KR20120138519A - 대립유전자 특이적 ｐｃｒ을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법 - Google Patents

대립유전자 특이적 ｐｃｒ을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120138519A
KR20120138519A KR1020110058054A KR20110058054A KR20120138519A KR 20120138519 A KR20120138519 A KR 20120138519A KR 1020110058054 A KR1020110058054 A KR 1020110058054A KR 20110058054 A KR20110058054 A KR 20110058054A KR 20120138519 A KR20120138519 A KR 20120138519A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pcr
seq
sex
primer
cattle
Prior art date
Application number
KR1020110058054A
Other languages
English (en)
Inventor
김현욱
한상은
유선아
명현군
Original Assignee
솔젠트 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 솔젠트 (주) filed Critical 솔젠트 (주)
Priority to KR1020110058054A priority Critical patent/KR20120138519A/ko
Publication of KR20120138519A publication Critical patent/KR20120138519A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 소의 모색 및 성별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 프라이머 세트, 이를 포함하는 PCR 키트, 및 이를 사용한 소의 모색 및 성별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PCR 방법에 의하면 종래 사용되던 PCR-RFLP 방법에 비교하여, 소의 모색과 성별을 더욱 간단하고 신속하게 동시에 판별할 수 있으며, 이를 통해 한우 및 암소 우육 여부 판단에 대한 신뢰도 높은 자료를 제공할 수 있다.

Description

대립유전자 특이적 ＰＣＲ을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법{Method for Identification of Coat Colour and Sex of Cattle Using Allele Specific Polymerase Chain Reaction}
본 발명은 대립유전자 특이적 PCR을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법에 관한 것이다.
국내에 유통되고 있는 쇠고기는 대부분 한우육과 젖소육, 그리고 수입육인데, 소비자들의 한우육 선호로 인해 젖소육이나 수입육이 한우육으로 둔갑되어 판매되는 경우가 종종 있다. 또한, 미국산 쇠고기 수입개방과 더불어 원산지 표시제 시행에 따라 한우와 수입쇠고기의 감별에 대한 요구가 높아졌다.
최근에 분자 유전학 및 유전자 분석기술의 발달로 DNA 분자수준에서 종 특이적인 DNA 염기서열 차이에 따른 축종 판별은 물론 동종내 품종판별의 가능성이 제기되었다. 특히, PCR을 이용하는 DNA 다형 분석기법으로서 RAPD(random amplified polymorphic DNA) 기법은 랜덤 프라이머(random primer)를 사용하여 지놈 내 DNA 염기서열 부위를 임의로 증폭시켜 DNA 표지 인자를 탐색하는 기술로서 각종 동물의 유전분석 및 종 또는 품종식별에 폭 넓게 응용되어 왔다.
SNP(Single Nucleotide Polymorphism)는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이, 집단에서 1％ 이상의 빈도로 존재하는 2개의 대립 염기서열이 발생하는 위치를 말하며 염기의 결손, 삽입 또는 치환에 의해 발생하며 사람 유전자에서 가장 많은 변이의 원인으로 질병이나 약물의 개발을 위해 많은 연구가 이루어지고 있다. SNP의 검출을 위한 가장 확실한 방법은 DNA염기서열을 분석하는 것이 일반적이지만, 이것은 힘들고 시간이 많이 소모된다는 단점이 있으며 현재 까지 개발된 SNP 분석 방법으로는 allele-specific oligonucleotide hybridization, ligase chain reaction, PCR-RFLP, 형광 probe와 5'-nuclease assay, allele-specific PCR 방법이 있다.
