CN111989408A - 检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法，其特征在于，其包括：在以包含靶核酸区域的核酸为模板、使包含参考序列的范围扩增的模板依赖性核酸扩增反应中，将同靶核酸区域内的参考序列进行杂交、且由10～200个碱基构成的单链核酸添加至反应体系并进行反应的工序；及确认扩增产物的工序，单链核酸为包含同参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体，单链核酸与参考序列的互补率高于单链核酸与无参考序列的互补率，所述无参考序列包含与参考序列的差异。

Description

检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法

技术领域

本发明涉及一种使用模板依赖性核酸扩增反应检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法。

背景技术

作为检测DNA或RNA的1个～多个碱基的突变(插入、缺失或置换)、换言之检测与参考序列(例如野生型序列)的差异的方法，已知有如下所述的技术。

(1)碱基序列确定

突变的检测中通常利用确定分析对象的核酸序列，并将其与野生型序列进行比较的方法。作为测序方法，可使用桑格法(双脱氧法)、一系列的下一代测序方法(非专利文献1)等。由此，最终确定分析对象样品是否具有突变、或者具有怎样的突变。然而，该方法需要在从各个细胞中提取核酸并通过PCR法将该核酸序列扩增后，直接进行测序反应或者克隆于质粒等中后进行测序反应，例如在检测经基因组编辑的细胞或临床标本中的突变细胞时，会花费大量的时间和精力。因此，碱基序列确定至少不适合于筛选具有突变的细胞的目的。为了筛选的目的，需要可更简便地实施的方法。

(2)使用了预测具有突变的DNA区域的引物的PCR法

已报道了使用下述引物的PCR法：预测具有突变的野生型DNA区域的引物、及通过与该引物的结合而产生扩增产物的引物(非专利文献2、3、4)。该方法为利用可由野生型DNA生成PCR产物，而无法由具有突变的DNA生成扩增产物这一情况，对包含突变型DNA的样品进行检测的方法。该方法的突变检测原理为，体现出未生成扩增产物的阴性信号，然而却存在很多导致PCR反应难以进行的要素，因而多呈假阳性。因此，为了正确检测突变，必须对大量的样品进行分析。

(3)使用了TaqMan探针等荧光物质与猝灭剂修饰寡核苷酸探针的PCR法

经常使用下述方法：通过将用荧光物质(探针的5’侧)与猝灭剂(探针的3’侧)修饰后的、针对预测具有突变的DNA区域的寡核苷酸探针添加至PCR反应体系，由此对具有突变的DNA进行检测(非专利文献5～7)。该方法基于下述原理：由于探针与野生型的模板DNA发生退火，因此探针因PCR中使用的DNA聚合酶的核酸外切酶活性而被切断，荧光物质与猝灭剂分离，结果在反应体系中产生荧光。由于探针不与具有突变的模板DNA发生退火，因此不会产生荧光。然而，该分析的实施中需要能够检测荧光的实时PCR循环仪或数字PCR装置。此外，在样品中混合存在野生型DNA与突变型DNA时，由于因样品中存在野生型DNA而产生荧光，因此难以用于这种杂合突变的检测。

(4)Surveyor测定

Surveyor测定通过将用PCR法进行了扩增的对照DNA与被测DNA在试验管内混合，进行热变性及再双链化，使用Surveyor核酸酶将错配碱基的3’侧切断，由此检测出被测DNA包含与对照DNA不同的碱基(非专利文献8)。该方法通常可在从细胞中提取核酸并用PCR法将该核酸序列扩增后实施。该方法比较简便，通过从进行了基因组编辑的细胞“群”中提取DNA而实施，主要用于检验基因组编辑的效率。此时，由于基因组编辑效率通常不是100％，而且基因组编辑方法也各式各样，因此没有必要引入对照DNA。然而，各个基因组编辑细胞的检测中，若不混合源自野生型细胞的DNA，则无法检测到同源的突变，因此必须混合源自野生型细胞的DNA。此外，进行源自单个细胞的分析时，上述碱基序列确定的技术更加直接，因此通常不使用Surveyor测定。

(5)高分辨率熔解曲线分析技术(HRMA)

该方法为通过对PCR产物的熔解曲线进行分析，由此对碱基序列的差异进行检测的方法(非专利文献9)。该分析可简便地进行，但需要用于检测熔解曲线的机器(实时PCR循环仪等)。

(6)毛细管电泳

该方法通过毛细管电泳对包含具有突变的区域的PCR产物进行分析，并精密地测定其长度，由此对碱基的插入或缺失进行检测(非专利文献10、11)。然而，该方法除了耗费时间和精力以外，还需要毛细管电泳装置，另外当碱基发生置换突变时，PCR产物的长度不变，因此无法检测到与野生型的差异。

本申请的发明人开发了一种通过将同靶区域进行杂交的单链核酸添加至反应体系，从而特异性抑制靶区域的核酸扩增的方法，并申请了专利(专利文献1)。然而，专利文献1中没有记载检测靶核酸区域内的突变(与参考序列的差异)的方法，也没有动机将专利文献1的技术方案应用于核酸突变的检测。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2016-049107号公报

非专利文献

非专利文献1：Shendure,2012,Nature Biotechnology 30,1084-1094

非专利文献2：Harayama,2017,PLoS ONE 12(6):e0179165

非专利文献3：Yu,2014,PLoS ONE9(6):e98282

非专利文献4：Hua,2017,J.Genet.Genomics,44(4),207-213

非专利文献5：Mock,2015,Nucleic Acids Res.,43(11):5560-5571

非专利文献6：Miyaoka,2014,Nat.Methods 11(3):291-293

非专利文献7：Findlay,2016,PLoS ONE 11(4):e0153901

非专利文献8：Zhu,2014,Scientific Reports 4,6420

非专利文献9：Dahlem,2012,PLoS Genet.,8(8):e1002861

非专利文献10：Young,2015,Nucleic Acids Res.,43(9):e59

非专利文献11：Ramlee,2015,Sci,Rep.5:15587

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明的技术问题在于提供一种能够简便且低成本地检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法。进一步，其技术问题还在于提供一种能够检测1个以上的碱基的缺失、插入或置换的方法。

解决技术问题的技术手段

[1]一种检测方法，其为检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法，所述检测方法的特征在于，其包括：在以包含所述靶核酸区域的核酸为模板、使包含参考序列的范围扩增的模板依赖性核酸扩增反应中，将同所述靶核酸区域内的参考序列进行杂交、且由10～200个碱基构成的单链核酸添加至反应体系并进行反应的工序；及确认扩增产物的工序，所述单链核酸为包含同参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体，单链核酸与参考序列的互补率高于单链核酸与无参考序列的互补率，所述无参考序列包含与参考序列的差异。

[2]根据所述[1]所述的检测方法，其中，靶核酸区域内的与参考序列的差异为参考序列中的1个以上的碱基的缺失、插入或置换。

[3]根据所述[1]或[2]所述的检测方法，其中，模板依赖性核酸扩增反应为选自由PCR法、RT-PCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法、LCR法、SDA法、TRC法、TMA法及RPA法组成的组中的任意一种。

[4]根据所述[3]所述的检测方法，其中，模板依赖性核酸扩增反应为PCR法。

[5]根据所述[4]所述的检测方法，其中，PCR法包括变性步骤、退火步骤及延伸步骤。

[6]根据所述[5]所述的检测方法，其中，在相同温度下实施退火步骤及延伸步骤。

[7]根据所述[1]～[6]中任一项所述的检测方法，其中，单链核酸由15～30个碱基构成。

[8]根据所述[1]～[7]中任一项所述的检测方法，其中，单链核酸为单链RNA。

[9]根据所述[1]～[8]中任一项所述的检测方法，其中，包含靶核酸区域的核酸为从受试者的临床标本中取得的核酸。

[10]一种筛选方法，其为筛选在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的细胞的方法，所述筛选方法的特征在于，其包括：由被测细胞制备核酸的工序；将得到的核酸作为模板供于所述[1]～[9]中任一项所述的检测方法，并确认有无扩增产物的工序；及选择已确认到扩增产物的细胞的工序。

[11]一种增加在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的核酸的比例的方法，其特征在于，其包括：由被测细胞群制备核酸的工序；将得到的核酸作为模板供于所述[1]～[9]中任一项所述的检测方法并回收扩增产物的工序。

[12]一种用于所述[1]～[9]中任一项所述的检测方法的试剂盒，其包含单链核酸，所述单链核酸为包含同靶核酸区域内的参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体。

[13]一种用于所述[1]～[9]中任一项所述的检测方法的检测剂，其包含单链核酸，所述单链核酸为包含同靶核酸区域内的参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体。

发明效果

根据本发明，可提供一种检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法，该方法将靶核酸区域内的与参考序列的差异高精度地转化为简便的阳性信号，且能够以低成本进行检测，同时能够检测出1个以上的碱基的缺失、插入或置换。

附图说明

图1的(A)为示出了人THYN1基因座的包含CRISPR剪切位点的靶核酸区域的碱基序列(序列号35)同寡核糖核苷酸(ORN_20b、ORN_24b或ORN_Target，参考表1)的杂交状态、及利用THYN1特异性引物对进行扩增的区域的图；图1的(B)为示出了以从野生型细胞中提取的基因组DNA为模板，添加所述寡核糖核苷酸并进行PCR的结果的图。

图2为示出了以从野生型细胞中提取的基因组DNA及从进行了基因组编辑的五种细胞(T1、T4、T6、T7及T9)中提取的基因组DNA为模板，添加寡核糖核苷酸(ORN_20b或ORN_306F(NC)，参考表1)并进行PCR的结果的图。

图3为示出了以从野生型细胞中提取的基因组DNA及从进行了基因组编辑的五种细胞(T1、T4、T6、T7及T9)中提取的基因组DNA为模板，添加寡核糖核苷酸(ORN_24b、ORN_Target或ORN_302F(NC)，参考表1)并进行PCR的结果的图。

图4为示出了以从野生型细胞中提取的基因组DNA、从在两侧的等位基因中具有相同突变的T4细胞或T9细胞中提取的基因组DNA、以及基因组DNA(WT+T4、WT+T9)为模板，添加寡核糖核苷酸(ORN_20b、ORN_24b、ORN_Target、ORN_302F(NC)或ORN_306F(NC)，参考表1)并进行PCR的结果的图，其中，所述基因组DNA(WT+T4、WT+T9)通过将从野生型细胞中提取的基因组DNA与从在两侧的等位基因中具有相同突变的T4细胞或T9细胞中提取的基因组DNA以1:1的比率进行混合，模拟单等位基因突变而得到。

图5为示出了除了使用PfuDNA聚合酶代替KODDNA聚合酶以外，利用与实施例1(1-2)及(1-3)相同的条件进行PCR的结果的图。

图6为示出了以从野生型细胞中提取的基因组DNA、从具有双等位基因突变的细胞(T4及T6)中提取的基因组DNA、以及模拟了单等位基因突变的基因组DNA(WT+T4)为模板，添加寡核糖核苷酸(ORN_24b、ORN_302F(NC))并进行实时PCR的结果的图。

