JP7362054B2 - High Resolution Melting(HRM)解析によるマグロ類の遺伝的性判別方法 - Google Patents
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よって、本発明の課題は、性判別の精度が高く、かつ、多検体を効率的に処理できるマグロ類の遺伝的性判別方法を提供することにある。
〔1〕配列番号1で表される塩基配列の501番目の塩基、561及び562番目の塩基、564番目の塩基、595番目の塩基、644番目の塩基、769番目の塩基、770番目の塩基、789番目の塩基、1198番目の塩基、1200番目の塩基、1213番目の塩基、1275番目の塩基、1280番目の塩基、1338番目の塩基、1344番目の塩基、1416~1423番目の塩基、1472番目の塩基、1493番目の塩基、1866番目の塩基、1867番目の塩基、1899番目の塩基、1913番目の塩基、2583番目の塩基、2588番目の塩基、2589番目の塩基、2611番目の塩基、2622番目の塩基、2634番目の塩基、2643番目の塩基、2687番目の塩基、2693番目の塩基、2752番目の塩基、2753番目の塩基、2756番目の塩基、2801番目の塩基、2817番目の塩基、2855番目の塩基、2874番目の塩基、2901番目の塩基、3057番目の塩基、3093番目の塩基、3139番目の塩基、3146番目の塩基、3148番目の塩基、3196番目の塩基、3199番目の塩基、3249番目の塩基、3251番目の塩基、3368番目の塩基、3404番目の塩基、3407番目の塩基、3426番目の塩基、3433番目の塩基、3442番目の塩基、3470番目の塩基、3479番目の塩基、3545番目の塩基、3546番目の塩基、3735番目の塩基、3756番目の塩基、3769番目の塩基、3788番目の塩基、6256番目の塩基、6312番目の塩基、6455番目の塩基、6585番目の塩基、6781番目の塩基、6879番目の塩基、6930番目の塩基、6933番目の塩基、6940番目の塩基、6941番目の塩基、6987番目の塩基並びに7014番目の塩基の位置に存在するDNA多型からなる群から選択される1以上のDNA多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出するDNA多型が位置する塩基を含むDNA断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットを用いてHigh Resolution Melting(HRM)解析を行うことを特徴とする、マグロ類の性判別方法。
〔2〕前記性判別用プローブが検出するDNA多型が、前記配列番号1で表される塩基配列の3139番目の塩基、3146番目の塩基及び3148番目の塩基の位置に存在するDNA多型であることを特徴とする、〔1〕記載のマグロ類の性判別方法。
〔3〕前記性判別用プローブが検出するDNA多型が、前記配列番号1で表される塩基配列の1416~1423番目の塩基の位置に存在するDNA多型であることを特徴とする、〔1〕記載のマグロ類の性判別方法。
〔4〕前記性判別用プローブが、配列番号2~7のいずれか1つで表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号8で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号9で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであることを特徴とする、〔1〕又は〔2〕記載のマグロ類の性判別方法。
〔5〕前記性判別用プローブが、配列番号10又は11で表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号12で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号13で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであることを特徴とする、〔1〕又は〔3〕記載のマグロ類の性判別方法。
〔6〕性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含むマグロ類の性判別用キットであって、前記性判別用プローブが、配列番号2~7のいずれか1つで表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号8で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号9で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、マグロ類の性判別用キット。
〔7〕性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含むマグロ類の性判別用キットであって、前記性判別用プローブが、配列番号10又は11で表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号12で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号13で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、マグロ類の性判別用キット。