포유동물의 proopiomelanocotin으로부터 유도된 MC (melanocortin)은 부신피질 세포에서 스테로이드 합성을 자극하는 ACTH (adrenocorticotropic hormone)과 멜라닌 세포에서 멜라닌 형성에 관여하는 MSH (melanocyte-stimulating hormone)으로 구성되어 있으며, 기능 및 생리적 활성도에 따라 5가지(MC1 - MC5) 서브타입으로 분류된다. 특히, MSHR (melanocyte-stimulating hormone receptor) 또는 MC1R (melanocortin 1 receptor)는 멜라닌의 확산 및 합성을 자극하는 호르몬 수용체로서 멜라닌 세포내에 두 종류의 색소 즉, 적색에 관여하는 phaeomelanin과 갈색 또는 흑색에 관여하는 eumelanin의 색소합성 조절에 중요한 역할을 담당한다. 체 내에서 멜라닌형성은 티로시나아제 효소농도에 따라 phaeomelanin과 eumelanin 생성이 달리 발현되며 티로시나아제 활성은 extension (E) 좌위를 지정하는 α-MSH와 MC1R에 의해 조절된다. 포유동물에서 MC1R 돌연변이가 모색변이를 일으킨다는 사실이 규명됨에 따라 색소합성 에 관여하는 MC1R 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 방법으로 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석방법을 이 용하여 소, 말, 돼지 및 면양 등의 축종을 대상으로 모색변이에 관한 연구가 진행되어 왔다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 소의 모색 및 성별을 동시에 판별할 수 있는 분자생물학적 검출 방법을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 모색 결정 유전자 MC1R (Melanocortin 1 receptor)의 SNP 변이 및 특정 염기 결실에 특이적인 프라이머와, 성별을 판별할 수 있는 Y 염색체 유전자 SRY (sex determining region Y)에 특이적인 프라이머를 설계하였고, 이를 사용하는 대립 유전자 특이적 PCR 방법을 확립하여, 소의 모색과 성별 동시에 성공적으로 판별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 소의 모색 및 성별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 프라이머 세트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 소의 모색 및 성별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PCR 방법을 이용하여 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 서열목록 제 4 서열, 서열목록 제 5 서열, 및 서열목록 제 6 서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는데 사용되는 PCR용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 서열목록 제 4 서열, 서열목록 제 5 서열, 및 서열목록 제 6 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 PCR 프라이머 세트를 포함하는 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는데 사용되는 PCR용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는 방법을 제공한다: (a) 소로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계; (b) 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열, 서열목록 제3서열, 서열목록 제4서열, 서열목록 제5서열, 및 서열목록 제6서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 PCR 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 행하는 단계; 및 (c) PCR 산물을 분석하여 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는 단계.
본 발명자들은 소의 모색 및 성별을 동시에 판별할 수 있는 분자생물학적 검출 방법을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 모색 결정 유전자 MC1R (Melanocortin 1 receptor)의 SNP 변이 및 특정 염기 결실에 특이적인 프라이머와, 성별을 판별할 수 있는 Y 염색체 유전자 SRY (sex determining region Y)에 특이적인 프라이머를 설계하였고, 이를 사용하는 대립 유전자 특이적 PCR 방법을 확립하여, 소의 모색과 성별 동시에 성공적으로 판별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 용어 "MC1R (Melanocortin 1 receptor)"는 MSHR (melanocyte-stimulating hormone receptor)으로도 알려진 단백질로서 멜라닌의 확산 및 합성을 자극하는 호르몬 수용체이다. MC1R은 멜라닌 세포 내에 두 종류의 색소, 즉 적색에 관여하는 phaeomelanin과 갈색 또는 흑색에 관여하는 eumelanin의 색소 합성 조절에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 포유동물에서 상기 MC1R 유전자의 돌연변이가 모색의 변화를 유도하며, 소에서 MC1R 유전자는 3개의 대립유전자(ED, e, E+)가 있는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "SNP (Single Nucleotide Polymorphism)"는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이, 집단에서 1％ 이상의 빈도로 존재하는 2개의 대립 염기서열이 발생하는 변이를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "SRY (sex-determining region Y)"는 Y 염색체상에서 성(sex)을 결정하는 유전자를 의미한다(Wallis MC, Waters PD, Graves JA, "Sex determination in mammals - Before and after the evolution of SRY". Cell. Mol. Life Sci. 65 (20): 3182, June 2008).