图7为示出了以从野生型细胞中提取的基因组DNA、从具有双等位基因突变的细胞(T4及T6)中提取的基因组DNA、以及模拟了单等位基因突变的基因组DNA(WT+T4)为模板，添加包含与CRISPR靶位点互补的RNA序列的crRNA_Target及作为对照的包含与无关的基因座互补的RNA序列的crRNA_NC来代替靶特异性寡核糖核苷酸并进行PCR的结果的图。

图8的(A)为示出了人CDKN2A(p16)的包含CRISPR剪切位点的靶核酸区域的碱基序列(序列号37)同寡核糖核苷酸(ORN_p16，参考表1)的杂交状态、及利用CDKN2A(p16)特异性引物对进行扩增的区域的图；图8的(B)为示出了以12个克隆(C1～C12)的各基因组DNA为模板，添加ORN_p16并进行PCR的结果的图，其中，所述12个克隆(C1～C12)从转染了以CDKN2A(p16)基因座为靶标的CRISPR复合物的细胞中分离得到。

图9的(A)为示出了利用CDKN2A(p16)特异性引物对进行扩增的区域(上游)及利用THYN1特异性引物对进行扩增的区域(下游)的图；图9的(B)为以11个克隆(CT1～CT11)的各基因组DNA为模板，添加ORN_p16及ORN_24b并进行PCR的结果的图，其中，所述11个克隆(CT1～CT11)从转染了以CDKN2A(p16)基因座为靶标的CRISPR复合物与以THYN1基因座为靶标的CRISPR复合物的细胞中分离得到。

图10的(A)为示出了以从在一侧的等位基因中具有1个碱基缺失的细胞(C4)中提取的基因组DNA及从在一侧的等位基因中具有2个碱基缺失的细胞(C6)中提取的基因组DNA为模板，添加ORN_p16并进行退火/延伸温度为62℃或70℃的两步PCR的结果的图；图10的(B)为示出了对各退火/延伸温度下的扩增产物的碱基序列进行分析的结果的图。

图11的(A)为示出了以从在一侧的等位基因中具有1个碱基插入的细胞(CT11)中提取的基因组DNA为模板，添加ORN_24b并进行退火温度为62℃或68℃的PCR的结果的图；图11的(B)为对各退火温度下的扩增产物的碱基序列进行分析的结果的图。

图12的(A)为示出了从HCT116细胞中提取的基因组DNA同ORN_Gx5的杂交状态、及利用CDKN2A(p16)特异性引物对进行扩增的区域的图，其中，所述HCT116细胞在CDKN2A(p16)基因座的一侧的等位基因中存在一个碱基(G)的插入；图12的(B)为对退火/延伸温度为68℃或72℃的两步PCR中的扩增产物的碱基序列进行分析的结果的图。

图13的(A)为示出了小鼠Tax1bp1基因座的靶核酸区域的碱基序列(序列号41)同寡核糖核苷酸(ORN_Tax，参考表1)的杂交状态、及利用Tax1bp1特异性引物对进行扩增的区域的图；图13的(B)为示出了两步PCR的反应条件的图；图13的(C)为示出了以野生型基因组DNA为模板，添加ORN_Tax并进行两步PCR的结果的图。

图14的(A)为示出了人c-FOS基因座的靶核酸区域的碱基序列(序列号42)同寡核糖核苷酸(ORN_FOS，参考表1)的杂交状态、及利用c-FOS特异性引物对进行扩增的区域的图；图14的(B)为示出了两步PCR的反应条件的图；图14的(C)为示出了以野生型基因组DNA为模板，添加ORN_FOS并进行两步PCR的结果的图。

图15的(A)为示出了人c-FOS基因座的包含TALEN剪切位点的靶核酸区域的碱基序列(序列号43)同寡核糖核苷酸(ORN_FOS，参考表1)的杂交状态、及利用c-FOS特异性引物对进行扩增的区域的图；图15的(B)为示出了以14个克隆(F1～F14)的各基因组DNA为模板，添加ORN_FOS并进行两步PCR的结果的图，其中，所述14个克隆(F1～F14)从转染了以c-FOS基因座为靶标的TALEN的细胞中分离得到。

图16的(A)为示出了人EGFR基因座的靶核酸区域的碱基序列(序列号44)同寡核糖核苷酸(ORN_EGFR_L858，参考表1)的杂交状态、及利用EGFR特异性引物对进行扩增的区域的图；图16的(B)为示出了两步PCR的反应条件的图；图16的(C)为示出了以293T或NCI-H1975基因组DNA为模板，添加ORN_EGFR_L858并进行两步PCR的结果的图；图16的(D)为示出了对退火及延伸温度为59℃的扩增产物的碱基序列进行分析的结果的图。

图17的(A)为实施例7(7-1)的实验方案；图17的(B)为示出了人THYN1基因座的靶核酸区域的碱基序列(序列号51)同寡核糖核苷酸(ORN_24b，参考表1)的杂交状态的图；图17的(C)为示出了以野生型细胞或引入基因组编辑后的细胞群的基因组DNA为模板，添加ORN_24b并进行两步PCR的结果的图；图17的(D)为对扩增产物的碱基序列进行分析的结果的图。

图18的(A)为示出了人CDKN2A(p16)基因座的靶核酸区域的碱基序列(序列号53)同crRNA(crRNA_lef5，序列号47)的杂交状态的图；图18的(B)为示出了以野生型细胞或引入基因组编辑后的细胞群的基因组DNA为模板，添加crRNA_lef5并进行两步PCR的结果的图；图18的(C)为对扩增产物的碱基序列进行分析的结果的图。

图19的(A)为将进行了亚硫酸氢盐处理的DNA作为模板而进行本发明的检测方法时的示意图；图19的(B)中，作为以进行了亚硫酸氢盐处理的HCT116细胞基因组DNA为模板时，利用CDKN2A(p16)特异性引物对(hCDKN2A-Bisul-CpG-free-F(序列号48)及hCDKN2A-Bisul-CpG-free-R(序列号49))进行扩增的DNA区域(序列号55)，示出了进行亚硫酸氢盐处理前的碱基序列的图；图19的(C)为示出了亚硫酸氢盐处理后的(B)的阴影部分的序列的互补序列(不包含甲基化胞嘧啶时(上)与包含甲基化胞嘧啶时(下))同ORN_hCDKN2A_U(序列号50)的杂交状态的图；图19的(D)为示出了以亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA为模板，添加ORN_hC DKN2A_U并进行两步PCR的结果的图；图19的(E)为示出了对扩增产物的碱基序列进行分析的结果((B)的序列的下划线部分的序列部分)的图。

具体实施方式

本发明提供一种检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法(以下，记为“本发明的检测方法”)。本发明的检测方法只要包括以下工序即可：在以包含靶核酸区域的核酸为模板、使包含参考序列的范围扩增的模板依赖性核酸扩增反应中，将同该靶核酸区域内的参考序列进行杂交、且由10～200个碱基构成的单链核酸添加至反应体系并进行反应的工序；及确认扩增产物的存在的工序。本发明的检测方法的特征在于，以欲检测是否与参考序列有差异的被测核酸为模板而进行模板依赖性核酸扩增反应时，在被测核酸在靶核酸区域内不具有与参考序列的差异的情况下，单链核酸同模板的杂交导致扩增被抑制而不生成扩增产物，在被测核酸在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的情况下，扩增不被抑制，可得到扩增产物。

在本说明书中，“参考序列”是作为用于分析差异的参考的序列，可根据目的任意决定。参考序列的长度(碱基长度)没有特别限定。优选为能够确定仅存在于靶核酸区域、不存在于除靶核酸区域以外的区域的长度，也可以为能够确定出在除靶核酸区域以外的区域中少量存在的序列的长度。具体而言，例如优选为10个碱基以上，更优选为15个碱基以上，进一步优选为20个碱基以上。

“靶核酸区域”只要为包含欲对与参考序列的差异进行分析的序列部分的区域即可，可根据参考序列所存在的位置适当规定。作为与参考序列的差异，可列举出相对于参考序列的缺失突变、插入突变、置换突变或参考序列内的碱基的甲基化等。此外，对于具有基因多态性的核酸，将特定的序列作为参考序列时，具有与参考序列不同的多态性时会被检测成包含与参考序列的差异的序列。在本申请说明书中，将包含与参考序列的差异的序列称为“无参考序列”。

模板依赖性核酸扩增反应只要是核酸合成酶基于模板核酸反复合成互补链，由此使目标区域的核酸链扩增的反应即可。所扩增的范围只要为包含参考序列的范围即可，可根据所使用的模板依赖性核酸扩增反应设定成适当的范围(碱基长度)。模板核酸可以为单链也可以为双链。此外，模板核酸可以为DNA、RNA、DNA/RNA杂合体中的任意一种。进一步，即使是构成核苷酸被人工衍生物置换的核酸，或者是天然DNA或RNA经修饰而成的核酸，只要作为互补链合成的模板而发挥功能，则也包含在模板核酸中。作为模板核酸，具体而言，例如可列举出基因组DNA、cDNA、合成DNA、全长RNA、mRNA、rRNA、miRNA、合成RNA等。本发明的检测方法中，欲检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的被测核酸为模板核酸。模板核酸可根据其种类分别使用公知的方法取得。

作为模板核酸，只要使用从受试者的临床标本中取得的核酸(例如，从血液或活检组织中提取的基因组DNA)，则可通过本发明的检测方法检测出受试者的特定基因(例如，癌基因)中有无突变、基因多态性。此外，只要将进行了亚硫酸氢盐处理的核酸(DNA)用作模板，则能够检测出参考序列内的甲基化碱基(甲基化胞嘧啶等)。检测参考序列内的甲基化碱基时，参考序列可以为存在于进行了亚硫酸氢盐处理的核酸(DNA)的靶区域内的碱基序列的互补序列。

模板依赖性核酸扩增反应优选为通过使引物退火并结合于模板核酸，使核酸从引物的3’末端延伸，由此使核酸链扩增的反应。作为这样的模板依赖性核酸扩增反应，可列举出PCR法(Polymerase Chain Reacti on：White,T.J.et al.,Trends Genet.,5,185(1989))、RT-PCR法(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction：JamesW.Larrick,Trends in Biotechnology,10,146-152,1992)、LAMP法(Loop-mediatedisothermal Amplification：国际公开第WO00/28082号)、ICAN法(Isothermal andChimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：国际公开第02/16639号)、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification：日本专利第2650159号公报)、LCR法(Ligase Chain Reaction：Barany,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.88,p.189-193,1991)、SDA法(Strand Dis placement Amplification：特公平7-114718号公报)、TRC法(Transcriptio n-Reverse Transcription-Concerted method：NakaguchiY.et al.,J.Clin.Microbiol.,vol.42:p.4248-4292(2004))、TMA法(Transcription-Mediated-Amplification：Sarrazin C.et al.,J.Clin.Microbiol.,vol.39:p.2850-2855(2001))、RPA法(Recombinase Polymerase Amplification：Piepenburg,O.,et al.,PLoSBiol.,2006,vol.4,e204)等，但并不限定于此。本发明的检测方法也可适用于任意的模板依赖性核酸扩增方法，优选适用于PCR法。

作为在模板依赖性核酸扩增反应中使用的引物，可根据各个核酸扩增方法使用适当的引物。可基于公知技术设计适于各个核酸扩增方法的引物，并能够利用公知的方法制造适于各个核酸扩增方法的引物。此外，只要生成符合各个核酸扩增方法的原理的特异性扩增产物，则模板依赖性核酸扩增反应的反应条件没有特别限定，可基于公知技术适当设定。

