CN116888271A - 用于选择性扩增等位基因的合成多核苷酸和方法 - Google Patents
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Abstract
在替代实施方案中，提供了基于引物的核酸扩增方法，其能够选择不扩增或修复特定等位基因，同时不干扰靶序列内特定核苷酸位置处的任何替代等位基因或突变的扩增或修复，或者换句话说，提供了用于选择性抑制一个等位基因同时扩增任何替代等位基因的方法，或者提供用于抑制野生型序列同时扩增点突变(包括扩增单核苷酸变体(SNV)、插入和缺失)的方法。在替代实施方案中，核酸组合物的一部分不选择性抑制特定核酸靶序列的扩增，从而提供可用于确定扩增的成功和确定特定核酸靶序列与编码替代等位基因或突变的序列的相对比率的内部对照。
Description
相关应用
本专利公约条约(PCT)国际申请根据35 U.S.C.§119(e)要求享有2021年2月2日提交的美国临时系列申请号(USSN)63/144,723的优先权。上述申请的全部内容并出于所有目的通过引用明确并入本文。本文引用的所有出版物、专利、专利申请均出于所有目的通过引用明确并入本文。
技术领域
本发明大体涉及分子生物学和高通量测序，例如来自例如基因组的核酸的NexGen测序(NGS)。在替代实施方案中，提供了基于引物的核酸扩增方法，其能够选择不扩增或修复特定等位基因，同时不干扰靶序列内特定核苷酸位置处的任何替代等位基因或突变的扩增或修复，或者换句话说，提供了用于选择性抑制一个等位基因同时扩增任何替代等位基因的方法，或者提供用于抑制野生型序列同时扩增点突变(包括扩增单核苷酸变体(SNV)、插入和缺失)的方法。在替代实施方案中，也可以检测cDNA中的融合。在替代实施方案中，核酸组合物的一部分不选择性抑制特定核酸靶序列的扩增，从而提供可用于确定扩增的成功和确定特定核酸靶序列与编码替代等位基因或突变的序列的相对比率的内部对照。在替代实施方案中，提供了用于诊断疾病或病症的方法，包括使用合成的DNA多核苷酸(称为选择者多核苷酸)和/或本文提供的方法。在替代实施方案中，提供了治疗、改善或预防疾病或病症的方法，包括使用合成的DNA多核苷酸(称为选择者多核苷酸)和/或本文提供的方法，包括本文提供的诊断方法。
背景
随着液体活检的出现，罕见等位基因检测变得比以往更加重要。循环细胞游离DNA(circulating cell-free DNA,ccfDNA)存在于每个人的血液中，大部分源自健康、正常的细胞。然而，孕妇体内也存在少量胎儿DNA并且可以用于通过称为无创产前检测(NIPT)的程序寻找遗传疾病；同样，在实体器官移植(SOT)中，微量的供体来源的细胞游离DNA(dd-cfDNA)可以用于检测多种器官的急性排斥反应；并且在癌症中，低水平的循环肿瘤DNA(ctDNA)已被用来检测疾病的早期复发。凭借可提高灵敏度、特异性和定量性的纠错方法(例如分子索引)，高通量NexGen测序(NGS)现在已成为所有这些液体活检应用的出色检测设备。然而，绝大多数序列读数都是无信息的：NIPT中的母体读数；dd-cfDNA中的接受者读数，以及ccfDNA中的野生型读数。大量无信息的读数降低通量、增加费用并妨碍检测。
等位基因特异性PCR(AS-PCR)可以用于选择性扩增所需靶标(特定等位基因或体细胞突变)，但无法使用校对聚合酶，错误引发可能导致假阳性，并且对于每个所需等位基因需要不同的引物。也可以使用针对不需要的等位基因的阻断剂，但它们会增加PCR检测“足迹”，而ccfDNA中的短DNA片段(中值大小约为168bp；如果源自胎儿或肿瘤DNA，则较短)会降低检测率。此外，尽管希望显著减少无信息读数的数量，但一定数量的此类读数可用作比较的内部对照并确保整个反应有效。AS-PCR或Blockers都无法可靠地做到这一点。
概述
在替代实施方案中，提供了基于引物的核酸组合物，其可用于选择性抑制特定核酸靶序列的扩增同时选择性扩增核酸(或多核苷酸、或脱氧核糖核酸(DNA)，包括cDNA)序列中存在的替代等位基因或突变的方法中，所述替代等位基因或突变与被抑制的靶序列的差异小至一个核苷酸，从而允许分析和测量替代等位基因或突变。在替代实施方案中，核酸组合物的一部分不选择性抑制特定核酸靶序列的扩增，从而提供可用于确定扩增的成功和确定特定核酸靶序列与编码替代等位基因或突变的序列的相对比率的内部对照。
在替代实施方案中，提供了通过选择性地将结合部分与核酸靶标分离来选择性抑制核酸靶标分离的方法。选择性保留结合部分的核酸靶标的替代等位基因或突变体的修复或保留不受影响。在替代实施方案中，所使用的核酸组合物的一部分不选择性地与结合部分分离，从而提供可用于确定修复的成功和确定特定核酸靶序列与编码替代等位基因或突变的序列的相对比率的内部对照。
在替代实施方案中，等位基因特异性或突变特异性或甲基化特异性扩增或捕获被用于确定分子单元型。
在替代实施方案中，通过测序、杂交、质谱或任何其他可以检测序列变化的技术(包括具有核苷酸分辨率的那些技术)来检测差异。
在替代实施方案中，提供了合成的DNA多核苷酸(称为选择者多核苷酸)，其包含至少单个残基(称为选择者核苷酸)，其位于相对于3’端的第一(最终)、第二(倒数第二)、第三(倒数第三)、第四(倒数第四)、第五(倒数第五)、或第六(倒数第五前一个)位置，或位于离3'端更远的位置，
其中所述至少单个残基选择者核苷酸在结构上或化学上不同于选择者多核苷酸的区域或部分内的选择者多核苷酸与靶核酸结合所必需的任何其他残基，
并且合成的DNA多核苷酸(称为选择者多核苷酸)具有可以：通过DNA聚合酶延伸的3’端，或加工成具有可以通过DNA聚合酶延伸的3’端，或者，
就其被酶(任选地DNA聚合酶)延伸的能力而言，合成的DNA多核苷酸在其3’端未被阻断。
在本文提供的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的替代实施方案中：
-单个选择者核苷酸残基位于合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的3’端第二个位置，或倒数第二个位置；
-单个选择者核苷酸残基位于合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的3’端的第三个位置，或倒数第三个位置；
-选择者核苷酸包含至少一种核糖核苷酸或至少一种合成或非天然核苷酸或由至少一种核糖核苷酸或至少一种合成或非天然核苷酸组成。和/或
-选择者核苷酸是核糖核苷酸。
在替代实施方案中，提供了用于区分第一核酸序列与第二核酸序列的核酸扩增方法，其中第一和第二核酸位于相同的扩增反应混合物中，包括：
(a)提供或已经提供了如本文所提供或描述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在其中含有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)；
(b)提供或已提供了DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸，其中任选地该DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸包含或衍生自基因组(任选地细胞、微生物或病毒基因组)、cDNA文库或基因组文库，并且任选地该基因组、cDNA文库或基因组文库衍生自真核生物或原核生物、植物或哺乳动物(任选地人类)、微生物(任选地细菌、藻类、原生生物、古细菌或真菌)或病毒或噬菌体；
(c)使合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸接触、退火或杂交，其中在合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸中或与DNA多核苷酸的互补序列或基本上互补的序列(例如，如果序列具有约95％和99％之间的序列同一性，则该序列是基本上互补的序列)退火或特异性杂交的条件下，该DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸充当合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的模板(模板DNA多核苷酸)，从而产生核酸双链体；
其中合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置处与模板DNA多核苷酸配对(参见例如图2A，其中“R”指与模板DNA多核苷酸配对的单个核糖核苷酸残基的位置)，或者在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置处不与模板DNA多核苷酸配对(参见例如图2B，其中“R”指与未与模板DNA多核苷酸配对(如“X”所示)的单个核糖核苷酸残基的位置)；
(d)在其中DNA聚合酶和/或具有5'至3'延伸活性的聚合酶和具有3'至5'核酸外切酶活性的酶是有酶促活性的条件下，使双链体与具有5'至3'延伸活性且具有3'至5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶和/或具有5'至3'延伸活性的DNA聚合酶以及具有3'至5'核酸外切酶活性的酶接触，
其中：
(i)选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)在合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸之间不匹配，并且3'至5'核酸外切酶活性导致从3'端酶促移除合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分，包括选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)和在DNA聚合酶将合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的剩余部分延伸成不保留选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的新的延伸DNA多核苷酸之前的选择者核苷酸3'的所有核苷酸；或者
(ii)DNA聚合酶延伸在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸碱基配对处的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，而不移除选择者核苷酸(任选地单个核糖核苷酸残基)，从而将合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)保留或掺入新的延伸的DNA多核苷酸中；和
(e)使新产生的核酸双链体与核糖核酸酶接触，其中任选地核糖核酸酶是热稳定的，其中在热稳定核糖核酸酶有活性的条件下，热稳定核糖核酸酶是热稳定核糖核酸酶H2酶，
其中：
(i)如果选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)已被反应中存在的3'至5'外切核酸酶活性移除，则位于单个选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)5'处的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分保留在延伸的合成多核苷酸内；或者
(ii)如果选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)保留在延伸的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)中并且与脱氧核糖核苷酸残基匹配，则热稳定性核糖核酸酶在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)处切割，从而分离位于选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)5’的延伸的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分，
其中保留了合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)5'处的部分的延伸的合成的DNA多核苷酸(或延伸的选择者多核苷酸)可以指数扩增，并且其中具有在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)5’处的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分从分离的延伸合成的DNA多核苷酸(或延伸选择者多核苷酸)中分离的延伸的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)不能指数扩增，因此它们的扩增被选择性抑制，从而将第一核酸序列与第二核酸序列区分开。
