KR20230141826A - 합성 폴리뉴클레오티드 및 대립유전자를 선택적으로 증폭하기 위한 방법 - Google Patents
합성 폴리뉴클레오티드 및 대립유전자를 선택적으로 증폭하기 위한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
대안적 실시양태에서, 표적 서열 내의 특정 뉴클레오티드 위치에서 임의의 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 증폭 또는 검색을 방해하지 않으면서 특정 대립유전자의 증폭 또는 검색에 대해 선택할 수 있는 프라이머-기반 핵산 증폭 방법이 제공되거나, 달리는, 임의의 대체 대립유전자를 동시에 증폭하면서 하나의 대립유전자를 선택적으로 억제하기 위한 방법이 제공되거나, 단일 뉴클레오티드 변이(SNV), 삽입 및 결실의 증폭을 포함하여 점 돌연변이를 동시에 증폭하면서 야생형 서열을 억제하기 위한 방법이 제공된다. 대안적 실시양태에서, 핵산 조성물의 일부는 특정 핵산 표적 서열의 증폭을 선택적으로 억제하지 않고, 이에 따라 증폭의 성공을 결정하고 대체 대립유전자(들) 또는 돌연변이를 코딩하는 것에 대한 특정 핵산 표적 서열의 상대적 비율을 결정하는 데 유용한 내부 제어를 제공한다.
Description
관련 출원
본 특허 협력 조약(PCT) 국제 출원은 2021년 2월 2일에 출원된 미국 가출원 일련번호(USSN) 63/144,723의 35 U.S.C. § 119(e)하에 우선권의 이익을 주장한다. 상술한 출원은 이의 전체가 모든 목적을 위해 본원에서 참조에 의해 명시적으로 포함되어 있다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원은 모든 목적을 위해 명시적으로 참조에 의해 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및, 예를 들면, 게놈으로부터 핵산의 NexGen 서열분석(NGS)과 같은 고처리량 서열분석에 관한 것이다. 대안적 실시양태에서, 표적 서열 내의 특정 뉴클레오티드 위치에서 임의의 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 증폭 또는 검색을 방해하지 않으면서 특정 대립유전자의 증폭 또는 검색에 대해 선택할 수 있는 프라이머(primer)-기반 핵산 증폭 방법이 제공되고, 달리 말하면, 임의의 대체 대립유전자를 동시에 증폭하면서 하나의 대립유전자를 선택적으로 억제하기 위한 방법이 제공되거나, 단일 뉴클레오티드 변이(SNV), 삽입 및 결실의 증폭을 포함하여 점 돌연변이를 동시에 증폭하면서 야생형 서열을 억제하기 위한 방법이 제공된다. 대안적 실시양태에서, cDNA의 융합도 검출될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 핵산 조성물의 일부는 특정 핵산 표적 서열의 증폭을 선택적으로 억제하지 않고, 이에 따라 증폭의 성공을 결정하고 대체 대립유전자(들) 또는 돌연변이를 코딩하는 것들에 대한 특정 핵산 표적 서열의 상대적 비율을 결정하는 데 유용한 내부 제어를 제공할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(선택자(selector) 폴리뉴클레오티드로 지칭됨) 및/또는 본원에 제공된 방법의 사용을 포함하는 질환 또는 상태를 진단하기 위한 방법이 제공된다. 대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 진단 방법을 포함하여, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(선택자 폴리뉴클레오티드로 지칭됨) 및/또는 본원에 제공된 방법의 사용을 포함하는 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하기 위한 방법이 제공된다.
액체 생검(biopsy)의 등장에 의해, 희귀 대립유전자 검출은 그 어느 때보다 중요해졌다. 순환 세포-비함유 DNA(ccfDNA)는 모든 인간의 혈액에 존재하며, 대부분 건강한 정상 세포에서 유래한다. 그러나, 임산부에서, 소량의 태아 DNA가 존재하고 비침습 산전 검사(non-invasive prenatal testing; NIPT)로 공지된 절차에서 유전 질환을 찾는 데 사용할 수 있으며; 마찬가지로, 고형 기관 이식(SOT)에서, 소량의 기증자-유래 세포-비함유 DNA(dd-cfDNA)를 사용하여 다양한 기관에 대한 급성 거부 반응을 검출할 수 있고; 암에서, 소량의 순환 종양 DNA(ctDNA)를 사용하여 질환의 조기 재발을 검출할 수 있었다. 감도, 특이성, 및 정량화를 개선하는 에러 보정 방법(예: 분자 인덱스)을 사용하여, 고처리량 NexGen 서열분석(NGS)은 이제 이들 모든 액체 생검 적용을 위한 우수한 검출 장치이다. 그러나, 대부분의 서열 판독은 비정보성이다: NIPT의 모체 판독, dd-cfDNA의 수용자 판독, ccfDNA의 야생형 판독. 다수의 비정보성 판독은 처리량을 감소시키고, 비용을 증가시키며, 검출을 방해한다.
대립유전자-특이적 PCR(AS-PCR)을 사용하여 목적하는 표적(특정 대립유전자 또는 체성 돌연변이)을 선택적으로 증폭할 수 있지만, 교정 폴리머라제를 사용할 수 없고, 미스프라이밍은 위양성을 유도할 수 있으며, 원하는 각 대립유전자마다 상이한 프라이머가 필요하다. 원하지 않는 대립유전자에 대한 차단제도 사용할 수 있지만, 이들은 PCR 검정 "풋프린트"를 증가시키고, 이는 ccfDNA의 짧은 DNA 조각(약 168bp의 중앙 크기; 태아 또는 종양 DNA에서 유래한 경우는 더 짧음)에 따라 검출율이 낮아진다. 또한, 비정보성 판독의 수를 극적으로 감소시키는 것이 바람직하지만, 이러한 판독의 세트 수는 비교를 위한 내부 제어로서 및 전체 반응이 작동했는지 보장하기 위해 유용하다. AS-PCR 또는 차단제 모두 이를 확실하게 수행할 수 없다.
대안적 실시양태에서, 특정 핵산 표적 서열의 증폭을 선택적으로 억제하면서, 억제된 표적과 적어도 하나의 뉴클레오티드만큼 상이한 핵산(또는 폴리뉴클레오티드 또는 데옥시리보핵산(DNA, cDNA 포함) 서열에 존재하는 대체 대립유전자(들) 또는 돌연변이(들)를 선택적으로 증폭시켜 대체 대립유전자(들) 또는 돌연변이(들)의 분석 및 측정을 가능하게 하는 방법에 유용한 프라이머-기반 핵산 조성물이 제공된다. 대안적 실시양태에서, 핵산 조성물의 일부는 특정 핵산 표적 서열의 증폭을 선택적으로 억제하지 않고, 이에 따라 증폭의 성공을 결정하고 대체 대립유전자(들) 또는 돌연변이를 코딩하는 것들에 대한 특정 핵산 표적 서열의 상대적 비율을 결정하는 데 유용한 내부 제어를 제공한다.
대안적 실시양태에서, 핵산 표적으로부터 결합 모이어티(binding moiety)를 선택적으로 분리함으로써 핵산 표적의 단리를 선택적으로 억제하기 위한 방법이 제공된다. 결합 모이어티를 선택적으로 보유한 핵산 표적의 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 검색 또는 체류는 영향을 받지 않는다. 대안적 실시양태에서, 사용된 핵산 조성물의 일부는 결합 모이어티로부터 선택적으로 분리되지 않고, 이에 따라 검색의 성공을 결정하고 대체 대립유전자(들) 또는 돌연변이를 코딩하는 것들에 대한 특정 핵산 표적 서열의 상대적 비율을 결정하는 데 유용한 내부 제어를 제공한다.
다른 실시양태에서, 대립유전자-특이적 또는 돌연변이-특이적 또는 메틸화-특이적 증폭 또는 포획은 분자 일배체를 결정하는 데 사용된다.
대안적 실시양태에서, 차이는 서열분석, 하이브리드화(hybridization), 질량 분석법 또는 뉴클레오티드 분해능을 포함하여 서열 변화를 검출할 수 있는 임의의 기타 기술에 의해 검출된다.
대안적 실시양태에서, 3' 말단을 기준으로 제1(최종(ultimate)), 제2(끝에서 두 번째(penultimate)), 제3(끝에서 세 번째(antepenultimate)), 제4(끝에서 네 번째(preantepenultimate)), 제5(끝에서 다섯 번째(propreantepenultimate)) 또는 제6(끝에서 다섯 번째 전의 하나의 잔기(one before the propreantepenultimate)) 위치에 위치하거나 3' 말단보다 더 먼 위치에 있는 적어도 하나의 잔기(선택자 뉴클레오티드라고 지칭됨)를 포함하는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(선택자 뉴클레오티드라고 지칭)로서,
상기 적어도 단일 잔기 선택자 뉴클레오티드는 표적 핵산에 대한 선택자 폴리뉴클레오티드의 결합에 필요한 선택자 폴리뉴클레오티드의 영역 또는 섹션 내의 임의의 다른 잔기와 구조적 또는 화학적으로 상이하고,
합성 DNA 폴리뉴클레오티드(선택자 폴리뉴클레오티드라고 지칭됨)는 DNA 폴리머라제에 의해 신장될 수 있거나, DNA 폴리머라제에 의해 신장될 수 있는 3' 말단을 갖도록 처리될 수 있는 3' 말단을 갖거나, 또는
상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드는 효소, 임의로 DNA 폴리머라제 효소에 의해 신장되는 이의 능력과 관련하여 이의 3' 말단에서 차단되지 않는, 합성 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본원에 제공된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 다른 실시양태에서:
- 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기는 3' 말단으로부터 제2 위치, 또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 끝에서 두 번째 위치에 위치하고;
- 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기가 3' 말단으로부터 제3 위치, 또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 끝에서 세 번째 위치에 위치하고;
- 선택자 뉴클레오티드는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 또는 적어도 하나의 합성 또는 비천연 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되고/되거나,
- 선택자 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다.
대안적 실시양태에서, 제2 핵산 서열로부터 제1 핵산 서열을 구별하기 위한 핵산 증폭 방법으로서,
상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 증폭 반응 혼합물 내에 있고,
(a) 본원에 제공 또는 기재된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 제공하거나 제공한 단계로서, 여기서 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 선택적 리보뉴클레오티드 잔기)을 함유하는 단계;
(b) DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드를 제공하거나 제공한 단계로서, 여기서 임의로 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드는 게놈(임의로 세포, 미생물 또는 바이러스 게놈), cDNA 라이브러리(library) 또는 게놈 라이브러리를 포함하거나 이들로부터 유래하고, 임의로 게놈, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리는 진핵생물 또는 원핵생물, 식물 또는 포유동물(임의로 인간), 미생물(임의로 박테리아, 조류, 원핵생물, 고세균(Archea) 또는 진균) 또는 바이러스 또는 박테리오파지로부터 유래하는 단계;
(c) 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드에 접촉, 어닐링(annealing) 또는 하이브리드화하는 단계로서, 여기서 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드는, 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)가, 상기 DNA 폴리뉴클레오티드에서 또는 이에 대해, 상보적 서열 또는 실질적으로 상보적 서열(예를 들면, 서열은, 약 95% 내지 99%의 서열 동일성(identity)을 갖는 경우, 실질적으로 상보성 서열이다)에 어닐링 또는 특이적으로 하이브리드화하는 조건하에서 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)에 대한 주형(template)(주형 DNA 폴리뉴클레오티드)으로 작용함에 따라 핵산 이중체(duplex)를 생성하고;
여기서, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에서 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루거나(예를 들면, 도 2A 참조, 여기서 "R"은 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다), 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에서 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루지 않는 단계(예를 들면, 도 2B 참조, 여기서 "R"은 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루지 않는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다("X"로 표시됨));
(d) 상기 이중체를, DNA 폴리머라제 효소, 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성(extension activity)을 갖는 폴리머라제 효소 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 효소적으로 활성인 조건하에서, 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖고 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소, 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 접촉시키는 단계로서,
여기서,
(i) 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 및 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드 사이에서 부정합(mismatching)하고, 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성은, DNA 폴리머라제가 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유하지 않는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드로 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 잔류물을 신장시키기 전에, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기) 및 선택자 뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드 3'을 포함하는 3' 말단으로부터 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 효소적 제거 부분을 초래하거나; 또는
(ii) 상기 DNA 폴리머라제는, 선택자 뉴클레오티드(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 제거하지 않으면서, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에서 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드와 염기쌍을 이루는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 신장시키고, 따라서 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유하거나 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드에 도입하는 단계; 및
(e) 신규 생성된 핵산 이중체를 리보뉴클레아제 효소와 접촉시키는 단계로서, 여기서 임의로 리보뉴클레아제 효소는 열안정성이고, 열안정성 리보뉴클레아제는 열안정성 리보뉴클레아제 효소가 활성인 조건하에서 열안정성 리보뉴클레아제 H2 효소인 단계를 포함하고,
여기서,
(i) 반응에 존재하는 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)가 제거되는 경우, 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에 5'인 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 일부는 신장된 합성 폴리뉴클레오티드 내에 보유되거나; 또는
(ii) 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)가, 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)에 보유되고 데옥시리보뉴클레오티드 잔기와 정합(matching)하는 경우, 열안정성 리보뉴클레아제 효소는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에서 절단함으로써 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에 5'인 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 부분을 분리하고,
상기 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보 뉴클레오티드 잔기)에 5'였던 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 부분을 보유하는 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 신장된 선택자 폴리뉴클레오티드)는 기하급수적으로 증폭될 수 있고, 상기 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)로부터 분리된 상기 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에 5'인 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 일부를 갖는 상기 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(신장된 선택자 폴리뉴클레오티드)는 기하급수적으로 증폭될 수 없고, 이에 따라 이의 증폭은 선택적으로 억제되어, 제2 핵산 서열로부터 제1 핵산 서열을 구별하는, 핵산 증폭 방법이 제공된다.