作为在本发明的检测方法中使用的单链核酸，优选使用包含同参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体。更优选为单链RNA。作为与RNA构成嵌合体的其他核酸，可列举出DNA、经修饰的DNA、经修饰的RNA等。当单链核酸为RNA与其他核酸的嵌合体时，优选其他核酸占总碱基长度的50％以下，更优选为40％以下，进一步优选为30％以下，进一步优选为20％以下，进一步优选为10％以下，进一步优选为5％以下。

同靶核酸区域内的参考序列杂交的单链核酸可根据包含参考序列的靶核酸区域的碱基序列信息进行设计。这样的碱基序列信息通常可从公知的数据库(DDBJ/GenBank/EMBL等)取得。所需的碱基序列信息无法从公知的数据库取得时，可使用公知的碱基测序法取得包含参考序列的靶核酸区域的碱基序列信息。模板核酸为双链(例如，由有义链及反义链构成的双链DNA)时，单链核酸可以与任一链杂交。

单链核酸的长度(碱基长度)只要为参考序列的长度以上则没有特别限定。例如，优选为10～200个碱基，更优选为10～150个碱基，更优选为10～120个碱基，更优选为10～100个碱基，更优选为10～90个碱基，进一步优选为10～80个碱基，进一步优选为10～70个碱基，进一步优选为10～60个碱基，进一步优选为10～50个碱基，进一步优选为15～30个碱基。

单链核酸的长度(碱基数)与参考序列相同时，单链核酸的碱基序列可以为与参考序列的互补序列完全一致的序列，只要可与碱基序列杂交，则也可以为包含与参考序列的互补序列不同的碱基的序列。优选单链核酸的碱基序列为与参考序列的互补序列完全一致的序列。此外，优选单链核酸与参考序列的互补率高于单链核酸与无参考序列的互补率。在本说明书中，“互补率”是指参考序列的互补序列与单链核酸的碱基序列的一致率，参考序列的互补序列与单链核酸的碱基序列完全一致时，互补率为100％。因此，换言之为“优选单链核酸的碱基序列与参考序列的错配碱基数少于单链核酸的碱基序列与无参考序列的错配碱基数”。

单链核酸比参考序列长(单链核酸的碱基数比参考序列多)时，对于单链核酸中包含的可同参考序列杂交的碱基序列，可适用与上述相同的基准。对于除可同参考序列杂交的碱基序列以外的碱基序列，没有特别限定。可以为可同靶核酸区域的与参考序列相邻的碱基序列杂交的序列，也可以为不同靶核酸区域的除参考序列以外的碱基序列杂交的碱基序列。

单链核酸的5’末端和/或3’末端可以被修饰。例如，可使用5’末端和/或3’末端经脱氧化、磷酸化、氨基化、生物素化、硫醇化、胆固醇化、DIG(地高辛)化、猝灭剂(BHQ-1、BHQ-3等)、荧光色素(DNP、Cy3、Cy5、TAMRA、6-FAM等)等修饰而成的单链核酸。

单链核酸只要可同靶核酸区域的参考序列杂交，则其核苷酸(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸)可以为糖、碱和/或磷酸盐经化学修饰的核苷酸。作为碱基被修饰的核苷酸，例如可列举出5位修饰尿苷或胞苷(例如，5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、5-甲氧基尿苷等)；8位修饰腺苷或鸟苷(例如，8-溴鸟苷等)；脱氮核苷酸(例如7-脱氮-腺苷等)；O-烷基化核苷酸及N-烷基化核苷酸(例如，N6-甲基腺苷等)等。此外，作为糖被修饰的核苷酸，例如可列举出核糖核苷酸的2’-OH被H、OR、R、卤原子、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN(此处，R表示碳原子数为1-6的烷基、烯基或炔基)等取代的2’位糖修饰、5’末端被单磷酸化的5’末端磷酸化修饰。作为磷酸盐被修饰的核苷酸，可列举出键合于相邻的核糖核苷酸的磷酸酯基被硫代磷酸酯基取代的核苷酸。

可利用公知的方法通过人工化学合成来制作单链核酸。此外，可利用体外转录法由模板DNA制作单链RNA。

模板依赖性核酸扩增反应中使用的核酸合成酶没有特别限定，可适当地选择并使用上述例示的适于各个核酸扩增方法的DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。在模板依赖性核酸扩增反应中使用DNA聚合酶时，所使用的DNA聚合酶没有特别限定，可使用上述例示的适于各个核酸扩增方法的DNA聚合酶。例如，可列举出polI型、α型、非polI非α型或混合型DNA聚合酶(多个DNA聚合酶的混合物)等。其中，优选使用α型DNA聚合酶。α型DNA聚合酶为具有3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。作为α型DNA聚合酶，例如市售有KOD DNA聚合酶(TOYOBOCo.,Ltd.)、Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)、Pfu DNA聚合酶(Promega KK.)等，可适当使用上述的α型DNA聚合酶。作为使用α型DNA聚合酶的模板依赖性核酸扩增反应，优选PCR。

对于核酸扩增反应的反应液，只要其组成使得目标反应得以进行，则没有特别限定，通常包含模板核酸、引物(引物对)、核酸合成酶(DNA聚合酶和/或RNA聚合酶)、作为核酸合成酶的底物的核苷酸。除此以外，可在反应液中添加缓冲剂、盐类等，可根据需要添加酶的保护剂、Tm值的调节剂、表面活性剂等。作为缓冲剂，可使用Tris-HCl等对中性至弱碱性具有缓冲作用的缓冲剂。可根据所使用的核酸合成酶将pH调节至最适pH附近。为了维持酶的活性或调节核酸的Tm值，可适当添加盐类，具体而言，可使用KCl、NaCl、MgCl₂、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄等。作为酶的保护剂，可使用牛血清白蛋白或糖类。进一步，作为Tm值的调节剂，可使用二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甜菜碱(N,N,N,-三甲基甘氨酸)等。作为表面活性剂，可使用Tween 20、Triton X等。可基于公知技术适当设定反应液的具体组成。优选根据实际使用的模板、引物、核酸合成酶、单链核酸的具体组合而对反应液的具体组成进行初步研究，进行适当设定。

单链核酸在模板依赖性核酸扩增反应体系中的添加量只要为：观察不到具有与参考序列没有差异的碱基序列的模板的扩增，却可观察到具有同参考序列有差异的碱基序列的模板的扩增的浓度即可。优选对所适用的每个核酸扩增反应的具体条件进行初步研究，并进行适当设定。具体而言，例如优选为2μM以下，更优选为1.5μM以下，进一步优选为1μM以下。下限没有特别限定，优选为10nM以上，更优选为50nM以上，进一步优选为100nM以上，进一步优选为500nM以上。

在本发明的检测方法中，使用PCR反应作为模板依赖性核酸扩增反应时，通过适当设定退火温度，可检测到一个碱基的缺失、一个碱基的插入或一个碱基的置换。退火温度优选考虑单链核酸中的同参考序列杂交的碱基序列部分的Tm值而设定。Tm值可基于毗邻法(最近接塩基対法)、GC％法等公知的计算方法而计算，更优选利用以下的计算式计算。

Tm＝(a+u)*2+(g+c)*4

另外，a、u、g、c分别表示A、U、G、C碱基的数目。

退火温度例如优选为Tm值±10℃，Tm值利用上述计算式计算得到，更优选为Tm±6℃，进一步优选为Tm±3℃。更具体而言，例如优选将退火温度设定为：当单链核酸与同其杂交的参考序列之间没有错配时，抑制包含参考序列的区域的核酸扩增，但当有1个错配时，包含参考序列的区域的核酸扩增的抑制弱于没有错配时、可得到扩增产物的温度。因此，优选根据实际使用的模板、引物、核酸合成酶、单链核酸的具体组合进行初步研究，并设定成适宜的退火温度。

此外，在本发明的检测方法中，使用PCR反应作为模板依赖性核酸扩增反应时，可以以通常的三步法(变性→退火→延伸的循环)进行，但优选以两步法(变性→退火/延伸的循环)进行。使用具有在退火温度下同参考序列杂交、在延伸温度下不同参考序列杂交的碱基序列的单链核酸时，存在由不具有突变的模板得到扩增产物，导致呈假阳性的情况。通过采用两步法，在退火/延伸温度中设定单链核酸同参考序列杂交的温度，由此可排除导致上述假阳性的结果的可能性。进行两步法时，也优选根据实际使用的模板、引物、核酸合成酶、单链核酸的具体组合进行初步研究，并设定成最适条件。

在本发明的检测方法中，使用PCR反应作为模板依赖性核酸扩增反应时，可进行定量PCR(实时PCR、数字PCR等)。

确认扩增产物的存在的工序中，利用公知的方法确认核酸扩增反应后的反应液中有无扩增产物即可。具体而言，例如将核酸扩增反应后的反应液供于琼脂糖凝胶电泳，确认有无靶区域的扩增产物的条带即可。确认到存在靶区域的扩增产物时，可判断为供于该反应的模板核酸在靶核酸区域内具有突变。此外，还可以进行扩增产物的序列分析，确认在靶核酸区域内存在突变。

本发明的检测方法对靶核酸区域内的与参考序列的差异进行检测，因此适于引入有序列特异性突变的基因组编辑细胞的突变检测。此外，本发明的检测方法也可用于确认在特定的基因(例如，癌基因)中是否具有突变的情况。此外，本发明的检测方法可用于检测动物或植物的多态性或判定品种等。

当样品具有与参考序列的差异时，本发明的检测方法可检测到阳性信号，因此能够用于杂合突变的检测，在这一点上非常优异。此外，为了实施本发明的检测方法，不需要昂贵的机器，可利用任意研究室中都有的机器(PCR循环仪等)简便地实施。而且，由于能够检测到一个碱基的缺失、插入或置换，因此非常有用。另外，由于在与参考序列有差异时，可检测到阳性信号，因此即使在仅在大量细胞的一部分细胞中存在与参考序列的差异的情况下，也可检测到差异，在这一点上非常优异。此外，由于检测到阳性信号，因此可通过将所检测到的扩增产物供于序列分析，进一步确认与参考序列有无差异。

在从对靶核酸区域内的参考序列进行了突变引入处理的细胞群中筛选实际引入了突变的细胞时，本发明的检测方法是有用的。此外，从具有基因多态性的细胞群中筛选具有多态性的细胞时也是有用的。因此，本发明提供一种在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的细胞的筛选方法。本发明的筛选方法包含以下的各工序即可。

(1)由被测细胞制备核酸的工序

(2)将得到的核酸作为模板供于上述的本发明的检测方法，并确认有无扩增产物的工序

(3)选择已确认到扩增产物的细胞的工序

工序(1)中，由被测细胞制备核酸。由被测细胞制备核酸的方法没有特别限定，可按照公知的方法进行。被测细胞只要为欲检测靶核酸区域内有无与参考序列的差异的细胞，则可以为任意的细胞。具体而言，可优选使用源自从对靶核酸区域内的参考序列进行了突变引入处理的细胞群中分离的克隆的细胞、源自从具有基因多态性的细胞群中分离的克隆的细胞等。使用对靶核酸区域内的参考序列进行了突变引入处理的细胞群时，突变引入处理只要为引入序列特异性突变的处理，则可以为任意的处理。例如，可适当使用公知的基因组编辑技术。可按照公知的方法从细胞群中分离克隆。