在替代实施方案中，提供了用于区分开第一核酸序列与第二核酸序列的核酸扩增方法，其中第一和第二核酸位于相同的扩增反应混合物中，包括：
(a)提供或已经提供了如本文所提供或描述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在其中含有选择者核苷酸残基(任选地单个选择核糖核苷酸残基)；
(b)提供或已提供了DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸，其中任选地该DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸包含或衍生自基因组(任选地细胞、微生物或病毒基因组)、cDNA文库或基因组文库，并且任选地该基因组、cDNA文库或基因组文库衍生自真核生物或原核生物、植物或哺乳动物(任选地人类)、微生物(任选地细菌、藻类、原生生物、古细菌或真菌)或病毒或噬菌体；
(c)使合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸接触、退火或杂交，其中在合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸中的互补序列或基本上互补的序列退火或特异性杂交的条件下，所述DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸充当合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的模板(模板DNA多核苷酸)，从而产生核酸双链体；
其中合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置处与模板DNA多核苷酸配对(参见例如图10A，其中“R”指与模板DNA多核苷酸配对的单个核糖核苷酸残基的位置)或者在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置处不与模板DNA多核苷酸配对(参见例如图10B，其中“R”指未与模板DNA多核苷酸配对(如“X”所示)的单个核糖核苷酸残基的位置；
(d)在DNA聚合酶和/或具有5'至3'延伸活性的聚合酶和具有3'至5'核酸外切酶是有酶促活性的条件下，使核酸双链体与具有5'至3'延伸活性且具有3'至5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶和/或具有5'至3'延伸活性的DNA聚合酶和具有3'至5'核酸外切酶活性的酶接触。
其中：
(i)选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)在合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸之间不匹配，并且3'至5'核酸外切酶活性导致从3'端酶促移除合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分，包括选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)和在DNA聚合酶将合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的剩余部分延伸成不保留选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的新的延伸DNA多核苷酸之前的选择者核苷酸3'的所有核苷酸；或
(ii)DNA聚合酶延伸在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸碱基配对处的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，而不移除选择者核苷酸(任选地单个核糖核苷酸残基)，从而将合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)保留或掺入新的延伸的DNA多核苷酸中；和
(e)扩增后，用试剂或酶处理扩增子(或新延伸的合成的DNA多核苷酸或选择者多核苷酸)，所述试剂或酶在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的5’或3’侧切割，或者在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的三个核苷酸内(当存在时)切割，
其中任选地，试剂或酶将结合部分或大量掺入的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物从保留了选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的扩增子(或新延伸的DNA多核苷酸)上分离，从而允许不具有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)，并因此保留结合部分或大量掺入的合成的DNA多核苷酸(或选择器多核苷酸)的扩增子或新延伸的DNA多核苷酸，优先捕获(或物理分离)或随后优先扩增。
在替代实施方案中，本文提供的方法：
-用于在单个选择者核糖核苷酸的5'侧进行切割的试剂是核糖核酸酶H2，或者用于在热存在下在单个选择者核糖核苷酸的3'侧进行切割的试剂是氢氧化钠；
-该方法还包括使核酸双链体变性以产生单链DNA，并且其中用在单个选择者核糖核苷酸的3’侧进行切割的核糖核酸酶处理该单链DNA；
-聚合酶和3'至5'核酸外切酶活性由不同的酶提供；
-合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)是或包含用于核酸扩增方法的引物，并且任选地，扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)；
-在扩增期间，用酶处理延伸的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物，该酶在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的5’或3’侧切割，或者在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的三个核苷酸内(当存在时)切割，从而从保留了选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的扩增子(或新延伸的DNA多核苷酸)分离合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的一部分或引物，并且防止合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物在扩增反应中通过返回引物的延伸而被完全复制，并且允许不具有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的扩增子凭借保留足够的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物，支持指数扩增的序列而被优先扩增；
-合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物包含核糖核苷酸并且在选择者核苷酸的5'侧切割的酶是核糖核酸酶H2，并且任选地核糖核酸酶H2是热稳定的，并且任选地热稳定核糖核酸酶H2是阿比火球菌(Pyrococcus abysii)RNase H2；
-该方法还包括第二合成的DNA多核苷酸或引物，其与第一合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)相同，除了选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)被相应的正常脱氧核糖核苷酸替换以产生DNA扩增引物，并且特定量的该DNA扩增引物与含有选择者核苷酸残基(任选单个核糖核苷酸残基)的第一合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物混合，以便允许一定量的扩增子产生，其本应含有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)，但现在缺乏选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)并且因此现在对由选择者核苷酸(任选地单个核糖核苷酸残基)特异的试剂或酶进行的切割具有抗性；
-由第二合成的DNA多核苷酸如此产生的扩增子被用作内部反应对照以证明扩增有效，并作为可以与由第一合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)产生的扩增子或新延伸的DNA多核苷酸的量进行比较的内部标准；
-扩增子或新延伸的DNA多核苷酸的序列通过DNA测序来确定，任选地使用包括使用Sanger测序、下一代测序(NGS)、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔DNA测序、可逆终止化学(例如，SOLEXA技术(Illumina))、组合探针锚定合成(cPAS)、质谱测序或大规模并行特征测序(MPSS)的方法；
-对应于原始选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置的核苷酸的同一性通过引物在感兴趣位点上的延伸来确定；
-通过使用或借助标记或通过质量来确定感兴趣位点处的核苷酸的同一性和相对量，并且任选地，通过包括跨在使用合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)产生的扩增子中的感兴趣位点的引物单碱基延伸的方法来确定感兴趣位点处的核苷酸的同一性和相对量；和/或
-通过定量PCR(qPCR)、数字PCR、基因分型方法或其等同方法或其组合来确定感兴趣的扩增子或新延伸的DNA多核苷酸的产生。
在替代实施方案中，提供了试剂盒或制造产品，其包含用于实践本文提供或描述的方法的材料、任选的酶和/或合成的DNA多核苷酸、任选的选择者多核苷酸(任选一种或多种本文提供的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸))，并且任选进一步包含用于实践本文提供或描述的方法的说明书。
在替代实施方案中，提供了包含用于实践本文所提供的方法的材料的试剂盒，并且任选地还包含用于实践本文所提供的方法的说明书。
在替代实施方案中，提供了用于诊断疾病或病症的方法，包括通过确定与疾病或病症相关的或诊断疾病或病症的等位基因或基因组序列的存在或不存在来确定有需要的个体是否患有疾病或病症，
其中通过使用本文提供的方法来确定与疾病或病症相关或诊断疾病或病症的等位基因或基因组序列的存在或不存在。该疾病可以是癌症。
在替代实施方案中，提供了用于治疗、改善或预防疾病或病症的方法，包括用适用于该疾病或病症的药物、药物组合或治疗方案治疗有需要的个体，其中使用本文提供的诊断方法将有需要的个体诊断为患有或倾向于患有该疾病或病症。该疾病可以是癌症，或者该病症是遗传性疾病或遗传病症。
在替代实施方案中，提供了如本文提供的合成的DNA多核苷酸用于诊断疾病或病症的用途，其中通过与疾病或病症相关或诊断疾病或病症的等位基因或基因组序列的存在来诊断疾病或病症，并且通过使用本文提供的方法确定与疾病或病症相关或诊断疾病或病症的等位基因或基因组序列的存在或不存在。
在替代实施方案中，本文提供的合成的DNA多核苷酸用于诊断疾病或病症，其中通过与疾病或病症相关或诊断疾病或病症的等位基因或基因组序列的存在来诊断疾病或病症，并且通过使用本文提供的方法确定与疾病或病症相关或诊断疾病或病症的等位基因或基因组序列的存在或不存在。
在替代实施方案中，提供了用于检测生物样本中稀有等位基因的存在或不存在的方法和合成的DNA多核苷酸，包括使用本文提供的方法，其中任选地生物样本包含或源自来自有需要的个体的活组织检查或组织或血液样品、或液体样品。
在替代实施方案中，检测生物样本中稀有等位基因的存在或不存在是为了非侵入性产前测试(NIPT)，或评估组织相容性或检测器官移植(任选实体器官或骨髓移植)后供体来源的核酸，或评估抗微生物耐药性(AMR)或早期检测有需要的个体中的微生物耐药性，或评估最小残留病(MRE)的存在，任选评估骨髓消融后的MRE。
本发明的一个或多个示例性实施方案的细节在附图和下面的描述中阐述。从描述和附图以及权利要求中，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。
本文引用的所有出版物、专利、专利申请均出于所有目的通过引用明确并入本文。
附图说明
专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。根据请求并支付必要的费用后专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本。