대안적 실시양태에서, 제2 핵산 서열로부터 제1 핵산 서열을 구별하기 위한 핵산 증폭 방법으로서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 증폭 반응 혼합물 내에 있고,
(a) 본원에 제공 또는 기재된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 제공하거나 제공한 단계로서, 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)을 함유하는 단계;
(b) DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드를 제공하거나 제공한 단계로서, 임의로 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드는 게놈(임의로 세포, 미생물 또는 바이러스 게놈), cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리를 포함하거나 이들로부터 유래하고, 임의로 게놈, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리는 진핵생물 또는 원핵생물, 식물 또는 포유동물(임의로 인간), 미생물(임의로 박테리아, 조류, 원핵생물, 고세균 또는 진균) 또는 바이러스 또는 박테리오파지로부터 유래하는 단계;
(c) 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드에 접촉, 어닐링 또는 하이브리드화하는 단계로서, 여기서 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드는, 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)가 상기 DNA 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열 또는 실질적으로 상보적 서열에 어닐링 또는 특이적으로 하이브리드화되는 조건하에서 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)에 대한 주형(주형 DNA 폴리뉴클레오티드)으로 작용함으로써 핵산 이중체를 생성하고;
여기서, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에서 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루거나(예를 들면, 도 10A 참조, 여기서 "R"은 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다), 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에서 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루지 않는 단계(예를 들면, 도 10B 참조, 여기서 "R"은 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루지 않는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다("X"로 표시됨));
(d) 상기 핵산 이중체를, DNA 폴리머라제 효소 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖는 폴리머라제 효소 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 효소적으로 활성인 조건하에서, 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖고 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소, 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소, 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 접촉시키는 단계로서,
여기서,
(i) 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 및 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드 사이에서 부정합하고, 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성은, DNA 폴리머라제가 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유하지 않는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드로 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 잔류물을 신장시키기 전에, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기) 및 선택자 뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드 3'을 포함하는 3' 말단으로부터 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 효소적 제거 부분을 초래하거나; 또는
(ii) 상기 DNA 폴리머라제는, 선택자 뉴클레오티드(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 제거하지 않으면서, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에서 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드와 염기쌍을 이루는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 신장시키고, 따라서 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유하거나 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드에 도입하는 단계; 및
(e) 증폭 후, 앰플리콘(또는 신규 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 선택자 폴리뉴클레오티드)을 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 5' 또는 3' 측에서, 또는, 존재하는 경우, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 3개 뉴클레오티드 내에서 절단하는 시약 또는 효소로 처리하는 단계를 포함하고,
여기서, 임의로, 시약 또는 효소는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유한 앰플리콘(또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드)로부터 결합 모이어티를 분리하거나 상당량의 도입된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머를 분리하여, 앰플리콘, 또는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 갖지 않는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드를 가능하게 하고, 따라서 결합 모이어티 또는 상당량의 도입된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드), 또는 우선적으로 포획(또는 물리적으로 단리) 또는 후속적으로 우선적으로 증폭되는 프라이머를 보유하는, 핵산 증폭 방법이 제공된다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서:
- 단일 선택자 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하는 데 사용되는 시약은 리보뉴클레아제 H2이거나, 단일 선택자 리보뉴클레오티드의 3' 측에서 절단하는 데 사용되는 시약은 열(heat)의 존재하에 수산화나트륨이고;
- 이 방법은 핵산 이중체를 변성시켜 단일가닥 DNA(single-stranded DNA)를 생성하는 것을 추가로 포함하고, 단일가닥 DNA를 단일 선택자 리보뉴클레오티드의 3' 측에서 절단하는 리보뉴클레아제로 처리되고;
- 폴리머라제 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성은 상이한 효소에 의해 제공되고;
- 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 핵산 증폭 방법에 사용되는 프라이머이거나 이를 포함하며, 임의로 증폭 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함하고;
- 증폭하는 동안, 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 5' 또는 3' 측에서, 또는, 존재하는 경우, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 3개 뉴클레오티드 내에서 절단하는 효소로 처리되어, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머의 일부를, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유한 앰플리콘(또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드)으로부터 분리하고, 증폭 반응에서 리턴 프라이머의 신장에 의해 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머가 완전히 카피되는 것을 방지하고, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 갖지 않는 앰플리콘이 기하급수적 증폭을 지원하기에 충분한 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머 서열의 보유에 의해 우선적으로 증폭되도록 하고;
- 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머는 리보뉴클레오티드를 포함하고, 선택자 뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하는 효소는 리보뉴클레아제 H2이며, 임의로 리보뉴클레아제 H2는 열안정성이고, 임의로 열안정성 리보뉴클레아제 H2는 파이로코커스 아비시(Pyrococcus abysii) RNase H2이고;
- 이 방법은 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)가 상응하는 정상 데옥시리보뉴클레오티드로 대체되어 DNA 증폭 프라이머를 생성하고, 이 DNA 증폭 프라이머의 특정 양이 상기 제1 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)와 혼합되는 것을 제외하고는 제1 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)와 동일한 제2 합성 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머, 또는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 함유하여, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 함유하지만, 이제 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 결여함에 따라, 이제 선택자 뉴클레오티드(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에 특이적인 시약 또는 효소에 의한 절단에 내성이 있는 소정 양의 앰플리콘이 생산되도록 하는 프라이머를 추가로 포함하고;
- 제2 합성 DNA 폴리뉴클레오티드에 의해 생성된 앰플리콘은, 증폭이 작동했음을 입증하기 위한 내부 반응 대조군(internal reaction control)으로서, 및 제1 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)에 의해 생성된 앰플리콘, 또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드의 양을 비교할 수 있는 내부 표준으로서 사용되고;
- 앰플리콘 또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드의 서열은, 임의로 생거(Sanger) 서열분석, 차세대 서열분석(NGS), 단일 분자 실시간(SMRT) 서열분석, 나노기공 DNA 서열분석, 가역적 종결 화학(예를 들면, SOLEXA 기술(Illumina)), 조합 프로브 앵커 합성(cPAS; combinatorial probe anchor synthesis), 질량 분석법 서열분석(mass spectrometry sequencing), 또는 대량 병렬 시그니처 서열분석(MPSS; massively parallel signature sequencing)의 사용을 포함하는 방법을 사용하는 DNA 서열분석에 의해 결정되고;
- 원래의 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에 대응하는 뉴클레오티드의 동일성은 목적 부위에 대한 프라이머의 신장에 의해 결정되고;
- 목적 부위에서 뉴클레오티드의 동일성 및 상대적 양은 라벨(label) 또는 질량(mass)을 사용하거나 또는 라벨 또는 질량에 의해 결정되고, 임의로 상기 목적 부위에서 뉴클레오티드의 동일성 및 상대적 양은 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 사용하여 생성된 앰플리콘에서 목적 부위 전체에 걸쳐 프라이머의 단일-염기 신장(single-base extension)을 포함하는 방법에 의해 결정되고/되거나;
- 목적 앰플리콘 또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드의 생산은 정량적 PCR(qPCR), 디지털 PCR, 유전자형 방법 또는 이의 등가물(equivalent) 또는 이들의 조합에 의해 결정된다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공 또는 기재된 방법을 실시하기 위한 물질, 임의로 효소 및/또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드, 임의로 선택자 폴리뉴클레오티드(임의로 본원에 제공된 하나 또는 복수의 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드))를 포함하고, 임의로 본원에 제공 또는 기재된 방법을 실행하기 위한 설명서(instruction)를 추가로 포함하는 키트 또는 제품이 제공된다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 방법을 실시하기 위한 재료를 포함하고, 임의로 본원에 제공된 방법을 실시하기 위한 위한 설명서도 포함하는 키트가 제공된다.
대안적 실시양태에서, 질환 또는 상태와 연관되거나 이의 진단과 관련된 대립유전자, 또는 게놈 서열의 존재 또는 부재를 결정함으로써 이를 필요로 하는 개체(individual)가 상기 질환 또는 상태를 갖고 있는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태를 진단하기 위한 방법으로서,
상기 질환 또는 상태와 연관되거나 이의 진단과 관련된 대립유전자 또는 게놈 서열의 존재 또는 부재는 본원에 제공된 방법을 사용하여 결정되는, 방법이 제공된다. 질환은 암일 수 있다.
대안적 실시양태에서, 질환 또는 상태에 대해 표시된 약물, 약물 조합 또는 치료 섭생으로 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하기 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체가 본원에 제공된 진단 방법을 사용하여 질환 또는 상태를 갖는 것으로 진단되거나 가질 소인이 있는, 방법이 제공된다. 질환은 암일 수 있거나, 상태는 유전성 질환 또는 유전적 상태이다.
대안적 실시양태에서, 질환 또는 상태를 진단하기 위한 본원에 제공된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드의 용도가 제공되고, 여기서 질환 또는 상태는 질환 또는 상태와 연관되거나 이의 진단과 관련된 대립유전자 또는 게놈 서열의 존재에 의해 진단되고, 질환 또는 상태와 연관되거나 이의 진단과 관련된 대립유전자 또는 게놈 서열의 존재 또는 부재는 본원에 제공된 방법을 사용하여 결정된다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 상태를 진단하는 데 사용하기 위한 것이고, 여기서 질환 또는 상태는 질환 또는 상태와 연관되거나 이의 진단과 관련된 대립유전자 또는 게놈 서열의 존재에 의해 진단되고, 질환 또는 상태와 연관되거나 이의 진단과 관련된 대립유전자 또는 게놈 서열의 존재 또는 부재는 본원에 제공된 방법을 사용하여 결정된다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하는 것을 포함하는, 생물학적 표본에서 희귀 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법 및 합성 DNA 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 여기서 임의로 생물학적 표본은 이를 필요로 하는 개체로부터 생검 또는 조직 또는 혈액 샘플, 또는 액체 샘플을 포함하거나 이들로부터 유래한다.
대안적 실시양태에서, 생물학적 표본에서 희귀 대립유전자의 존재 또는 부재의 검출은 비침습적 산전 검사(NIPT), 또는 기관 이식(임의로 고형 기관 또는 골수 이식) 후에 조직 적합성의 평가 또는 기증자-유래 핵산의 검출, 또는 항미생물 내성(AMR)의 평가 또는 이를 필요로 하는 개체의 미생물 내성의 조기 검출, 또는 최소 잔류 질환(MRE) 존재의 평가, 임의로 골수 절제 후에 MRE의 평가를 위한 것이다.
본 발명의 하나 이상의 예시적 실시양태에 대한 상세한 설명은 첨부된 도면 및 하기 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
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도 1은 선택자 프라이머 내에서 단일 잔기 리보뉴클레오티드 선택자 뉴클레오티드의 가능한 배치를 나타내고; 리보뉴클레오티드 선택자 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 문자 앞에 배치된 "r"로 지정된다(즉, "r"은 자체 뉴클레오티드 잔기가 아니라, "r"로 밑줄이 그어진 "G" 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 것을 분명히 지정하기 위해서만 포함된다). 선택자 뉴클레오티드는 3' 말단을 기준으로 제1(최종)(서열번호 1), 제2(끝에서 두 번째)(서열번호 2), 제3(끝에서 세 번째)(서열번호 3), 제4(끝에서 네 번째)(서열번호 4), 제5(끝에서 다섯 번째)(서열번호 5) 또는 제6번(끝에서 다섯 번째 전의 것)(서열번호 6) 위치에 배치할 수 있다. 리보뉴클레오티드 선택자 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 문자 앞에 "r"로 표시되며 밑줄이 그어져 있다. 선택자 뉴클레오티드가 위치할 수 있는 3' 말단에서 훨씬 더 먼 위치는 제시되지 않는다:
서열번호 1, 또는 최종
AGGCCTGCTGAAAATGACGTGAATATAACTTGTGGTGTGTAGTTGAGCTGGTGTG
서열번호 2, 또는 끝에서 두 번째
GGCCTGCTGAAAATGAATGAATATAACTTGTGGTGGTGGTGGTGC
서열번호 3, 또는 끝에서 세 번째
GCCTGCTGAAAATGACGTGAATATAACTTGTGGTGGTGTTGAGTTGAGCTGGTGGCG
서열번호 4, 또는 끝에서 네 번째
CCTGCTGAAAATGACTGAATATAACTTGTGGTGTAGTTGAGCTGGTGTGCGT
서열번호 5, 또는 끝에서 다섯 번째
CTGCTGAAAATGACGTGAATATAACTTGTGGTGTAGTTGAGCTGGTGTGGCGTA
서열번호 6, 또는 끝에서 다섯 번째 전의 것
TGCTGAAAATGACGTGAATATAACTTGTGGTGTAGTTGAGCTGGTGGCGTAG
도 2A-B는 하나의 대립유전자를 억제하면서 동시에 동일한 뉴클레오티드 위치에서 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 증폭을 가능하게 하는 본원에 제공된 예시적 방법을 개략적으로 도시한다(예를 들면, 돌연변이 대립유전자만 증폭되는 경우):
도 2A: 억제되는 대립유전자(이 예에서는 야생형(WT) 뉴클레오티드)의 경우, 프라이머(여기서, "R"은 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 나타냄)는 목적 WT 뉴클레오티드와 정확한 서열 정합이고, 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 교정 폴리머라제에 의해 신장된다. 프라이머가 연장되면, 열안정성 리보뉴클레아제 H2(예: 파이로코커스 아비시(Pyrococcus abysii) RNase H2)는 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 "R"(밑줄)로 표시된 위치에서 절단하고, 대부분의 프라이머 서열(5' 말단)이 제거되거나 분리된다. 열안정성 리보뉴클레아제 H2에 의해 서열이 제거 또는 분리되었기 때문에, 리턴 프라이머는 제1 프라이머의 대부분을 카피할 수 없다. 이는 억제되는 대립유전자(이 예에서는 WT 대립유전자)가 기하급수적으로 증폭되는 것을 정지시키고, 증폭 반응에서 생성되는 WT 대립유전자 서열의 수를 크게 감소시킬 수 있다.
도 2B: 대조적으로, 선택자 프라이머의 단일 리보뉴클레오티드(여기서 "R"은 주형 DNA 폴리클레오티드와 쌍을 이루는 있는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 나타냄)가 주형과 부정합하는 경우(이 예에서는 WT 대립유전자), 교정 폴리머라제의 3' 및 5' 엑소뉴클레아제 활성은 부정합을 통해 다시 어닐링된 프라이머를 소화시키고, 단일 잔기 리보뉴클레오티드가 제거되고, 절단된 프라이머는 돌연변이 부위로 연장되는 경우, 정확한 데옥시리보뉴클레오티드(즉, 돌연변이와 부정합하는 것)이 사용된다. 당해 부위의 임의의 대체 대립유전자 또는 임의의 돌연변이는 야생형 리보뉴클레오티드와 부정합할 수 있고, 따라서 모든 대체 대립유전자 또는 돌연변이에 대해 단일 잔기 부정합 리보뉴클레오티드는 WT 대립유전자에 결합된 프라이머로부터 제거되고, 절단된 프라이머가 돌연변이 부위 위로 신장될 때에 특정 돌연변이에 대해 정확한 정합으로 대체된다. 선택자 프라이머에서 단일 잔기 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된(어닐링된) 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 대해 내성을 갖게 된다. 이어서, 리턴 프라이머는 도입(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머를 카피할 수 있으며, 임의의 대체 대립유전자 또는 돌연변이 서열은 기하급수적으로 증폭되어, 존재하는 경우, 반응에서 생성되는 대체 대립유전자 또는 돌연변이 서열의 수를 크게 증가시킨다. 선택자 프라이머에 의해 돌연변이 서열은 도입되지 않는다. 후속 분석에 의해 검출된 모든 돌연변이 서열은 2개의 품질 검사를 통과했다: 첫째, 돌연변이는 단일 잔기 리보뉴클레오티드를 제거하는 하이브리드화 부정합으로 인해 검출되고; 리보뉴클레오티드의 손실은 대체 대립유전자 또는 돌연변이가 존재했음을 나타내며; 둘째, 고도로 정확한 폴리머라제는 대체 대립유전자 또는 돌연변이 부위를 높은 충실도로 카피하며(여기서, 임의로 높은 충실도는 폴리머라제가 대체 대립유전자 또는 돌연변이 부위를 TAQ 폴리머라제보다 높은 충실도로 카피한다는 것을 의미한다), 이는 서열분석(또는 프라이머 신장 또는 하이브리드화와 같은 기타 방법)을 통해 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 동일성을 나타낸다.
도 3은 동일한 3' 말단 및 상이한 길이의 5' 말단을 갖는 선택자 프라이머를 나타낸다. 선택자 단일 잔기 리보뉴클레오티드는 밑줄이 그어져 있고, 앞에 "r"이 붙어 있으며, 코딩 서열의 뉴클레오티드 위치 38에서 인간 유전자 커스틴(Kirsten) 랫트 육종(KRAS)의 야생형 뉴클레오티드와 정합하도록 배치되어 있다. 표준 PCR 조건하에 야생형 서열 및 돌연변이 서열(여기서는 38G>A가 사용됨) 사이의 예상되는 TM 차이가 확인된다. 선택자 프라이머의 길이를 증가시키면, TM의 차이가 감소한다. TM 차이의 감소는 록킹된 핵산(LNA)(브릿지 핵산(BNA) 또는 접근불가능한 RNA(이는 RNase H2에 의해 소화되지 않음) 또는 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가 브릿지로 리보스 모이어티가 변형된 변형된 RNA 뉴클레오티드로도 공지됨), 및/또는 기타 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, 선택자 뉴클레오티드에 대한 서열 5'에서 TM을 증가시키는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, dT와 염기쌍을 이룰 수 있는 2,6-디아미노퓨린을 사용하여(증가는 잔기당 1-2℃까지 가능); 또는 dG와 염기쌍을 이루고 TM을 잔기당 0℃까지 증가시키는 5-메틸 데옥시시티딘을 사용함으로써 달성될 수 있다.