본 발명의 명세서에서 용어 “프라이머 (primer)”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 완충액하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
296 Y(T/C) SNP 검출 프라이머쌍
본 발명에서 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오타이드는 MC1R 유전자의 99번째 아미노산 코돈 CTG가 CCG로 치환되는 (T/C) SNP를 검출할 수 있는 대립유전자 특이적 프라이머 (allele specific primer)이다.
본 명세서에서 상기 서열목록 제 3 서열의 프라이머는"296 C F"프라이머로 명명된다.
본 발명의 상기 "296 C F"프라이머는 상기 (T/C) SNP에서 "C" 염기를 특이적으로 검출하도록 디자인되었다.
또한, 상기"296 C F" 프라이머는 SNP의 "C" 염기 검출 특이도를 더욱 향상시키기 위해 상기 프라이머의 3' 말단으로부터 3번째 야생형 염기 "구아닌(Guaine, G)"을 "티민(Thymine, T)" 으로 치환함으로서 미스 매치(mismatch) 염기를 도입한 프라이머이다(도 3 참조).
한편, 본 발명에서 서열목록 제 4 서열의 올리고뉴클레오티드는"CON R"으로 명명되며, 상기 "296 C F"프라이머와 쌍을 이루어 이에 대해 역방향 프라이머로 작용하여, 225 bp 크기의 PCR 산물이 생성한다(도 6 참조).
상기"296 C F"와 "CON R" 프라이머 쌍에 의해 생성되는 225 bp 크기의 PCR 산물은 MC1R 유전자의 대립유전자형이 흑색의 모색인 ED 유전자형("C" 염기 특이적 유전자형)임을 지시한다.
310 구아닌 염기 결실 (310 G del.) 검출 프라이머쌍
본 발명에서 서열목록 제 4 서열의 올리고뉴클레오타이드는 MC1R 유전자의 104번째 아미노산 글리신의 코돈 GGT와, 이 코돈 GGT에서 두 번째 구아닌(Guanine) 염기 하나가 결실된 서열 G_T를 구별하는 대립유전자 특이적 프라이머이다.
본 명세서에서 상기 서열목록 제 4 서열의 프라이머는"310 T R"프라이머로 명명된다.
본 발명의 상기"310 T R"프라이머는 상기 코돈 GGT에서 G가 결여됨으로써 이동되는 " T " 염기를 특이적으로 검출하도록 디자인되었다.
또한, 본 발명의 상기 "310 T R" 프라이머는 검출 특이도를 향상시키기 위해 3' 말단으로부터 2번째 야생형 염기"시토신(Cytosine, C)"을 "아데닌(Adenine, A)"으로 치환한 미스 매치(mismatch) 염기가 도입되어 있다(도 3 참조).
한편, 본 발명에서 서열목록 제 1 서열의 올리고뉴클레오티드는"CON F"으로 명명되며, 상기"310 T R"프라이머와 쌍을 이루어 전방향 프라이머로 작용하면, 151 bp 크기의 PCR 산물이 생성된다(도 6 참조).
상기"310 T R"및"CON F" 프라이머쌍에 의해 생성되는 151 bp 크기의 PCR 산물은 MC1R 유전자의 대립유전자형이 적색 모색을 나타내는 "e" 유전자형임("T" 염기 특이적 유전자형)을 지시한다.
성 판별 프라이머쌍
본 발명에서"SRY F"로 명명되는 서열목록 제 5 서열의 프라이머와 "SRY R"로 명명되는 서열목록 제 6 서열의 프라이머는 쌍을 이루어 PCR 반응에서 100 bp의 PCR 산물을 생성하며, 이 100 bp 크기의 PCR 산물의 생성은 SRY (sex-determining region Y) 유전자의 존재를 지시하므로, 검출 대상 시료가 수컷임을 나타낸다(도 6 참조).
내부 대조군(Internal Control) 프라이머쌍
MC1R 유전자를 타겟으로 하는 서열목록 제 1 서열의 "CON F" 프라이머와 서열목록 제 2 서열의 "CON R" 프라이머는 쌍을 이루어 PCR 반응에서 308 bp 크기의 PCR 산물을 생성한다. 이 308 bp 크기의 PCR 산물은 PCR 반응의 정상적 수행 여부를 모니터링 할 수 있는 내부 대조군 산물이다(도 6 참조).