本文阐述的附图是本文提供的示例性实施例的说明，并不意味着限制权利要求所涵盖的本发明的范围。
图1绘示了单个残基核糖核苷酸选择者核苷酸在选择者引物内的可能放置；核糖核苷酸选择者核苷酸由位于核苷酸字母之前的“r”指定(换句话说，“r”本身不是核苷酸残基，而只是为了清楚地指定和“r”一起下划线的“G”核苷酸是核糖核苷酸)。选择者核苷酸可置于相对于3'端的第一(最后)(SEQ ID NO:1)、第二(倒数第二)(SEQ ID NO:2)、第三(倒数第三)(SEQ ID NO:3)、第四(倒数第四)(SEQ ID NO:4)、第五(倒数第五)(SEQ ID NO:5)或第六(倒数第五前一个)(SEQ ID NO:6)位置。核糖核苷酸选择者核苷酸由位于核苷酸字母之前的“r”指定并带有下划线。未示出的是距离3'端更远的位置，其中可以放置选择者核苷酸：
SEQ ID NO:1,或最后
AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGG
SEQ ID NO:2,或倒数第二
GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGC
SEQ ID NO:3,或倒数第三
GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCG
SEQ ID NO:4,或倒数第四
CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGT
SEQ ID NO:5,或倒数第五
CTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTA
SEQ ID NO:6,或倒数第五前一个
TGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAG
图2A-B示意性地绘示了本文提供的示例性方法，用于抑制一个等位基因，同时允许在相同核苷酸位置处扩增另一种等位基因或突变，例如，仅扩增突变体等位基因：
图2A：对于要抑制的等位基因(在本例中为野生型(WT)核苷酸)，引物(其中“R”指与模板DNA多核苷酸配对的单个核糖核苷酸残基的位置)与感兴趣的WT核苷酸精确序列匹配，并通过具有3'至5'核酸外切酶活性的校对聚合酶进行延伸。一旦引物延伸，热稳定性核糖核酸酶H2(例如阿比火球菌RNase H2)就会在核糖核苷酸5'侧标记“R”(下划线)的位置处进行切割，并且大部分引物序列(在5'端)被移除或分离。返回引物不能复制第一引物的大部分，因为该序列已被热稳定性核糖核酸酶H2移除或分离。这会阻止要抑制的等位基因(本例中的WT等位基因)呈指数扩增，从而大大减少扩增反应中产生的WT等位基因序列的数量。
图2B：相比之下，如果选择者引物中的单个核糖核苷酸(其中“R”指与模板DNA多核苷酸配对的单个核糖核苷酸残基的位置)与模板(本例中为WT等位基因)不匹配，则校对聚合酶的3'至5'外切核酸酶活性通过错配消化退火的引物，并且消除单个残基核糖核苷酸，并且当截短的引物在突变位点上延伸时，使用正确的脱氧核糖核苷酸(即与突变体匹配的脱氧核糖核苷酸)。请注意，该位点的任何替代等位基因或任何突变体都可能与野生型核糖核苷酸不匹配，因此对于所有替代等位基因或突变体，将从与WT等位基因结合的引物中移除单个残基错配核糖核苷酸，并在截短的引物延伸到突变位点上时用特定突变的正确匹配替换。选择者引物中单个残基核糖核苷酸的丢失使得掺入的(退火的)引物序列抵抗核糖核酸酶的移除。然后，返回引物可以复制掺入的(即，部分消化，然后延伸)的第一引物，并且任何替代等位基因或突变体序列呈指数扩增，大大增加反应中产生的替代等位基因或突变体序列的数量(如果它们存在的话)。选择者引物不会引入任何突变序列。随后分析检测到的每个突变体序列都通过了两次质量检查：首先，通过导致单个残基核糖核苷酸被移除的杂交错配来检测突变体；核糖核苷酸的丢失表明存在替代等位基因或突变体；其次，高度准确的聚合酶以高保真度复制替代等位基因或突变位点(其中任选地，高保真度意味着聚合酶以高于TAQ聚合酶的保真度复制替代等位基因或突变位点)，其通过测序(或其他方法，例如引物延伸或杂交)揭示替代等位基因或突变体的同一性。
图3绘示了具有相同3’端和不同长度5'端的选择者引物。选择者单个残基核糖核苷酸有下划线，前面有“r”，其位置与编码序列的核苷酸位置38处的人类克尔斯滕大鼠肉瘤基因(KRAS)中的野生型核苷酸相匹配。注意到在标准PCR条件下野生型序列和突变体序列(此处使用38G>A)之间的预期TM差异。增加选择者引物的长度会导致TM差异减少。还可以通过使用锁核酸(LNA)(也称为桥接核酸(BNA)或不可接近的RNA(不被RNase H2消化)，或其中核糖部分被连接2'氧和4'碳的额外桥修饰的修饰RNA核苷酸)和/或其他修饰核苷酸来实现TM差异的减少，例如，增加选择者核苷酸5'序列中TM的修饰核苷酸，例如，使用可以与dT碱基配对的2,6-二氨基嘌呤(每个残基升高可达1-2℃)；或者使用5-甲基脱氧胞苷，它与dG碱基配对，每个残基将TM提高多达0.5℃。
SEQ ID NO:7
GTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
SEQ ID NO:8
CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
SEQ ID NO:9
TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
SEQ ID NO:10
GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
SEQ ID NO:11
GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
SEQ ID NO:12
TATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGrGCG
图4绘示了由用图3中描绘的每一个引物和通用返回引物运行的PCR产生的扩增子的Sanger测序轨迹。对于顶行和底行，箭头指示可变核苷酸在靶序列中的位置(使用的模板是从野生型和KRAS 38G>A突变体杂合的细胞系中提取的DNA)。Sanger测序轨迹的顶行示出了PCR期间不存在RNase H2时每个反应的结果。引物越长，因此越稳定，看见的突变体信号(绿色轨迹，也用箭头突出显示)就越好，尽管即使使用60-mer引物，绿色突变体“A”信号也远小于黑色野生型“G”信号。进一步的稳定化，例如通过LNA或其他增加TM的核苷酸修饰，将改善突变体等位基因的这些结果。当不存在RNase H2时，引物的任何部分(无核糖核苷酸或核苷酸残基)不会从与野生型序列退火并延伸的引物中移除；野生型发生指数扩增。当热稳定性RNase H2包含在其他相同的反应中时(底行)，与野生型信号相比，突变体信号随着引物对突变体模板的稳定性而变得更加明显。对于野生型，RNase H2的存在会导致大部分引物序列(5'端)从延伸引物中分离或移除，从而影响指数扩增。对于突变体，在延伸之前，通过校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性，单个残基核糖核苷酸已从与突变体序列退火的引物中移除；因此，延伸至突变体位点的引物对RNase H2具有抗性，并呈指数扩增。
图5绘示了使用图3中描绘的51-mer选择者引物和通用返回引物在野生型(等位基因G)DNA模板滴定突变体(等位基因A)DNA模板中的Sanger测序结果。每个Sanger测序轨迹上方示出了为野生型(WT)和突变型(MUT)KRAS等位基因计算的单倍体基因组当量数。即使在计算出的2,998个野生型DNA背景下计算出两个突变体DNA拷贝，也可以看到清晰的突变体(A)信号(底行，最右侧)。当突变体DNA含量非常低时(底行)，可以看到非常微弱的“G”信号；还可以看到“T”信号，这些信号不是模板编码的，而是由测序聚合酶(例如SEQUENASETM(ThermoFisher Scientific))在到达模板末端时添加的。添加的“T”信号在幅度上与“G”信号相当，表明引物位点已从所有或几乎(或基本上)所有包含扩增子的WT“G”中被切割。例如，添加条形码(例如ILLUMINA样品条形码)的后续PCR不会扩增这些WT序列。进入NGS的样品将不会桥接扩增，也不会被测序。因此，可以在没有任何或几乎(或基本上)任何野生型背景的情况下检测任何量的突变体DNA。
图6A-B显示了在不存在RNase H2的情况下使用选择者引物扩增野生型KRAS时的结果。扩增后：图6A，添加RNase H2以在核糖核苷酸G(rG)的5'侧进行切割并移除WT“G”上游的引物序列；或：图6B，NaOH和热用于切割核糖核苷酸G(rG)的3’侧并移除WT“C”上游的引物序列，其位于核糖核苷酸G(rG)的3’侧。在这两种情况下，都可以看到聚合酶(SEQUENASETM)添加了“T”，表示加工后的DNA链的末端。从含有WT的扩增子中移除任何结合部分，例如生物素或捕获序列。使用链霉亲和素(对于生物素)或/>流动池(对于/>捕获序列)进行检索将仅捕获突变体扩增子(如果存在)。
图7绘示了51-mer选择者引物，其在倒数第三个位置中包含G核糖核苷酸(rG)(SEQID：11)，并且在其下方，在倒数第三个位置中包含其与正常脱氧核糖核苷酸的对应物(SEQID：13)。选择者引物的一个独特特征是它们可以进行微调以允许有限数量的野生型序列。可以选择含有G核糖核苷酸(rG)的引物，例如在存在RNase H2的PCR中，而缺乏核糖核苷酸(被脱氧核糖核苷酸取代)的引物将对RNase H2具有抗性，并且可以被扩增或修复。其价值在于，它提供了内部对照，证明特定测定有效；它还允许对样品之间的WT和MUT序列进行定量比较。所示序列是 其中核糖核苷酸选择者核苷酸由置于核苷酸字母之前的“r”指定(粗体和下划线的残基是核糖核苷酸)。在下面的图7是相同的序列，除了倒数第三个位置的核苷酸是脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸(SEQ ID NO：13)。如图3和图4所示，可以使用更短的序列。
序列号：13
GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCG
图8绘示了本文提供的方法在进行分子单倍型分析中的效用。在这个例子中，个体的基因型在四个多态性位点上都是杂合的。通过使用适当的选择者引物，顶部DNA的扩增受到抑制，同时底部DNA的扩增不受阻碍。通过多种方式进行基因分型将揭示一种单倍型，而另一种单倍型可以从整体基因型(如果已知)中衍生出来。如果需要，在单独的反应中，可以进行相反的操作：使用适当的选择者引物，底部DNA的扩增受到抑制，而顶部DNA的扩增不受阻碍。该扩增子的基因分型将确认单倍型组成。
图9绘示了使用由图1中列出的选择者多核苷酸获得的扩增子的Sanger测序结果；在没有RNase H2的情况下获得的结果(顶行)通常在位置38处显示两条轨迹，即野生型“G”和突变体“A”；当选择者核苷酸位于本例中的最终位置时，野生型“G”信号几乎与突变型“A”信号相当；在所有其他情况下，“A”信号的幅度小于“G”信号。在热稳定性RNase H2(底行)存在的情况下，所有选择者多核苷酸均可有效抑制或部分抑制位置38(箭头标记)处含有序列的野生型“G”的扩增，同时不干扰突变体“A”信号(在本例中)。
图10A-B示意性地示出了本文提供的示例性方法，其中在扩增期间相同核苷酸位置处的所有可能的等位基因都用结合部分标记，但是等位基因之一(例如，仅野生型等位基因)与结合部分分离，从而阻止其纯化：
图10A：说明在不希望纯化的等位基因的情况下(在本实施例中为野生型(WT)核苷酸)，引物通过具有3'至5'外切核酸酶活性的校对聚合酶延伸，其中“R”指与模板DNA多核苷酸配对的单个核糖核苷酸残基的位置(也参见图1)，其与感兴趣的WT核苷酸精确序列匹配。引物用结合部分标记，例如生物素，在图10A中用圆圈内的“B”表示；结合部分还可以是特定的核苷酸序列或允许其捕获和纯化(以及随后的检测)的任何其他部分。扩增后，用试剂或酶处理扩增子，该试剂或酶在选择者核苷酸的5'或3'侧进行切割(在本例中用“R”表示并加下划线)，从而使捕获部分与包含野生型等位基因的延伸引物分离，从而阻止其随后的捕获和纯化。当选择者核苷酸是核糖核苷酸时，当扩增子仍是双链时，在其5'侧切割的酶可以是RNase H2；或者，如果变性为单链状态，则使用核糖核酸酶I，它会在核糖核苷酸的3'侧进行切割。氢氧化钠在加热下也可用于切割核糖核苷酸的3'侧；