フォワードプライマーとリバースプライマーは、通常のPCRと同様にそれぞれ同量を用いてもよいし、一方のプライマーを過剰量用いて、性判別用プローブがハイブリダイズし得るDNA断片がより多く合成されるように非対称PCRを行ってもよい。非対称PCRは、より効率よく性判別を行うことが可能であるため好ましい。
鋳型DNAに対し本発明の性判別用プローブがハイブリダイズする領域と、本発明の各プライマーがハイブリダイズする領域は、一部重複してもよいし、重複しなくてもよい。
PCR反応の条件としては、特に限定されず、増幅サイズ、プライマーの塩基長、GC含有率、Tm値などを考慮して適宜設定すればよい。
なお、PCR反応及び融解曲線の作成の一連の操作は、通常、リアルタイムPCR装置を用いて行えばよい。様々なリアルタイムPCR装置が市販されており、例えば、QuantStudio(登録商標)3リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製)、7500 FastリアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製)、LightCycler(登録商標) 480システム(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製)等が例示される。
本発明のマグロ類の性判別用キットの別の一実施形態としては、例えば、配列番号10又は11で表される塩基配列からなる性判別用プローブと、配列番号12で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号13で表される塩基配列からなるプライマーとからなる雌雄共通プライマーセットとを含むキットが挙げられる。
天然太平洋クロマグロ成魚の雌16個体及び雄15個体(生殖腺による性判別済み)の全ゲノムリシーケンスデータと新たに作成したクロマグロドラフトゲノム配列を用いて変異解析を実施し、性別特異的な複数のDNA多型を見出した。当該DNA多型が存在するスキャフォルド64番の約7.5kbのゲノム領域の配列を配列番号1に示す。また、配列番号1で表される塩基配列中の各DNA多型の位置、雌の遺伝子型、雄の遺伝子型、性判別成功率を表2に示す。各DNA多型の遺伝子型は、雌においてはホモ接合型であり、雄においてはヘテロ接合型である。性判別成功率は、データの取得できた個体数における、雌又は雄特異的遺伝子型を有する個体数の割合である。各DNA多型は、その性判別成功率が93.5%以上と高く、性判別マーカーとして有用である。
さらに、スキャフォルド64番のゲノム配列をHaploview(v4.2)を用い、LD-based partitioning algorithmで解析したところ、配列番号1の422番目から3595番目、3735番目から3788番目、6240番目から6642番目及び6698番目から7197番目の領域が、それぞれ、連鎖不平衡ブロックであることが明らかとなった。
クロマグロゲノムのスキャフォルド64番上の性特異的DNA多型を対象に、雌雄共通プライマーであるtuna_HRM4_F(配列番号8)及びtuna_HRM4_R(配列番号9)と、配列番号1で表される塩基配列の3139、3146及び3148番目(領域1の81、88及び90番目に相当)の塩基に位置する3箇所の雄特異的DNA多型を含む雄特異的未標識プローブであるtuna_HRMup_28(配列番号2)を用い(図2)、HRM解析による性判別試験を行った。プライマーとプローブの配列を表3に示す。なお、tuna_HRMup_28プローブは、PCRで伸長しないように、3’末端にidT修飾を有する。
本試験は、雌雄の配列の違いによりPCR産物とプローブの融解曲線が異なることを利用して性判別を行うものであり、HRM解析の結果出力される融解曲線において、65℃付近に特異的なピークが認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定できる。
マグロ類のHRM解析による性判別方法は、上述のように高い性判別精度を有し、従来技術のPCR法による性判別方法で必要だった個々のサンプルの電気泳動とその後の特異的バンドの確認が不要となることから、簡便な操作及び短時間で多検体のマグロ類の遺伝的性を判別できる。
被験体として実施例1の天然クロマグロのうち雄4個体及び雌4個体を用い、プローブを、配列番号1で表される塩基配列の3139、3146及び3148番目(領域1の81、88及び90番目に相当)の塩基に位置する3箇所の雄特異的DNA多型を含む雄特異的未標識プローブであるtuna_HRMup_24(配列番号3)、tuna_HRMup_32(配列番号4)、tuna_HRMup_36(配列番号5)、tuna_HRMup_28_2(配列番号6)又はtuna_HRMup_28_3(配列番号7)にかえた以外は、実施例1と同様にしてHRM解析による性判別を行った。試験は2連で行った。プローブは、それぞれ、実施例1のプローブの長さを4ヌクレオチド短くしたもの、4ヌクレオチド長くしたもの、8ヌクレオチド長くしたもの、プローブ位置を5’側に6ヌクレオチド分ずらしたもの、プローブ位置を3’側に4ヌクレオチド分ずらしたものである。プライマーとプローブの配列を表6に示す。各プローブは、3’末端にidT修飾を有する。