본 발명은 상기 프라이머쌍을 이용하여 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는 멀티플렉스 PCR 방법을 제공한다.
하기에서 본 발명의 방법을 단계에 따라 상세히 설명한다.
단계 (a): 소로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계
먼저, 소로부터 지놈(genomic) DNA 분자를 얻는다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 DNA 분자는 소의 다양한 세포 또는 조직으로부터 얻을 수 있으며, 이러한 세포 또는 조직의 원천의 예로는 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기 등이 있다.
본 발명의 방법에서 지놈 DNA의 분리는 당 업계에 공지된 통상의 방법, 예컨대, 페놀-클로로포름(Phenol-Chloroform) 추출 방법에 따라 실시될 수 있다(Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF., Nucleotic Acids Res. 16, p1215. 1998).
단계 (b) : 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열, 서열목록 제3서열, 서열목록 제4서열, 서열목록 제5서열, 및 서열목록 제6서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 PCR 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 행하는 단계
상기 단계 (a)에서 준비한 지놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 설명된 본 발명의 프라이머들(CON F, CON R, 296 C F, 310 T R, SRY F, SRY R)을 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하여 타겟 서열을 증폭한다.
상기 중합효소연쇄반응은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
중합효소연쇄반응에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.
본 발명에서 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다. 한편, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성 (pre-denaturation) 과정, (ⅱ) 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 행한다.
단계 (c) : PCR 산물을 분석하여 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는 단계
소의 모색과 관련하여,"296 C F"프라이머 및 "CON R" 프라이머의 쌍에 의해 생성되는 225 bp 크기의 PCR 산물은 MC1R 유전자의 대립유전자형이 ED 유전자형(흑색 모색)임을 지시하고,"310 T R"프라이머 및 "CON F" 프라이머의 쌍에 의해 생성되는 151 bp 크기의 PCR 산물은 MC1R 유전자의 대립유전자형이 "e" 유전자형(적색 모색)을 지시한다. 따라서, 소의 모색 판별은 (i) 296 Y(T/C) SNP에 관한 225bp PCR 산물 및 (ⅱ) 310 Guanine 염기 결실에 관한 151bp PCR 산물의 생성여부를 관찰하여 결정한다.
보다 구체적으로, (i) 225bp의 PCR 산물만이 생성된 경우 ED/ED 또는 ED/E+의 유전자형이고, 이는 비황우로 판별하고, (ⅱ) 225bp 및 151bp의 PCR 산물이 동시에 생성된 경우 ED/e 유전자형이고, 이는 비황우로 판별하며, (ⅲ) 151bp의 PCR 산물만이 생성된 경우 e/e 또는 e/E+ 유전자형이고, 이는 황우로 판별하고, (iv) 225bp 및 151bp의 PCR 산물 모두 생성되지 않은 경우 E+/E+ 유전자형이고, 이는 비황우로 판별된다. PCR 산물로부터 소의 모색의 판별은 아래 표 1와 같이 정리할 수 있다.
PCR 결과 PCR 산물의 크기 MC1R 유전자형 모색 판별
296 Y SNP (225bp) 310 G del. (151bp)
1 225bp X ED/ED 또는 ED/E+ 비황우
2 225bp 151bp ED/e 비황우
3 X 151bp e/e 또는 e/E+ 황우
4 X X E+/E+ 비황우
또한, 시료 소의 성 판별은 SRY F 프라이머와 SRY R 프라이머쌍으로부터 생성되는 100bp의 PCR 산물의 생성여부를 관찰하여 판별한다. 즉, 100bp 크기의 PCR 산물이 생성되면 수소로 판별하며, 이 100bp 산물이 생성되지 않으며 암소로 판별한다.
