JP6941568B2 - ヌクレアーゼを使用する野生型dnaの選択的分解および突然変異体対立遺伝子の濃縮 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年6月24日に出願された米国仮出願番号第62/183,854号への米国特許法第119条(e)項の下の優先権を主張しており、それらの内容は参考として本明細書中に援用される。
本発明は、国立衛生研究所によって認められた認可番号R21CA175542の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
遺伝子分析において一般的に遭遇する状況は、大過剰の非変異体配列(「多数派対立遺伝子」)の存在下で、低割合の変異体DNA配列(「少数派対立遺伝子」)を識別する必要がある。このような状況の例としては、以下のものが挙げられる:癌において一般的に遭遇する状況として、大過剰の正常(野生型)対立遺伝子の存在下における少数の突然変異対立遺伝子の識別および配列決定(例えば、大過剰の野生型対立遺伝子の存在下における癌患者の血液中または尿中の腫瘍循環DNA(または、癌を有すると疑われる人の異常DNA)の識別;エピジェネティック分析において、大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の識別(または、逆もまた同様である);大過剰の母性DNA配列も存在する母体血中を循環する少数の胎児DNA配列の識別および遺伝子型決定;感染因子(細菌またはウイルス)における突然変異株の識別;ならびに作物開発のための変異体配列の検出。
本開示は、野生型核酸の優先的切断をもたらし、それにより、目的の突然変異標的配列をその後に濃縮することを可能にする新規開発(ヌクレアーゼ支援突然変異濃縮(Nuclease−assisted Mutation Enrichment)、NaME)に関する。次いで、突然変異を識別するための任意の現在利用可能な方法、例えばサンガーシーケンシング、高解像度融解(HRM)などを使用して、突然変異濃縮配列をスクリーニングし得る。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること;
前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);ならびに
前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目2)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);ならびに
前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目3)
前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件が、有機溶媒の添加および/または耐熱性DSNと組み合わせた温度の上昇を含む、項目1〜2のいずれか一項に記載の方法。
(項目4)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する)
;
前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること;ならびに
前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目5)
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
各プローブが、ロックド核酸、ペプチド核酸、異種核酸(XNA)、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはRNAを含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に対する1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムDNAまたは循環DNAを含む、項目1〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
項目2または4に記載の方法を実行する前に、以下:前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を濃縮することをさらに含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている、項目11に記載の方法。
(項目13)
項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを増幅条件に供する、項目1〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目1〜13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記増幅条件が、PCR、COLD−PCR、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性PCRまたはCOLD−PCR、マルチプレックスPCRおよび等温増幅からなる群より選択される、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、項目13〜14のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記DSN切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるDNA分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
MALDI−TOF、HR融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング(MPS)、パイロシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCRおよび定量PCRからなる群より選択される方法の1つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含み;ならびに
前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;ならびに
(c)前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目24)
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、項目23に記載の方法。
(項目25)
工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目23〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、項目23〜25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記変性温度が65〜85℃である、項目23〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記標的DNA上のそれらの対応する配列への、異なるTmを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程(c)を実施する、項目23〜27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
DSN消化中に67℃〜64℃の漸減温度勾配を適用して、64〜67℃の異なるTmを有するプローブがそれらの個々の標的にハイブリダイズすることを可能にする、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記温度勾配が2〜20℃の範囲である、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目23〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目23〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目23〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペア(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する)と、PCR増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること;
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
(c)前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記DSNは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない);ならびに