工序(2)及(3)可按照上述的本发明的检测方法的说明进行。

本发明的检测方法在增加在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的核酸的比例时是有用的。因此，本发明提供一种增加在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的核酸的比例的方法。本发明的增加核酸的比例的方法包含以下的各工序即可。

(1)由被测细胞群制备核酸的工序

(2)将得到的核酸作为模板供于上述的本发明的检测方法，并回收扩增产物的工序

工序(1)中，由被测细胞群制备核酸。由被测细胞群制备核酸的方法没有特别限定，可按照公知的方法进行。被测细胞群只要为在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的细胞与在靶核酸区域内不具有与参考序列的差异的细胞可混合存在的细胞群，则可以为任意的细胞群。例如，可优选使用对靶核酸区域内的参考序列进行了突变引入处理的细胞群等。使用对靶核酸区域内的参考序列进行了突变引入处理的细胞群时，突变引入处理只要为引入序列特异性突变的处理，则可以为任意的处理。例如，可适当使用公知的基因组编辑技术。工序(1)中，不从细胞群中分离克隆，而是由整个细胞群制备核酸。

工序(2)可按照上述的本发明的检测方法的说明进行。回收扩增产物的方法没有特别限定，可按照公知的方法进行。例如，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无扩增产物时，可通过切取包含扩增产物的条带的凝胶部分而回收扩增产物。回收的扩增产物可供于任意的分析。例如，可通过确定回收的扩增产物的序列来分析突变模式。

本发明提供一种用于实施上述的本发明的检测方法的试剂盒。本发明的试剂盒只要含有单链核酸即可，所述单链核酸为包含同靶核酸区域内的参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体。对除此以外的试剂盒的构成没有特别限定，例如还可包含模板依赖性核酸扩增反应用的试管、试剂类(例如DNA聚合酶、用于扩增包含参考序列的范围的引物对、dNTP混合溶液、缓冲液等)、说明书等。通过使用本发明的试剂盒，可简便且迅速地实施上述的本发明的检测方法。

本发明提供一种用于上述的本发明的检测方法的检测剂。本发明的检测剂只要包含单链核酸作为有效成分即可，所述单链核酸为包含同靶核酸区域内的参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体。对于该单链核酸，能够按照上述的本发明的检测方法中所说明的方式实施。

实施例

以下，利用实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于此。

[寡核糖核苷酸及引物]

实施例中使用的寡核糖核苷酸(以下记为“ORN”)及引物全部使用委托Greiner公司化学合成的寡核糖核苷酸及引物。将使用的ORN示于表1，将使用的引物示于表2。

[表1]

[表2]

[细胞及基因组DNA提取]

Raji细胞用包含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640(Wako)培养。293T细胞用包含10％FBS的DMEM(Wako)培养。HCT116细胞用包含10％FBS的McCoy’s 5A(Thermo FisherScientific)培养。Ba/F3细胞用包含10％FBS、10mM HEPES缓冲液(PH7.2)、1×非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、5μM 2-巯基乙醇、1ng/ml IL-3的RPMI-1640培养。NCI-H1975细胞用包含10％FBS的RPMI-1640培养。利用标准的苯酚/氯仿提取法，从细胞中提取基因组DNA。

[PCR条件]

以人THYN1基因座为靶标的PCR中，按照制造商的实验方案制备10μl中包含20ng的Raji细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及0.1-2μM的ORN的PCR反应液。反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着以98℃10秒、62℃30秒及68℃1分钟为一个循环而循环35次。

以人CDKN2A(p16)基因座为靶标的PCR中，制备在10μl中包含20ng的293T细胞或HCT116细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及1μM的ORN的PCR反应液。实施例2的反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着以98℃10秒、62℃30秒及68℃1分钟为一个循环而循环30次。实施例3的反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及62-72℃20秒这两个步骤循环35次。

以人THYN1基因座及人CDKN2A(p16)基因座这两者为靶标的PCR中，制备在10μl中包含20ng的293T细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及1μM的各ORN的PCR反应液。反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着以98℃10秒、62℃30秒及68℃1分钟为一个循环而循环30次。实施例3的反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着以98℃10秒、62℃30秒、68℃1分钟为一个循环而循环30次；或者最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及68℃1分30秒这两个步骤循环30次。

以小鼠Tax1bp1基因座为靶标的PCR中，制备在10μl中包含20ng的Ba/F3细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及1μM的ORN的PCR反应液。实施例4的反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及50-65℃80秒这两个步骤循环30次。

以人c-FOS基因座为靶标的PCR中，制备在10μl中包含20ng的293T细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及1μM的ORN的PCR反应液。实施例4的反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及50-68℃80秒这两个步骤循环30次。实施例5的反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及65℃80秒这两个步骤循环30次。

以人EGFR基因座为靶标的PCR中，制备在10μl中包含20ng的293T细胞或NCI-H1975细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及1μM的ORN的PCR反应液。实施例6的反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及59-65℃80秒这两个步骤循环30次。

将PCR产物供于使用了1％或2％的琼脂糖凝胶的电泳，并根据需要进行DNA测序。DNA序列的分析中使用了Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0(ThermoFisher Scientific)。

[实时PCR条件]

实时PCR中使用了KOD SYBR qPCR Mix(Toyobo)。按照制造商的实验方案制备在10μl中包含20ng的基因组DNA、0.2μM的各引物、及0.25μM的ORN的PCR反应液。反应中，最初在98℃下预变性2分钟，接着以98℃10秒、62℃30秒及68℃1分钟为一个循环而循环30次。使用7900HTFast实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems)，进行反应及定量。将PCR产物供于使用了1％的琼脂糖凝胶的电泳，确认得到了所预料的大小的扩增产物。

[质粒]

Cas9表达质粒(Addgene#41815)及嵌合体单链向导RNA(single guide RNA:sgRNA)表达质粒(Addgene#41824)由George Church博士通过Addgene提供。为了构建以人THYN1基因座为靶标的sgRNA表达质粒，按照hCRISPR gRNA合成实验方案(https://media.addgene.org/data/93/40/adf4a4fe-5e77-11e2-9c30-003048dd6500.pdf)，在sgRNA表达质粒中的U6启动子的下游克隆CRISPR靶序列。为了构建以人CDKN2A(p16)基因座为靶标的Cas9-sgRNA表达质粒，在Cas9表达质粒中的Cas9表达盒的上游克隆CDKN2A(p16)(Gx4#2)的sgRNA表达盒。

[介由CRISPR的基因组编辑]

为了人THYN1基因座的基因组编辑，通过使用Gene Pulser II(Bio-Rad)，以250V及950μF对Cas9表达质粒(120μg)、以人THYN1基因座为靶标的sgRNA表达质粒(120μg)、及pEGFP-N3(0.3μg，Clontech)进行电穿孔，转染至Raji细胞(1×10⁷个)。1天后，逐个筛选GFP阳性细胞并使其增殖。

为了人CDKN2A(p16)基因座的基因组编辑，使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific)，将以人CDKN2A(p16)基因座为靶标的Cas9-sgRNA表达质粒(4μg)及pcDNA3.1/Hygro(-)(0.4μg，Thermo Fisher Scientific)转染至293T细胞(4×10⁵个)。2天后，添加潮霉素(0.4mg/ml)，采集潮霉素抗性菌落并进行培养。

为了人THYN1及CDKN2A(p16)基因座的基因组编辑，使用Lipofectamine 3000，将以人CDKN2A(p16)基因座为靶标的Cas9-sgRNA表达质粒(4μg)、以人THYN1为靶标的sgRNA表达质粒(4μg)及pcDNA3.1/Hygro(-)(0.4μg)转染至293T细胞(4×10⁵个)。2天后，添加潮霉素(0.4mg/ml)，采集潮霉素抗性菌落并进行培养。

[介由TALEN的基因组编辑]

为了人c-FOS基因座的基因组编辑，使用Lipofectamine 3000(Thermo FisherScientific)，将以人c-FOS基因座为靶标的TALEN质粒(TALEN-left及TALEN-right，各4μg)及pcDNA3.1/Hygro(-)(0.4μg，Thermo Fisher Scientific)转染至293T细胞(4×10⁵个)。2天后，添加潮霉素(0.4mg/ml)，采集潮霉素抗性菌落并进行培养。

[实施例1：人THYN1基因座的突变检测]

(1-1)利用以人THYN1基因座为靶标的ORN的PCR扩增抑制

作为ORN，使用了ORN_20b、ORN_24b及ORN_Target(参考表1)。

图1的(A)中示出了人THYN1基因座的包含CRISPR剪切位点的靶核酸区域的碱基序列CTGCAGCGTGACCATGTCGAGACCCCGGAAGAGGCTGGC(序列号35)同各ORN的杂交状态、及利用THYN1特异性引物对进行扩增的区域。图中的下划线部分表示CRISPR靶位点(参考序列)，阴影表示PAM(前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif))，箭头表示CRISPR剪切位点。ORN_20b及ORN_24b在其序列的中央与靶位点、即PAM上游3个碱基处的CRISPR剪切位点杂交，ORN_Target与基因组编辑中使用的sgRNA及PAM的碱基序列一致。

使用这些ORN、Raji细胞的基因组DNA、THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F3及hTHYN1-gRNA-target-15-R3，参考表2)、KODDNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2(Toyobo))，在上述的PCR条件下扩增靶序列周围的0.9kbp。将结果示于图1的(B)。在不存在ORN的情况下，将由人Raji细胞提取的基因组DNA用于PCR时，0.9kbp区域被特异性扩增。将ORN_20b或ORN_24b以0.1μM～2μM的范围添加至反应液时，扩增被强烈抑制。将ORN_Target以0.5μM～2μM的范围添加至反应液时，扩增也被抑制。另一方面，添加同无关的基因座(人IRF-1基因座)杂交的ORN_306F(NC)并未影响扩增。根据该结果确认了：通过将同靶核酸区域内的参考序列杂交的ORN添加至PCR反应液，可特异性抑制靶核酸区域的PCR扩增。

(1-2)基因组编辑细胞的检测

研究了添加同靶核酸区域内的参考序列杂交的ORN时，在靶核酸区域内具有突变的模板的PCR扩增如何变化。

对Raji细胞进行THYN1基因座的CRISPR介导的基因组编辑，建立两侧的等位基因的参考序列均发生了突变的五种基因组编辑克隆(T1、T4、T6、T7及T9)。各基因组编辑克隆在野生型人THYN1基因座的包含CRISPR剪切位点的靶核酸区域的碱基序列GCACTAAAGTCCCCTGCAGCGTGACCATGTCGAGACCCCGGAAGAGGCTGGC(序列号36，下划线部分为CRISPR靶位点(参考序列)，第25～27位的CCA为PAM，第30位的T与第31位的C之间为CRISPR剪切位点)中具有以下的突变。