또한, PCR 반응의 정상적인 수행 여부는 "CON F" 프라이머 및 "CON R" 프라이머가 쌍을 이루어 생성되는 308bp 크기의 내부대조군의 PCR 산물을 관찰하여 판별한다. 이 308bp 크기의 PCR 산물이 생성된 경우는 PCR 반응이 정상적으로 수행되었음을 의미하며, 이 308bp의 산물이 생성되지 않으면 PCR 반응이 정상적으로 수행되지 않은 것이다.
본 발명은 상기 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 서열목록 제 4 서열, 서열목록 제 5 서열, 및 서열목록 제 6 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 PCR 프라이머 세트를 포함하는 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는데 사용되는 PCR용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명은 소의 모색 및 성별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 프라이머 세트, 이를 포함하는 PCR 키트, 및 이를 사용한 소의 모색과 성별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PCR 방법에 의하면 종래 사용되던 PCR-RFLP 방법에 비교하여, 소의 모색과 성별을 더욱 간단하고 신속하게 판별할 수 있으며, 이를 통해 한우 및 암소 우육 여부 판단을 위한 신뢰도 높은 자료를 제공할 수 있다.
도 1은 MC1R 유전자에서 본 발명의 프라이머 타깃이 되는 296 Y SNP 부위 및 310 G del. 부위의 염기서열을 보여준다.
도 2는 MC1R 유전자의 296 Y SNP 부위 및 310 G del. 부위에 결합하는 본 발명의 프라이머의 위치를 보여준다.
도 3은 본 발명의 "296 C F" 프라이머와 "310 T R" 프라이머의 구성도를 보여준다.
도 4은 SRY 유전자에서 본 발명의 프라이머 타깃이 되는 부위의 염기서열을 보여준다.
도 5는 SRY 유전자에서 본 발명의 프라이머가 결합하는 위치를 보여준다.
도 6는 본 발명의 멀티플렉스 PCR에 사용되는 각 프라이머들의 결합부위와 PCR 증폭 산물을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 시료에 대해 본 발명의 멀티플렉스 PCR을 행한 실험 결과를 보여준다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 공시 재료
본 실시예에서는 국립 농산물 품질관리원 시험연구소에서 제공된 한우 745두, 수입우 1026두의 시료를 사용하였다. DNA 추출을 위해 시료로부터 세포를 포함하는 시료를 채취하였다.
2. 실험 방법
(1) 지놈(genomic) DNA의 분리
시료로부터 지놈(genomic) DNA의 추출 및 정제는 Miller 등의 방법(Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF., Nucleotic Acids Res. 16, p1215.(1998))을 일부 보완하여 실시하였다. 추출 및 정제된 DNA 정량 분석은 Spectrophotometer ND-1000 (Nanodrop, USA)을 이용하였으며, 260 nm - 280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도와 순도를 확인하였다. 멸균증류수를 이용하여 모두 25 ng/㎕로 보정한 후 실험 사용 전까지 -20 ℃에 보관하였다.
(2) 프라이머(Primer)의 제작
황우와 비-황우의 판별을 위한 MC1R 유전자의 프라이머는 MC1R 유전자(Genebank accession number Y19103)의 염기서열을 근거로 하여 제작하였다.
MC1R 유전자의 99 번째 아미노산 코돈 CTG가 CCG로 치환되는 (T/C) SNP [= 296 Y SNP]를 특이적으로 검출할 수 있는 대립유전자 특이적 프라이머는"C"대립유전자 염기 특이적으로 제작하였으며, 여기에 프라이머의 3'-말단 에서 3번째 염기서열을 "G"에서 "T"로 치환시켜 미스매치 염기를 도입함으로써 프라이머의 특이도를 향상시켰다. 이렇게 제조한 프라이머는 "296 C F"으로 명명하였다.