(d)前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮すること
を含む、方法。
(項目35)
工程(d)を行う前に、工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
工程(b)、(c)および(d)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目34〜35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、項目34〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記変性温度が65〜85℃である、項目34〜37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目34〜38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、項目34〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
PCR増幅に使用されるプライマーが、工程(c)において適用された温度未満の融解温度を有する、項目34〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
野生型核酸と比べて2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目34〜41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記増幅条件がCOLD−PCRである、項目34〜42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供すること;
(d)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、最適なDSN活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記DSNが、前記メチル化二本鎖核酸を切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目45)
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること;
(d)前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること;ならびに
(e)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、最適なDSN活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記DSNが、前記メチル化二重鎖を優先的に切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目46)
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程;ならびに
(d)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断するが、前記メチル化二本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目47)
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること;
(d)前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること;ならびに
(e)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断するが、前記メチル化二重鎖を切断しない、方法。
(項目48)
工程(b)の前記核酸増幅反応が、PCR;完全COLD−PCR、高速COLD−PCR;ice−COLD−PCR、耐温COLD−PCRおよび変性時間限定COLD−PCRからなる群より選択される、項目44〜47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記切断非メチル化一本鎖核酸および前記非切断メチル化二重鎖を、工程(a)においてライゲーションされた前記亜硫酸水素塩耐性アダプターを使用した増幅条件に供する、項目44〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記増幅条件が、PCR;完全COLD−PCR、高速COLD−PCR;ice−COLD−PCR、耐温COLD−PCRおよび変性時間限定COLD−PCRからなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然にATリッチな配列を除去する、項目44〜50のいずれか一項に記載の方法。
低頻度体細胞突然変異の検出を伴うほとんどの用途において、突然変異体対立遺伝子は、突然変異体対立遺伝子および野生型対立遺伝子の両方を増幅するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)工程によって検出される。野生型対立遺伝子よりも突然変異対立遺伝子を優先的に増幅する方法も記載されている(例えば、低変性温度同時増幅(co−amplification at lower denaturation temperature)すなわちCOLD−PCRおよび改良型完全濃縮(improved and complete enrichment)COLD PCRすなわちice−COLD−PCR;Li J,Wang L,Mamon H,Kulke MH,Berbeco R,Makrigiorgos GM.Replacing PCR with COLD−PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing.Nat Med 2008;14:579−84;Milbury CA,Li J,Makrigiorgos GM. Ice−COLD−PCR enables rapid amplification and robust enrichment for low−abundance unknown DNA mutations.Nucleic Acids Res;39:e2)。しかしながら、数回の合成サイクル後、ポリメラーゼが、誤った組み込み(PCRエラー)(これは、突然変異として後に記録される)を不可避的に導入するので、このようなPCRベースの方法によって得られ得る濃縮には限界がある。増幅の反復はまた、望ましくない非標的配列の増幅をもたらすミスプライミングを導入し得る。さらに、PCRの使用を完全に取り除き得る現在新たに登場した強力な遺伝子分析方法(「第3世代配列決定」Nanopore,Pac−Bio systems)がある。したがって、実施されるPCRの量を減少させるか、またはPCRなしで、もしくは必要な場合にはPCRと併せて行い得る突然変異濃縮方法が重要である。
したがって、本開示のいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法を提供する。その後の濃縮は、増幅条件を生成反応混合物に適用することによって達成され得る。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、プローブは、プローブの一方が、突然変異を含有する標的核酸のトップ鎖上の配列と重複し、他方のプローブが、目的の突然変異を含有する標的核酸のボトム鎖上の配列と重複し、2つのプローブが互いに部分的に重複するように構築される(図2および3)。2つのプローブは、DSN消化中にNaMEに使用される温度(例えば、65℃〜70℃)において溶液中で互いに実質的に結合しないように、部分的にのみ重複する。したがって、プローブとそれらの対応する配列とのハイブリダイゼーション中は、プローブが鋳型に結合するために十分に低い温度であるが、実質的なプローブ間結合を可能にしないほど十分に高い温度を保持することが重要である。このアプローチは、突然変異配列に対するプロセスの特異性を増加させ、突然変異濃縮は、野生型核酸とマッチする第2のプローブと共に1つの突然変異特異的プローブのみを使用する場合よりもかなり顕著になる(図1A)。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、ゲノムDNAに対して直接実施される。ゲノムDNAは、場合により、NaMEの適用前に断片化され得る(図4)。