T1：在一侧的等位基因中，序列号36的碱基序列的第9～30位的碱基缺失，在另一侧的等位基因中，在CRISPR剪切位点插入有115个碱基

T4：在两侧的等位基因中，序列号36的碱基序列的第24～30位的碱基缺失

T6：在一侧的等位基因中，序列号36的碱基序列的第21～36位的碱基缺失，在另一侧的等位基因中，第30～32位的碱基缺失

T7：在一侧的等位基因中，序列号36的碱基序列的第27～37位的碱基缺失，在另一侧的等位基因中，第31～36位的碱基缺失

T9：在两侧的等位基因中，在CRISPR剪切位点插入有相同序列的501个碱基

将分别从野生型细胞及各基因组编辑克隆中提取的基因组DNA作为模板，使用THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F3及hTHYN1-gRNA-target-15-R3，参考表2)、KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN而进行PCR，或者不添加ORN而进行PCR。作为ORN，使用了ORN_20b或ORN_306F(NC)(参考表1)。将结果示于图2。左边为不添加ORN的结果，中央为添加ORN_20b的结果，右边为添加ORN_306F(NC)的结果。不添加ORN时，野生型细胞(WT)及所有的基因组编辑细胞的基因组DNA中的靶核酸区域扩增。添加ORN_20b时，野生型细胞(WT)的基因组DNA的扩增完全被抑制，基因组编辑细胞的基因组DNA的扩增未被抑制。添加同无关的基因座(人IRF-1基因座)杂交的ORN_306F(NC)并未影响靶核酸区域的扩增。

以源自在CRISPR靶位点的各等位基因中具有不同突变的细胞的基因组DNA为模板时，ORN_20b可能会抑制等位基因特异性PCR扩增，因此确定了在CRISPR靶位点的各等位基因中具有不同突变的T1、T6及T7细胞的基因组DNA在不添加ORN的情况下的PCR产物、与该基因组DNA在添加ORN_20b的情况下的PCR产物的序列。其结果，由两者的PCR产物得到了相同的2个图案(pattern)的序列信号。因此可知，ORN_20b不影响这些基因组DNA的扩增。

接着，使用其他ORN(ORN_24b、ORN_Target或ORN_302F(NC)，参考表1)，在相同条件下进行PCR。将结果示于图3。左边为添加ORN_24b的结果，中央为添加ORN_Target的结果，右边为添加ORN_302F(NC)的结果。添加ORN_24b或ORN_Target的PCR显示出了与添加ORN_20b的PCR相同的PCR图谱。添加同无关的基因座(人IRF-1基因座)杂交的21个碱基的ORN_302F(NC)并未影响扩增。

这些结果显示了，通过将同靶核酸区域内的参考序列杂交的ORN添加至PCR反应液并进行PCR，可区别在靶核酸区域内不具有突变的野生型核酸序列(参考序列)、与在靶核酸区域内的双等位基因中具有插入缺失突变的突变型核酸序列(无参考序列)。

(1-3)单等位基因突变的检测

上述(1-2)中，使用从在双等位基因中具有插入缺失突变的基因组编辑细胞中提取的基因组DNA作为模板，而单等位基因突变的检测中，则研究了能否区别仅在单侧的等位基因中具有突变的单等位基因突变与野生型核酸序列(参考序列)。为此，将从野生型细胞中提取的基因组DNA、与从在双等位基因中具有相同突变的T4细胞或T9细胞中提取的基因组DNA以1:1的比例混合，模拟单等位基因突变。将从野生型细胞(WT)中提取的基因组DNA、分别从T4细胞及T9细胞中提取的基因组DNA、以及WT+T4混合基因组DNA及WT+T9混合基因组DNA作为模板，使用THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F3及hTHYN1-gRNA-target-15-R3，参考表2)、KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN而进行PCR，或者不添加ORN而进行PCR。作为ORN，使用了ORN_20b、ORN_24b、ORN_Target、ORN_302F(NC)或ORN_306F(NC)(参考表1)。

将结果示于图4。添加ORN_20b、ORN_24b或ORN_Target进行PCR时，扩增仅在以不包含突变型基因组DNA的野生型基因组DNA(WT)为模板时被抑制，以WT+T4混合基因组DNA及WT+T9混合基因组DNA为模板时，分别出现了与T4基因组DNA及T9基因组DNA的扩增相同大小的单一的条带。将WT+T4混合基因组DNA作为模板，确定添加了ORN_20b的PCR产物(0.9kb)的序列，结果检测到了与T4基因组DNA的扩增产物的序列相同的信号，未检测到与WT基因组DNA相同的序列信号。这些结果显示了，通过将同靶核酸区域内的参考序列杂交的ORN添加至PCR反应液并进行PCR，可区别在靶核酸区域内不具有突变的野生型核酸序列(参考序列)、与在靶核酸区域内的单侧的等位基因中具有插入缺失突变的突变型核酸序列(无参考序列)。

(1-4)利用使用了PfuDNA聚合酶的PCR的基因组编辑细胞的检测

Pfu DNA聚合酶为与实施例1中使用的KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)同样地保持3’-5’核酸外切酶活性的α型DNA聚合酶。因此，除了使用Pfu DNA聚合酶来代替KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)以外，以与上述(1-2)及(1-3)相同的条件进行PCR。具体而言，将从野生型细胞(WT)中提取的基因组DNA、分别从T1、T4、T6、T7及T9细胞中提取的基因组DNA、以及WT+T4混合基因组DNA及WT+T9混合基因组DNA作为模板，使用THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F3及hTHYN1-gRNA-target-15-R3，参考表2)、PfuDNA聚合酶，添加ORN而进行PCR，或者不添加ORN而进行PCR。作为ORN，使用ORN_20b、ORN_24b或ORN_306F(NC)(参考表1)。

将结果示于图5。与使用了KODDNA聚合酶的情况相同，添加了ORN_20b或ORN_24b时，WT基因组DNA的靶核酸区域的扩增被妨碍，但是在参考序列中具有突变的基因组DNA的靶核酸区域扩增。

(1-5)利用实时(定量)PCR的基因组编辑细胞的检测

研究了是否可根据实时PCR，区别单等位基因插入缺失突变与双等位基因插入缺失突变。

将从野生型细胞(WT)中提取的基因组DNA、分别从具有双等位基因突变的T4细胞及T6细胞中提取的基因组DNA、以及模拟了单等位基因突变的WT+T4混合基因组DNA作为模板，使用THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F3及hTHYN1-gRNA-target-15-R3，参考表2)、KOD DNA聚合酶(KOD SYBR qPCR Mix)，添加ORN_24b而进行实时PCR、添加ORN_302F(NC)而进行实时PCR、或者不添加ORN而进行实时PCR。

将结果示于图6。在存在ORN_24b的实时PCR中，未检测到WT基因组DNA的靶核酸区域的扩增。T4细胞或T6细胞的基因组DNA的靶核酸区域的扩增未受影响，模拟单等位基因插入缺失突变的模板(WT+T4)的靶核酸区域的扩增的约60％被抑制。添加同无关的基因座(人IRF-1基因座)杂交的ORN_302F(NC)并未影响靶核酸区域的扩增。这些结果显示了，通过将同靶核酸区域内的参考序列杂交的ORN添加至PCR反应液并进行实时PCR，可区别在靶核酸区域内不具有突变的野生型核酸序列(参考序列)与在靶核酸区域内的两侧的等位基因中具有插入缺失突变的突变型核酸序列(无参考序列)、在靶核酸区域内的单侧的等位基因中具有插入缺失突变的突变型核酸序列(无参考序列)。

(1-6)使用了CRISPR RNA的PCR的研究

能够通过将重组CRISPR核糖核蛋白(RNP)转染至细胞而进行基因组编辑。该方法中，将所合成的sgRNA或CRISPR RNA(crRNA)+反式激活crRNA(tracrRNA)的复合物用作gRNA。使用CRISPR RNP进行基因组编辑时，相较于使用靶特异性ORN，反而是使用crRNA时的检测基因组编辑细胞的成本效率更高。因此，使用crRNA代替靶特异性ORN而进行PCR。作为crRNA，使用了包含与CRISPR靶位点互补的RNA序列的crRNA_Target(序列号8，参考表1)及作为对照的包含与无关的基因座(鸡Pax5基因座)互补的RNA序列的crRNA、即crRNA_NC(序列号9，参考表1)。将从野生型细胞(WT)中提取的基因组DNA、分别从T4细胞及T6细胞中提取的基因组DNA、以及WT+T4混合基因组DNA作为模板，使用THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F3及hTHYN1-gRNA-target-15-R3，参考表2)、KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，分别添加上述两种crRNA而进行PCR。

将结果示于图7。存在crRNA_Target时的PCR扩增的图谱与利用THYN1特异性ORN而得到的PCR扩增的图谱相同(参考图2、3及4)。添加crRNA_NC并未影响靶核酸区域的扩增。

[实施例2：基因组编辑细胞的筛选]

(2-1)人293T细胞中CDKN2A(p16)基因座被编辑的细胞的筛选

对人293T细胞进行CDKN2A(p16)基因座的CRISPR介导的基因组编辑，尝试使用本发明的检测方法筛选在CDKN2A(p16)基因座中引入了突变的细胞。图8的(A)中示出了人CDKN2A(p16)基因座的包含CRISPR剪切位点的靶核酸区域的碱基序列CTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGG(序列号37)与其互补序列、及该互补序列同ORN_p16的杂交状态，进一步示出了利用CDKN2A(p16)特异性引物对进行扩增的区域。图中下划线部分表示CRISPR靶位点(参考序列)，阴影表示PAM，箭头表示CRISPR剪切位点。

对人293T细胞进行CDKN2A(p16)基因座的CRISPR介导的基因组编辑，将单个菌落分离后，从12个克隆(C1～C12)的细胞中提取基因组DNA。将这些基因组DNA作为模板，使用CDKN2A(p16)特异性引物对(hCDKN2A-ORN-F及hCDKN2A-ORN-R，参考表2)、KODDNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN_p16而进行PCR，或者不添加ORN而进行PCR。

将结果示于图8的(B)。12个样品中的11个样品的靶核酸区域扩增，认为已对这些克隆进行了基因组编辑。检测到了C9、C11及C12的基因组DNA的两个PCR产物，认为这些克隆在双侧的等位基因中进行了不同的基因组编辑。C10的扩增产物的分子量超过1kb，因此认为产生了插入突变。C1、C3-C8的基因组DNA的扩增产物的大小与以野生型基因组DNA为模板且不添加ORN而进行的PCR产物相同(0.8kbp)，因此为了确定这些克隆的突变的种类，确定了扩增产物的序列。其结果，由于未检测到与不具有突变的CRISPR靶位点对应的序列信号，因此认为在这些克隆的靶位点引入了双等位基因突变。该结果显示了，本发明的检测方法可用于筛选基因组编辑细胞。

(2-2)多个靶位点被编辑的细胞的筛选

能够在单个细胞内的多个基因座上同时引入基因组编辑。因此，研究了是否能够将本发明的检测方法适用于多个靶位点被编辑的细胞的筛选。

在对人293T细胞进行CDKN2A(p16)基因座及THYN1基因座的CRISPR介导的基因组编辑，并将单个菌落分离后，从11个克隆(CT1～CT11)中提取基因组DNA。将这些基因组DNA作为模板，使用CDKN2A(p16)特异性引物对(hCDKN2A-ORN-F及hCDKN2A-ORN-R，参考表2)及THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F2及hTHYN1-gRNA-target-15-R2，参考表2)、KODDNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN_p16而进行PCR、添加ORN_24b而进行PCR、或者不添加ORN而进行PCR(参考图9的(A))。