296 Y SNP 부위의 "C" 대립유전자 염기 특이적 PCR 산물을 225 bp 크기로 만들기 위해, 상기 "296 C F" 프라이머와 쌍을 이루는 역방향"CON R" 프라이머를 제작하였다.
MC1R 유전자의 104번째 아미노산인 글리신 코돈 GGT와, 이 코돈 GGT에서 두 번째 구아닌(Guanine) 염기 하나가 결실된 서열 G_T ["310 G del." 부위]를 구별할 수 있는 대립유전자 특이적 프라이머 "310 T R"를 설계하였다. 이 "310 T R"프라이머는 " T " 염기 특이적으로 제작하였으며, 프라이머의 3'-말단에서 2번째 염기를 "C"에서 "A"로 치환시켜 미스 매치 염기를 도입시킴으로써 프라이머의 특이성을 향상시켰다.
상기 "310 G del." 부위의 "T"염기 특이적 PCR 산물을 151 bp 크기로 만들기 위해, 상기 "310 T R"프라이머와 쌍을 이루는 전방향 "CON F" 프라이머를 제작하였다.
한편, 상기 프라이머 "CON F"와 "CON R"은 쌍을 이루어 308 bp 크기의 PCR 산물을 생성하며, 이는 정상적인 PCR 반응을 모니터링할 수 있는 내부 대조군 밴드로 사용된다.
성별을 판별할 수 있는 SRY (sex-determining region Y) 유전자 (Genebank accessioin number AB039748) 특이적 프라이머는 100 bp 크기의 PCR 산물이 생성되도록 설계하였다.
상기 설명된 본 발명의 PCR 프라이머의 염기서열은 아래 표 1과 같다.
명칭 염기서열 (5' -> 3')
CON F ccattgccaagaaccgcaacct (서열목록 제 1 서열)
CON R atcctccacgctcggggcag (서열목록 제 2 서열)
296 C F acgtgctggagacggcagtcatTcC (서열목록 제 3 서열)
310 T R acggccgcctgggtggccaggacAAg (서열목록 제 4 서열)
SRY F cgaagacgaaagktggctct (서열목록 제 5 서열)
SRY R gcttttcagcatctgtaagccttt (서열목록 제 6 서열)
(3) 프라이머 프리 믹스(Primer pre-mix)의 제조
상기 제조한 6개의 각 프라이머를 100 pmole/㎕로 희석하였다. 희석한 프라이머들은 멸균수 240 ㎕에 10 ㎕씩 혼합하고, 최종 부피가 300 ㎕가 되도록하고, 3 ㎕씩 PCR 튜브에 옮겼다. 옮긴 프라이머 믹스는 동결건조기(BIOTRON, Korea)에서 2시간 동안 동결건조하였다. 동결 건조된 프라이머 프리-믹스는 사용 전 까지 -20 ℃에 보관하였다.
(4) PCR에 의한 증폭
PCR 반응은 프라이머가 동결 건조되어 있는 PCR 튜브에 지놈 DNA 2 ㎕, 2X 멀티플렉스 PCR 프리 믹스(SolGent, Korea) 12.5 ㎕를 넣고 최종 부피가 25 ㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. PCR 조건은 95℃에서 15분간 전-변성(pre-denaturation)시킨 후 95 ℃ 20초, 64 ℃ 30초, 72 ℃ 50초간 3단계로 30사이클을 수행하고, 마지막으로 72 ℃에서 3분간 최종 연장(final extension)을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 3 ％ 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기 영동하여 UV로 증폭 여부를 확인하였다.
(5) 유전자형의 결정
각 시료에서의 유전자형 결정은 세 가지 유전자 마커, "296 Y SNP", "310 G del.", 및 "SRY"를 대상으로 대립유전자 특이적 PCR (allele specific PCR) 방법을 통해 PCR을 행한 후, PCR 산물의 양상을 비교하여 결정하였다.
296 Y SNP 마커가"C" 염기 타입(ED : 흑색을 나타내는 유전자 형)인 경우 225 bp 크기의 PCR 산물이 생성되는 반면, T 염기 타입(E+ 혹은 e 유전자형)일 경우에는 PCR 산물이 생성되지 않았다. 또한, "310 G del." 마커의 경우, T 염기 타입(e : 적색을 나타내는 유전자 형)일 경우에는, 151 bp 크기의 PCR 산물이 생성되는 반면, G 염기 타입(E+ 혹은 ED 유전자형)일 경우에는 PCR 산물이 생성되지 않았다.