서열번호 7
GTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
서열번호 8
CTTGTGGTAGTTGAGCTGGTGGTGrGCG
서열번호 9
TAAACTTGTGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
서열번호 10
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
서열번호 11
GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
서열번호 12
TATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
도 4는 도 3에 도시된 각 프라이머와 공통 리턴 프라이머를 사용하여 실행된 PCR에 의해 생성된 앰플리콘의 생거 서열분석 트레이스를 나타낸다. 상부 열과 하부 열 모두에서, 화살표는 표적 서열에서 가변 뉴클레오티드의 위치를 나타낸다(사용된 주형은 야생형 및 KRAS 38G>A 돌연변이에 대해 이형접합성인 세포주로부터 추출한 DNA이다). 생거 서열분석 트레이스의 상부 열은 PCR 중에 RNase H2가 존재하지 않은 경우의 각 반응에 대한 결과를 나타낸다. 프라이머가 길고 더욱 안정적일수록, 돌연변이 신호(화살표로 강조 표시된 녹색 트레이스)가 더 양호하게 보이지만, 60-mer 프라이머를 사용하더라도 녹색 돌연변이 "A" 신호는 흑색 야생형 "G" 신호보다 상당히 적다. 예를 들면, TM을 증가시키는 LNA 또는 기타 뉴클레오티드 변형에 의한 추가 안정화는 돌연변이 대립유전자에 대한 이들 결과를 개선시킬 수 있다. RNase H2가 존재하지 않는 경우, 프라이머의 일부(리보뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 잔기 없음)는 야생형 서열에 어닐링되고 신장된 프라이머로부터 제거되지 않고; 야생형의 기하급수적 증폭이 발생한다. 열안정성 RNase H2가 동일한 반응(하부 열)에 포함되는 경우, 돌연변이 신호는 돌연변이 주형에 대한 프라이머 안정성의 함수로서 야생형 신호와 비교하여 점진적으로 더 현저해진다. 야생형의 경우, RNase H2의 존재는 대부분의 프라이머 서열(5' 말단)이 신장된 프라이머로부터 분리 또는 제거되어 기하급수적 증폭을 손상시킨다. 돌연변이의 경우, 단일 잔기 리보뉴클레오티드는 신장 전에 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 돌연변이 서열에 어닐링된 프라이머로부터 제거되고, 따라서 돌연변이 부위에 걸쳐 신장된 프라이머는 RNase H2에 내성을 갖고, 기하급수적으로 증폭된다.
도 5는 도 3에 도시된 51-mer 선택자 프라이머 및 야생형(대립유전자 G) DNA 주형과 돌연변이(대립유전자 A) DNA 주형의 적정에서 공통 리턴 프라이머를 사용한 생거 서열분석 결과를 나타낸다. 야생형(WT) 및 돌연변이(MUT) KRAS 대립유전자 모두에 대해 계산된 일배체 게놈 등가물의 수는 각 생거 서열분석 트레이스 위에 도시되어 있다. 2,998개의 야생형 DNA의 계산된 배경에 대한 돌연변이 DNA의 계산된 2개 카피에서도, 명확한 돌연변이(A) 신호가 보인다(하부 열, 우측). 매우 적은 양의 돌연변이 DNA(하부 열)에서, 매우 희미한 "G" 신호를 볼 수 있으며, 주형 코딩되지 않지만 서열분석 폴리머라제(예: SEQUENASETM(ThermoFisher Scientific))에 의해 주형 말단에 도달할 때에 추가되는 "T" 신호도 볼 수 있다. 추가된 "T" 신호의 크기가 "G" 신호에 필적한다는 것은 프라이머 부위가 앰플리콘을 함유하는 모든 또는 거의(또는 실질적으로) 모든 WT "G"로부터 절단되었음을 나타낸다. 예를 들면, 바코드(예: ILLUMINA 샘플 바코드)를 추가하기 위한 후속 PCR은 이들 WT 서열을 증폭하지 않는다. ILLUMINA® NGS로 진행하는 샘플은 브릿지 증폭되지 않으며, 서열분석되지 않는다. 따라서, 임의의 또는 거의(또는 실질적으로) 임의의 야생형 배경 없이 임의 양의 돌연변이 DNA를 검출할 수 있다.
도 6A-B는 RNase H2의 부재하에 선택자 프라이머를 사용하여 야생형 KRAS를 증폭했을 경우의 결과를 나타낸다. 증폭 후, 도 6A, RNase H2를 추가하여 리보뉴클레오티드 G(rG)의 5' 측에서 절단하고 WT "G"의 상류에서 프라이머 서열을 제거하거나; 또는 도 6B, NaOH 및 열을 사용하여 리보뉴클레오티드 G(rG)의 3' 측에서 절단하고, 리보뉴클레오티드 G(rG)의 3' 측에 있는 WT "C"의 상류에서 프라이머 서열을 제거한다. 두 경우 모두, 처리된 DNA 쇄의 말단을 나타내는 폴리머라제(SEQUENASETM) 부가 "T"를 볼 수 있다. 예를 들면, 비오틴 또는 ILLUMINA® 캡처 서열과 같은 임의의 결합 모이어티는 WT 함유 앰플리콘으로부터 제거된다. 스트렙트아비딘(비오틴의 경우) 또는 ILLUMINA® 플로우 셀(ILLUMINA® 캡처 서열의 경우)을 사용한 검색은 돌연변이 앰플리콘(존재하는 경우)만을 캡처한다.
도 7은 끝에서 세 번째 위치(서열번호 11)에 G 리보뉴클레오티드(rG)를 포함하는 51-mer 선택자 프라이머 및 그 하부에 끝에서 세 번째 위치(서열번호 13)에 정상 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 이의 대응물을 나타낸다. 선택자 프라이머의 고유한 특징은 제한된 수의 야생형 서열을 허용하도록 미세 조정할 수 있다는 것이다. 예를 들면, G 리보뉴클레오티드(rG)를 함유하는 프라이머는 RNase H2가 존재하는 PCR에서 선택될 수 있는 반면, 리보뉴클레오티드를 결여하는(데옥시리보뉴클레오티드로 대체된) 프라이머는 RNase H2에 내성을 갖고 증폭 또는 검색될 수 있다. 이것의 가치는 특정 검정이 작동했다는 것을 입증하는 내부 제어를 제공하고; 샘플 사이의 WT 및 MUT 서열의 정량적 비교를 가능하게 한다는 것이다. 도시된 서열은 GCCTGCTGAAAATGACTGAATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG(서열번호 3)이고, 여기서 리보뉴클레오티드 선택자 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 문자 앞에 배치된 "r"로 지정된다(볼드체로 표시되고 밑줄 그어진 잔기는 리보뉴클레오티드이다). 도 7에서 그 하부는 끝에서 세 번째 위치의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드 대신 데옥시리보뉴클레오티드라는 점을 제외하면 동일한 서열이다(서열번호 13). 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 더 짧은 서열을 사용할 수 있다.
서열번호 13
GGCCTGCTGAAAATGAATGAATATAACTTGTGGTGGTGTTGAGTTGAGCTGGTGGCG
도 8은 분자 일배체의 실행에서 본원에 제공된 방법의 유용성을 나타낸다. 이 실시예에서, 개체의 유전자형은 4개의 다형성 부위의 각각에서 이형접합성이다. 적절한 선택자 프라이머를 사용함으로써, 상부 DNA의 증폭은 억제되고, 하부 DNA의 증폭은 방해받지 않는다. 다양한 수단에 의한 유전자형은 하나의 일배체형을 나타내는 반면, 다른 일배체형은, 공지된 경우, 전체 유전자형으로부터 도출될 수 있다. 원하는 경우, 별도의 반응에서, 그 반대의 경우도 수행할 수 있다: 적절한 선택자 프라이머를 사용하면, 하부 DNA의 증폭은 억제되고, 상부 DNA의 증폭은 방해받지 않는다. 이 앰플리콘의 유전자형은 일배체형 조성을 확인할 수 있다.
도 9는 도 1에 수록된 선택자 폴리뉴클레오티드로 수득된 앰플리콘을 사용한 생거 서열분석 결과를 나타내고; RNase H2(상부 열)의 부재하에 수득된 결과는 종종 위치 38번에서 2개 트레이스, 야생형 "G" 및 돌연변이 "A"를 나타내고; 선택자 뉴클레오티드가 이 예의 최종 위치에 있는 경우, 야생형 "G" 신호는 돌연변이 "A" 신호에 거의 필적하지만, 다른 모든 경우, "A" 신호는 "G" 신호보다 더 작은 크기를 갖는다. 열안정성 RNase H2(하부 열)의 존재하에, 모든 선택자 폴리뉴클레오티드는, 돌연변이 "A" 신호(이 경우)를 방해하지 않으면서, 위치 38(화살표로 표시)에서 야생형 "G" 함유 서열의 증폭을 억제 또는 부분적으로 억제하는 데 효과적이다.
도 10A-B는 본원에 제공된 예시적 방법을 개략적으로 도시한 것이며, 여기서 동일한 뉴클레오티드 위치에서 가능한 모든 대립유전자들은 증폭 동안 결합 모이어티에 태그되지만, 대립유전자 중 하나, 예를 들면, 야생형 대립유전자만이 결합 모이어티로부터 분리되어 정제를 방지한다.
도 10A: 정제를 원하지 않는 대립유전자(이 예에서, 야생형(WT) 뉴클레오티드)의 경우, "R"이, 목적의 WT 뉴클레오티드와 정확히 서열 정합인, 예를 들면(도 1 참조), 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 나타내는 프라이머가 3'으로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 교정 폴리머라제에 의해 신장되는 것을 나타낸다. 프라이머는 결합 모이어티(예: 도 10A의 원 내에 "B"로 표시된 비오틴)로 태그되고; 결합 모이어티는 또한 특정 뉴클레오티드 서열 또는 이의 포획 및 정제(및 후속 검출)를 가능하게 하는 기타 모이어티일 수도 있다. 증폭 후, 앰플리콘은, 야생형 대립유전자를 함유하는 신장된 프라이머로부터 포획 모이어티를 분리하여 이의 후속 포획 및 정제를 방지하는 선택자 뉴클레오티드(이 예에서 "R"로 표시되고 밑줄이 그어진)의 5' 또는 3' 측에서 절단하는 약제 또는 효소로 처리된다. 선택자 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 경우, 앰플리콘이 여전히 이중가닥일 때 이의 5' 측에서 절단하는 효소는 RNase H2일 수 있거나; 단일가닥 상태로 변성된 경우, 리보뉴클레오티드의 3' 측에서 절단하는 리보뉴클레아제 I일 수 있다. 열의 존재하에 수산화나트륨을 사용하여, 리보뉴클레오티드의 3' 측에서 절단할 수도 있다;
도 10B: 대조적으로, 선택자 프라이머의 단일 리보뉴클레오티드가 주형(이 예에서 WT 대립유전자)과 부정합하는 경우, 교정 폴리머라제의 3'으로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성은 부정합을 통해 어닐링된 프라이머를 다시 소화하고 단일 잔기 리보뉴클레오티드가 제거되고; 절단된 프라이머가 돌연변이 부위로 신장되는 경우, 정확한 데옥시리보뉴클레오티드(즉, 돌연변이와 부정합하는 것)이 사용된다. 당해 부위의 임의의 대체 대립유전자 또는 임의의 돌연변이는 야생형 리보뉴클레오티드와 부정합할 수 있고, 따라서 모든 대체 대립유전자 또는 돌연변이에 대해 단일 잔기 부정합 리보뉴클레오티드는 WT 대립유전자에 결합된 프라이머로부터 제거되고, 절단된 프라이머가 돌연변이 부위로 신장될 때 특정 돌연변이에 대해 정확한 (데옥시리보뉴클레오티드) 정합으로 대체된다. 선택자 프라이머에서 단일 잔기 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된(어닐링된) 프라이머 서열이 리보뉴클레아제 또는 선택자 뉴클레오티드의 존재에 의존하는 임의의 기타 처리에 의한 제거에 내성을 갖게 한다. 포획 모이어티가 부착된 상태로 잔류하기 때문에, 신장된 프라이머는 우선적으로 포획(또는 물리적으로 단리)되거나, 이후에 우선적으로 증폭될 수 있다. 선택자 프라이머에 의해 돌연변이 서열은 도입되지 않는다. 후속 분석에 의해 검출된 모든 돌연변이 서열은 2개 품질 검사를 통과했다: 첫째, 돌연변이는 단일 잔기 리보뉴클레오티드를 제거하는 하이브리드화 부정합으로 인해 검출되고; 리보뉴클레오티드의 손실은 대체 대립유전자 또는 돌연변이가 존재하는 것을 나타내며; 둘째, 고도로 정확한 폴리머라제가 대체 대립유전자 또는 돌연변이 부위를 높은 충실도로 카피하여, 서열분석(또는 프라이머 신장 또는 하이브리드화와 같은 다른 방법)에 의해 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 동일성을 나타낸다.
도 11은 예시적 단일 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 뉴클레오티드가 KRAS c.35에 특이적임)가 당해 부위에서 발생하는 3개 돌연변이 중 어느 하나를 검출할 수 있음을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 그래프로 나타낸 것이고; 마스터 혼합에서 정확히 동일한 것이 3개의 상이한 주형 각각에 적용되었고, 각 경우에 KRAS c.35. 선택자 프라이머는 KRAS c.35G>A 돌연변이(G12D 아미노산 변화에 상응); c.35G>T 돌연변이(G12V 아미노산); 또는 c.35G>C 돌연변이(G12A 아미노산)의 존재에 관계없이 정확한 돌연변이를 검출했으며; 이들 3개 돌연변이는 모두 결장암에서 빈번히 돌연변이되고 췌장암 및 폐암에서 나타났다.
도 12는 예시적 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 뉴클레오티드는 EGFR c.2573T에 특이적이고, 이의 T>G 돌연변이는 EGFR p.L858R 돌연변이를 초래함)가 0.1%의 낮은 빈도에서 돌연변이 G 대립유전자를 검출할 수 있음을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 그래프로 나타낸 것이고; 적색으로 표시된 음영 처리되지 않은 컬럼은 야생형 신호의 5배에 해당하며; 0.1%의 돌연변이 대립유전자 빈도에서도 돌연변이 신호가 5배의 야생형 값을 크게 초과한다.
도 13은 예시적 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 뉴클레오티드는 EGFR c.2236G에 특이적이고, 이의 c.2236_2250 결실 돌연변이는 EGFR p.E746_A750del을 초래함)가 0.1%의 낮은 빈도에서 돌연변이 결실을 검출할 수 있음을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 나타내며; 적색으로 표시된 음영 처리되지 않은 컬럼은 야생형 신호의 5배에 해당하며; 0.1%의 돌연변이 대립유전자 빈도에서도 돌연변이 신호는 5배의 야생형 값을 크게 초과한다.
도 14는 예시적 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 뉴클레오티드는 KRAS c.37에 특이적이고, 이의 G>T 돌연변이는 KRAS p.G13C 돌연변이를 초래함)가 0.02%의 낮은 빈도에서 돌연변이 T 대립유전자를 검출할 수 있음을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 나타내며, 이는 야생형 분자 10,000개 중에서 2개의 돌연변이 분자를 발견하는 것과 같다.
도 15는 원치 않는 신호를 "조정가능한" 수준으로 억제하는 예시적 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 프라이머 뉴클레오티드는 KRAS c.38에 특이적이고, 이의 G>A 돌연변이는 KRAS p.G13D 돌연변이를 초래함)의 능력을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 나타내고; 선택자 프라이머 대신에 정상 데옥시리보뉴클레오티드(이 경우, 리보뉴클레오티드)를 함유하는 것을 제외하고는 선택자 프라이머와 동일한 프라이머를 0% 선택자 프라이머(이하 포인트서프레서(PointSuppressor) 프라이머 또는 PSP로 지칭) 내지 최대 100% 선택자 프라이머 범위로 선택자 프라이머와의 다양한 혼합물로 사용하고; 선택자 프라이머를 사용하지 않는 경우, 야생형 G 서열의 증폭이 우세하고; 선택자 프라이머의 비율이 증가함에 따라 돌연변이 A 대립유전자는 더 크게 증폭된다.
다양한 도면에서 유사한 참조 기호는 유사한 요소를 나타낸다.