将结果示于图9的(B)。由于从11个克隆中的9个克隆(CT1、CT3-CT8、CT10、CT11)的基因组DNA中得到了CDKN2A(p16)基因座的扩增产物，且从所有11个克隆的基因组DNA中得到了THYN1基因座的扩增产物，因此认为已对各基因座顺利地进行了基因组编辑。CT3、CT7及CT10的扩增产物的长度不同，认为在靶基因的单等位基因或双等位基因中引入了突变。对于除此以外的克隆，在未添加ORN的情况下进行PCR，并确定扩增产物的序列。如表3所示，CT2及CT9在THYN1基因座中具有突变，但在CDKN2A(p16)基因座中没有突变。CT1、CT4～CT8及CT11在THYN1基因座与CDKN2A(p16)基因座中均具有突变。该结果显示了，可将本发明的检测方法用于多个靶位点被编辑的细胞的筛选。

[表3]

[实施例3：点突变(point mutation)的检测]

可使用基因组编辑引入点突变，考虑到检测该突变在实际使用中是重要的，因此研究了本发明的检测方法是否能够检测到点突变。

(3-1)1个碱基的缺失突变的检测

由上述(2-1)的C4及C6的序列确定的结果可知，它们在野生型人CDKN2A(p16)基因座的包含CRISPR剪切位点的靶核酸区域的碱基序列CTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGG(序列号38，下划线部分为CRISPR靶位点(参考序列)，第26～28位的GGG为PAM，第22位的G与第23位的G之间为CRISPR剪切位点)中具有以下的突变。

C4：在一侧的等位基因中，序列号38的碱基序列的第20～25位的6个碱基缺失，在另一侧的等位基因中，第22位的1个碱基缺失

C6：在一侧的等位基因中，序列号38的碱基序列的第20～25位的6个碱基缺失，在另一侧的等位基因中，第22～23位的2个碱基缺失

将从野生型细胞(WT)中提取的基因组DNA、分别从C4细胞及C6细胞中提取的基因组DNA作为模板，使用CDKN2A(p16)特异性引物对(hCDKN2A-(-)Bisul-F2及hCDKN2A-(-)Bisul-R2，参考表2)、KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN_p16，进行退火/延伸温度为62℃或70℃的两步PCR。将结果示于图10的(A)。在退火/延伸温度为62℃(左)及退火/延伸温度为70℃(右)的条件下，由C4及C6的基因组DNA均得到了扩增产物，但未能由WT基因组DNA得到扩增产物。

对于所得到的扩增产物，进行碱基序列确定。将结果示于图10的(B)。退火/延伸温度为62℃时，C6中可检测到了2个序列信号，但在C4中仅检测到了缺失6个碱基的等位基因的序列信号，认为缺失1个碱基的等位基因的扩增被ORN_p16的杂交阻碍。另一方面，退火/延伸温度为70℃时，在C4的扩增产物中检测到了缺失1个碱基的等位基因的序列信号。该结果显示了，通过根据所使用的ORN调节退火/延伸温度，能够检测到参考序列内的1个碱基的缺失。

(3-2)1个碱基的插入突变的检测

上述(2-2)的CT11在THYN1基因座的一侧的等位基因中具有1个碱基的插入(另一侧的等位基因缺失了11个碱基，参考表3)。因此，将从野生型细胞(WT)中提取的基因组DNA及从CT11细胞中提取的基因组DNA作为模板，使用THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F5及hTHYN1-gRNA-target-15-R5，参考表2)、KODDNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN_24b进行退火温度为62℃或68℃的PCR。将结果示于图11的(A)。在退火温度为62℃(左)及68℃(右)的条件下，均由CT11的基因组DNA得到了扩增产物，但未能由WT基因组DNA得到扩增产物。

对于所得到的扩增产物，进行碱基序列确定。将结果示于图11的(B)。退火温度为62℃时，未检测到插入了1个碱基的碱基序列的序列信号，退火温度为68℃时，检测到了插入了1个碱基的碱基序列的序列信号。该结果显示了，通过根据所使用的ORN调节退火温度，能够检测到靶核酸区域内的1个碱基的插入。

(3-3)1个碱基的置换的检测

尝试使用基因组DNA与突变位于末端的ORN(ORN_Gx5)检测突变，所述基因组DNA提取自在CDKN2A(p16)基因座的一侧的等位基因中存在一个碱基(G)的插入的HCT116细胞。如图12的(A)所示，Gx5的碱基序列CCGCGGCCCGGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCG(序列号39)在Gx4的碱基序列CCGCGGCCCGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCG(序列号40)的第9位的C与第10位的G之间插入有G，若将两者对齐，则可以理解为Gx4的碱基序列的第9位的C在Gx5中被置换为G。ORN_Gx5为与Gx5的碱基序列的第10～30位的碱基(参考序列)完全互补的序列，其与Gx4的碱基序列的第11～30位完全互补，但与第10位的C错配。将该基因组DNA作为模板，使用CDKN2A(p16)特异性引物对(hCDKN2A-(-)Bisul-F2及hCDKN2A-(-)Bisul-R2，参考表2)、KODDNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN_Gx5，进行退火/延伸温度为64℃、68℃或72℃的两步PCR。其结果，虽然在退火/延伸温度为64℃时，未能得到扩增产物，但在退火/延伸温度为68℃及72℃时，均得到了扩增产物。

对于退火/延伸温度为68℃及72℃时得到的扩增产物，进行碱基序列确定。将结果示于图12的(B)。退火/延伸温度为68℃时，与ORN_Gx5没有错配的Gx5的碱基序列的序列信号非常弱，认为扩增被抑制。退火/延伸温度为72℃时，强烈地检测到了Gx5的碱基序列的序列信号，认为扩增未被抑制。该结果显示了，通过根据所使用的ORN调节退火/延伸温度，能够检测到靶核酸区域内的1个碱基的置换。此外，欲检测的突变的位置没有必要在进行杂交的ORN的中央附近，也可以在末端。

[实施例4：两步PCR的条件的研究]

(4-1)通过利用以小鼠Tax1bp1基因座为靶标的ORN的两步PCR的扩增抑制

作为ORN，使用了ORN_Tax(参考表1)。

图13的(A)中示出了小鼠Tax1bp1基因座的靶核酸区域的碱基序列CCATTACACCTTAACTCCGTATATCCAT(序列号41)同ORN_Tax的杂交状态、及利用Tax1bp1特异性引物对进行扩增的区域。

使用ORN_Tax、Ba/F3细胞的基因组DNA、Tax1bp1特异性引物对(mTax1bp1-exon2-F2及mTax1bp1-exon2-R2，参考表2)、KODDNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，如图13的(B)所示，将退火/延伸温度在50～65℃的范围内设定成6个阶段，进行两步PCR。将结果示于图13的(C)。在不存在ORN的情况下，将从小鼠Ba/F3细胞中提取的基因组DNA用于PCR时，0.6kbp区域被扩增。将ORN_Tax以1μM添加至反应液时，在退火/延伸温度为56℃以下时可观察到因ORN产生的扩增抑制，当退火/延伸温度为50℃及53℃时，扩增被强烈抑制。根据该结果可确认，通过根据所使用的ORN调节退火/延伸温度，能够通过两步PCR，特异性抑制靶核酸区域的PCR扩增。此外，该结果暗示了，ORN_Tax1同模板DNA杂交的温度为53～56℃。

(4-2)通过利用以人c-FOS基因座为靶标的ORN的两步PCR的扩增抑制

作为ORN，使用了ORN_FOS(参考表1)。

图14的(A)中示出了人c-FOS基因座的靶核酸区域的碱基序列GTTATAAAAGCAGTGGCTGCGGCGCCTCGT(序列号42)同ORN_FOS的杂交状态、及利用c-FOS特异性引物对进行扩增的区域。

使用ORN_FOS、293T细胞的基因组DNA、c-FOS特异性引物对(hc-fos-prom-F及hc-fos-prom-R，参考表2)、KODDNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，如图14的(B)所示，将退火/延伸温度在50～68℃的范围内设定成7个阶段，进行两步PCR。将结果示于图14的(C)。在不存在ORN的情况下，将从人293T细胞中提取的基因组DNA用于PCR时，在退火/延伸温度为53～68℃的情况下，0.8kbp区域被特异性扩增。将ORN_FOS以1μM添加至反应液时，在退火/延伸温度为53～65℃时，扩增被强烈抑制，仅在68℃时观察到了0.8kbp区域的特异性扩增。根据该结果也可确认，通过根据所使用的ORN调节退火/延伸温度，能够通过两步PCR特异性抑制靶核酸区域的PCR扩增。此外，该结果暗示了，ORN_FOS同模板DNA杂交的温度为65～68℃。

作为DNA的Tm值的预测方法，已知有以下的计算式。

Tm＝(a+t)*2+(g+c)*4

另外，a、t、g、c分别表示A、T、G、C碱基的数目。

基于上述的计算式，将碱基T记作U而计算ORN_Tax及ORN_FOS的Tm值，结果ORN_Tax的Tm值为54℃，ORN_FOS的Tm值为66℃(表4)。根据图12的结果可知，ORN_Tax的实际的Tm值为53～56℃，根据图13的结果可知，ORN_FOS的实际的Tm值为65～68℃，这暗示了能够预测ORN的Tm值。

[表4]

[实施例5：基于两步PCR的基因组编辑细胞的筛选]

(5-1)人293T细胞中c-FOS基因座被编辑的细胞的筛选

对人293T细胞进行c-FOS基因座的TALEN介导的基因组编辑，尝试使用本发明的检测方法筛选在c-FOS基因座中引入了突变的细胞。图15的(A)中示出了人c-FOS基因座的包含TALEN剪切位点的靶核酸区域的碱基序列CTCATTCATAAAACGCTTGTTATAAAAGCAGTGGCTGCGGCGCCTCGTACTCCAACCGCATCTGC(序列号43)及其同ORN_FOS的杂交状态，以及利用c-FOS特异性引物对进行扩增的区域。图中下划线部分表示TALEN-左及TALEN-右靶位点，夹在两者间的区域被剪切。

对人293T细胞进行c-FOS基因座的TALEN介导的基因组编辑，将单个菌落分离后，从14个克隆(F1～F14)的细胞中提取基因组DNA。将这些基因组DNA作为模板，使用c-FOS特异性引物对(hc-fos-prom-F及hc-fos-prom-R，参考表2)、KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN_FOS，以退火/延伸温度65℃进行两步PCR。

将结果示于图15的(B)。从14个样品中的9个样品中观察到了清晰的扩增产物的条带，认为已对这些克隆进行了基因组编辑。检测到了F4及F10的基因组DNA的两个PCR产物，认为这些克隆在两侧的等位基因中进行了不同的基因组编辑。此外，检测到了F9的基因组DNA的三个PCR产物，认为该克隆可能包含多种进行了基因组编辑的细胞。为了确定除F4及F9以外的克隆有无突变及突变的种类，不添加ORN而进行PCR扩增，并确定PCR产物的序列。其结果，在未观察到扩增产物的清晰条带的F2、F3、F5、F13、F14的TALEN靶位点中未观察到突变，对于观察到了清晰条带的克隆，检测到了与具有突变的TALEN靶位点对应的序列信号，因此认为在这些克隆的靶位点的两侧的等位基因或一侧的等位基因中引入了突变。将结果示于表5。该结果显示了，利用两步PCR的本发明的检测方法可用于筛选基因组编辑细胞。