PCR 정상적 진행 여부를 확인 할 수 있는 내부 대조군(internal control) PCR 산물은 308 bp 크기로 나타났다. 내부 대조군이 확인되지 않을 경우에는 PCR을 다시 수행 하여야 한다.
100 bp 위치에는 소의 Y 염색체에 특이적으로 존재하는 SRY (sex determining region Y)유전자의 PCR 산물이 나타났으며, 100 bp 크기의 PCR 산물에 의해 시료가 수소임을 확인할 수 있었다. 100 bp 크기의 PCR 산물이 생성되지 않는 경우에는 Y 염색체가 없는 암소로 판별이 된다.
아래 표 3에 3가지 유전자 마커를 대상으로 상술한 대립유전자 특이적 PCR을 행하는 경우의 각 마커에 대응하는 PCR 증폭 산물의 크기를 정리하였다.
내부
대조군		 296 Y SNP -
C 타입(ED 유전자형)		 310 G del. -
T 타입(e 유전자형) 		SRY -
유전자 마커
PCR 산물의
크기(bp)		 308 225 151 100
하기 표 4에는 3가지 유전자 마커를 대상으로 상술한 대립유전자 특이적 PCR을 행하는 경우의 각 마커에 대응하는 유전자형을 정리하였다.
MC1R 유전자형 성별 PCR 증폭 산물 밴드의 크기(bp)
ED/ED Male 308, 225, 100
ED/E+ Male 308, 225, 100
ED/e Male 308, 225, 151, 100
E+/E+ Male 308, 100
E + /e Male 308, 151, 100
e/e Male 308, 151, 100
ED/ED Female 308, 225
ED/E+ Female 308, 225
ED/e Female 308, 225, 151
E+/E+ Female 308
E + /e Female 308, 151
e/e Female 308, 151
3. 실험 결과
도 7에는 수입우와 한우 시료에 대해 본 발명의 방법을 사용하여 소의 모색 및 성별을 판별한 결과를 나타내었다. 1번 시료의 경우 모색과 관련하여 225 bp 및 151 bp의 밴드가 나타나지 않았고, 성별과 관련하여 100 bp 밴드가 나타나 비황우의 수소로 판별하였다. 2번 시료의 경우 모색과 관련하여 225 bp 밴드가 나타났고 성별과 관련하여 100 bp 밴드가 나타나지 않아 비황우의 암소로 판별하였다. 3번 시료의 경우 모색과 관련하여 225 bp 및 151 bp 밴드가 나타났고 성별과 관련하여 100 bp 밴드가 나타나 비황우의 수소로 판별하였다. 4번 시료의 경우 모색과 관련하여 151 bp 밴드만이 나타났으며 성별과 관련하여 100 bp 밴드가 나타나지 않아 황우의 암소로 판별하였다. 5번 시료의 경우 모색과 관련하여 151 bp 밴드만이 나타났고 성별과 관련하여 100 bp가 나타나 황우의 수소로 판별하였다. 한편, 모든 시료에서 내부 대조군인 308 bp 밴드가 관찰되어 PCR이 정상적으로 수행되었음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Solgent.co.,Ltd <120> Method for Identification of Coat Colour and Sex of Cattle Using Allele Specific Polymerase Chain Reaction <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ccattgccaa gaaccgcaac ct 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 atcctccacg ctcggggcag 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 acgtgctgga gacggcagtc attcc 25 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 acggccgcct gggtggccag gacaag 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 cgaagacgaa agktggctct 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 gcttttcagc atctgtaagc cttt 24

Claims (3)

  1. 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 서열목록 제 4 서열, 서열목록 제 5 서열, 및 서열목록 제 6 서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는데 사용되는 PCR 프라이머 세트.
  2. 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 서열목록 제 4 서열, 서열목록 제 5 서열, 및 서열목록 제 6 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 PCR 프라이머 세트를 포함하는 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는데 사용되는 PCR용 키트.