본원에 기재된 도면은 본원에 제공된 예시적 실시양태의 예시일 뿐이며, 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
도 1은 선택자 프라이머 내에서 단일 잔기 리보뉴클레오티드 선택자 뉴클레오티드의 가능한 배치를 나타내고; 리보뉴클레오티드 선택자 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 문자 앞에 배치된 "r"로 지정된다(즉, "r"은 자체 뉴클레오티드 잔기가 아니라, "r"로 밑줄이 그어진 "G" 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 것을 분명히 지정하기 위해서만 포함된다). 선택자 뉴클레오티드는 3' 말단을 기준으로 제1(최종)(서열번호 1), 제2(끝에서 두 번째)(서열번호 2), 제3(끝에서 세 번째)(서열번호 3), 제4(끝에서 네 번째)(서열번호 4), 제5(끝에서 다섯 번째)(서열번호 5) 또는 제6번(끝에서 다섯 번째 전의 것)(서열번호 6) 위치에 배치할 수 있다. 리보뉴클레오티드 선택자 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 문자 앞에 "r"로 표시되며 밑줄이 그어져 있다. 선택자 뉴클레오티드가 위치할 수 있는 3' 말단에서 훨씬 더 먼 위치는 제시되지 않는다:
서열번호 1, 또는 최종
AGGCCTGCTGAAAATGACGTGAATATAACTTGTGGTGTGTAGTTGAGCTGGTGTG
서열번호 2, 또는 끝에서 두 번째
GGCCTGCTGAAAATGAATGAATATAACTTGTGGTGGTGGTGGTGC
서열번호 3, 또는 끝에서 세 번째
GCCTGCTGAAAATGACGTGAATATAACTTGTGGTGGTGTTGAGTTGAGCTGGTGGCG
서열번호 4, 또는 끝에서 네 번째
CCTGCTGAAAATGACTGAATATAACTTGTGGTGTAGTTGAGCTGGTGTGCGT
서열번호 5, 또는 끝에서 다섯 번째
CTGCTGAAAATGACGTGAATATAACTTGTGGTGTAGTTGAGCTGGTGTGGCGTA
서열번호 6, 또는 끝에서 다섯 번째 전의 것
TGCTGAAAATGACGTGAATATAACTTGTGGTGTAGTTGAGCTGGTGGCGTAG
도 2A-B는 하나의 대립유전자를 억제하면서 동시에 동일한 뉴클레오티드 위치에서 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 증폭을 가능하게 하는 본원에 제공된 예시적 방법을 개략적으로 도시한다(예를 들면, 돌연변이 대립유전자만 증폭되는 경우):
도 2A: 억제되는 대립유전자(이 예에서는 야생형(WT) 뉴클레오티드)의 경우, 프라이머(여기서, "R"은 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 나타냄)는 목적 WT 뉴클레오티드와 정확한 서열 정합이고, 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 교정 폴리머라제에 의해 신장된다. 프라이머가 연장되면, 열안정성 리보뉴클레아제 H2(예: 파이로코커스 아비시(Pyrococcus abysii) RNase H2)는 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 "R"(밑줄)로 표시된 위치에서 절단하고, 대부분의 프라이머 서열(5' 말단)이 제거되거나 분리된다. 열안정성 리보뉴클레아제 H2에 의해 서열이 제거 또는 분리되었기 때문에, 리턴 프라이머는 제1 프라이머의 대부분을 카피할 수 없다. 이는 억제되는 대립유전자(이 예에서는 WT 대립유전자)가 기하급수적으로 증폭되는 것을 정지시키고, 증폭 반응에서 생성되는 WT 대립유전자 서열의 수를 크게 감소시킬 수 있다.
도 2B: 대조적으로, 선택자 프라이머의 단일 리보뉴클레오티드(여기서 "R"은 주형 DNA 폴리클레오티드와 쌍을 이루는 있는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 나타냄)가 주형과 부정합하는 경우(이 예에서는 WT 대립유전자), 교정 폴리머라제의 3' 및 5' 엑소뉴클레아제 활성은 부정합을 통해 다시 어닐링된 프라이머를 소화시키고, 단일 잔기 리보뉴클레오티드가 제거되고, 절단된 프라이머는 돌연변이 부위로 연장되는 경우, 정확한 데옥시리보뉴클레오티드(즉, 돌연변이와 부정합하는 것)이 사용된다. 당해 부위의 임의의 대체 대립유전자 또는 임의의 돌연변이는 야생형 리보뉴클레오티드와 부정합할 수 있고, 따라서 모든 대체 대립유전자 또는 돌연변이에 대해 단일 잔기 부정합 리보뉴클레오티드는 WT 대립유전자에 결합된 프라이머로부터 제거되고, 절단된 프라이머가 돌연변이 부위 위로 신장될 때에 특정 돌연변이에 대해 정확한 정합으로 대체된다. 선택자 프라이머에서 단일 잔기 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된(어닐링된) 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 대해 내성을 갖게 된다. 이어서, 리턴 프라이머는 도입(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머를 카피할 수 있으며, 임의의 대체 대립유전자 또는 돌연변이 서열은 기하급수적으로 증폭되어, 존재하는 경우, 반응에서 생성되는 대체 대립유전자 또는 돌연변이 서열의 수를 크게 증가시킨다. 선택자 프라이머에 의해 돌연변이 서열은 도입되지 않는다. 후속 분석에 의해 검출된 모든 돌연변이 서열은 2개의 품질 검사를 통과했다: 첫째, 돌연변이는 단일 잔기 리보뉴클레오티드를 제거하는 하이브리드화 부정합으로 인해 검출되고; 리보뉴클레오티드의 손실은 대체 대립유전자 또는 돌연변이가 존재했음을 나타내며; 둘째, 고도로 정확한 폴리머라제는 대체 대립유전자 또는 돌연변이 부위를 높은 충실도로 카피하며(여기서, 임의로 높은 충실도는 폴리머라제가 대체 대립유전자 또는 돌연변이 부위를 TAQ 폴리머라제보다 높은 충실도로 카피한다는 것을 의미한다), 이는 서열분석(또는 프라이머 신장 또는 하이브리드화와 같은 기타 방법)을 통해 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 동일성을 나타낸다.
도 3은 동일한 3' 말단 및 상이한 길이의 5' 말단을 갖는 선택자 프라이머를 나타낸다. 선택자 단일 잔기 리보뉴클레오티드는 밑줄이 그어져 있고, 앞에 "r"이 붙어 있으며, 코딩 서열의 뉴클레오티드 위치 38에서 인간 유전자 커스틴(Kirsten) 랫트 육종(KRAS)의 야생형 뉴클레오티드와 정합하도록 배치되어 있다. 표준 PCR 조건하에 야생형 서열 및 돌연변이 서열(여기서는 38G>A가 사용됨) 사이의 예상되는 TM 차이가 확인된다. 선택자 프라이머의 길이를 증가시키면, TM의 차이가 감소한다. TM 차이의 감소는 록킹된 핵산(LNA)(브릿지 핵산(BNA) 또는 접근불가능한 RNA(이는 RNase H2에 의해 소화되지 않음) 또는 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가 브릿지로 리보스 모이어티가 변형된 변형된 RNA 뉴클레오티드로도 공지됨), 및/또는 기타 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, 선택자 뉴클레오티드에 대한 서열 5'에서 TM을 증가시키는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, dT와 염기쌍을 이룰 수 있는 2,6-디아미노퓨린을 사용하여(증가는 잔기당 1-2℃까지 가능); 또는 dG와 염기쌍을 이루고 TM을 잔기당 0℃까지 증가시키는 5-메틸 데옥시시티딘을 사용함으로써 달성될 수 있다.
서열번호 7
GTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
서열번호 8
CTTGTGGTAGTTGAGCTGGTGGTGrGCG
서열번호 9
TAAACTTGTGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
서열번호 10
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
서열번호 11
GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
서열번호 12
TATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
도 4는 도 3에 도시된 각 프라이머와 공통 리턴 프라이머를 사용하여 실행된 PCR에 의해 생성된 앰플리콘의 생거 서열분석 트레이스를 나타낸다. 상부 열과 하부 열 모두에서, 화살표는 표적 서열에서 가변 뉴클레오티드의 위치를 나타낸다(사용된 주형은 야생형 및 KRAS 38G>A 돌연변이에 대해 이형접합성인 세포주로부터 추출한 DNA이다). 생거 서열분석 트레이스의 상부 열은 PCR 중에 RNase H2가 존재하지 않은 경우의 각 반응에 대한 결과를 나타낸다. 프라이머가 길고 더욱 안정적일수록, 돌연변이 신호(화살표로 강조 표시된 녹색 트레이스)가 더 양호하게 보이지만, 60-mer 프라이머를 사용하더라도 녹색 돌연변이 "A" 신호는 흑색 야생형 "G" 신호보다 상당히 적다. 예를 들면, TM을 증가시키는 LNA 또는 기타 뉴클레오티드 변형에 의한 추가 안정화는 돌연변이 대립유전자에 대한 이들 결과를 개선시킬 수 있다. RNase H2가 존재하지 않는 경우, 프라이머의 일부(리보뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 잔기 없음)는 야생형 서열에 어닐링되고 신장된 프라이머로부터 제거되지 않고; 야생형의 기하급수적 증폭이 발생한다. 열안정성 RNase H2가 동일한 반응(하부 열)에 포함되는 경우, 돌연변이 신호는 돌연변이 주형에 대한 프라이머 안정성의 함수로서 야생형 신호와 비교하여 점진적으로 더 현저해진다. 야생형의 경우, RNase H2의 존재는 대부분의 프라이머 서열(5' 말단)이 신장된 프라이머로부터 분리 또는 제거되어 기하급수적 증폭을 손상시킨다. 돌연변이의 경우, 단일 잔기 리보뉴클레오티드는 신장 전에 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 돌연변이 서열에 어닐링된 프라이머로부터 제거되고, 따라서 돌연변이 부위에 걸쳐 신장된 프라이머는 RNase H2에 내성을 갖고, 기하급수적으로 증폭된다.
도 5는 도 3에 도시된 51-mer 선택자 프라이머 및 야생형(대립유전자 G) DNA 주형과 돌연변이(대립유전자 A) DNA 주형의 적정에서 공통 리턴 프라이머를 사용한 생거 서열분석 결과를 나타낸다. 야생형(WT) 및 돌연변이(MUT) KRAS 대립유전자 모두에 대해 계산된 일배체 게놈 등가물의 수는 각 생거 서열분석 트레이스 위에 도시되어 있다. 2,998개의 야생형 DNA의 계산된 배경에 대한 돌연변이 DNA의 계산된 2개 카피에서도, 명확한 돌연변이(A) 신호가 보인다(하부 열, 우측). 매우 적은 양의 돌연변이 DNA(하부 열)에서, 매우 희미한 "G" 신호를 볼 수 있으며, 주형 코딩되지 않지만 서열분석 폴리머라제(예: SEQUENASETM(ThermoFisher Scientific))에 의해 주형 말단에 도달할 때에 추가되는 "T" 신호도 볼 수 있다. 추가된 "T" 신호의 크기가 "G" 신호에 필적한다는 것은 프라이머 부위가 앰플리콘을 함유하는 모든 또는 거의(또는 실질적으로) 모든 WT "G"로부터 절단되었음을 나타낸다. 예를 들면, 바코드(예: ILLUMINA 샘플 바코드)를 추가하기 위한 후속 PCR은 이들 WT 서열을 증폭하지 않는다. ILLUMINA® NGS로 진행하는 샘플은 브릿지 증폭되지 않으며, 서열분석되지 않는다. 따라서, 임의의 또는 거의(또는 실질적으로) 임의의 야생형 배경 없이 임의 양의 돌연변이 DNA를 검출할 수 있다.
도 6A-B는 RNase H2의 부재하에 선택자 프라이머를 사용하여 야생형 KRAS를 증폭했을 경우의 결과를 나타낸다. 증폭 후, 도 6A, RNase H2를 추가하여 리보뉴클레오티드 G(rG)의 5' 측에서 절단하고 WT "G"의 상류에서 프라이머 서열을 제거하거나; 또는 도 6B, NaOH 및 열을 사용하여 리보뉴클레오티드 G(rG)의 3' 측에서 절단하고, 리보뉴클레오티드 G(rG)의 3' 측에 있는 WT "C"의 상류에서 프라이머 서열을 제거한다. 두 경우 모두, 처리된 DNA 쇄의 말단을 나타내는 폴리머라제(SEQUENASETM) 부가 "T"를 볼 수 있다. 예를 들면, 비오틴 또는 ILLUMINA® 캡처 서열과 같은 임의의 결합 모이어티는 WT 함유 앰플리콘으로부터 제거된다. 스트렙트아비딘(비오틴의 경우) 또는 ILLUMINA® 플로우 셀(ILLUMINA® 캡처 서열의 경우)을 사용한 검색은 돌연변이 앰플리콘(존재하는 경우)만을 캡처한다.
도 7은 끝에서 세 번째 위치(서열번호 11)에 G 리보뉴클레오티드(rG)를 포함하는 51-mer 선택자 프라이머 및 그 하부에 끝에서 세 번째 위치(서열번호 13)에 정상 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 이의 대응물을 나타낸다. 선택자 프라이머의 고유한 특징은 제한된 수의 야생형 서열을 허용하도록 미세 조정할 수 있다는 것이다. 예를 들면, G 리보뉴클레오티드(rG)를 함유하는 프라이머는 RNase H2가 존재하는 PCR에서 선택될 수 있는 반면, 리보뉴클레오티드를 결여하는(데옥시리보뉴클레오티드로 대체된) 프라이머는 RNase H2에 내성을 갖고 증폭 또는 검색될 수 있다. 이것의 가치는 특정 검정이 작동했다는 것을 입증하는 내부 제어를 제공하고; 샘플 사이의 WT 및 MUT 서열의 정량적 비교를 가능하게 한다는 것이다. 도시된 서열은 GCCTGCTGAAAATGACTGAATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG(서열번호 3)이고, 여기서 리보뉴클레오티드 선택자 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 문자 앞에 배치된 "r"로 지정된다(볼드체로 표시되고 밑줄 그어진 잔기는 리보뉴클레오티드이다). 도 7에서 그 하부는 끝에서 세 번째 위치의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드 대신 데옥시리보뉴클레오티드라는 점을 제외하면 동일한 서열이다(서열번호 13). 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 더 짧은 서열을 사용할 수 있다.
서열번호 13
GGCCTGCTGAAAATGAATGAATATAACTTGTGGTGGTGTTGAGTTGAGCTGGTGGCG
도 8은 분자 일배체의 실행에서 본원에 제공된 방법의 유용성을 나타낸다. 이 실시예에서, 개체의 유전자형은 4개의 다형성 부위의 각각에서 이형접합성이다. 적절한 선택자 프라이머를 사용함으로써, 상부 DNA의 증폭은 억제되고, 하부 DNA의 증폭은 방해받지 않는다. 다양한 수단에 의한 유전자형은 하나의 일배체형을 나타내는 반면, 다른 일배체형은, 공지된 경우, 전체 유전자형으로부터 도출될 수 있다. 원하는 경우, 별도의 반응에서, 그 반대의 경우도 수행할 수 있다: 적절한 선택자 프라이머를 사용하면, 하부 DNA의 증폭은 억제되고, 상부 DNA의 증폭은 방해받지 않는다. 이 앰플리콘의 유전자형은 일배체형 조성을 확인할 수 있다.
도 9는 도 1에 수록된 선택자 폴리뉴클레오티드로 수득된 앰플리콘을 사용한 생거 서열분석 결과를 나타내고; RNase H2(상부 열)의 부재하에 수득된 결과는 종종 위치 38번에서 2개 트레이스, 야생형 "G" 및 돌연변이 "A"를 나타내고; 선택자 뉴클레오티드가 이 예의 최종 위치에 있는 경우, 야생형 "G" 신호는 돌연변이 "A" 신호에 거의 필적하지만, 다른 모든 경우, "A" 신호는 "G" 신호보다 더 작은 크기를 갖는다. 열안정성 RNase H2(하부 열)의 존재하에, 모든 선택자 폴리뉴클레오티드는, 돌연변이 "A" 신호(이 경우)를 방해하지 않으면서, 위치 38(화살표로 표시)에서 야생형 "G" 함유 서열의 증폭을 억제 또는 부분적으로 억제하는 데 효과적이다.