クロマグロゲノムのスキャフォルド64番上の性特異的変異を対象に、雌雄共通プライマーであるY3_DEL_F2(配列番号12)及びY3_DEL_R1(配列番号13)と、配列番号1で表される塩基配列の1417~1423番目(領域2の109~115番目に相当)の塩基の欠失部位を含む雄特異的未標識プローブであるtuna_HRMup_P3M_20(配列番号10)又はtuna_HRMup_P3M_24(配列番号11)を用い(図3)、HRM解析による性判別試験を行った。プライマーとプローブの配列を表7に示す。各プローブは、3’末端にidT修飾を有する。
実施例1~3の結果より、マグロ類のHRM解析による性判別方法は、表2に記載の一塩基多型だけにとどまらず、欠失多型にも適用できることが明らかとなった。
被験体として大西洋クロマグロ雄6個体及び雌6個体(計12個体、生殖腺による性判別済み)を用い、プローブとして配列番号2又は4のプローブを用いた以外は、実施例1と同様にしてHRM解析による性判別を行った。また、同個体を用い、プローブとして配列番号11のプローブを用いた以外は、実施例3と同様にしてHRM解析による性判別を行った。各試験は2連で行った。
従来より実施されている生殖腺目視により雌と判別された一方、本実施例の各試験で雄の融解曲線のパターンを示し、雄と判別された個体は、同一個体である。生殖腺による性判別では、個体採取時に生殖腺等を取り出し投棄する一瞬に生殖腺をみて判別する際の記録ミスの可能性があること、当該個体について複数のプローブとプライマーの組み合わせでPCR増幅と融解曲線の作成が確認できており、かつ全てで雄であるという同じ結果が得られていることから、当該個体については、生殖腺により判別した元々の性別データが誤っていたものと考えられる。
実施例1の天然太平洋クロマグロの雄77個体及び雌70個体(計147個体、生殖腺による性判別済み)の各個体より抽出したゲノムDNA(最終濃度0.5ng/μl)を鋳型とし、PrimeSTAR GXL kit(タカラバイオ株式会社製)と、領域1に設計した雄特異的プライマーY2_F1(配列番号14)及びY2_R2(配列番号15)(最終濃度各0.4μM)を用いて、Proflex PCR システム(アプライドバイオシステムズ製)によりPCR反応(98℃10秒、60℃15秒、68℃15秒の反応を35サイクル)を行い、得られたPCR増幅産物を3%アガロースゲルにアプライし、100Vで20分間、電気泳動を行った。
Y2_F1プライマーの3’末端並びに3’末端から3及び10塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Y2_R2プライマーの5’末端から7塩基目は雌雄共通の低頻度多型(A/T)に対応する塩基Wを、3’末端から2及び4塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有する。
電気泳動の結果、143bpのDNA断片の増幅が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、DNA断片の増幅が認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。
なお、陰性対照として、塩基配列を確認済の雌個体を用い、陽性対照として、塩基配列を確認済の雄個体を用いた。また、ノンテンプレートコントロール(NTC)として、DNAなしでPCRを行った。さらに、人為的ミスでPCRに失敗し、雄個体から特異的DNA断片が増幅されずに、雌と誤判定されてしまう偽陰性を防止するため、内部陽性対照としてミトコンドリアDNAのND4遺伝子(268bp)について、ND4_Fプライマー(配列番号18)及びND4_Rプライマー(配列番号19)(最終濃度各0.05μM)を用いた以外は、(1)と同様にしてPCR反応及び電気泳動を行った。
各プライマーの配列を表8に示す。
本比較例の方法では、ゲル電気泳動が必要なため、PCR反応とあわせて、1回の試験あたり実働1時間程度かかる。
領域2に設計した表8に示す雄特異的プライマーY3_F1(配列番号16)及びY3_R1(配列番号17)を用いた以外は、比較例1と同様にしてPCR反応及び電気泳動を行った。
Y3_F1プライマーの3’末端及び3’末端から7塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Y3_R1プライマーは欠失領域の上流及び下流の配列を有する。
電気泳動の結果、113bpのDNA断片の増幅が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、DNA断片の増幅が認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。
本比較例の方法では、ゲル電気泳動が必要なため、PCR反応とあわせて、1回の試験あたり実働1時間程度かかる。
領域2に設計した表7に示す雌雄共通プライマーY3_DEL_F2(配列番号12)及びY3_DEL_R1(配列番号13)を用いた以外は、比較例1と同様にしてPCR反応を行った。その後、得られたPCR増幅産物をマイクロチップ電気泳動装置(MultiNA DNA/RNA分析用マイクロチップ電気泳動装置、DNA-500キット、島津製作所製)を用いて電気泳動した。マイクロチップ電気泳動は、通常のアガロースゲル電気泳動よりも分解能が高い。
Y3_DEL_F2プライマー及びY3_DEL_R1プライマーで増幅されるDNA領域には、雄特異的な連続7塩基の欠失が存在するため、149bpの雌雄共通DNA断片と7塩基短い142bpの雄特異的欠失型DNA断片が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、149bpの雌雄共通DNA断片のみが認められた場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。
