〕
実施例２において設計したプライマーを用いて、９品種２１９羽に対してＰＣＲ反応を行った。反応は、９４℃で９分３０秒間行った後、９４℃で３０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で３分間を３５サイクル、次いで７２℃で１分間行った。

結果、品種識別が可能な三つの一塩基多型を得ることができた（表１）。

第１の一塩基多型は、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーとのセット（第１の共通プライマーセット）および配列番号６に示す塩基配列からなる第１の品種特異的プライマー（第１のポリヌクレオチド）によって検出される一塩基多型である。比内鶏のゲノムＤＮＡに対して、第１の共通プライマーおよび第１の品種特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、塩基長１８６ｂｐの断片が１００％の確率で得られる。一方、他の品種の鶏ゲノムＤＮＡに対して、第１の共通プライマーおよび第１の品種特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、塩基長４６７ｂｐの断片が１００％の確率で得られる。すなわち、比内鶏であるか否かを１００％の確率で識別することができた（図１（Ａ））。

また、第１の一塩基多型は、相同性検索の結果から、Ｚ染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＷ＿０６０７４８を参照）上に存在していた（図２（Ａ））。但し、第１の一塩基多型の位置は、特定のタンパク質をコードする遺伝子内にはなかった。詳細には、Ｚ染色体の３０１５７１７番目のＡがＴに変換していた。

第２の一塩基多型は、配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーとのセット（第２の共通プライマーセット）および配列番号９に示す塩基配列からなる第２の品種特異的プライマー（第２のポリヌクレオチド）によって検出される一塩基多型である。土佐地鶏のゲノムＤＮＡに対して、第２の共通プライマーおよび第２の品種特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、塩基長３４０ｂｐの断片が１００％の確率で得られる。一方、他の品種の鶏ゲノムＤＮＡに対して、第２の共通プライマーおよび第２の品種特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、塩基長４４４ｂｐの断片が１００％の確率で得られる。すなわち、１００％の確率で土佐地鶏であるか否かを識別することができた（図１（Ｂ））。

また、第２の一塩基多型は、第１染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＷ＿０６０２２０を参照）上に存在していた（図２（Ｂ））。但し、第２の一塩基多型の位置は、特定のタンパク質をコードする遺伝子内にはなかった。詳細には、第１染色体の１５７３０８０番目のＡがＧに置換していた。

第３の一塩基多型は、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーとのセット（第３の共通プライマーセット）および配列番号１２に示す塩基配列からなる第３の品種特異的プライマー（第３のポリヌクレオチド）によって検出される一塩基多型である。ニューハンプシャーのゲノムＤＮＡに対して、第３の共通プライマーおよび第３の品種特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、塩基長２０８ｂｐの断片が１００％の確率で得られる。一方、他の品種の鶏ゲノムＤＮＡに対して、第３の共通プライマーおよび第３の品種特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、塩基長４７４ｂｐの断片が１００％の確率で得られる。すなわち、１００％の確率でニューハンプシャーであるか否かを識別することができた（図１（Ｃ））。

また、第３の一塩基多型は、第１０染色体上のグアニンヌクレオチド交換因子ｐ５３２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＷ＿０６０４３３を参照）上に存在していた（図２（Ｃ））。詳細には、グアニンヌクレオチド交換因子ｐ５３２遺伝子の１９６８４番目のＣがＧに置換していた。

これらの一塩基多型に関して、該当する３品種におけるホモ接合体もしくはヘテロ接合体の判断は、シークエンスに基づいて行った。それぞれの品種におけるホモ接合体の割合を表２に示す。

特異性の低いもしくは発現頻度の低い、品種特異的マーカーの他の候補を表３に示す。

例えば、対馬地鶏のみに存在する１４塩基（ＡＡＧＧＴＧＡＣＴＴＡＡＴＴ：配列番号１３）の欠失を第１１染色体上の１０８８６４５番から１０８８６５８番の間に見出した（候補２）が、この発現頻度は５０％であり、対馬地鶏の識別においての有効性は低かった。

このように、得られるマーカーの特定の品種における頻度は、通常１００％よりも低く、複数のマーカーを組み合わせて統計的な処理を行うことにより、１００％に近い検出率を得る（非特許文献３を参照）。

一方、本発明は、一つの一塩基多型のみに基づいて特定の品種を１００％の確率で識別することができるので、従来の他の品種識別法と比較して非常に簡便であり、日常の検査手段として用いる際に、非常に有効である。

本発明は、鶏製品、特に特定ＪＡＳ規格認定地鶏やブランド鶏に由来する製品を検査および保証するためのツールとして有用である。本発明を用いれば、品種を誤って表記した鶏製品の流通を防止し、鶏製品に対する信頼感を消費者に与えることができる。

なお、本発明は、交雑種の鶏に対しても適用することが可能である。例えば、比内地鶏は比内鶏と他の鶏との交雑種であるが、本発明に係る一塩基多型をホモ接合体として有する比内鶏を繁殖のために用いれば、該比内鶏の子であるすべての比内地鶏は該一塩基多型を有するため、本発明を用いて該比内地鶏を検出することが可能である。

（Ａ）は本発明に係る比内鶏を識別するためのプライマーを用いて、各品種の鶏ゲノムＤＮＡを増幅した結果を示す写真であり、（Ｂ）は本発明に係る土佐地鶏を識別するためのプライマーを用いて、各品種の鶏ゲノムＤＮＡを増幅した結果を示す写真であり、（Ｃ）は本発明に係るニューハンプシャーを識別するためのプライマーを用いて、各品種の鶏ゲノムＤＮＡを増幅した結果を示す写真である。 （Ａ）は、鶏ゲノムＤＮＡ（Ｚ染色体）の塩基配列を示す図であり、比内鶏ではゴシック部位に本発明に係る一塩基多型部位が存在する。（Ｂ）は、鶏ゲノムＤＮＡ（第１染色体）の塩基配列を示す図であり、土佐地鶏ではゴシック部位に本発明に係る一塩基多型部位が存在する。（Ｃ）は、第１０染色体上のグアニンヌクレオチド交換因子ｐ５３２遺伝子の塩基配列を示す図であり、ニューハンプシャーではゴシック部位に本発明に係る一塩基多型部位が存在する。

Claims (9)

1. 配列番号１に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、
   該部分配列は、配列番号１に示される塩基配列の１７７番目の塩基を含み、かつ連続した１５個以上の塩基からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
2. 配列番号２に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、
   該部分配列は、配列番号２に示される塩基配列の１８０番目の塩基を含み、かつ連続した１５個以上の塩基からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
3. 配列番号３に示される塩基配列の部分配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであって、
   該部分配列は、配列番号３に示される塩基配列の２４４番目の塩基を含み、かつ連続した１５個以上の塩基からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
4. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートする工程を包含することを特徴とする比内鶏の検出方法。
5. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートする工程を包含することを特徴とする土佐地鶏の検出方法。
6. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを鶏ゲノムＤＮＡと共にインキュベートする工程を包含することを特徴とするニューハンプシャーの検出方法。
7. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とする比内鶏の検出キット。
8. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とする土佐地鶏の検出キット。
9. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするニューハンプシャーの検出キット。