도 10A-B는 본원에 제공된 예시적 방법을 개략적으로 도시한 것이며, 여기서 동일한 뉴클레오티드 위치에서 가능한 모든 대립유전자들은 증폭 동안 결합 모이어티에 태그되지만, 대립유전자 중 하나, 예를 들면, 야생형 대립유전자만이 결합 모이어티로부터 분리되어 정제를 방지한다.
도 10A: 정제를 원하지 않는 대립유전자(이 예에서, 야생형(WT) 뉴클레오티드)의 경우, "R"이, 목적의 WT 뉴클레오티드와 정확히 서열 정합인, 예를 들면(도 1 참조), 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루는 단일 리보뉴클레오티드 잔기의 위치를 나타내는 프라이머가 3'으로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 교정 폴리머라제에 의해 신장되는 것을 나타낸다. 프라이머는 결합 모이어티(예: 도 10A의 원 내에 "B"로 표시된 비오틴)로 태그되고; 결합 모이어티는 또한 특정 뉴클레오티드 서열 또는 이의 포획 및 정제(및 후속 검출)를 가능하게 하는 기타 모이어티일 수도 있다. 증폭 후, 앰플리콘은, 야생형 대립유전자를 함유하는 신장된 프라이머로부터 포획 모이어티를 분리하여 이의 후속 포획 및 정제를 방지하는 선택자 뉴클레오티드(이 예에서 "R"로 표시되고 밑줄이 그어진)의 5' 또는 3' 측에서 절단하는 약제 또는 효소로 처리된다. 선택자 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 경우, 앰플리콘이 여전히 이중가닥일 때 이의 5' 측에서 절단하는 효소는 RNase H2일 수 있거나; 단일가닥 상태로 변성된 경우, 리보뉴클레오티드의 3' 측에서 절단하는 리보뉴클레아제 I일 수 있다. 열의 존재하에 수산화나트륨을 사용하여, 리보뉴클레오티드의 3' 측에서 절단할 수도 있다;
도 10B: 대조적으로, 선택자 프라이머의 단일 리보뉴클레오티드가 주형(이 예에서 WT 대립유전자)과 부정합하는 경우, 교정 폴리머라제의 3'으로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성은 부정합을 통해 어닐링된 프라이머를 다시 소화하고 단일 잔기 리보뉴클레오티드가 제거되고; 절단된 프라이머가 돌연변이 부위로 신장되는 경우, 정확한 데옥시리보뉴클레오티드(즉, 돌연변이와 부정합하는 것)이 사용된다. 당해 부위의 임의의 대체 대립유전자 또는 임의의 돌연변이는 야생형 리보뉴클레오티드와 부정합할 수 있고, 따라서 모든 대체 대립유전자 또는 돌연변이에 대해 단일 잔기 부정합 리보뉴클레오티드는 WT 대립유전자에 결합된 프라이머로부터 제거되고, 절단된 프라이머가 돌연변이 부위로 신장될 때 특정 돌연변이에 대해 정확한 (데옥시리보뉴클레오티드) 정합으로 대체된다. 선택자 프라이머에서 단일 잔기 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된(어닐링된) 프라이머 서열이 리보뉴클레아제 또는 선택자 뉴클레오티드의 존재에 의존하는 임의의 기타 처리에 의한 제거에 내성을 갖게 한다. 포획 모이어티가 부착된 상태로 잔류하기 때문에, 신장된 프라이머는 우선적으로 포획(또는 물리적으로 단리)되거나, 이후에 우선적으로 증폭될 수 있다. 선택자 프라이머에 의해 돌연변이 서열은 도입되지 않는다. 후속 분석에 의해 검출된 모든 돌연변이 서열은 2개 품질 검사를 통과했다: 첫째, 돌연변이는 단일 잔기 리보뉴클레오티드를 제거하는 하이브리드화 부정합으로 인해 검출되고; 리보뉴클레오티드의 손실은 대체 대립유전자 또는 돌연변이가 존재하는 것을 나타내며; 둘째, 고도로 정확한 폴리머라제가 대체 대립유전자 또는 돌연변이 부위를 높은 충실도로 카피하여, 서열분석(또는 프라이머 신장 또는 하이브리드화와 같은 다른 방법)에 의해 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 동일성을 나타낸다.
도 11은 예시적 단일 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 뉴클레오티드가 KRAS c.35에 특이적임)가 당해 부위에서 발생하는 3개 돌연변이 중 어느 하나를 검출할 수 있음을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 그래프로 나타낸 것이고; 마스터 혼합에서 정확히 동일한 것이 3개의 상이한 주형 각각에 적용되었고, 각 경우에 KRAS c.35. 선택자 프라이머는 KRAS c.35G>A 돌연변이(G12D 아미노산 변화에 상응); c.35G>T 돌연변이(G12V 아미노산); 또는 c.35G>C 돌연변이(G12A 아미노산)의 존재에 관계없이 정확한 돌연변이를 검출했으며; 이들 3개 돌연변이는 모두 결장암에서 빈번히 돌연변이되고 췌장암 및 폐암에서 나타났다.
도 12는 예시적 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 뉴클레오티드는 EGFR c.2573T에 특이적이고, 이의 T>G 돌연변이는 EGFR p.L858R 돌연변이를 초래함)가 0.1%의 낮은 빈도에서 돌연변이 G 대립유전자를 검출할 수 있음을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 그래프로 나타낸 것이고; 적색으로 표시된 음영 처리되지 않은 컬럼은 야생형 신호의 5배에 해당하며; 0.1%의 돌연변이 대립유전자 빈도에서도 돌연변이 신호가 5배의 야생형 값을 크게 초과한다.
도 13은 예시적 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 뉴클레오티드는 EGFR c.2236G에 특이적이고, 이의 c.2236_2250 결실 돌연변이는 EGFR p.E746_A750del을 초래함)가 0.1%의 낮은 빈도에서 돌연변이 결실을 검출할 수 있음을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 나타내며; 적색으로 표시된 음영 처리되지 않은 컬럼은 야생형 신호의 5배에 해당하며; 0.1%의 돌연변이 대립유전자 빈도에서도 돌연변이 신호는 5배의 야생형 값을 크게 초과한다.
도 14는 예시적 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 뉴클레오티드는 KRAS c.37에 특이적이고, 이의 G>T 돌연변이는 KRAS p.G13C 돌연변이를 초래함)가 0.02%의 낮은 빈도에서 돌연변이 T 대립유전자를 검출할 수 있음을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 나타내며, 이는 야생형 분자 10,000개 중에서 2개의 돌연변이 분자를 발견하는 것과 같다.
도 15는 원치 않는 신호를 "조정가능한" 수준으로 억제하는 예시적 선택자 프라이머(이 경우, 선택자 프라이머 뉴클레오티드는 KRAS c.38에 특이적이고, 이의 G>A 돌연변이는 KRAS p.G13D 돌연변이를 초래함)의 능력을 입증하는 본원에 제공된 예시적 방법의 사용 결과를 나타내고; 선택자 프라이머 대신에 정상 데옥시리보뉴클레오티드(이 경우, 리보뉴클레오티드)를 함유하는 것을 제외하고는 선택자 프라이머와 동일한 프라이머를 0% 선택자 프라이머(이하 포인트서프레서(PointSuppressor) 프라이머 또는 PSP로 지칭) 내지 최대 100% 선택자 프라이머 범위로 선택자 프라이머와의 다양한 혼합물로 사용하고; 선택자 프라이머를 사용하지 않는 경우, 야생형 G 서열의 증폭이 우세하고; 선택자 프라이머의 비율이 증가함에 따라 돌연변이 A 대립유전자는 더 크게 증폭된다.
다양한 도면에서 유사한 참조 기호는 유사한 요소를 나타낸다.
대안적 실시양태에서, 표적 서열, 예를 들면, 게놈 내의 표적 서열 내의 특정 뉴클레오티드 위치에서 임의의 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 증폭 또는 검색을 방해하지 않으면서 특정 대립유전자에 대해 선택될 수 있는 핵산 증폭 방법이 제공된다. 대안적 실시양태에서, 단일 뉴클레오티드 변이, 삽입 및 결실을 포함하고 cDNA의 경우 융합도 포함하는 점 돌연변이를 동시에 증폭하면서 야생형 서열을 억제하기 위한 핵산 증폭 방법이 제공된다.
대안적 실시양태에서, 원치 않는 대립유전자를 10배 또는 100배 또는 원하는 양만큼 (증폭 또는 검색 프로세스에서) 억제할 수 있음을 의미하는, "조정가능한" 방법이 제공된다. 이는 비정보적 판독의 수를 감소시키고, 이는 처리량을 증가시키고, 샘플당 비용을 저하시키며, 서열분석 공간에 대한 경쟁이 감소되기 때문에 원하는 표적의 검출을 증강시킨다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 일부 비정보성 판독을 허용하는 능력을 갖고, 이는 고유하고 내부 제어를 통해 검정이 작동했음을 입증할 수 있으며(대체 대립유전자 또는 돌연변이가 샘플에 존재하지 않는 경우의 "결과 없음"과 대조적으로), 정량화를 위한 내부 표준으로 기능할 수도 있다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 임의의 프라이머-기반 접근법과 함께 작동할 수 있으며, 본원에 제공된 방법을 사용함으로써, 변이 서열이 증폭 반응에 도입되지 않는다. 예를 들면, 체세포 돌연변이를 탐색하는 경우, 야생형 대립유전자는 G일 수 있고, 가능한 돌연변이 대립유전자는 A, C 및 T일 수 있으며; 본원에 제공된 증폭 방법을 사용함으로써, 돌연변이 판독을 감소시키지 않고서 G-함유 판독이 감소되고(예를 들면, 100배), 가능한 임의의 돌연변이가 동일한 단일 프라이머에 의해 증폭될 수 있다. 야생형 판독의 수가 현저하게 감소하여, 돌연변이 판독은, 존재하는 경우, 서열분석 및 검출될 가능성이 높아지고, 부재하는 경우, 설정된 야생형 판독 수는 반응이 작동했다는 것을 보장한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 검출하고자 하는 서열을 함유하는 프라이머를 도입하지 않고서, 현재의 방법보다 뚜렷한 이점을 가질 수 있고, 돌연변이가 하기의 경우에만 검출된다:
(1) 선택자 프라이머 및 돌연변이된 주형 사이의 부정합은 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 인식되고 제거되며,
(2) 고충실도 폴리머라제가 돌연변이된 주형을 복사하는 경우.
대조적으로, 대립유전자-특이적 증폭은 검출하고자 하는 돌연변이 서열을 도입하고, 이는 오 양성을 유도할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 단일 프라이머가 특정 뉴클레오티드 위치에서 임의의 변이를 검출하는 이점을 가질 수 있다. 대조적으로, 대립유전자 특이적 PCR은 각 대립유전자 변이 또는 돌연변이에 대해 특정 프라이머를 필요로 한다[참조: 예를 들면, van Mansfeld AD, Bos JL. PCR-based approaches for detection of mutated ras genes. PCR Methods Appl. 1992 May;1(4):211-6; Darawi, M.N., Ai-Vyrn, C., Ramasamy, K. et al. Allele-specific polymerase chain reaction for the detection of Alzheimer's disease-related single nucleotide polymorphisms. BMC Med Genet 14, 27 (2013); Lang AH, Drexel H, Geller-Rhomberg S, et al. Optimized allele-specific real-time PCR assays for the detection of common mutations in KRAS and BRAF. J Mol Diagn. 2011;13(1):23-28; Dobosy JR, Rose SD, et al. (2011) RNase H-dependent PCR (rhPCR): improved specificity and single nucleotide polymorphism detection using blocked cleavable primers. BMC Biotechnol, 11:80].
핵산의 증폭
대안적 실시양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 기타 프라이머-기반 증폭 방법과 같은 DNA 증폭 기술의 사용을 포함하는 방법이 제공된다.
DNA 증폭 기술을 실행하는 데 사용되는 임의의 공지된 프로토콜 또는 재료(전설비 또는 효소 포함)는, 예를 들면, 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖고 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 교정 효소, 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 사용하는 것을 포함하여, 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용되는 폴리머라제 연쇄 반응을 위한 표준 재료 및 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 및 McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany]에서 발견할 수 있다.
예시적 PCR 프로토콜은 하기 2개 표에 제시되어 있으며, 첫 번째 표는 반응 설정을 나타내고, 두 번째 표는 사이클링 조건을 나타낸다:
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 다양한 DNA 농도가 사용될 수 있다. 유사하게는, 프라이머 농도도 상이할 수 있다. 파이로코커스 아비시(Pyrococcus abyssi) RNase H2 및/또는 기타 열안정성 RNase H2 효소의 임의의 공급원을 사용할 수 있다. 다른 공급원의 열안정성 교정 DNA 폴리머라제도 사용할 수 있으며, 여기에는 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)의 Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(HOT START HIGH-FIDELITY®) DNA 폴리머라제, 및 써모피셔(ThermoFisher)의 플래티넘 슈퍼파이 II(PLATINUM SUPERFI II®) DNA 폴리머라제-하이-피델리티 PCR 효소 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
이하는 사이클링 조건에 대한 일반적 예시 조건이며, 증폭의 실시를 제한하기 위한 것이 아니다: 10초 내지 30초 범위의 시간 동안 94℃ 내지 98℃ 범위의 변성 온도; 5초 내지 30초 동안 55℃ 내지 72℃ 범위의 어닐링 온도; 증폭되는 DNA 킬로베이스당 15초 내지 30초 동안 55℃ 내지 72℃ 이상의 신장 온도. 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 PCR 방법론에 대한 일반적 논의는, 예를 들면, Wikipedia에서 발견할 수 있다[참조: https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction, 또는 Valones MA, Guimaraes RL, Brandao LA, de Souza PR, de Albuquerque Tavares Carvalho A, Crovela S. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: a review. Braz J Microbiol. 2009;40(1):1-11; Garibyan L, Avashia N. Polymerase chain reaction. J Invest Dermatol. 2013;133(3):1-4; Dieffenbach CW, Lowe TM, Dveksler GS. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 1993 Dec;3(3):S30-7]. IDT 웹 사이트(https://www.idtdna.com/pages/products/qpcr-and-pcr/master-mixes-reagents/rnase-h-enzyme)에 RNase H2 효소의 사용에 대한 예시적 조건도 또한 문헌[참조: obosy JR, Rose SD, et al. (2011) RNase H-dependent PCR (rhPCR): improved specificity and single nucleotide polymorphism detection using blocked cleavable primers, BMC Biotechnol, 11:80]에 포함되어 있다. 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 예시적 효소에는, 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 열안정성 DNA 폴리머라제인 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II®이 포함되고, 이는 이용가능하고 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 다수의 효소 중 하나이다[참조: 예를 들면, Ishino S, Ishino Y, DNA polymerases as useful reagents for biotechnology - the history of developmental research in the field, Front Microbiol. 2014 Aug 29; 5:465]. 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II®의 예시적 조건은 써모피셔(ThermoFisher) 웹 사이트(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F549L#/F549L)를 통해 이용할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 디지털 PCR[참조: 예를 들면, Morley AA. Digital PCR: A brief history. Biomol Detect Quantif. 2014 Aug 15;1(1):1-2], 또는, 예를 들면, 목적 앰플리콘의 생산 또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드의 생산을 위해, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한, 예를 들면, 드롭렛 디지털(Droplet Digital) PCR(ddPCR)을 포함하는 DigitalPCR 또는 dPCR을 사용하는 방법이 제공되고; 본원에 제공된 방법은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 실시할 수 있으며, 예를 들면, USPN 제9,797,007호에 기재된 바와 같이 실시할 수 있다.