图10B：相反，说明如果选择者引物中的单个核糖核苷酸与模板(本实施例中的WT等位基因)错配，则校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性通过错配消化退火的引物，并且消除单个残基核糖核苷酸；当截短的引物延伸到突变位点上时，使用正确的脱氧核糖核苷酸(即与突变体匹配的脱氧核糖核苷酸)。请注意，该位点的任何替代等位基因或任何突变体都可能与野生型核糖核苷酸不匹配，因此对于所有替代等位基因或突变体，将从与WT等位基因结合的引物中除去单残基错配核糖核苷酸，并在截短的引物延伸到突变位点上时用特定突变的正确(脱氧核糖核苷酸)匹配替换。选择者引物中单个残基核糖核苷酸的丢失使得掺入的(退火的)引物序列抵抗由核糖核酸酶或依赖于选择者核苷酸存在的任何其他处理的移除。由于捕获部分保持附着，因此可以优先捕获(或物理分离)或随后优先扩增延伸的引物。选择者引物不会引入任何突变体序列。随后分析检测到的每个突变体序列都通过了两次质量检查：首先，通过导致单个残基核糖核苷酸被移除的杂交错配来检测突变体；核糖核苷酸的丢失表明存在替代等位基因或突变体；其次，高度准确的聚合酶以高保真度复制替代等位基因或突变位点，通过测序(或其他方法，例如引物延伸或杂交)揭示替代等位基因或突变体的同一性。
图11以图形方式显示了使用本文提供的示例性方法的结果，其展示了示例性单个选择者引物(在这种情况下，选择者核苷酸对KRAS c.35是特异性的)可以检测在该位点发生的三种突变中的任何一种；将完全相同的母混合物应用于三种不同模板中的每一种，并且在每种情况下，KRAS c.35选择者引物检测到正确的突变，无论是KRAS c.35G>A突变体(对应于G12D氨基酸变化)；c.35G>T突变体(G12V氨基酸)；或c.35G>C突变体(G12A氨基酸)，存在突变；所有这三种突变在结肠癌中经常发生突变，并在胰腺癌和肺癌中出现。
图12以图形方式显示了使用本文提供的示例性方法的结果，证明示例性选择者引物(在这种情况下，选择者核苷酸对EGFR c.2573T具有特异性，其T>G突变导致EGFRp.L858R突变)可以低至0.1％的频率检测突变体G等位基因；以红色标出的无阴影柱等于野生型信号的五倍；即使突变体等位基因频率为0.1％，突变信号也大大超过野生型值的5倍。
图13显示了使用本文提供的示例性方法的结果，证明示例性选择者引物(在这种情况下，选择者核苷酸对EGFR c.2236G具有特异性，其c.2236_2250缺失突变导致EGFRp.E746_A750del突变)可以低至0.1％的频率检测突变体缺失；以红色标出的无阴影柱等于野生型信号的五倍；即使突变体等位基因频率为0.1％，突变信号也大大超过野生型值的5倍。
图14显示了使用本文提供的示例性方法的结果，证明示例性选择者引物(在这种情况下，选择者核苷酸对KRAS c.37具有特异性，其G>T突变导致KRAS p.G13C突变)可以低至0.02％的频率检测突变体T等位基因，相当于在10,000个野生型分子中发现两个突变分子。
图15显示了使用本文提供的示例性方法的结果，证明了示例性选择者引物(在这种情况下，选择者核苷酸对KRAS c.38具有特异性，其G>A突变导致KRAS p.G13D突变)将不需要的信号抑制至“可调”水平的能力；与选择者引物相同的引物，除了它包含代替选择者核苷酸(在这种情况下，核糖核苷酸)的正常脱氧核糖核苷酸，与选择者引物以各种混合物使用，范围从0％选择者引物(此处称为点抑制(PointSuppressor)引物或PSP)，即，直至100％选择者引物；当不使用选择者引物时，野生型G序列的扩增占主导地位；随着选择者引物百分比的增加，突变体A等位基因被更大程度地扩增。
各个附图中相同的附图标记表示相同的元件。
详细说明
在替代实施方案中，提供了核酸扩增方法，其可以针对特定等位基因进行选择，同时不干扰靶序列(例如基因组中的靶序列)内的特定核苷酸位置处的任何替代等位基因或突变的扩增或修复。在替代实施方案中，提供了用于抑制野生型序列同时扩增点突变(包括单核苷酸变体、插入和缺失)的核酸扩增方法；就cDNA而言，还包括融合体。
在替代实施方案中，提供了“可调谐”的方法，这意味着不需要的等位基因可以被抑制(在扩增或修复过程中)10或100倍或任何期望的量，这减少了无信息读取的数量，从而提高了通量，降低了每个样本的成本，并且由于减少了对测序空间的竞争，增强了对所需目标的检测。
在替代实施方案中，本文提供的方法能够允许一些无信息的读数，这是独特的并且允许内部对照证明测定有效(与当样品中不存在替代等位基因或突变体时“无结果”相反)并且还可以充当定量的内部标准。
在替代实施方案中，本文提供的方法可以与任何基于引物的方法一起使用，并且通过使用本文提供的方法，不将变体序列引入扩增反应中。举例来说，如果要寻找体细胞突变，野生型等位基因可能是G，并且可能的突变体等位基因是A、C和T；通过使用本文提供的扩增方法，含G的读数将被减少(例如，100倍)而不减少突变体读数，并且任何可能的突变体将通过相同的单一引物被扩增。野生型读数的数量显著减少，使得突变体读数更有可能被测序和检测(如果存在)，并且如果它们不存在，野生型读数的设定数量可确保反应有效。
在替代实施方案中，本文提供的方法可以具有优于现有方法的明显优点，包括从不引入含有检测上感兴趣的序列的引物；仅在以下情况下才检测到突变体：
(1)选择者引物和突变模板之间的错配被校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性识别并消除，和
(2)如果高保真聚合酶复制突变模板。
相反，等位基因特异性扩增引入了检测上感兴趣的变异序列，这可能导致假阳性。
在替代实施方案中，本文提供的方法可以具有单个引物检测特定核苷酸位置处的任何变体的优点。相比之下，等位基因特异性PCR需要针对每个等位基因变体或突变的特异性引物；例如，参见van Mansfeld AD,Bos JL.PCR-based approaches for detection ofmutated ras genes.PCRMethods Appl.1992May；1(4):211-6；Darawi,M.N.,Ai-Vyrn,C.,Ramasamy,K.等人，Allele-specific polymerase chain reaction for the detectionof Alzheimer’s disease-related single nucleotide polymorphisms.BMC Med Genet14,27(2013)；Lang AH,Drexel H,Geller-Rhomberg S,等人，Optimized allele-specificreal-timePCRassays for the detection of common mutations in KRAS and BRAF.JMol Diagn.2011；13(1):23-28；Dobosy JR,Rose SD,等人，(2011)RNase H-dependentPCR(rhPCR):improved specificity and single nucleotide polymorphism detectionusing blocked cleavable primers.BMC Biotechnol,11:80。
核酸扩增
在替代实施方案中，提供了方法，包括使用DNA扩增技术例如聚合酶链式反应(PCR)或其他基于引物的扩增方法。
用于实践DNA扩增技术的任何已知方案或材料(包括设备或酶)可以用于实践本文提供的方法，包括例如使用具有5'至3'延伸活性且具有3'至5'核酸外切酶活性的校对酶，和/或具有5'至3'延伸活性的DNA聚合酶和具有3'至5'核酸外切酶活性的酶。用于实践本文提供的方法的聚合酶链式反应的标准材料和方法可以见于例如：Dieffenbach andDveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,and in McPherson at al.(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第一版,Springer Verlag,Germany。
下面两个表中示出了示例性PCR方案，第一个表示出了反应设置，第二个表示出了循环条件：
正如本领域技术人员所知，可以使用多种DNA浓度。同样，引物浓度也可以变化。可以使用任何来源的阿比火球菌RNase H2和/或其他热稳定性RNase H2酶。可以使用来自其他来源的热稳定性校对DNA聚合酶，包括但不限于来自New England Biolabs的HOTSTART HIGH-/>DNAPolymerase和来自ThermoFisher的PLATINUM SUPERFI/>DNAPolymerase-高保真PCR酶。
以下是循环条件的一般示例性条件，并不旨在限制扩增的实践：变性温度在94℃至98℃范围内，时间在10秒至30秒范围内；退火温度在55℃至72℃范围内，持续5秒至30秒；延伸温度在55℃至72℃或更高范围内，每千个碱基待扩增DNA延伸15秒至30秒。可用于实践本文提供的方法的PCR方法的一般讨论可见于例如维基百科(https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction，或ValonesMA、RL、/>LA、de SouzaPR、de Albuquerque Tavares Carvalho A、Crovela S.Principles and applications ofpolymerase chain reaction in medical diagnostic fields:a review.Braz JMicrobiol.2009；40(1):1-11；Garibyan L,Avashia N.Polymerase chainreaction.JInvest Dermatol.2013；133(3):1-4；Dieffenbach CW,Lowe TM,DvekslerGS.General concepts for PCR primer design.PCR Methods Appl.1993Dec；3(3):S30-7)。IDT网站(https://www.idtdna.com/pages/products/qpcr-and-pcr/master-mixes-reag ents/rnase-h-enzyme)上提供了使用RNase H2酶的示例性条件，并且也包含在Dobosy JR、Rose SD等人中(2011)RNase H-dependent PCR(rhPCR):improvedspecificity and single nucleotide polymorphism detection using blockedcleavable primers,BMC Biotechnol,11:80。可用于实践本文提供的方法的示例性酶包括例如Phusion Hot Start/>一种可商购的热稳定性DNA聚合酶，是可获得的并且可用于实践本文提供的方法的许多酶之一，参见例如Ishino S、Ishino Y、DNAIshino S,IshinoY,DNA polymerases as useful reagents for biotechnology-the history ofdevelopmental research in the field,Front Microbiol.2014Aug29；5:465)。PhusionHot Start/>的示例条件可通过ThermoFisher网站(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F549L#/F549L)获取。
在替代实施方案中，提供了包括使用数字PCR的方法，参见例如MorleyAA.Digital PCR:A brief history.Biomol Detect Quantif.2014Aug 15；1(1):1-2，或数字PCR或dPCR，包括例如Droplet Digital PCR(ddPCR)，用于本文提供的方法，例如用于产生感兴趣的扩增子，或用于产生新的延伸DNA多核苷酸；本文提供的方法可以使用本领域已知的任何方法来实施，例如USPN 9,797,007中描述的方法。
合成核酸
在替代实施方案中，提供了包含至少单个核糖核苷酸残基(称为选择者核苷酸)的合成的DNA多核苷酸，所述核糖核苷酸残基可以位于相对于合成的DNA多核苷酸(或选择者核苷酸)的3'端的第一(最后)、第二(倒数第二)、第三(倒数第三)、第四(倒数第四)、第五(倒数第五)或第六(倒数第五前一个)位置处，并且在替代实施方案中，在合成的DNA多核苷酸中包含第二或第三或额外的核糖核苷酸残基。
在替代实施方案中，选择者多核苷酸在扩增方法中用作引物，能够选择特定等位基因的扩增，同时不干扰靶序列内特定核苷酸位置处的任何替代等位基因或突变的扩增或修复。选择者多核苷酸的设计、组成和制造基于要抑制的等位基因。举例来说，如果对人类癌基因KRAS中c.38处发生的单核苷酸突变感兴趣，则将创建与野生型序列完美匹配并且在对应于感兴趣位点的位置处包含单个核糖核苷酸的嵌合DNA/RNA多核苷酸。参照图1，显示的所有序列都与野生型序列相同，包括每个序列中红色和下划线的核苷酸(这是选择者核苷酸并且是序列中唯一的核糖核苷酸)。选择者核苷酸可以位于图1所示的任何位置，尽管最终位置不是优选的，并且距离3'端更远的位置有时也可以用作选择者核苷酸。参照图3，选择者多核苷酸可以具有多种长度，包括但不限于所描述的长度。图9显示了使用图1中列出的选择者多核苷酸获得的结果。在热稳定性RNase H2存在的情况下，所有选择者多核苷酸均能有效抑制或部分抑制在位置38(箭头标记)处含有野生型“G”的序列的扩增，同时不干扰突变体“A”信号(在本例中)。