本比較例の方法では、高解像度ゲル電気泳動が必要なため、PCR反応とあわせて、1回の試験あたり実働1.5時間程度かかる。
Claims (7)
- 配列番号1で表される塩基配列の501番目の塩基、561及び562番目の塩基、564番目の塩基、595番目の塩基、644番目の塩基、769番目の塩基、770番目の塩基、789番目の塩基、1198番目の塩基、1200番目の塩基、1213番目の塩基、1275番目の塩基、1280番目の塩基、1338番目の塩基、1344番目の塩基、1416~1423番目の塩基、1472番目の塩基、1493番目の塩基、1866番目の塩基、1867番目の塩基、1899番目の塩基、1913番目の塩基、2583番目の塩基、2588番目の塩基、2589番目の塩基、2611番目の塩基、2622番目の塩基、2634番目の塩基、2643番目の塩基、2687番目の塩基、2693番目の塩基、2752番目の塩基、2753番目の塩基、2756番目の塩基、2801番目の塩基、2817番目の塩基、2855番目の塩基、2874番目の塩基、2901番目の塩基、3057番目の塩基、3093番目の塩基、3139番目の塩基、3146番目の塩基、3148番目の塩基、3196番目の塩基、3199番目の塩基、3249番目の塩基、3251番目の塩基、3368番目の塩基、3404番目の塩基、3407番目の塩基、3426番目の塩基、3433番目の塩基、3442番目の塩基、3470番目の塩基、3479番目の塩基、3545番目の塩基、3546番目の塩基、3735番目の塩基、3756番目の塩基、3769番目の塩基、3788番目の塩基、6256番目の塩基、6312番目の塩基、6455番目の塩基、6585番目の塩基、6781番目の塩基、6879番目の塩基、6930番目の塩基、6933番目の塩基、6940番目の塩基、6941番目の塩基、6987番目の塩基並びに7014番目の塩基の位置に存在するDNA多型からなる群から選択される1以上のDNA多型を検出することができる性判別用プローブと、前記性判別用プローブが検出するDNA多型が位置する塩基を含むDNA断片を増幅することができる雌雄共通プライマーセットを用いてHigh Resolution Melting(HRM)解析を行うことを特徴とする、太平洋クロマグロ(Thunnus orientalis)又は大西洋クロマグロ(Thunnus thynnus)の性判別方法。
- 前記性判別用プローブが検出するDNA多型が、前記配列番号1で表される塩基配列の3139番目の塩基、3146番目の塩基及び3148番目の塩基の位置に存在するDNA多型であることを特徴とする、請求項1記載の太平洋クロマグロ又は大西洋クロマグロの性判別方法。
- 前記性判別用プローブが検出するDNA多型が、前記配列番号1で表される塩基配列の1416~1423番目の塩基の位置に存在するDNA多型であることを特徴とする、請求項1記載の太平洋クロマグロ又は大西洋クロマグロの性判別方法。
- 前記性判別用プローブが、配列番号2~7のいずれか1つで表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号8で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号9で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであることを特徴とする、請求項1又は2記載の太平洋クロマグロ又は大西洋クロマグロの性判別方法。
- 前記性判別用プローブが、配列番号10又は11で表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号12で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号13で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであることを特徴とする、請求項1又は3記載の太平洋クロマグロ又は大西洋クロマグロの性判別方法。
- 性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含むマグロ類の性判別用キットであって、前記性判別用プローブが、配列番号2~7のいずれか1つで表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号8で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号9で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、太平洋クロマグロ又は大西洋クロマグロの性判別用キット。
- 性判別用プローブと雌雄共通プライマーセットを含むマグロ類の性判別用キットであって、前記性判別用プローブが、配列番号10又は11で表される塩基配列からなるプローブであり、前記雌雄共通プライマーセットが、配列番号12で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号13で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、太平洋クロマグロ又は大西洋クロマグロの性判別用キット。
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