합성 핵산
다른 실시양태에서, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 뉴클레오티드)의 3' 말단을 기준으로 제1(최종), 제2(끝에서 두 번째), 제3(끝에서 세 번째), 제4(끝에서 네 번째), 제5(끝에서 다섯 번째) 또는 제6(끝에서 다섯 번째 전의 하나의 잔기) 위치에 위치할 수 있는 적어도 단일 리보뉴클레오티드 잔기(선택자 뉴클레오티드로 지칭됨)을 포함하는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 대안적 실시양태에서, 제2 또는 제3 또는 추가 리보 뉴클레오티드 잔기는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드에 제공된 것에 포함된다.
대안적 실시양태에서, 선택자 폴리뉴클레오티드는 표적 서열 내의 특정 뉴클레오티드 위치에서 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 증폭 또는 검색을 방해하지 않으면서 특정 대립유전자의 증폭에 대해 선택할 수 있는 증폭 방법에서 프라이머로 사용된다. 선택자 폴리뉴클레오티드의 설계, 조성 및 제조는 억제하고자 하는 대립유전자를 기반으로 한다. 예를 들면, 인간 종양유전자 KRAS의 c.38에서 발생하는 단일 뉴클레오티드 돌연변이에 관심이 있는 경우, 야생형 서열과 완벽하게 정합하고 목적 부위에 상응하는 위치에 단일 리보뉴클레오티드를 함유하는 키메라 DNA/RNA 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 도 1을 참조하면, 도시된 모든 서열은 야생형 서열과 동일하며, 각 서열에서 적색으로 밑줄이 그어진 뉴클레오티드(이는 선택자 뉴클레오티드이며 서열에서 유일한 리보뉴클레오티드이다)가 포함된다. 선택자 뉴클레오티드는 도 1에 도시된 위치 중 어느 위치에도 존재할 수 있지만, 최종 위치가 선호되지 않고, 3' 말단에서 더 먼 위치도 종종 선택자 뉴클레오티드로서 작용할 수 있다. 도 3을 참조하면, 선택자 폴리뉴클레오티드는 도시된 것을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 길이일 수 있다. 도 9는 도 1에 수록된 선택자 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수득된 결과를 나타낸다. 열안정성 RNase H2의 존재하에, 모든 선택자 폴리뉴클레오티드는 돌연변이 "A" 신호(이 경우)를 방해하지 않으면서 위치 38(화살표로 표시)에서 야생형 "G" 함유 서열의 증폭을 억제하거나 부분적으로 억제하는 데 효과적이다.
실시예에 기재된 바와 같이, 결실, 삽입, 및 cDNA의 경우 융합을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 기타 대안의 검출을 방해하지 않고서 야생형 서열의 억제를 위한 선택자 폴리뉴클레오티드의 설계, 조성 및 제조도 달성될 수 있다. 억제는 억제되는 대립유전자의 서열에 기초하기 때문에, 당업자에 의해 대체 설계가 달성될 수 있다.
핵산의 서열분석
대안적 실시양태에서, 앰플리콘 또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드의 서열이, 임의로 생거 서열분석 또는 차세대 서열분석(NGS), 단일 분자 실시간(SMRT) 서열분석, 나노기공 DNA 서열분석, 가역적 종결 화학(예: SOLEXA 기술(Illumina)), 조합 프로브 앵커 합성(cPAS), 질량 분석법 서열분석 또는 대량 병렬 시그니처 서열분석(MPSS) 또는 이의 임의의 등가물 또는 이들의 조합을 사용하는 DNA 서열분석에 의해 결정되는 방법이 제공된다.
당업자에게 공지된 임의의 서열분석 방법을 사용하여 본원에 제공된 방법에 의해 생성된 앰플리콘, 또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드를 서열분석할 수 있다.
제품 및 키트
본원에 제공된 제품 및 방법을 실행하기 위한 키트가 제공되며; 임의로 제품 및 키트에는 본원에 제공된 방법을 실시하기 위한 설명서가 추가로 포함될 수 있다.
상기 임의의 측면 및 실시양태는 요약, 도면 및/또는 상세한 설명 섹션에 개시된 바와 같이 임의의 다른 측면 또는 실시양태와 조합될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 문맥에서 달리 명시되지 않는 한, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 복수의 지시대상을 포함한다.
문맥에서 특별히 명시되거나 명백하지 않은 한, 본원에서 사용된 "또는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 이해되며, "또는"과 "및"을 모두 포함한다.
문맥에서 구체적으로 명시되거나 명백하지 않은 한, 본원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 당해 기술분야에서 통상적 허용 오차 범위(예: 평균의 2 표준편차 이내) 내에 있는 것으로 이해된다. 약은 명시된 값의 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 문맥에서 달리 명확하지 않은 한, 본원에 제공된 모든 숫자 값은 "약"이라는 용어로 변경된다.
문맥에서 특별히 명시되거나 명백하지 않은 한, 본원에서 사용되는 "실질적으로 전부", "실질적으로 대부분", "실질적으로 모두" 또는 "대다수"라는 용어는 참조된 조성물 양의 적어도 약 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상을 포괄한다.
본원에 언급된 각 특허, 특허 출원, 간행물 및 문서의 전체 내용은 참조에 의해 포함된다. 상기 특허, 특허 출원, 간행물 및 문서의 인용은 전술한 내용이 관련 선행 기술임을 인정하는 것이 아니며, 이러한 간행물 또는 문서의 내용 또는 날짜에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다. 이러한 문서의 참조에 의한 포함은 단독으로는 문서 내용의 일부가 특허 출원에 대한 임의의 국가 또는 지역의 법적 공개 요건을 충족하는 데 필수적 자료로 간주된다는 주장이나 인정으로 해석되어서는 안 된다. 그럼에도 불구하고, 적절한 경우, 심사 기관이나 법원에 의해 청구된 주제에 필수적인 것으로 간주되는 자료를 제공하기 위해 임의의 이러한 문서에 의존할 권리는 유보된다.
본 발명의 기본적 측면을 벗어나지 않는 범위 내에서 전술한 내용에 대한 수정이 이루어질 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 특정 실시양태를 참조하여 실질적으로 상세하게 기재되었지만, 당업자는 본 출원에 구체적으로 개시된 실시양태에 변경이 이루어질 수 있음을 인식할 것이며, 그럼에도 불구하고 이러한 수정 및 개선은 본 발명의 범위 및 정신에 속한다. 본원에 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의 요소의 부재하에 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본원의 각 사례에서, "포함하는(comprising)", "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)" 및 "이루어진(consisting of)"이라는 용어는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 따라서, 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로 사용되고, 제한이 아니며, 도시 및 기재된 특징의 등가물 또는 이의 일부가 배제되는 것은 아니고, 본 발명의 범위 내에서 다양한 수정이 가능하다는 것이 인정된다. 본 발명의 실시양태는 하기 청구범위에 기재되어 있다.
본 발명은 본원에 기재된 실시예를 참조하여 더욱 상세히 설명될 것이나, 본 발명이 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니라는 점을 이해해야 한다.
실시예
실시예에서 달리 명시되지 않는 한, 모든 재조합 DNA 기술은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 및 in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA]에 기재된 바와 같은 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 표준 분자생물학 기술에 대한 다른 참고문헌에는 문헌[참조: Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK)이 포함된다. 폴리머라제 연쇄 반응을 위한 표준 재료 및 방법은 문헌[참조: Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and in McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany]에서 찾을 수 있다.
대안적 실시양태에서, 실시예에서 언급된 차이는 서열분석, 하이브리드화, 질량 분석법 또는 뉴클레오티드 분해능에 의한 것들을 포함하여 서열 변화를 검출할 수 있는 기타 기술에 의해 검출된다.
실시예
1: 임의의 대체 대립유전자를 동시에 증폭하면서 하나의 대립유전자의 억제
본 실시예는 대체 대립유전자를 동시에 증폭하면서 하나의 대립유전자를 선택적으로 억제하기 위한 본원에 제공된 예시적 방법의 효능을 기재하고 입증한다. 본 실시예는 또한 점 돌연변이를 동시에 증폭하면서 야생형 서열을 억제하기 위한 예시적 방법의 효능을 기재하고 입증한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 예시적 방법은 코딩 위치 35(본 실시예에서는 KRAS c.35)에서 야생형 "G" 뉴클레오티드를 코딩하는 KRAS DNA의 기하급수적 증폭을 억제하는 동시에 이 위치에서 가능한 3개의 돌연변이 중 어느 하나의 기하급수적 증폭을 가능하게 하는 것을 포함한다. 이 위치에서의 돌연변이는 가장 빈번한 암-유발 KRAS 돌연변이이고, KRAS 코돈 12 및 13의 점 돌연변이의 약 65%를 차지한다. 사용되는 선택자 프라이머는 끝에서 세 번째 위치에 "G" 리보뉴클레오티드(riboG 또는 rG)를 포함하고, 야생형 주형과 완벽하게 정합하며, 교정 DNA 폴리머라제 효소에 의해 신장된다. 신규 형성된 이중체 DNA가 riboG를 보유하기 때문에, 반응에 존재하는 열안정성 리보뉴클레아제 H2(TS RNase H2)는 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하고 대부분의 프라이머 서열을 분리하고; 기하급수적 증폭은 억제된다. 이와 대조적으로, c.35G>A(p.G12D) 돌연변이; 또는 c.35G>T(p.G12V) 돌연변이; 또는 c.35.G>C(p.G12A) 돌연변이를 코딩하는 주형은 끝에서 세 번째 위치에서 선택자 프라이머와 정합하지 않아 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소 뉴클레아제 활성이 부정합을 통해 프라이머를 다시 소화하고, 돌연변이 부위에서 프라이머의 신장 전에 리보뉴클레오티드가 제거된다. 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 대해 내성을 갖게 한다. 리턴 프라이머는 도입된(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머 위로 카피되며, 돌연변이 서열은 기하급수적으로 증폭된다.
본원에 제공된 방법에 사용할 수 있는 교정 DNA 폴리머라제의 비제한적 예로는 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # F549L), Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(Hot Start High-Fidelity) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, cat. # M0493L), 플래티늄 슈퍼파이(Platinum SuperFi) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # 12361050)이 포함된다. 본원에 제공된 방법에 사용할 수 있는 열안정성 리보뉴클레아제 H2의 비제한적 예는 RNase H2 효소(IDT, cat. # 11-03-02-03)이다.
이 예시적 방법은 검출하고자 하는 서열을 포함하는 프라이머를 도입하지 않고, 하기와 같은 경우에만 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는 기존 방법과 비교하여 명백한 이점을 포함한다: 1. 선택자 프라이머와 돌연변이 주형 사이의 부정합이 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 인식되고 제거되며, 2. 고충실도 폴리머라제가 돌연변이된 주형을 카피한다. 반면, 대립유전자-특이적 증폭은 검출하고자 하는 변이 서열을 도입하여 위양성을 유도할 수 있다. 또 다른 이점은 단일 프라이머가 특정 뉴클레오티드 위치에서 모든 변이체를 검출하는 반면, 대립유전자-특이적 PCR은 각각의 대립유전자 변이체 또는 돌연변이에 대해 특정 프라이머가 필요하다는 것이다.
실시예
2: DNA 결실을 동시에 증폭하면서 야생형 서열의 억제
본 실시예는 결실을 함유하는 주형을 동시에 증폭하면서 야생형 DNA의 증폭을 억제하기 위한 예시적 방법을 입증한다.
대안적 실시양태에서, 본원에 제공된 예시적 방법은 야생형 표피 성장 인자 수용체(EGFR) DNA의 기하급수적 증폭을 억제하는 동시에 인프레임 결실, c.2235_2249del(p.E746_A750del)을 사용하여 DNA의 기하급수적 증폭을 가능하게 하는 것을 포함한다. 인프레임 결실은 암에서 모든 EGFR 돌연변이의 약 41%를 차지하며, 이 특정 돌연변이는 가장 빈번한 것 중의 하나이다.
선택자 프라이머의 3' 말단은 GAA로 종결하고, 끝에서 세 번째 위치에 "G" 리보뉴클레오티드(riboG 또는 rG)를 함유하며, 아미노산 위치 746에서 글루탐산 잔기를 코딩하는 야생형 EGFR 코돈과 완벽하게 정합한다. 신규 형성된 이중체 DNA는 riboG를 보유하기 때문에, 반응에 존재하는 열안정성 리보뉴클레아제 H2(TS RNase H2)가 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하고, 대부분의 프라이머 서열을 분리하여 기하급수적 증폭을 억제한다.
대조적으로, c.2235_2249del(p.E746_A750del) 결실에 대한 주형은 끝에서 세 번째 위치의 선택자 프라이머와 정합하지 않아 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성이 부정합을 통해 프라이머를 다시 소화하고, 리보뉴클레오티드는 돌연변이 부위에 걸쳐 프라이머의 신장 전에 제거된다. 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 내성을 갖게 한다. 리턴 프라이머는 도입된(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머 위로 카피되고, 임의의 돌연변이 서열은 기하급수적으로 증폭된다.
본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 교정 폴리머라제의 비제한적 예로는 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # F549L), Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(Hot Start High-Fidelity) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, cat. # M0493L), 플래티늄 슈퍼파이(Platinum SuperFi) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # 12361050)가 포함된다. 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 열안정성 리보뉴클레아제 H2의 비제한적 예는 RNase H2 효소(IDT, cat. # 11-03-02-03)이다.
이 예시적 방법은 검출하고자 하는 서열을 함유하는 프라이머를 도입하지 않는 것을 포함하여 기존 방법에 비해 명백한 이점을 포함하고; 반면, 대립유전자-특이적 증폭은 검출하고자 하는 변이체 서열을 도입하여 위양성을 유도할 수 있다. 또 다른 이점은 단일 프라이머가 특정 뉴클레오티드 위치에서 임의의 변이체를 검출하는 반면, 대립유전자-특이적 PCR은 각각의 대립유전자 변이체 또는 돌연변이에 대해 특정 프라이머가 필요하다는 것이다.
실시예
3: DNA 삽입을 동시에 증폭하면서 야생형 서열의 억제
본 실시예는 삽입을 함유하는 주형을 증폭하는 동시에 야생형 DNA의 증폭을 억제하기 위한 예시적 방법을 입증한다.
비제한적 예로는 야생형 EGFR DNA의 기하급수적 증폭을 억제하는 동시에 c.2300_2308dup(p.A767_V769dup) 삽입을 사용하여 DNA의 기하급수적 증폭을 가능하게 하는 것이다. 이 삽입은 중복이며, 이를 갖는 환자는 종종 1세대 및 2세대 EGFR 티로신 키나제 억제제(TKI)에 대한 감수성을 감소시킨다. 선택자 프라이머의 3' 말단은 ACA로 종결하고, 끝에서 세 번째 위치에 "A" 리보뉴클레오티드(riboA 또는 rA)를 함유하며, 아미노산 위치 770에서 아스파르트산 잔기를 코딩하는 야생형 EGFR 코돈과 완벽히 정합한다. 신규 형성된 이중체 DNA는 riboA를 보유하기 때문에, 반응에 존재하는 열안정성 리보뉴클레아제 H2(TS RNase H2)가 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하고, 대부분의 프라이머 서열을 분리하여 기하급수적 증폭을 억제한다. 대조적으로, c.2300_2308dup(p.A767_V769dup) 삽입을 함유하는 주형은 끝에서 세 번째 위치에서 선택자 프라이머와 정합하지 않아 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성이 부정합을 통해 프라이머를 다시 소화하고, 리보뉴클레오티드는 돌연변이 부위로 프라이머의 신장 전에 제거된다. 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 내성을 갖게 한다. 리턴 프라이머는 도입된(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머 위로 카피되며, 임의의 돌연변이 서열은 기하급수적으로 증폭된다.
본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 교정 폴리머라제의 비제한적 예로는 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # F549L), Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(Hot Start High-Fidelity) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, cat. # M0493L), 플래티늄 슈퍼파이(Platinum SuperFi) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # 12361050)가 포함된다. 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 열안정성 리보뉴클레아제 H2의 비제한적 예는 RNase H2 효소(IDT, cat. # 11-03-02-03)이다.