[表5]

[实施例6：基于两步PCR的1个碱基的置换突变的检测]

(6-1)人NCI-H1975细胞的EGFR基因座的1个碱基的置换突变的检测

NCI-H1975细胞中，在EGFR基因座的一侧的等位基因中存在一个碱基的置换突变。如图16的(A)所示，NCI-H1975细胞中，一侧的等位基因的正常的碱基序列TCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGG(序列号44)的第16位的T被置换为G。ORN_EGFR_L858为与正常的碱基序列的第6～26位的碱基(参考序列)完全互补的序列，其与一个碱基被置换的碱基序列的第16位的G错配。分别从NCI-H1975细胞及不具有一个碱基置换突变的293T细胞中提取基因组DNA。将这些基因组DNA作为模板，使用EGFR特异性引物对(hEGFR-Exon21-F及hEGFR-Exon21-R，参考表2)、KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，在添加或不添加ORN_EGFR_L858的情况下，如图16的(B)所示，将退火/延伸温度在59～65℃的范围内设定为3个阶段，进行两步PCR。其结果，如图16的(C)所示，不添加ORN_EGFR_L858时，在将基因组DNA用作模板的情况下均观察到了扩增产物，但添加了ORN_EGFR_L858时，在退火及延伸温度为59℃且使用了293T的基因组DNA的情况下，未观察到扩增产物，在退火及延伸温度为59℃且使用了NCI-H1975细胞的基因组DNA的情况下，观察到了扩增产物。

对于退火/延伸温度为59℃时所得到的扩增产物，进行碱基序列确定。将结果示于图16的(D)。将293T细胞的基因组DNA用作模板时，在不添加ORN的情况下，检测到了正常的碱基序列的信号。使用NCI-H1975细胞的基因组DNA时，在不添加ORN的情况下，检测到了正常的碱基序列及一个碱基发生了置换突变的碱基序列的两个信号。另一方面，添加ORN_EGFR_L858时，仅检测到了一个碱基发生了置换突变的碱基序列信号。该结果显示了，利用了两步PCR的本发明的检测方法能够检测靶核酸区域内的1个碱基的置换突变。

[实施例7：经基因组编辑的碱基序列组的扩增]

(7-1)经基因组编辑的人THYN1基因座碱基序列组的扩增

通过使用从经基因组编辑处理的细胞群中提取的DNA进行本发明的检测方法，由此研究在靶核酸区域内具有突变的碱基序列组是否扩增。

为了对人THYN1基因座进行基因组编辑，使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific)将Cas9表达质粒(4μg)及以人THYN1基因座为靶标的sgRNA表达质粒(4μg)转染至HCT116细胞(4×10⁵个)。3天后，使用Quick-DNA Universal试剂盒(ZymoResearch)提取基因组DNA。

以人THYN1基因座为靶标的PCR中，制备在10μl中包含20ng的HCT116细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及0.5μM的ORN的PCR反应液。反应最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及68℃90秒这两步循环34次。

将PCR产物供于使用了1％的琼脂糖凝胶的电泳，并根据需要直接确定DNA序列或克隆于pCR4-TOPO(Thermo Fisher Scientific)后确定DNA序列。DNA序列的分析中使用了Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0(Thermo Fisher Scientific)。

将本实验方案示于图17的(A)。对HCT116细胞进行THYN1基因座的CRISPR介导的基因组编辑处理，不进行细胞的克隆化而统一提取基因组DNA。将提取的基因组DNA作为模板，使用THYN1特异性引物对(hTHYN1-gRNA-target-15-F5及hTHYN1-gRNA-target-15-R5，参考表2)、KOD DNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加ORN_24b(参考表1)而进行PCR，或者不添加ORN_24b而进行PCR。

图17的(B)中示出了人THYN1基因座的包含CRISPR剪切位点的靶核酸区域的碱基序列CAGCGTGACCATGTCGAGACCCCGGAAGAGGCT(序列号51)同ORN_24b的杂交状态。图中下划线部分表示CRISPR靶位点(参考序列)，阴影表示PAM，箭头表示CRISPR剪切位点。

将结果示于图17的(C)。不添加ORN时，野生型细胞及基因组编辑处理细胞群的基因组DNA中的靶核酸区域扩增。添加ORN_24b时，野生型细胞的基因组DNA的扩增完全被抑制，基因组编辑处理细胞群的基因组DNA的扩增未被完全抑制。确定不添加ORN的PCR产物与添加ORN_24b的PCR产物的序列，其结果，在不添加ORN的PCR产物中仅检测到了野生型的碱基序列(TGCAGCGTGACCATGTCGAGACCCCGGAAGAGGCTGGCTGG：序列号52)信号，与之相对，在添加ORN_24b的PCR产物中得到了多种碱基序列信号(参考图17的(D))。此外，在添加ORN_24b的PCR产物中未确认到野生型的碱基序列信号。因此可知，ORN_24b抑制了源自经基因组编辑处理的细胞群中的野生型细胞的基因组DNA的THYN1基因座的扩增，并且不影响引入了基因组编辑的细胞的基因组DNA的扩增。

接着，在质粒中克隆不添加ORN的PCR产物与添加ORN_24b的PCR产物后，确定各克隆的碱基序列。将结果示于表6。克隆不添加ORN的PCR产物后，11个克隆中的2个为经基因组编辑的碱基序列。另一方面，克隆添加ORN_24b的PCR产物时，所有7个克隆均为经基因组编辑的碱基序列。这些结果显示了，通过将同靶核酸区域内的参考序列杂交的ORN添加至PCR反应液并进行PCR，在靶核酸区域内不具有突变的野生型核酸序列(参考序列)的扩增得到抑制，并可扩增在靶核酸区域内具有突变的突变型核酸序列(无参考序列)。

[表6]

(7-2)经基因组编辑的人CDKN2A(p16)基因座碱基序列组的扩增

接着，以人CDKN2A(p16)基因座为靶标，使用crRNA代替靶特异性ORN并进行相同的研究。

为了对人CDKN2A(p16)基因座进行基因组编辑，使用Lipofectamine 3000(ThermoFisherScientific)，将Cas9表达质粒(4μg)及以人CDKN2A(p16)基因座为靶标的sgRNA表达质粒(4μg)转染至HCT116细胞(4×10⁵个)。3天后，使用Quick-DNAUniversal试剂盒(ZymoResearch)提取基因组DNA。

以人CDKN2A(p16)基因座为靶标的PCR中，制备在10μl中包含20ng的HCT116细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及0.25μM的crRNA的PCR反应液。反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及74℃70秒这两步循环34次。

将PCR产物供于使用了1％的琼脂糖凝胶的电泳，并根据需要直接进行DNA序列确定。DNA序列的分析中使用了Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0(Thermo Fisher Scientific)。

以与图17的(A)所示的实验方案相同的方式，对HCT116细胞进行人CDKN2A(p16)基因座的CRISPR介导的基因组编辑处理，不进行细胞的克隆化而统一提取基因组DNA。将提取的基因组DNA作为模板，使用人CDKN2A(p16)基因座特异性引物对(hCDKN2A-CpG-645-F及hCDKN2A-CpG-645-R)、KODDNA聚合酶(KOD-Plus-Ver.2)，添加crRNA_lef5进行PCR，或者不添加crRNA_lef5而进行PCR。

hCDKN2A-CpG-645-F：ggagacccaacctggggcgacttca(序列号45)

hCDKN2A-CpG-645-R：ctgtacgcgcgtggctcctcattcc(序列号46)

crRNA_lef5：uggggcggaccgcgugcgcuguuuuagagcuaugcuguuu(序列号47)

图18的(A)中示出了人CDKN2A(p16)基因座的包含CRISPR剪切位点的靶核酸区域的碱基序列GGTGGGGCGGACCGCGTGCGCTCGGCG(序列号53)与其互补序列、及该互补序列同crRNA_lef5的杂交状态。图中下划线部分表示CRISPR靶位点(参考序列)，阴影表示PAM，箭头表示CRISPR剪切位点。

将结果示于图18的(B)。不添加crRNA时，野生型细胞及基因组编辑处理细胞群的基因组DNA中的靶核酸区域扩增。添加crRNA_lef5时，野生型细胞的基因组DNA的扩增完全被抑制，基因组编辑处理细胞群的基因组DNA的扩增未被完全抑制。接着，确定不添加crRNA_lef5的PCR产物与添加crRNA_lef5的PCR产物的碱基序列，其结果，在不添加crRNA_lef5的PCR产物中主要检测到了野生型的碱基序列(GGTGGGGCGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGG：序列号54)信号，与之相对，在添加crRNA_lef5的PCR产物中得到了多种碱基序列信号(参考图18的(C))。因此可知，crRNA_lef5抑制源自经基因组编辑处理的细胞群中的野生型细胞的基因组DNA的CDKN2A(p16)基因座的扩增，并且不影响引入了基因组编辑的细胞的基因组DNA的扩增。这些结果显示了，通过将同靶核酸区域内的参考序列杂交的crRNA添加至PCR反应液并进行PCR，在靶核酸区域内不具有突变的野生型核酸序列(参考序列)的扩增得到抑制，并可扩增在靶核酸区域内具有突变的突变型核酸序列(无参考序列)。

综上可知，本发明的检测方法通过增加具有在靶核酸区域内包含突变的突变型核酸序列(无参考序列)的核酸的比例，除了可进一步效率良好地分析突变模式以外，还可用于确认基因组编辑处理后的细胞群中有无基因组编辑细胞。另外，也可以使用下一代测序方法代替基于PCR产物的克隆及测序的碱基序列的确定。

[实施例8：包含经甲基化的胞嘧啶的DNA区域的亚硫酸氢盐处理后的扩增]

(8-1)包含经甲基化的胞嘧啶的人CDKN2A(p16)基因座的亚硫酸氢盐处理后的扩 增

已知在存在很多CpG的CpG岛区域中，CpG序列的胞嘧啶被甲基化。通过亚硫酸氢盐处理，未被甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而经甲基化的胞嘧啶不会被转化。因此，使用了经亚硫酸氢盐处理的DNA的PCR中，未被甲基化的胞嘧啶以胸腺嘧啶的形式扩增，经甲基化的胞嘧啶仍以胞嘧啶的形式扩增。即，认为经亚硫酸氢盐处理的DNA中，碱基序列会因CpG的胞嘧啶是否经甲基化而产生差异，通过进行本发明的检测方法，可特异性扩增源自CpG的胞嘧啶中具有(或不具有)甲基化的DNA区域的碱基序列。

已知HCT116细胞中的人CDKN2A(p16)基因座的CpG岛区域仅在单侧的等位基因上受到CpG的甲基化。因此，研究了通过使用提取的DNA，并在亚硫酸氢盐处理后进行本发明的检测方法，是否能够特异性扩增源自CDKN2A(p16)基因座CpG岛区域的CpG的胞嘧啶中具有甲基化的DNA区域的碱基序列。