如实施例中所述，还可以完成用于抑制野生型序列而不干扰其他替代物(包括但不限于缺失、插入以及在cDNA的情况下的融合)的检测的选择者多核苷酸的设计、组成和制造。由于抑制是基于待抑制的等位基因的序列，因此本领域技术人员可以完成替代设计。
核酸测序
在替代实施方案中，提供了方法，其中通过DNA测序确定扩增子或新延伸的DNA多核苷酸的序列，任选地使用包括使用Sanger测序或下一代测序(NGS)、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔DNA测序、可逆终止化学(例如，SOLEXA技术(Illumina))、组合探针锚定合成(cPAS)、质谱测序或大规模并行特征测序(MPSS)或其任何等同物或其任何组合的方法。
本领域已知的任何测序方法均可以用于对通过本文提供的方法产生的扩增子或新的延伸的DNA多核苷酸进行测序。
制造产品和试剂盒
提供了用于实践本文所提供的方法的制造产品和试剂盒；任选地，制造产品和试剂盒还可以包含用于实践本文所提供的方法的说明书。
上述方面和实施例中的任何一个都可以与本文在概述、附图和/或详细说明部分中公开的任何其他方面或实施例组合。
如本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。
除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“或”应理解为包括性的并且涵盖“或”和“和”两者。
除非具体说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。大约可以理解为规定值的20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
除非具体说明或从上下文显而易见，否则本文所用的术语“基本上全部”、“基本上大部分”、“基本上全部”或“大部分”涵盖组合物参考量的至少约90％、95％、97％、98％、99％或99.5％或更多。
本文引用的每个专利、专利申请、出版物和文件的全部内容均通过引用并入本文。引用上述专利、专利申请、出版物和文件并不表示承认前述任何内容是相关现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。单独引用这些文件不应被解释为断言或承认任何文件内容的任何部分被认为是满足专利申请的任何国家或地区法定公开要求的基本材料。尽管如此，保留在适当情况下依赖任何此类文件来提供审查机构或法院认为对所主张主题至关重要的材料的权利。
在不脱离本发明的基本方面的情况下，可以对前述内容进行修改。尽管已经参考一个或多个具体实施例对本发明进行了相当详细的描述，但是本领域的普通技术人员将认识到，可以对本申请中具体公开的实施例进行改变，并且这些修改和改进仍然在本发明的范围和精神之内。本文适当地说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何元件的情况下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个可以用其他两个术语中的任一个代替。因此，所使用的术语和表达被用作描述术语而不是限制，不排除示出和描述的特征或其部分的等同物，并且认识到在本发明的范围内可以进行各种修改。本发明的实施例在所附权利要求中阐述。
将参照本文描述的实施例进一步描述本发明；然而，应当理解，本发明不限于这些实施例。
实施例
除非实施例中另有说明，所有重组DNA技术均根据标准方案进行，例如，如中所述Sambrook等人，(2012)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第四版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY以及Ausubel等人.(1994)Current Protocols inMolecular Biology,Current Protocols,USA的第1册和第2册。标准分子生物学技术的其他参考资料包括Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,Brown(1998)Molecular BiologyLabFax,第二版,Academic Press(UK)的第I和II册。聚合酶链反应的标准材料和方法可见于Dieffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,以及McPherson等人，(2000)PCR-Basics:From Background toBench,第一版,Springer Verlag,Germany。
在替代实施方案中，实施例中指出的差异通过测序、杂交、质谱或可以检测序列变化的任何其他技术(包括具有核苷酸分辨率的那些技术)来检测。
实施例1：抑制一个等位基因，同时扩增任何替代等位基因
该实施例描述并展示了本文提供的示例性方法用于选择性抑制一个等位基因同时扩增任何替代等位基因的功效。该实施例还描述并证明了用于抑制野生型序列同时扩增点突变的示例性方法的功效。
在替代性实施方案中，本文提供的示例性方法包括抑制编码位置35处的野生型“G”核苷酸(在本实施例中，KRAS c.35)的KRASDNA的指数扩增，同时允许该位置处可能的三种突变中的任何突变的指数扩增。该位置的突变是最常见的致癌KRAS突变，约占KRAS密码子12和13点突变的65％。所使用的选择者引物将在倒数第三的位置包含“G”核糖核苷酸(riboG或rG)，与野生型模板完美匹配，并通过校对DNA聚合酶进行延伸。由于新形成的双链体DNA保留了riboG，反应中存在的热稳定性核糖核酸酶H2(TS RNase H2)在核糖核苷酸的5’侧进行切割，并分离大部分引物序列；指数扩增被抑制。相比之下，编码c.35G>A(p.G12D)突变；或c.35G>T(p.G12V)突变；或c.35G>C(p.G12A)突变的模板与倒数第三个位置的选择者引物不匹配，导致校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性通过错配消化引物，并且在引物延伸至突变位点之前消除核糖核苷酸。核糖核苷酸的丢失使得掺入的引物序列抵抗核糖核酸酶的移除。返回引物在掺入的(即部分消化，然后延伸)第一引物上复制，并且任何突变序列均呈指数扩增。
可以用于本文提供的方法中的校对DNA聚合酶的非限制性实例包括Phusion HotStart IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，cat.#F549L)；Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，目录号#M0493L)；和PlatinumSuperFi IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，目录号#12361050)。可以用于本文提供的方法中的热稳定性核糖核酸酶H2的非限制性实例是RNase H2酶(IDT，目录号#11-03-02-03)。
该示例性方法与现有方法相比包括明显的优点，包括从不引入含有检测上感兴趣的序列的引物；仅在以下情况下才检测到突变体：1.选择者引物和突变模板之间的错配被校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性识别并移除，以及2.如果高保真聚合酶在突变模板上复制。相反，等位基因特异性扩增引入了检测上感兴趣的变异序列，这可能导致假阳性。另一个优点是单个引物可以检测特定核苷酸位置上的任何变体；相反，等位基因特异性PCR需要针对每个等位基因变体或突变的特定引物。
实施例2：抑制野生型序列，同时扩增DNA缺失
该实施例展示了抑制野生型DNA扩增同时扩增包含缺失的模板的示例性方法。
在替代实施方案中，本文提供的示例性方法包括抑制野生型表皮生长因子受体(EGFR)DNA的指数扩增，同时允许具有框内缺失(inframe deletion)c.2235_2249del(p.E746_A750del)的DNA指数扩增。框内缺失约代表了癌症中所有EGFR突变的41％，这种特殊突变是最常见的突变之一。
选择者引物的3’端以GAA结尾，在倒数第三个位置包含“G”核糖核苷酸(riboG或rG)，与编码氨基酸位置746处的谷氨酸残基的野生型EGFR密码子完美匹配。由于新形成的双链体DNA保留了riboG，因此反应中存在的热稳定性核糖核酸酶H2(TS RNase H2)在核糖核苷酸的5'侧进行切割并分离大部分引物序列，导致指数扩增受到抑制。
相反，c.2235_2249del(p.E746_A750del)缺失的模板与倒数第三个位置的选择者引物不匹配，导致校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性通过错配消化引物，并且在引物延伸到突变位点之前消除核糖核苷酸。核糖核苷酸的丢失使得掺入的引物序列抵抗核糖核酸酶的移除。返回引物在掺入的(即部分消化，然后延伸)第一引物上复制，并且任何突变序列均呈指数扩增。
可以用于实践本文提供的方法的校对聚合酶的非限制性实例包括Phusion HotStart IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，cat.#F549L)；Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，目录号#M0493L)；和PlatinumSuperFi IIDNA Polymerase(ThermoFisher Scientific，目录号#12361050)。可以用于本文提供的方法中的热稳定性核糖核酸酶H2的非限制性实例是RNase H2酶(IDT，目录号#11-03-02-03)。
该示例性方法与现有方法相比具有明显的优点，包括从不引入含有检测上感兴趣的序列的引物；相反，等位基因特异性扩增引入了检测上感兴趣的变异序列，这可能导致假阳性。另一个优点是单个引物可以检测特定核苷酸位置上的任何变体；相反，等位基因特异性PCR需要针对每个等位基因变体或突变的特定引物。
实施例3：抑制野生型序列，同时扩增DNA插入
该实施例展示了抑制野生型DNA扩增同时扩增含有插入片段的模板的示例性方法。
一个非限制性实例是抑制野生型EGFRDNA的指数扩增，同时允许具有c.2300_2308dup(p.A767_V769dup)插入的DNA指数扩增。这种插入是重复的，具有这种插入的患者通常对第一代和第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性降低。选择者引物的3'端以ACA结尾，在倒数第三个位置包含“A”核糖核苷酸(riboA或rA)，与编码氨基酸位置770处天冬氨酸残基的野生型EGFR密码子完美匹配。由于新形成的双链体DNA保留了riboA，因此反应中存在的热稳定核糖核酸酶H2(TS RNase H2)在核糖核苷酸的5'侧进行切割并分离大部分引物序列；指数扩增被抑制。相反，包含c.2300_2308dup(p.A767_V769dup)插入的模板与倒数第三个位置的选择者引物不匹配，导致校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性通过错配消化引物，并且在引物延伸到突变位点之前消除核糖核苷酸。核糖核苷酸的丢失使得掺入的引物序列抵抗核糖核酸酶的移除。返回引物在掺入的(即部分消化，然后延伸)第一引物上复制，并且任何突变序列均呈指数扩增。
可以用于实践本文提供的方法的校对聚合酶的非限制性实例包括Phusion HotStart IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，cat.#F549L)；Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，目录号#M0493L)；和PlatinumSuperFi IIDNA Polymerase(ThermoFisher Scientific，目录号#12361050)。可以用于本文提供的方法中的热稳定性核糖核酸酶H2的非限制性实例是RNase H2酶(IDT，目录号#11-03-02-03)。
该示例性方法与现有方法相比具有明显的优点，包括从不引入含有检测上感兴趣的序列的引物；相反，等位基因特异性扩增引入了检测上感兴趣的变异序列，这可能导致假阳性。另一个优点是单个引物可以检测特定核苷酸位置上的任何变体；相反，等位基因特异性PCR需要针对每个等位基因变体或突变的特定引物。