본 예시적 방법은 검출하고자 하는 서열을 함유하는 프라이머를 도입하지 않는 것을 포함하여 기존 방법에 비해 명백한 이점을 포함하고; 반면, 대립유전자-특이적 증폭은 검출하고자 하는 변이체 서열을 도입하여 위양성을 유도할 수 있다. 또 다른 이점은 단일 프라이머가 특정 뉴클레오티드 위치에서 임의의 변이체를 검출하는 반면; 대립유전자-특이적 PCR은 각각의 대립유전자 변이체 또는 돌연변이에 대해 특정 프라이머가 필요하다는 것이다.
실시예
4: 융합 단백질을 코딩하는 cDNA을 동시에 증폭하면서 야생형 cDNA 서열의 억제
본 실시예는 융합 단백질을 코딩하는 주형을 증폭하는 동시에 야생형 cDNA의 증폭을 억제하기 위한 예시적 방법을 입증한다.
비제한적 예는 야생형 극피동물 미세소관-관련 단백질-유사 4(EML4)의 기하급수적 증폭을 억제하는 동시에 EML4-ALK 융합 단백질을 코딩하는 cDNA의 기하급수적 증폭을 가능하게 하는 것이다(ALK는 역형성 림프종 키나제의 약자이고, ALK 티로신 키나제 수용체 또는 CD246으로도 공지되어 있다). EML4-ALK 융합 단백질은 비소세포 폐암(NSCLC)에서 발견되며, 다른 표적화 요법 중에서도 크리조티닙의 표적이다. 먼저, cDNA를 제조한 다음, 이의 3' 말단에 서열 GTG을 갖는 선택자 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 여기서 끝에서 세 번째 "G"는 리보뉴클레오티드(riboG 또는 rG)이며, 야생형 EML4 서열과 완벽하게 정합한다. 신규 형성된 이중체 DNA가 riboG를 보유하기 때문에, 반응에 존재하는 열안정성 리보뉴클레아제 H2(TS RNase H2)는 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하고, 대부분의 프라이머 서열을 분리하며; 기하급수적 증폭이 억제된다. 대조적으로, EML4-ALK 융합 주형은 끝에서 세 번째 위치에서 선택자 프라이머와 정합하지 않아 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성이 부정합을 통해 프라이머를 다시 소화하고, 리보뉴클레오티드는 돌연변이 부위에 걸쳐 프라이머의 신장 전에 제거된다. 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 내성을 갖게 한다. 리턴 프라이머는 도입된(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머 위로 카피되고, 돌연변이 서열은 기하급수적으로 증폭된다. 교정 폴리머라제의 비제한적 예로는 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # F549L), Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(Hot Start High-Fidelity) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, cat. # M0493L), 플래티늄 슈퍼파이(Platinum SuperFi) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # 12361050)가 포함된다.
본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 열안정성 리보뉴클레아제 H2의 비제한적 예는 RNase H2 효소(IDT, cat. # 11-03-02-03)이다. 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 mRNA 주형으로부터 cDNA를 제조하는 데 사용되는 역전사효소의 비제한적 예는 SuperScriptTM III 역전사효소(ThermoFisher Scientific, cat. # 18080085)이다.
본 예시적 방법은 검출하고자 하는 서열을 포함하는 프라이머를 도입하지 않는 것을 포함하여 기존 방법에 비해 명백한 이점을 포함하지만; 대립유전자-특이적 증폭은 검출하고자 하는 변이체 서열을 도입하고, 이는 위양성을 유도할 수 있다.
실시예
5: 대체 대립유전자를 동시에 증폭하면서 하나의 대립유전자의 억제: 변형 또는 비변형 뉴클레오티드 상태를 결정하기 위해 적용
본 실시예는 하나의 대립유전자의 증폭을 억제하는 동시에 뉴클레오티드 위치에 존재하는 임의의 대체 대립유전자를 증폭하기 위한 예시적 방법, 특히 뉴클레오티드 변형의 존재 또는 부재에 기초하여 하나 또는 다른 대립유전자가 생성된 경우의 예시적 방법을 입증한다. 비제한적 예로는 변형되지 않은 사이토신 뉴클레오티드가 데옥시우리딘(dU)으로 변경된 반면 메틸화 또는 하이드록시메틸화된 사이토신은 그렇지 않은 경우를 들 수 있다.
비제한적 예로는 끝에서 세 번째 위치에 "G" 리보뉴클레오티드(riboG 또는 rG)를 함유하고, 처리된 주형과 완벽하게 정합하며(상보성 위치에서는 변형되어 변경되지 않기 때문에 "C"로 잔류함), 교정 효소에 의해 신장되는 선택자 프라이머를 사용하는 것이다. 신규 형성된 이중체 DNA가 riboG를 보유하기 때문에, 반응에 존재하는 열안정성 리보뉴클레아제 H2(TS RNase H2)는 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하고 대부분의 프라이머 서열을 분리하며, 기하급수적 증폭은 억제된다. 대조적으로, "C"가 "dU"로 변경된 처리된 주형에서, 끝에서 세 번째 위치에서 선택자 프라이머와 정합하는 것이 없어, 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성이 부정합을 통해 프라이머를 다시 소화하고, 리보뉴클레오티드가 "dU" 부위로 프라이머의 신장 전에 제거된다("A"와 쌍을 이룸). 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 내성을 갖게 한다. 리턴 프라이머는 도입된(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머 위로 카피되고, "dU" 서열이 기하급수적으로 증폭된다(증폭 중에 "T"로 변경됨).
비제한적 예는, 전술한 것과 반대로, 선택자 프라이머가 이제 끝에서 세 번째 위치에 "A" 리보뉴클레오티드(riboA 또는 rA)를 함유하고, 처리된 주형과 완벽하게 정합하며(상보적 위치에서는 변형되지 않고 변경되어 "dU"가 됨), 교정 효소에 의해 신장되는 경우이다. 신규 형성된 이중체 DNA가 riboA를 보유하기 때문에, 반응에 존재하는 열안정성 리보뉴클레아제 H2(TS RNase H2)는 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하고 대부분의 프라이머 서열을 분리하며, 기하급수적 증폭은 억제된다. 대조적으로, "C"가 변경되지 않은(변형에 의해 보호된) 처리된 주형에서는 끝에서 세 번째 위치에서 선택자 프라이머와 정합하지 않아, 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성이 부정합을 통해 프라이머를 다시 소화하고, 리보뉴클레오티드가 돌연변이 부위에 걸쳐 프라이머의 신장 전에 제거된다. 리보뉴클레오티드의 손실은 도입된 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 내성을 갖게 한다. 리턴 프라이머는 도입된(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머 위로 카피되고, 서열은 기하급수적으로 증폭된다.
본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 교정 폴리머라제의 비제한적 예로는 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # F549L), Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(Hot Start High-Fidelity) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, cat. # M0493L), 플래티늄 슈퍼파이(Platinum SuperFi) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # 12361050)가 포함된다.
본 예시적 방법은 검출하고자 하는 서열을 함유하는 프라이머를 도입하지 않는 것을 포함하여 기존 방법에 비해 명백한 이점을 포함하지만; 대립유전자-특이적 증폭은 검출하고자 하는 변이체 서열을 도입하고, 이는 위양성을 유도할 수 있다.
실시예
6: 대체 대립유전자를 동시에 증폭하면서 하나의 대립유전자의 억제: 분자 일배체형에 적용
본 실시예는 하나의 대립유전자의 증폭을 억제하는 동시에 뉴클레오티드 위치에 존재하는 임의의 대체 대립유전자를 대체 대립유전자와 동일한 DNA 동족체에 위치한 대립유전자와 함께 동시에 증폭하여 분자 일배체형 분석을 가능하게 하기 위한 예시적 방법을 입증한다.
비제한적 예는 ITGA4 유전자에서 AGT 일배체형의 존재 또는 부재를 결정하는 것이다. ITGA4 유전자 내의 뉴클레오티드 다형태는 c.1845G>A, c.2633A>G, c.2883C>T를 포함하고, 일배체형 AGT는 심장 이식 환자에서 항체-매개 거부반응의 발달과 관련이 있다. 유전자형 분석에 의해 개인이 2개 또는 3개의 부위에서 이형접합성인 것을 나타내면, 적절한 이형접합성 부위에 대한 선택자 프라이머 및 가장 먼 이형접합성 부위 너머에 위치한 리턴 프라이머를 사용하여 일배체형을 결정할 수 있다. 예를 들면, DNA가 c.1845에서 이형접합성인 경우, 선택자 프라이머는 c.1845 위치에 상응하는 끝에서 세 번째 위치에 "G" 리보뉴클레오티드(riboG 또는 rG)를 함유하고; 리턴 프라이머는 c.2883 위치의 하류에 위치할 것이다. 이것은 c.1845G 대립유전자의 억제를 유도하는 동시에, c.1845A 대립유전자의 기하급수적 증폭을 가능하게 할 것이다. 사용된 교정 효소의 높은 충실도와 매우 낮은 수준의 쇄-스위칭으로 인해, 기하급수적으로 증폭되는 동일한 DNA 동족체에 존재하는 대립유전자를 결정하고, 1845A DNA 동족체에 대한 일배체형을 발견할 수 있다. 다른 동족체에 대한 일배체형은 유전자형으로부터 추론하거나, 끝에서 세 번째 위치에 "A" 리보뉴클레오티드(riboA 또는 rA)를 함유하는 선택자 프라이머를 사용하여 별도의 반응에서 확인할 수 있다.
본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 교정 폴리머라제의 비제한적 예로는 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # F549L), Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(Hot Start High-Fidelity) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, cat. # M0493L), 플래티늄 슈퍼파이(Platinum SuperFi) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # 12361050)가 포함된다. 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 열안정성 리보뉴클레아제 H2의 비제한적 예는 RNase H2 효소(IDT, cat. # 11-03-02-03)이다.
본 예시적 방법은 검출하고자 하는 서열을 함유하는 프라이머를 도입하지 않는 것을 포함하여 기존 방법에 비해 명백한 이점을 포함하고; 반면, 대립유전자-특이적 증폭은 검출하고자 하는 변이체 서열을 도입하고, 이는 위양성을 유도할 수 있다. 또 다른 이점은 단일 프라이머가 특정 뉴클레오티드 위치의 임의의 변이체를 검출하는 반면; 대립유전자-특이적 PCR은 각각의 대립유전자 변이체 또는 돌연변이에 대해 특정 프라이머가 필요하다는 것이다.
실시예
7: 대체 대립유전자를 동시에 증폭하면서 하나의 대립유전자의 부분적 억제
본 실시예는 하나의 대립유전자의 증폭을 부분적으로 억제하는 동시에 뉴클레오티드 위치에 존재하는 임의의 대체 대립유전자를 증폭하기 위한 예시적 방법을 입증한다. 이는 점 돌연변이를 증폭하는 동시에 야생형 서열을 부분적으로 억제하는 데에도 적용될 수 있다. 후자의 경우, 임의 돌연변이의 증폭을 방해하지 않으면서 야생형의 증폭만을 부분적으로 억제함으로써, 하기와 같은 2개 결과를 달성할 수 있다: 1. 돌연변이가 존재하지 않는 경우, 야생형의 부분적 증폭은 전체 반응이 작동했음을 확인하는 내부 제어를 제공하고; 2. 야생형의 억제 수준을 제어함으로써 돌연변이(존재하는 경우)의 증폭 수준을 비교할 수 있는 내부 표준이 제공된다.
비제한적 예는 코딩 위치 35에서 야생형 "G" 뉴클레오티드를 코딩하는 KRAS DNA의 기하급수적 증폭을 부분적으로 억제하는 동시에 이 위치에서 가능한 임의의 3개 돌연변이 중 어느 하나의 기하급수적 증폭을 가능하게 하는 것이다. 선택자 프라이머는 끝에서 세 번째 위치에 "G" 리보뉴클레오티드(riboG 또는 rG)를 함유하고, 야생형 주형과 완벽하게 정합하며, 교정 효소에 의해 신장될 것이다. 선택자 프라이머와 소정 양으로 혼합하는 것은, 끝에서 세 번째 위치의 "G"가 리보뉴클레오티드가 아니라 정상 데옥시리보뉴클레오티드인 것을 제외하고는 선택자 프라이머와 동일한 대응물로 된다. riboG를 보유하는 신규 형성된 이중체 DNA는 반응에 존재하는 열안정성 리보뉴클레아제 H2(TS RNase H2)에 의해 절단되고, 이는 대부분의 프라이머 서열을 분리하고; 기하급수적 증폭은 억제된다. 그러나, 선택자 프라이머에 대한 대응물을 함유하는 신규 형성된 이중체 DNA(즉, 선택자 뉴클레오티드 위치에 정상 데옥시뉴클레오티드 대응물을 함유하는 프라이머)는 절단되지 않고, 프라이머의 전체가 보유된다. 야생형의 기하급수적 증폭은 부분적으로만 억제된다. c.35G>A(p.G12D) 돌연변이, 또는 c.35G>T(p.G12V) 돌연변이, 또는 c.35G>C (p.G12A) 돌연변이를 코딩하는 주형은 끝에서 세 번째 위치에서 선택자 프라이머 (또는 이의 대응물)와 정합하지 않고, 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성이 부정합을 통해 프라이머를 다시 소화하고, 리보뉴클레오티드 또는 이의 데옥시리보뉴클레오티드 대응물은 돌연변이 부위에 걸쳐 프라이머의 신장 전에 제거된다. 임의 리보뉴클레오티드의 부재는 도입된 프라이머 서열이 리보뉴클레아제에 의한 제거에 내성을 갖게 한다. 리턴 프라이머는 도입된(즉, 부분적으로 소화되고, 이어서 신장된) 제1 프라이머 위로 카피되며, 돌연변이 서열은 기하급수적으로 증폭된다.
본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 교정 폴리머라제의 비제한적 예로는 퓨젼 핫 스타트(Phusion Hot Start) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # F549L), Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(Hot Start High-Fidelity) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, cat. # M0493L), 플래티늄 슈퍼파이(Platinum SuperFi) II DNA 폴리머라제(ThermoFisher Scientific, cat. # 12361050)가 포함된다. 본원에 제공된 방법을 실행하는 데 사용할 수 있는 열안정성 리보뉴클레아제 H2의 비제한적 예는 RNase H2 효소(IDT, cat. # 11-03-02-03)이다.
본 예시적 방법은 검출하고자 하는 서열을 함유하는 프라이머를 도입하지 않고 이하와 같은 경우에만 돌연변이를 검출하는 것을 포함하여 기존 방법과 비교하여 명백한 이점을 포함한다: 1. 선택자 프라이머와 돌연변이 주형 사이의 부정합이 교정 폴리머라제의 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 인식되고 제거되며, 2. 고충실도 폴리머라제가 돌연변이된 주형을 카피한다. 반면, 대립유전자-특이적 증폭은 검출하고자 하는 변이체 서열을 도입하고, 이는 위양성을 유도할 수 있다. 또 다른 이점은 단일 프라이머가 특정 뉴클레오티드 위치의 임의 변이체를 검출하는 반면, 대립유전자-특이적 PCR은 각각의 대립유전자 변이체 또는 돌연변이에 대해 특정 프라이머가 필요하다는 것이다. 본 실시예에서 기재되고 다른 실시양태 및 일반적으로 본원에 제공된 모든 방법에 적용되는 또 다른 이점은 반응이 작동했음을 입증하는 내부 대조군으로서; 및 대체 대립유전자 또는 돌연변이의 증폭 수준을 비교할 수 있는 내부 표준으로서(존재하는 경우) 작용하는 특정 대립유전자 또는 야생형의 설정 양의 증폭을 가능하게 하는 능력이다.
본 발명의 다수의 실시양태가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태는 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> RhoDx, Inc.