使用EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(Zymo Research)，对从HCT116细胞中提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。以人CDKN2A(p16)基因座为靶标的PCR中，制备在10μl中包含1μl的亚硫酸氢盐处理后的HCT116细胞的基因组DNA、0.3μM的各引物、及1μM的ORN的PCR反应液。反应中，最初在94℃下预变性2分钟，接着将98℃10秒及56℃60秒这两步循环35次。将PCR产物供于使用了2％的琼脂糖凝胶的电泳，并根据需要确定DNA序列。DNA序列的分析中使用了Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0(ThermoFisher Scientific)。

图19的(A)中示出了以亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板进行本发明的检测方法时的示意图。从HCT116细胞中提取基因组DNA，并以亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，使用CDKN2A(p16)特异性引物对(hCDKN2A-Bisul-CpG-free-F及hCDKN2A-Bisul-CpG-free-R)与KOD-Multi&Epi-(TOYOBO Co.,Ltd.)，添加ORN_hCDKN2A_U而进行PCR，或者不添加ORN_hCDKN2A_U而进行PCR。

hCDKN2A-Bisul-CpG-free-F：tttttagaggatttgagggatagg(序列号48)

hCDKN2A-Bisul-CpG-free-R：ctacctaattccaattcccctacaaacttc(序列号49)

ORN_hCDKN2A_U：guggggaguaguauggaguuuuu(序列号50)

作为以亚硫酸氢盐处理后的HCT116细胞基因组DNA为模板时，利用上述CDKN2A(p16)特异性引物对进行扩增的DNA区域(序列号55)，图19的(B)中示出了亚硫酸氢盐处理前的碱基序列。图19的(C)中示出了亚硫酸氢盐处理后的(B)的阴影部分的序列的互补序列同ORN_hCDKN2A_U的杂交状态。上方为(B)的阴影部分的序列不包含甲基化胞嘧啶的情况，下方为(B)的阴影部分的序列包含甲基化胞嘧啶的情况。对于ORN_hCDKN2A_U，在(B)的阴影部分的序列不包含甲基化胞嘧啶时，与其互补序列(AAAAACTCCATACTACTCCCCAC：序列号56)完全互补，在(B)的阴影部分的序列包含甲基化胞嘧啶时，则与其互补序列(GAAAACTCCATACTACTCCCCGC：序列号57)发生2个碱基的错配。

将结果示于图19的(D)。在添加ORN及不添加ORN这两种情况下，经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA中的靶CpG岛区域扩增，但添加ORN_hCDKN2A_U时，靶CpG岛区域的扩增减弱。接着，确定不添加ORN的PCR产物与添加ORN_hCDKN2A_U的PCR产物的碱基序列。对于图19的(B)的下划线部分区域的碱基序列，图19的(E)示出了包含甲基化胞嘧啶时的亚硫酸氢盐处理后的碱基序列(CGGATCGCGTGCGTTCGGCGG：序列号58)信号。在不添加ORN的PCR产物的CpG位点检测到了源自甲基化胞嘧啶及非甲基化胞嘧啶的碱基序列信号，与之相比，添加ORN_hCDKN2A_U的PCR产物中仅检测到了源自甲基化胞嘧啶的碱基序列信号。因此可知，ORN_hCDKN2A_U抑制CDKN2A(p16)基因座CpG岛区域的CpG的胞嘧啶中不具有甲基化的DNA区域的DNA扩增，并且不影响胞嘧啶中具有甲基化的DNA区域的DNA扩增。

综上可判断，本发明的检测方法在亚硫酸氢盐处理后可特异性扩增(浓缩)源自CpG的胞嘧啶中具有(或不具有)甲基化的DNA区域的碱基序列。通过使用本发明的检测方法，可进一步效率良好地分析作为对象的DNA区域的CpG的甲基化模式。

另外，本发明并不限定于上述的各实施方式及实施例，可在权利要求所示的范围内进行各种变更，将不同的实施方式中各自公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的学术文献及专利文献均作为参考而援用于本说明书中。

序列表

<110> 株式会社艾匹基乃龙

<120> 检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法

<130> KHP202112620.6

<150> JP2018-081752

<151> 2018-04-20

<160> 58

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 1

cggggucucg acauggucac 20

<210> 2

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 2

uccggggucu cgacaugguc acgc 24

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 3

ccucuuccgg ggucucgaca ugg 23

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 4

ccgggggcgc ugggcugucc c 21

<210> 5

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 5

ggggccgggg gcgcugggcu guccc 25

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 6

caccuccucu acccgacccc c 21

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 7

gcggcccggg gucggguaga 20

<210> 8

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 8

ccucuuccgg ggucucgaca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42

<210> 9

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 9

cggcaggcuc gggugcgccu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 10

auauacggag uuaaggugua 20

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 11

gcgccgcagc cacugcuuuu 20

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 12

caguuuggcc agcccaaaau c 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

agccagcaaa ttacttcatc atc 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

ctcctcctcc atccacttag aat 23

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ctgcagcgtg accatgtc 18

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

cacccaacaa aagtgtctct gtg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gttctcaaaa agcagggagt gaa 23

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

ccgcagtcga gtctgcagag tgttgg 26

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

caaggctggg ctcaaattcc acatcc 26

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

cggggtctcg acatggtcac 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

gaggggctgg ctggtcacca ga 22

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

tgcagaccct ctacccacct ggat 24

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

ccccgattca atttggcagt tagga 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

attacaaacc ccttctgaaa actcc 25

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

actccatgct cctgccaaat 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ccagcgagct agccagagat 20

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

ccgaagagtc tccaggctag aag 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

acctccttct gcacacattt gaa 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

ttgactgagt tgtatcccca tcc 23

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

tgcacagtgt ttagtatttc atggtg 26

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

aactgtcttc agtttccgta caagg 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gggtgagtgg tagtaagaga ggcta 25

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gcctttccat tctttggatc ag 22

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

ctgcagggag agactgaaac ct 22

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人

<400> 35

ctgcagcgtg accatgtcga gaccccggaa gaggctggc 39

<210> 36

<211> 52

<212> DNA

<213> 智人

<400> 36

gcactaaagt cccctgcagc gtgaccatgt cgagaccccg gaagaggctg gc 52

<210> 37

<211> 43

<212> DNA

<213> 智人

<400> 37

ctggccacgg ccgcggcccg gggtcgggta gaggaggtgc ggg 43

<210> 38

<211> 43

<212> DNA

<213> 智人

<400> 38

ctggccacgg ccgcggcccg gggtcgggta gaggaggtgc ggg 43

<210> 39

<211> 36

<212> DNA

<213> 智人

<400> 39

ccgcggcccg ggggtcgggt agaggaggtg cgggcg 36

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> 智人

<400> 40

ccgcggcccg gggtcgggta gaggaggtgc gggcg 35

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 41

ccattacacc ttaactccgt atatccat 28

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人

<400> 42

gttataaaag cagtggctgc ggcgcctcgt 30

<210> 43

<211> 65

<212> DNA

<213> 智人

<400> 43

ctcattcata aaacgcttgt tataaaagca gtggctgcgg cgcctcgtac tccaaccgca 60

tctgc 65

<210> 44

<211> 31

<212> DNA

<213> 智人

<400> 44

tcacagattt tgggctggcc aaactgctgg g 31

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

ggagacccaa cctggggcga cttca 25

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ctgtacgcgc gtggctcctc attcc 25

<210> 47

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 47

uggggcggac cgcgugcgcu guuuuagagc uaugcuguuu 40

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

tttttagagg atttgaggga tagg 24

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

ctacctaatt ccaattcccc tacaaacttc 30

<210> 50

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核糖核酸

<400> 50

guggggagua guauggaguu uuu 23

<210> 51

<211> 33

<212> DNA

<213> 智人

<400> 51

cagcgtgacc atgtcgagac cccggaagag gct 33

<210> 52

<211> 41

<212> DNA

<213> 智人

<400> 52

tgcagcgtga ccatgtcgag accccggaag aggctggctg g 41

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人

<400> 53

ggtggggcgg accgcgtgcg ctcggcg 27

<210> 54

<211> 34

<212> DNA

<213> 智人

<400> 54

ggtggggcgg accgcgtgcg ctcggcggct gcgg 34

<210> 55

<211> 392

<212> DNA

<213> 智人

<400> 55

cctccagagg atttgaggga cagggtcgga gggggctctt ccgccagcac cggaggaaga 60

aagaggaggg gctggctggt caccagaggg tggggcggac cgcgtgcgct cggcggctgc 120

ggagaggggg agagcaggca gcgggcggcg gggagcagca tggagccggc ggcggggagc 180

agcatggagc cttcggctga ctggctggcc acggccgcgg cccggggtcg ggtagaggag 240

gtgcgggcgc tgctggaggc gggggcgctg cccaacgcac cgaatagtta cggtcggagg 300

ccgatccagg tgggtagagg gtctgcagcg ggagcagggg atggcgggcg actctggagg 360

acgaagtttg caggggaatt ggaatcaggt ag 392

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以经亚硫酸氢盐处理的DNA为模板扩增的DNA

<400> 56

aaaaactcca tactactccc cac 23

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以经亚硫酸氢盐处理的DNA为模板扩增的DNA

<400> 57

gaaaactcca tactactccc cgc 23

<210> 58

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 以经亚硫酸氢盐处理的DNA为模板扩增的DNA

<400> 58

cggatcgcgt gcgttcggcg g 21

Claims (13)

1.一种检测方法，其为检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法，所述检测方法的特征在于，其包括：

在以包含所述靶核酸区域的核酸为模板、使包含参考序列的范围扩增的模板依赖性核酸扩增反应中，将同所述靶核酸区域内的参考序列进行杂交、且由10～200个碱基构成的单链核酸添加至反应体系并进行反应的工序；及确认扩增产物的工序，

所述单链核酸为包含同参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体，单链核酸与参考序列的互补率高于单链核酸与无参考序列的互补率，所述无参考序列包含与参考序列的差异。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，靶核酸区域内的与参考序列的差异为参考序列中的1个以上的碱基的缺失、插入或置换。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，模板依赖性核酸扩增反应为选自由PCR法、RT-PCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法、LCR法、SDA法、TRC法、TMA法及RPA法组成的组中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，模板依赖性核酸扩增反应为PCR法。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，PCR法包括变性步骤、退火步骤及延伸步骤。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，在相同温度下实施退火步骤及延伸步骤。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的检测方法，其中，单链核酸由15～30个碱基构成。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的检测方法，其中，单链核酸为单链RNA。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其中，包含靶核酸区域的核酸为从受试者的临床标本中取得的核酸。

10.一种筛选方法，其为筛选在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的细胞的方法，所述筛选方法的特征在于，其包括：由被测细胞制备核酸的工序；将得到的核酸作为模板供于权利要求1～9中任一项所述的检测方法，并确认有无扩增产物的工序；及选择已确认到扩增产物的细胞的工序。

11.一种增加在靶核酸区域内具有与参考序列的差异的核酸的比例的方法，其特征在于，其包括：由被测细胞群制备核酸的工序；将得到的核酸作为模板供于权利要求1～9中任一项所述的检测方法并回收扩增产物的工序。

12.一种用于权利要求1～9中任一项所述的检测方法的试剂盒，其包含单链核酸，所述单链核酸为包含同靶核酸区域内的参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体。

13.一种用于权利要求1～9中任一项所述的检测方法的检测剂，其包含单链核酸，所述单链核酸为包含同靶核酸区域内的参考序列互补的序列的RNA或RNA与其他核酸的嵌合体。

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