实施例4：抑制野生型cDNA序列，同时扩增编码融合蛋白的cDNA
该实施例展示了抑制野生型cDNA扩增同时扩增编码融合蛋白的模板的示例性方法。
一个非限制性的例子是抑制野生型棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)的指数扩增，同时允许编码EML4-ALK融合蛋白(ALK代表间变性淋巴瘤激酶，也称为ALK酪氨酸激酶受体或CD246)的cDNA指数扩增。EML4-ALK融合蛋白已在非小细胞肺癌(NSCLC)中发现，并且是克唑替尼(Crizotinib)等靶向治疗的靶标。首先制备cDNA，然后使用3'端带有GTG序列的选择者引物进行扩增，其中倒数第三个“G”是核糖核苷酸(riboG或rG)，并与野生型EML4序列完美匹配。由于新形成的双链体DNA保留了riboG，反应中存在的热稳定性核糖核酸酶H2(TSRNase H2)在核糖核苷酸的5’侧进行切割，并分离大部分引物序列；指数扩增被抑制。相反，EML4-ALK融合模板与倒数第三个位置的选择者引物不匹配，导致校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性通过错配消化引物，并且在引物延伸到突变位点之前消除核糖核苷酸。核糖核苷酸的丢失使得掺入的引物序列抵抗核糖核酸酶的移除。返回引物在掺入的(即部分消化，然后延伸)第一引物上复制，并且任何突变序列均呈指数扩增。校对聚合酶的非限制性实例包括Phusion Hot Start IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，cat.#F549L)；Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，目录号#M0493L)；和Platinum SuperFi IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，目录号#12361050)。
可以用于实践本文提供的方法的热稳定核糖核酸酶H2的非限制性实例是RNaseH2酶(IDT，目录号#11-03-02-03)。用于从可用于实践本文提供的方法的mRNA模板制备cDNA的逆转录酶的非限制性实例是SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase(ThermoFisherScientific，目录号#18080085)。
该示例性方法与现有方法相比具有明显的优点，包括从不引入含有检测上感兴趣的序列的引物；相反，等位基因特异性扩增引入了检测上感兴趣的变异序列，这可能导致假阳性。
实施例5：抑制一个等位基因，同时扩增任何替代等位基因：应用于确定修饰或未
修饰的核苷酸状态
该实施例展示了用于抑制一个等位基因的扩增同时扩增该核苷酸位置处存在的任何替代等位基因的示例性方法，特别是当基于核苷酸修饰的存在或不存在而创建一个或另一个等位基因时。非限制性实例是当未修饰的胞嘧啶核苷酸变成脱氧尿苷(dU)而甲基化或羟甲基化的胞嘧啶没有改变时。
一个非限制性的例子是使用在倒数第三个位置包含“G”核糖核苷酸(riboG或rG)的选择者引物，它与处理模板完美匹配(其在互补位置仍然是“C”，因为它被修饰，因此没有改变)，并通过校对酶进行延伸。由于新形成的双链体DNA保留了riboG，反应中存在的热稳定性核糖核酸酶H2(TS RNase H2)在核糖核苷酸的5’侧进行切割，并分离大部分引物序列；指数扩增被抑制。相反，在“C”已改变为“dU”的处理模板中，倒数第三个位置的选择者引物不匹配，导致校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性通过错配消化引物，在引物延伸到“dU”位点(其与“A”配对)之前，核糖核苷酸被消除。核糖核苷酸的丢失使得掺入的引物序列抵抗核糖核酸酶的移除。返回引物在掺入的(即部分消化，然后延伸)第一引物上复制，并且“dU”序列呈指数扩增(在扩增过程中变为“T”)。
一个非限制性的例子将是上述的相反情况，其中选择者引物现在在倒数第三个位置包含“A”核糖核苷酸(riboA或rA)，与处理模板完美匹配(其在互补位置变成“dU”，因为它未经修饰并因此改变)，并且通过校对酶延伸。由于新形成的双链体DNA保留了riboA，因此反应中存在的热稳定性核糖核酸酶H2(TS RNase H2)在核糖核苷酸的5'侧进行切割，并分离大部分引物序列；指数扩增被抑制。相反，在“C”未改变(受修饰保护)的处理模板中，倒数第三个位置的选择者引物不匹配，导致校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性通过错配消化引物，并且在引物延伸到突变位点之前消除核糖核苷酸。核糖核苷酸的丢失使得掺入的引物序列抵抗核糖核酸酶的移除。返回引物在掺入的(即部分消化，然后延伸)第一引物上复制，并且序列呈指数扩增。
可以用于实践本文提供的方法的校对聚合酶的非限制性实例包括Phusion HotStart IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，cat.#F549L)；Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，目录号#M0493L)；和PlatinumSuperFi IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，目录号#12361050)。
该示例性方法与现有方法相比具有明显的优点，包括从不引入含有检测上感兴趣的序列的引物；相反，等位基因特异性扩增引入了检测上感兴趣的变异序列，这可能导致假阳性。
实施例6：抑制一个等位基因，同时扩增任何替代等位基因：在分子单倍型分析中
的应用
该实施例展示了用于抑制一个等位基因的扩增，同时扩增存在于核苷酸位置处的任何替代等位基因以及与替代等位基因位于相同DNA同源物上的等位基因，从而允许分子单倍型分析的示例性方法。
非限制性的例子是确定ITGA4基因中AGT单倍型的存在或不存在。ITGA4基因内的单核苷酸多态性包括c.1845G>A、c.2633A>G和c.2883C>T，单倍型AGT与心脏移植患者中抗体介导的排斥反应的发生有关。如果基因分型显示个体在两个或三个位点是杂合的，则可以使用适当杂合位点的选择者引物和位于最远端杂合位点之外的返回引物来确定单倍型。举例来说，如果DNA在c.1845处是杂合的，则选择者引物将在倒数第三个位置处包含“G”核糖核苷酸(riboG或rG)，对应于c.1845位置；返回引物将位于c.2883位置的下游。这将导致c.1845G等位基因受到抑制，同时允许c.1845A等位基因呈指数扩增。由于所使用的校对酶具有高保真度和非常低水平的链转换，因此可以确定呈指数扩增的同一DNA同源物上存在的等位基因，并找到1845ADNA同源物的单倍型。另一个同源物的单倍型可以从基因型推断出来，或者使用倒数第三个位置含有“A”核糖核苷酸(riboA或rA)的选择者引物在单独的反应中进行确认。
可以用于实践本文提供的方法的校对聚合酶的非限制性实例包括Phusion HotStart IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，cat.#F549L)；Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，目录号#M0493L)；和PlatinumSuperFi IIDNA Polymerase(ThermoFisher Scientific，目录号#12361050)。可用于实践本文提供的方法的热稳定核糖核酸酶H2的非限制性实例是RNase H2酶(IDT，目录号#11-03-02-03)。
该示例性方法与现有方法相比具有明显的优点，包括从不引入含有检测上感兴趣的序列的引物；相反，等位基因特异性扩增引入了检测上感兴趣检测的变异序列，这可能导致假阳性。另一个优点是单个引物可以检测特定核苷酸位置上的任何变体；相反，等位基因特异性PCR需要针对每个等位基因变体或突变的特定引物。
实施例7：部分抑制一个等位基因，同时扩增任何替代等位基因
该实施例展示了部分抑制一个等位基因的扩增同时扩增该核苷酸位置处存在的任何替代等位基因的示例性方法。这也可以应用于野生型序列的部分抑制，同时扩增点突变。对于后一种情况，通过仅部分抑制野生型的扩增而不干扰任何突变体的扩增，可以实现两种结果：1.如果不存在突变体，则野生型的部分扩增提供了内部对照，其确认整个反应有效；和2.通过控制野生型的抑制水平，提供内部标准，可以将突变体(如果存在)的扩增水平与其进行比较。
一个非限制性的例子是部分抑制编码位置35处的野生型“G”核苷酸的KRASDNA的指数扩增，同时允许该位置处可能的三种突变中的任何一种的指数扩增。选择者引物将在倒数第三个位置包含“G”核糖核苷酸(riboG或rG)，与野生型模板完美匹配，并通过校对酶进行延伸。以预定量与选择者引物混合的将是与选择者引物相同的对应物，除了倒数第三个位置处的“G”不是核糖核苷酸，而是正常的脱氧核糖核苷酸。新形成的保留riboG的双链体DNA会被反应中存在的耐热核糖核酸酶H2(TS RNase H2)切割，从而分离大部分引物序列；指数扩增被抑制。然而，新形成的含有选择者引物对应物的双链体DNA(即，在选择者核苷酸位置含有正常脱氧核苷酸对应物的引物)不会被切割，并且整个引物被保留。野生型的指数扩增将仅被部分抑制。编码c.35G>A(p.G12D)突变；或c.35G>T(p.G12V)突变；或c.35G>C(p.G12A)突变的模板与倒数第三个位置的选择者引物(或其对应物)不匹配，导致校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性通过错配消化引物，并且在引物延伸至突变位点之前消除核糖核苷酸或其脱氧核糖核苷酸对应物。任何核糖核苷酸的缺失使得掺入的引物序列抵抗核糖核酸酶的移除。返回引物在掺入的(即部分消化，然后延伸)第一引物上复制，并且任何突变序列均呈指数扩增。
可以用于实践本文提供的方法的校对聚合酶的非限制性实例包括Phusion HotStart IIDNAPolymerase(ThermoFisher Scientific，cat.#F549L)；Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，目录号#M0493L)；和PlatinumSuperFi IIDNA Polymerase(ThermoFisher Scientific，目录号#12361050)。可以用于实践本文提供的方法的热稳定核糖核酸酶H2的非限制性实例是RNase H2酶(IDT，目录号#11-03-02-03)。
该示例性方法与现有方法相比具有明显的优点，包括从不引入含有检测上感兴趣的序列的引物；仅在以下情况下才检测到突变体：1.选择者引物和突变模板之间的错配被校对聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性识别并消除，以及2.如果高保真聚合酶在突变模板上复制。相反，等位基因特异性扩增引入了检测上感兴趣的变异序列，这可能导致假阳性。另一个优点是单个引物可以检测特定核苷酸位置上的任何变体；相反，等位基因特异性PCR需要针对每个等位基因变体或突变的特定引物。本实施例中描述的并且适用于其他实施例以及大体上适用于本文提供的所有方法的另一个优点是能够允许特定等位基因或野生型的设定量的扩增，所述特定等位基因或野生型用作证明反应已经起作用的内部对照；并作为内部标准，可以与替代等位基因或突变体的扩增水平(如果存在)进行比较。
已经描述了本发明的多个实施例。然而，可以理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其他实施例在所附权利要求的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 瑞红德西公司（RhoDx, Inc.）
<120> 用于选择性扩增等位基因的合成多核苷酸和方法
<130> GREE313-23P8
<140> to be assigned
<141> 2022-02-02
<150> 63/144,723
<151> 2021-02-02
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 1
aggcctgctg aaaatgactg aatataaact tgtggtagtt ggagctggtg g 51
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 2
ggcctgctga aaatgactga atataaactt gtggtagttg gagctggtgg c 51
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 3
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<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 4