<120> SYNTHETIC POLYNUCLEOTIDES AND METHODS FOR SELECTIVELY AMPLIFYING
ALLELES
<130> 6150.144385PCT
<140> to be assigned
<141> 2022-02-01
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<151> 2021-02-02
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Claims (35)
- 3' 말단을 기준으로 제1(최종(ultimate)), 제2(끝에서 두 번째(penultimate)), 제3(끝에서 세 번째(antepenultimate)), 제4(끝에서 네 번째(preantepenultimate)), 제5(끝에서 다섯 번째(propreantepenultimate)) 또는 제6(끝에서 다섯 번째 전의 하나의 잔기(one residue before the propreantepenultimate) ) 위치에 위치하거나 3' 말단보다 더 먼 위치에 있는 적어도 하나의 잔기(선택자(selector) 뉴클레오티드라고 지칭됨)를 포함하는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(선택자 뉴클레오티드라고 지칭)로서,
상기 적어도 단일 잔기 선택자 뉴클레오티드는 표적 핵산에 대한 선택자 폴리뉴클레오티드의 결합에 필요한 선택자 폴리뉴클레오티드의 영역 또는 섹션 내의 임의의 다른 잔기와 구조적 또는 화학적으로 상이하고,
합성 DNA 폴리뉴클레오티드(선택자 폴리뉴클레오티드라고 지칭됨)는 DNA 폴리머라제에 의해 신장될 수 있거나, DNA 폴리머라제에 의해 신장될 수 있는 3' 말단을 갖도록 처리될 수 있는 3' 말단을 갖는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드. - 제1항에 있어서, 상기 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기가 3' 말단으로부터 제2 위치, 또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 끝에서 두 번째 위치에 위치하는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제1항에 있어서, 상기 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기가 3' 말단으로부터 제3 위치, 또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 끝에서 세 번째 위치에 위치하는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제1항에 있어서, 상기 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기가 3' 말단으로부터 제1 위치, 또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 최종 위치에 위치하는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제1항에 있어서, 상기 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기가 3' 말단으로부터 제4 위치, 또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 끝에서 네 번째 위치에 위치하는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제1항에 있어서, 상기 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기가 3' 말단으로부터 제5 위치, 또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 끝에서 다섯 번째 위치에 위치하는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제1항에 있어서, 상기 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기가 3' 말단으로부터 제6 위치, 또는 합성위치, 또는 합성오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 다섯 번째 위치 전의 하나의 잔기에 위치하는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제1항 내지 제7항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택자 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제1항 내지 제8항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택자 뉴클레오티드가 적어도 하나의 리보뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제1항 내지 제9항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택자 뉴클레오티드가 적어도 하나의 합성 또는 비천연 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성되는, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드).
- 제2 핵산 서열로부터 제1 핵산 서열을 구별하기 위한 핵산 증폭 방법으로서,
상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 증폭 반응 혼합물 내에 있고,
(a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 제공하거나 제공한 단계로서, 여기서 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 선택적 리보뉴클레오티드 잔기)을 함유하는 단계;
(b) DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드를 제공하거나 제공한 단계로서, 여기서 임의로 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드는 게놈(임의로 세포, 미생물 또는 바이러스 게놈), cDNA 라이브러리(library) 또는 게놈 라이브러리를 포함하거나 이들로부터 유래하고, 임의로 게놈, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리는 진핵생물 또는 원핵생물, 식물 또는 포유동물(임의로 인간), 미생물(임의로 박테리아, 조류, 원핵생물, 고세균(Archea) 또는 진균) 또는 바이러스 또는 박테리오파지로부터 유래하는 단계;
(c) 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드에 접촉, 어닐링(annealing) 또는 하이브리드화(hybridizing)하는 단계로서, 여기서 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드는, 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)가 상기 DNA 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열 또는 실질적으로 상보적 서열에 어닐링 또는 특이적으로 하이브리드화하는 조건하에서 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)에 대한 주형(template)(주형 DNA 폴리뉴클레오티드)으로 작용하여 핵산 이중체(duplex)를 생성하고;
여기서, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 선택자 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에서 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루거나(예를 들면, 도 2A 참조), 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에서 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루지 않는 단계(예를 들면, 도 2B 참조);
(d) 상기 이중체를, DNA 폴리머라제 효소 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성(extension activity)을 갖는 폴리머라제 효소 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 효소적으로 활성인 조건하에서, 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖고 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소, 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 접촉시키는 단계로서,
여기서,
(i) 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 및 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드 사이에서 부정합하고, 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성은, DNA 폴리머라제가 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유하지 않는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드로 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 잔류물을 신장시키기 전에, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기) 및 선택자 뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드 3'을 포함하는 3' 말단으로부터 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 효소적 제거 부분을 초래하거나; 또는
(ii) 상기 DNA 폴리머라제는, 선택자 뉴클레오티드(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 제거하지 않으면서, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에서 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드와 염기쌍을 이루고 있는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 신장시키고, 따라서 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유하거나 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드에 도입하는 단계; 및
(e) 신규 생성된 핵산 이중체를 리보뉴클레아제 효소와 접촉시키는 단계로서, 여기서 임의로 리보뉴클레아제 효소는 열안정성이고, 열안정성 리보뉴클레아제는 열안정성 리보뉴클레아제 효소가 활성인 조건하에서 열안정성 리보뉴클레아제 H2 효소인 단계를 포함하고,
여기서,
(i) 반응에 존재하는 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)가 제거되는 경우, 단일 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에 5'인 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 일부는 신장된 합성 폴리뉴클레오티드 내에 보유되거나; 또는
(ii) 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)가 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)에 보유되고 데옥시리보뉴클레오티드 잔기와 정합(matching)하는 경우, 열안정성 리보뉴클레아제 효소는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에서 절단하여 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에 5'인 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 부분을 분리하고,
상기 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보 뉴클레오티드 잔기)에 5'였던 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 부분을 보유하는 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 신장된 선택자 폴리뉴클레오티드)는 기하급수적으로 증폭될 수 있고, 상기 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)로부터 분리된 상기 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에 5'인 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 일부를 갖는 상기 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(신장된 선택자 폴리뉴클레오티드)는 기하급수적으로 증폭될 수 없고, 이에 따라 이의 증폭은 선택적으로 억제되어, 제2 핵산 서열로부터 제1 핵산 서열을 구별하는, 핵산 증폭 방법. - 제2 핵산 서열로부터 제1 핵산 서열을 구별하기 위한 핵산 증폭 방법으로서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 증폭 반응 혼합물 내에 있고,
(a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 제공하거나 제공한 단계로서, 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 함유하는 단계;
(b) DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드를 제공하거나 제공한 단계로서, 임의로 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드는 게놈(임의로 세포, 미생물 또는 바이러스 게놈), cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리를 포함하거나 이들로부터 유래하고, 임의로 게놈, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리는 진핵생물 또는 원핵생물, 식물 또는 포유동물(임의로 인간), 미생물(임의로 박테리아, 조류, 원핵생물, 고세균 또는 진균) 또는 바이러스 또는 박테리오파지로부터 유래하는 단계;
(c) 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드에 접촉, 어닐링 또는 하이브리드화하는 단계로서, 여기서 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드는, 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)가 상기 DNA 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열 또는 실질적으로 상보적 서열에 어닐링 또는 특이적으로 하이브리드화되는 조건하에서 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)에 대한 주형(주형 DNA 폴리뉴클레오티드)으로 작용하여 핵산 이중체를 생성하고;
여기서, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에서 주형 DNA 폴리뉴클레오티드에 쌍을 이루거나(예를 들면, 도 10A 참조), 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에서 주형 DNA 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루지 않는 단계(예를 들면, 도 10B 참조);
(d) 상기 핵산 이중체를, DNA 폴리머라제 효소 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖는 폴리머라제 효소 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 효소적으로 활성인 조건하에서, 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖고 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소, 및/또는 5'로부터 3'로의 신장 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 효소 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 접촉시키는 단계로서,
여기서,
(i) 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 및 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드 사이에서 부정합(mismatching)하고, 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성은, DNA 폴리머라제가 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유하지 않는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드로 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 잔류물을 신장시키기 전에, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기) 및 선택자 뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드 3'을 포함하는 3' 말단으로부터 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 효소적 제거 부분을 초래하거나; 또는
(ii) 상기 DNA 폴리머라제는, 선택자 뉴클레오티드(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 제거하지 않으면서, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에서 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 DNA 폴리뉴클레오티드와 염기쌍을 이루고 있는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 신장시키고, 이에 따라 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)의 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유하거나 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드에 도입하는 단계; 및
(e) 증폭 후, 앰플리콘(또는 신규 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 선택자 폴리뉴클레오티드)을 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 5' 또는 3' 측에서 또는, 존재하는 경우, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 3개 뉴클레오티드 내에서 절단하는 시약 또는 효소로 처리하는 단계를 포함하고,
여기서, 임의로, 시약 또는 효소는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유한 앰플리콘(또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드)로부터 결합 모이어티(binding moiety)를 분리하거나 상당량의 도입된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머(primer)를 분리하여, 앰플리콘, 또는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 갖지 않는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드를 가능하게 하고, 따라서 결합 모이어티 또는 상당량의 도입된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드), 또는 우선적으로 포획(또는 물리적으로 단리) 또는 후속적으로 우선적으로 증폭되는 프라이머를 보유하는, 핵산 증폭 방법. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 단일 선택자 리보뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하는 데 사용되는 시약이 리보뉴클레아제 H2인, 방법.
- 제12항에 있어서, 단일 선택자 리보핵산의 3' 측에서 절단하는 데 사용되는 시약이 열(heat)의 존재하에 수산화나트륨인, 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 핵산 이중체를 변성시켜 단일 가닥 DNA(single-stranded DNA)를 생성하는 것을 추가로 포함하고, 상기 단일 가닥 DNA는 단일 선택자 리보뉴클레오티드의 3' 측에서 절단하는 리보뉴클레아제로 처리되는, 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머라제 및 3'로부터 5'로의 엑소뉴클레아제 활성이 상이한 효소에 의해 제공되는, 방법.
- 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)가 핵산 증폭 방법에 사용되는 프라이머이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 증폭 방법이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함하는, 방법.
- 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 증폭하는 동안, 신장된 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머가 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 5' 또는 3' 측에서 또는, 존재하는 경우, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 3개 뉴클레오티드 내에서 절단하는 효소로 처리되어, 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머의 일부를, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 보유한 앰플리콘(또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드)으로부터 분리하고, 증폭 반응에서 리턴 프라이머의 신장에 의해 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머가 완전히 카피되는 것을 방지하고, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 갖지 않는 앰플리콘이 기하급수적 증폭을 지원하기에 충분한 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머 서열의 보유에 의해 우선적으로 증폭되도록 하는, 방법.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드) 또는 프라이머가 리보뉴클레오티드를 포함하고, 상기 선택자 뉴클레오티드의 5' 측에서 절단하는 효소가 리보뉴클레아제 H2인, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 리보뉴클레아제 H2는 열안정성인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 열안정성 리보뉴클레아제 H2가 파이로코커스 아비시(Pyrococcus abysii) RNase H2인, 방법.
- 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)가 상응하는 정상 데옥시리보뉴클레오티드로 대체되어 DNA 증폭 프라이머를 생성하고, 이 DNA 증폭 프라이머의 특정 양이 상기 제1 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)와 혼합되는 것을 제외하고는 제1 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)와 동일한 제2 합성 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머, 또는 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 함유하여, 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 함유하지만, 이제 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)를 결여하고, 이에 따라 이제 선택자 뉴클레오티드(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)에 특이적인 시약 또는 효소에 의한 절단에 내성이 있는 소정 양의 앰플리콘이 생산되도록 하는 프라이머를 추가로 포함하는, 방법.
- 제23항에 있어서, 제2 합성 DNA 폴리뉴클레오티드에 의해 생성된 앰플리콘이, 증폭이 작동했음을 입증하기 위한 내부 반응 대조군(internal reaction control)으로서, 및 제1 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)에 의해 생성된 앰플리콘 또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드의 양을 비교할 수 있는 내부 표준으로서 사용되는, 방법.
- 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앰플리콘 또는 신규 신장된 DNA 폴리뉴클레오티드의 서열이, 임의로 생거(Sanger) 서열분석, 차세대 서열분석(NGS), 단일 분자 실시간(SMRT) 서열분석, 나노기공 DNA 서열분석, 가역적 종결 화학(예를 들면, SOLEXA 기술(Illumina)), 조합 프로브 앵커 합성(combinatorial probe anchor syntheis; cPAS), 질량 분석법 서열분석(mass spectrometry sequencing) 또는 대량 병렬 시그니처 서열분석(massively parallel signature sequencing; MPSS)의 사용을 포함하는 방법을 사용하는 DNA 서열분석에 의해 결정되는, 방법.
- 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 원래의 선택자 뉴클레오티드 잔기(임의로 단일 리보뉴클레오티드 잔기)의 위치에 대응하는 뉴클레오티드의 동일성(identity)이 목적 부위에 대한 프라이머의 신장에 의해 결정되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 목적 부위에서 뉴클레오티드의 동일성 및 상대적 양이 라벨(label) 또는 질량(mass)을 사용하거나 또는 라벨 또는 질량에 의해 결정되고, 임의로 상기 목적 부위에서 뉴클레오티드의 동일성 및 상대적 양이 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드)를 사용하여 생성된 앰플리콘에서 목적 부위 전체에 걸쳐 프라이머의 단일-염기 신장(single-base extension)을 포함하는 방법에 의해 결정되는, 방법.
- 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 한에 있어서, 목적 앰플리콘, 또는 신규 확장 DNA 폴리뉴클레오티드의 생산이 정량적 PCR(qPCR), 디지털 PCR 또는 등가물(equivalent)에 의해 결정되는, 방법.
- 전술한 항들 중 어느 한 항의 방법을 실시하기 위한 물질, 임의로 효소 및/또는 합성 DNA 폴리뉴클레오티드, 임의로 선택자 폴리뉴클레오티드(임의로 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 하나 또는 복수의 합성 DNA 폴리뉴클레오티드(또는 선택자 폴리뉴클레오티드))를 포함하고, 임의로 제11항 내지 제28항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항의 방법을 실행하기 위한 설명서(instruction)를 추가로 포함하는 키트 또는 제품.
- 질환 또는 상태와 연관되거나 이의 진단과 관련된 대립유전자, 또는 게놈 서열의 존재 또는 부재를 결정함으로써 이를 필요로 하는 개체(individual)가 상기 질환 또는 상태를 갖고 있는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태를 진단하기 위한 방법으로서,
상기 질환 또는 상태와 연관되거나 이의 진단과 관련된 대립유전자 또는 게놈 서열의 존재 또는 부재가 제11항 내지 제28항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 결정되는, 방법. - 제30항에 있어서, 상기 질환이 암(cancer)인, 방법.
- 질환 또는 상태에 대해 표시된 약물, 약물 조합 또는 치료 섭생으로 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하기 위한 방법으로서,
이를 필요로 하는 개체가 제30항 또는 제31항의 진단 방법을 사용하여 상기 질환 또는 상태를 갖는 것으로 진단되거나 가질 소인이 있는, 방법. - 제32항에 있어서, 상기 질환이 암이거나, 상기 상태가 유전성 질환 또는 유전적 상태인, 방법.
- 제11항 내지 제28항 중 어느 한 항 또는 전술한 항들 중 어느 한 항의 방법을 사용하는 것을 포함하는, 생물학적 표본에서 희귀 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법으로서,
임의로, 상기 생물학적 표본은 이를 필요로 하는 개인으로부터 생검(biopsy) 또는 조직 또는 혈액 샘플, 또는 액체 샘플을 포함하거나 이들로부터 유래하는, 방법. - 제34항에 있어서, 상기 생물학적 표본에서 희귀 대립유전자의 존재 또는 부재의 검출이 비침습적 산전 검사(non-invasive pre-natal testing; NIPT), 또는 기관 이식(임의로 고형 기관 또는 골수 이식) 후에 조직 적합성의 평가 또는 기증자-유래 핵산의 검출, 또는 항미생물 내성(AMR)의 평가 또는 이를 필요로 하는 개체의 미생물 내성의 조기 검출, 또는 최소 잔류 질환(MRE) 존재의 평가, 임의로 골수 절제 후에 MRE의 평가를 위한 것인, 방법.
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