  3. 다음의 단계를 포함하는 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는 방법:
    (a) 소로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
    (b) 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열, 서열목록 제 3 서열, 서열목록 제 4 서열, 서열목록 제 5 서열, 및 서열목록 제 6 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 PCR 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 행하는 단계; 및
    (c) PCR 산물을 분석하여 소의 모색 및 성별을 동시에 판별하는 단계.
KR1020110058054A 2011-06-15 2011-06-15 대립유전자 특이적 ｐｃｒ을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법 KR20120138519A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110058054A KR20120138519A (ko) 2011-06-15 2011-06-15 대립유전자 특이적 ｐｃｒ을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110058054A KR20120138519A (ko) 2011-06-15 2011-06-15 대립유전자 특이적 ｐｃｒ을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120138519A true KR20120138519A (ko) 2012-12-26

Family

ID=47905302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110058054A KR20120138519A (ko) 2011-06-15 2011-06-15 대립유전자 특이적 ｐｃｒ을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20120138519A (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190041798A (ko) * 2017-10-13 2019-04-23 대한민국(농촌진흥청장) 소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별방법
CN114075566A (zh) * 2020-08-13 2022-02-22 中国农业大学 水牛asip基因插入突变及其分子鉴定方法和应用
KR20230168694A (ko) 2022-06-08 2023-12-15 대한민국(농촌진흥청장) 제주 흑우 이모색 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별 방법

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190041798A (ko) * 2017-10-13 2019-04-23 대한민국(농촌진흥청장) 소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별방법
CN114075566A (zh) * 2020-08-13 2022-02-22 中国农业大学 水牛asip基因插入突变及其分子鉴定方法和应用
KR20230168694A (ko) 2022-06-08 2023-12-15 대한민국(농촌진흥청장) 제주 흑우 이모색 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8936912B2 (en) Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
JPH11512607A (ja) 核酸分子を特性化する方法
JP2007530026A (ja) 核酸配列決定
WO2016152812A1 (ja) 標的核酸の高感度検出方法
CN113913530B (zh) 一种与绵羊体高相关的分子标记及其应用
EP3064596B1 (en) Method for analysing cyp2c19 gene polymorphism, kit and use thereof for analysing the cyp2c19 gene polymorphisms and to evaluate drug efficacy.
US10023908B2 (en) Nucleic acid amplification method using allele-specific reactive primer
CN110603326B (zh) 扩增靶核酸的方法
US11111514B2 (en) Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
KR20120138519A (ko) 대립유전자 특이적 ｐｃｒ을 이용한 소의 모색 및 성별 동시 판별 방법
KR101843432B1 (ko) 소 미토콘드리아 dna의 단일염기다형성 마커를 포함하는 소 개체 및 품종 식별용 조성물, 및 이를 이용하는 소의 식별 방법
KR101355914B1 (ko) 한우 및 수입우 판별에 유용한 단일염기다형성마커 및 이의 용도
US20080305470A1 (en) Nucleic Acid Sequencing
AU2004257309B2 (en) Improving production characteristics of cattle
KR101845711B1 (ko) Ociad2 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 snp 마커 및 이를 이용한 판별 방법
CN110938681A (zh) 等位基因核酸富集和检测方法
KR102575618B1 (ko) 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물
KR102576264B1 (ko) 유의 종 근원 판별용 바이오 마커 및 이의 용도
EP4253564A1 (en) Target nucleic acid amplification method with high specificity and target nucleic acid amplifying composition using same
KR101972107B1 (ko) Ap1ar 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 snp 마커 및 이를 이용한 유전체 각인 판별 방법
JP4022522B2 (ja) 塩基置換の検出方法
JP3682688B2 (ja) 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キット
KR20230141826A (ko) 합성 폴리뉴클레오티드 및 대립유전자를 선택적으로 증폭하기 위한 방법
US20110257018A1 (en) Nucleic acid sequencing
SUTARNO et al. Genetic diversity and sequence variations at growth hormone loci among composite and hereford populations of beef cattle

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application