cctgctgaaa atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg t 51
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 5
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctggtggcgt a 51
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 6
tgctgaaaat gactgaatat aaacttgtgg tagttggagc tggtggcgta g 51
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 7
gcctgctgaa aatgactgaa tataaacttg tggtagttgg agctggtgrg cg 52
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 8
gtagttggag ctggtgrgcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 9
cttgtggtag ttggagctgg tgrgcg 26
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 11
gactgaatat aaacttgtgg tagttggagc tggtgrgcg 39
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 12
gcctgctgaa aatgactgaa tataaacttg tggtagttgg agctggtgrg cg 52
<210> 13
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 13
tattataagg cctgctgaaa atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtgrgc 60
g 61
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 14
tattataagg cctgctgaaa atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg 60
Claims (35)
1.一种合成的DNA多核苷酸(称为选择者多核苷酸)，其包含至少单个残基(称为选择者核苷酸)，所述残基位于相对于3’端的第一(最后)、第二(倒数第二)、第三(倒数第三)、第四(倒数第四)、第五(倒数第五)或第六(倒数第五前一个残基)位置，或者位于距离3’端更远的位置，
其中所述至少单个残基选择者核苷酸在结构上或化学上不同于选择者多核苷酸的区域或部分内的选择者多核苷酸与靶核酸结合所必需的任何其他残基，和
合成的DNA多核苷酸(称为选择者多核苷酸)具有能够：通过DNA聚合酶延伸的3'端，或加工成具有能够通过DNA聚合酶延伸的3’端。
2.根据权利要求1所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述单个选择者核苷酸残基位于所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的从3’端起的第二个位置或倒数第二个位置。
3.根据权利要求1所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述单个选择者核苷酸残基位于所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的从3’端起的第三个位置，或倒数第三个位置。
4.根据权利要求1所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述单个选择者核苷酸残基位于所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的3’端的第一个位置或最终位置。
5.根据权利要求1所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述单个选择者核苷酸残基位于所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的从3’端起的第四个位置，或倒数第四个位置。
6.根据权利要求1所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述单个选择者核苷酸残基位于所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的从3'端起的第五个位置，或前倒数第五个位置。
7.根据权利要求1所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述单个选择者核苷酸残基位于所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的从3’端起的第六个位置，或位于倒数第五个位置之前的一个残基。
8.根据权利要求1至7或前述权利要求中任一项所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述选择者核苷酸是核糖核苷酸。
9.根据权利要求1至8或前述权利要求中任一项所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述选择者核苷酸包含至少一种核糖核苷酸或由至少一种核糖核苷酸组成。
10.根据权利要求1至9或前述权利要求中任一项所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述选择者核苷酸包含至少一种合成或非天然核苷酸或由至少一种合成或非天然核苷酸组成。
11.一种用于区分第一核酸序列与第二核酸序列的核酸扩增方法，其中第一和第二核酸位于相同的扩增反应混合物中，包括：
(a)提供或已提供了权利要求1至10中任一项所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在其中含有选择者核苷酸残基(任选地单个选择核糖核苷酸残基)；
(b)提供或已提供了DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸，其中任选地DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸包含或衍生自基因组(任选地细胞、微生物或病毒基因组)、cDNA文库或基因组文库，并且任选地所述基因组、cDNA文库或基因组文库衍生自真核生物或原核生物、植物或哺乳动物(任选地人类)、微生物(任选地细菌、藻类、原生生物、古细菌或真菌)或病毒或噬菌体；
(c)使合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸接触、退火或杂交，其中在合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸中的互补序列或基本上互补的序列退火或特异性杂交的条件下，所述DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸充当合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的模板(模板DNA多核苷酸)，从而产生核酸双链体；
其中合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在选择者核苷酸残基(任选地单个选择核糖核苷酸残基)的位置处与模板DNA多核苷酸配对(参见例如图2A)，或者在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置处不与模板DNA多核苷酸配对(参见例如图2B)；
(d)在其中DNA聚合酶和/或具有5'至3'延伸活性的聚合酶和具有3'至5'核酸外切酶活性的酶是具有酶促活性的条件下，使双链体与具有5'至3'延伸活性的DNA聚合酶和/或具有5'至3'延伸活性的DNA聚合酶和具有3'至5'核酸外切酶活性的酶接触，
其中：
(i)选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)在合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸之间不匹配，并且3'至5'核酸外切酶活性导致从3'端酶促移除合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分，包括选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)和选择者核苷酸在DNA聚合酶将合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的剩余部分延伸成不保留选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的新的延伸DNA多核苷酸之前的所有3'所有核苷酸；或者
(ii)DNA聚合酶延伸在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)处与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸碱基配对的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，而不移除选择者核苷酸(任选地单个核糖核苷酸残基)，从而将合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)保留或掺入新的延伸的DNA多核苷酸中；和
(e)使新产生的核酸双链体与核糖核酸酶接触，其中任选地核糖核酸酶是热稳定的，其中在热稳定核糖核酸酶有活性的条件下，热稳定核糖核酸酶是热稳定核糖核酸酶H2酶，
其中：
(i)如果选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)已被反应中存在的3'至5'外切核酸酶活性移除，则位于单个选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)5'处的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分保留在延伸的合成多核苷酸内；或
(ii)如果选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)保留在延伸的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)中并且与脱氧核糖核苷酸残基匹配，则热稳定性核糖核酸酶在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)处切割，从而分离位于选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)5’的延伸的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分，
其中保留合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)5'处的部分的延伸的合成的DNA多核苷酸(或延伸的选择者多核苷酸)会指数扩增，并且其中具有在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)5’处的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分从不能指数扩增的分离的延伸合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)中分离，因此它们的扩增被选择性抑制，从而将第一核酸序列与第二核酸序列区分开。
12.一种用于区分第一核酸序列与第二核酸序列的核酸扩增方法，其中所述第一和第二核酸位于相同的扩增反应混合物中，包括：
(a)提供或已提供权利要求1至10中任一项所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，其中所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在其中含有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)；
(b)提供或已提供DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸，其中任选地该DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸包含或衍生自基因组(任选地细胞、微生物或病毒基因组)、cDNA文库或基因组文库，并且任选地该基因组、cDNA文库或基因组文库衍生自真核生物或原核生物、植物或哺乳动物(任选地人类)、微生物(任选地细菌、藻类、原生生物、古细菌)或真菌)或病毒或噬菌体；
(c)使合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸接触、退火或杂交，其中在合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸中的互补序列或基本上互补的序列退火或特异性杂交的条件下，所述DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸充当合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的模板(模板DNA多核苷酸)，从而产生核酸双链体；
其中合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置处与模板DNA多核苷酸配对(参见例如图10A)，或者在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置处不与模板DNA多核苷酸配对(参见例如图10B)；
(d)在DNA聚合酶和/或具有5'至3'延伸活性的聚合酶和具有3'至5'核酸外切酶活性的条件下，使核酸双链体与具有5'至3'延伸活性的DNA聚合酶和/或具有5'至3'延伸活性的DNA聚合酶和具有3'至5'核酸外切酶活性的酶接触。具有酶活性，
其中：
(i)选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)在合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸之间不匹配，并且3'至5'核酸外切酶活性导致从3'端酶促移除合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的部分，包括选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)和选择者核苷酸3'之前的所有核苷酸。DNA聚合酶将合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的剩余部分延伸成不保留选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的新的延伸DNA多核苷酸；或者
(ii)DNA聚合酶延伸在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)处与DNA多核苷酸或多个DNA多核苷酸碱基配对的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)，而不移除选择者核苷酸(任选地单个核糖核苷酸残基)，从而将合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)的选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)保留或掺入新的延伸的DNA多核苷酸中；和(e)扩增后，用试剂或酶处理扩增子(或新延伸的合成的DNA多核苷酸或选择者多核苷酸)，所述试剂或酶在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的5’或3’侧切割，或者在存在时在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的三个核苷酸内切割，
其中任选地，试剂或酶将结合部分或大量掺入的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物从保留了选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的扩增子(或新延伸的DNA多核苷酸)上分离，从而允许不具有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)并因此保留结合部分或大量掺入的合成的DNA多核苷酸(或选择器多核苷酸)的扩增子或新延伸的DNA多核苷酸，优先捕获(或物理分离)或随后优先扩增。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中用于在所述单一选择者核糖核苷酸的5’侧进行切割的试剂是核糖核酸酶H2。
14.根据权利要求12所述的方法，其中在热存在下用于在单个选择者核糖核苷酸的3’侧进行切割的试剂是氢氧化钠。
15.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，进一步包括使所述核酸双链体变性以产生单链DNA，并且其中所述单链DNA用在所述单个选择者核糖核苷酸的3'侧切割的核糖核酸酶进行处理。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，或根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合酶和3'至5'核酸外切酶活性由不同的酶提供。
17.权利要求11至16中任一项所述的方法，或前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)是或包含用于核酸扩增方法的引物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，或根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在扩增期间，用酶处理所述延伸的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物，所述酶在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的5'或3'侧上进行切割，或者在选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的三个核苷酸内(当存在时)切割，从而将所述合成的DNA多核苷酸的一部分。或选择者多核苷酸)或引物与保留了选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的扩增子(或新延伸的DNA多核苷酸)分离，并防止合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物在扩增反应中通过返回引物的延伸而被完全复制，并且允许不具有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的扩增子通过保留足够的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物，支持指数扩增的序列而被优先扩增。
20.根据权利要求11至19中任一项所述的方法，或根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物包含核糖核苷酸并且在所述选择者核苷酸的5'侧切割的酶是核糖核酸酶H2。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述核糖核酸酶H2是热稳定的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述热稳定性核糖核酸酶H2是阿比火球菌RNaseH2。
23.权利要求11至22中任一项所述的方法，或前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包含第二合成的DNA多核苷酸或引物，其与第一合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)相同，除了选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)被相应的正常脱氧核糖核苷酸取代以产生DNA扩增引物，并且特定量的所述DNA扩增引物与含有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的第一合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)或引物混合，以便允许产生一定量的扩增子，该扩增子本应含有选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)，但现在缺乏选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)并且因此现在对由选择者核苷酸(任选地单个核糖核苷酸残基)特异的试剂或酶进行的切割具有抗性。
24.权利要求23所述的方法，其中由第二合成的DNA多核苷酸如此产生的扩增子用作内部反应对照以证明扩增有效，并用作能够与由第一合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)产生的扩增子或新延伸的DNA多核苷酸的量进行比较的内部标准。
25.根据权利要求11至24中任一项所述的方法，或根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增子或所述新延伸的DNA多核苷酸的序列通过DNA测序来确定，任选地使用包括使用Sanger测序、下一代测序(NGS)、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔DNA测序、可逆终止化学(例如，SOLEXA技术(Illumina))、组合探针锚定合成(cPAS)、质谱测序或大规模并行特征测序(MPSS)。
26.根据权利要求11至25中任一项所述的方法，或根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过引物在感兴趣位点上的延伸来确定对应于原始选择者核苷酸残基(任选地单个核糖核苷酸残基)的位置的核苷酸的同一性。
27.权利要求26所述的方法，其中感兴趣位点处的核苷酸的同一性和相对量通过使用或借助标记或通过质量来确定，并且任选地，感兴趣位点处的核苷酸的同一性和相对量通过包括跨使用合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸)产生的扩增子中的引物的单碱基延伸的方法来确定。
28.权利要求11至27中任一项的方法，或前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过定量PCR(qPCR)、数字PCR或等同物测定感兴趣的扩增子或新的延伸的DNA多核苷酸的产生。
29.一种试剂盒或制造产品，其包含用于实践前述权利要求中任一项的方法的材料、任选地酶和/或合成的DNA多核苷酸、任选地选择者多核苷酸(任选地一个或多个权利要求1至10中任一项所述的合成的DNA多核苷酸(或选择者多核苷酸))，并且任选地进一步包含用于实践权利要求11至28中任一项的方法或前述权利要求中任一项的方法的说明书。
30.一种用于诊断疾病或病症的方法，包括通过确定与所述疾病或病症相关或诊断所述疾病或病症的等位基因或基因组序列的存在或不存在来确定有需要的个体是否患有所述疾病或病症，
其中与疾病或病症相关或诊断疾病或病症的等位基因或基因组序列的存在或不存在通过使用权利要求11至28中任一项的方法或前述权利要求中任一项的方法来确定。
31.权利要求30的方法，其中所述疾病是癌症。
32.一种用于治疗、改善或预防疾病或病症的方法，包括用适用于所述疾病或病症的药物、药物组合或治疗方案来治疗有需要的个体，其中使用权利要求30或权利要求31的诊断方法将有需要的个体诊断为患有或倾向于患有所述疾病或病症。
33.权利要求32的方法，其中所述疾病是癌症，或者所述病症是遗传性疾病或遗传病症。
34.一种用于检测生物样本中稀有等位基因的存在或不存在的方法，包括使用权利要求11至28中任一项所述的方法或前述权利要求中任一项所述的方法，其中任选地所述生物样本包含或源自来自有需要的个体的活组织检查或组织或血液样品、或液体样品。
35.根据权利要求34所述的方法，其中检测所述生物样本中稀有等位基因的存在或不存在是用于非侵入性产前测试(NIPT)，或评估组织相容性或检测器官移植(任选实体器官或骨髓移植)后供体来源的核酸，或评估抗微生物耐药性(AMR)或早期检测有需要的个体中的微生物耐药性，或评估最小残留病(MRE)的存在，任选地评估骨髓消融后的MRE。
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