このアプローチでは、NaMEは、(a)酵素的または物理的な手段を使用して、ゲノムDNAを断片化すること;(b)トップDNA鎖およびボトムDNA鎖の両方に対処する重複(または非重複)プローブを添加することであって、場合により、野生型核酸および標的核酸の両方を(例えば、95℃で)変性させること;(c)親DNA鎖の実質的な再生前に、温度を例えば60〜70℃に低下させることであって、プローブがそれらの各標的を発見することを可能にし、プローブ間相互作用を最小限にするために十分に高い温度を維持すること;(d)DSNを添加することであって、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を実質的にインタクトなままにしながら、1つまたはそれを超える(複数の)相補的な野生型−プローブ二重鎖DNA標的を選択的に切断することによって適用される。切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する得られた反応混合物は、当技術分野で公知の方法、例えば限定されないが、PCR、COLD−PCR、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性PCRまたはCOLD−PCR、マルチプレックスPCRまたは等温増幅(例えば、phi−29ベース;またはLAMPベース;または任意の他の等温増幅法)を使用して増幅され、それにより、野生型と比較して標的突然変異体核酸が濃縮され得る。この増幅産物は、任意の利用可能な方法、例えば限定されないが、MALDI−TOF、HR融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング(MPS)、パイロシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCRおよび定量PCRを使用して、突然変異について検査され得る(野生型核酸は、DSNによって選択的に切断されたので、この増幅工程中に増幅しない)。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、大量並列シーケンシング(MPS)と併せて使用され得る。MPSは、現在、突然変異を識別するための最進のアプローチである。MPSのためのサンプル(「ライブラリー」)調製は、全ゲノムシーケンシングもしくは全エクソームシーケンシングまたはターゲティングリシーケンシングを適用する前の非常に重要な工程である。NaMEは、突然変異に関する多数の標的を予想通りに濃縮し、それにより、MPSが、過剰のシーケンスリード数を必要とせずに、本来的には非常に少ない存在量の突然変異を容易に識別することを可能にし得るので、MPSの前のサンプル調製のためのユニークな利点を提供する。これは、コストの削減ならびに感度および簡便性の増加を可能にする。図8は、MPSの前のNaME強化サンプル調製プロセスの例を提供する。このアプローチでは、目的のすべての標的の野生型核酸を同時に選択的に切断するために、(先のセクションに記載されているように、多数の遺伝子突然変異に対する重複プローブを同時に使用した)多重NaMEを元の出発物質に適用する。次いで、サンプルを増幅して、突然変異DNA標的を優先的に濃縮する。最後に、MPSの前に、得られた突然変異濃縮DNAをルーチンライブラリーの構築に使用する。
これまでに記載されている実施形態ではすべて、濃縮突然変異標的配列を有するサンプルを生産するために、野生型DNA対立遺伝子のDSN消化の適用後に、増幅工程を行う。あるいは、突然変異標的配列を濃縮するための別の方法は、(増幅せずに)野生型配列を排除することである。
多くの場合、(KRASなどの単一のホットスポット位置における公知の突然変異の識別とは対照的に)長いDNA領域における突然変異をスキャンする必要がある。隣接DNA配列に相補的な2つのより長いプローブ(第1のプローブはボトム鎖に対するものであり、第2の隣接プローブはトップ鎖に対するものである)を使用して、NaMEを「突然変異スキャニング」に適合させ得る。例えば、50〜70bpのプローブを使用して、100〜140塩基対の領域をカバーし得る。これら140塩基対のいずれかの位置に突然変異がある場合、対応する鎖は、DSNによって実質的に切断されない。したがって、突然変異体鎖は残るので、その後にPCR産物を得て、これを配列決定し得る(図12A)。このようにして、突然変異の位置にかかわらず、p53のような腫瘍抑制遺伝子上のより長い領域を、突然変異について濃縮し得る(図12Bおよび12C)。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、一本鎖形式の野生型cDNAまたはmRNAまたはDNAを選択的に切断するために使用され得る。dsDNAでは、各逆鎖に対して1つのプローブが使用されるのとは反対に、このアプローチ(図13)では、1つの標的遺伝子に必要なプローブは1つのみであろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、その後の濃縮のための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用される。このような実施形態では、反応混合物に対してNaMEを実行する前に、核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する(シトシンがCpGジヌクレオチド位置でメチル化されていない限り、亜硫酸水素塩は、すべてのシトシンをウラシルに変換する)。これらの方法において使用されるオリゴヌクレオチドプローブペアは、目的のメチル化核酸のトップ鎖およびボトム鎖に相補的である(すなわち、亜硫酸水素塩変換の後、オリゴヌクレオチドプローブの一方は、目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、他方のオリゴヌクレオチドプローブは、目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的である)。したがって、プローブは、完全メチル化DNAを含有する対立遺伝子におけるトップ鎖およびボトム鎖と相補的な(すなわち、いかなるミスマッチも有しない)二重鎖を形成する。対照的に、(亜硫酸水素塩変換前にはシトシンであった)ウラシルの位置におけるミスマッチにより、プローブは、非メチル化シトシンを含有する対立遺伝子と部分的に相補的な二本鎖を形成する。その結果、メチル化二重鎖はDSNによって切断されるが、非メチル化二重鎖は依然として、その後の増幅のために実質的にインタクトである(図14)。
本開示のいくつかの態様は、「連鎖反応アプローチ」を使用して、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法に関する。前記方法は、(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露して反応混合物を作る工程(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);(b)前記反応混合物を変性温度に供して、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にする工程;ならびに(c)前記温度を低下させて、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上の対応する配列への前記プローブの迅速なハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成する工程を含み、前記DSNは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない。
本開示のいくつかの態様は、図10に示されているように、NaMEプロセスとPCR増幅とを単一工程で組み合わせた方法を提供する。したがって、本開示の態様は、標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペアと、PCR増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製する工程(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);(b)前記反応混合物を変性温度に供して、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にする工程;(c)前記温度を低下させて、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上の対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成する工程(ここで、前記DSNは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない);ならびに(d)前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮する工程を含む方法を提供する。
本開示のいくつかの態様は、DSNまたはエキソヌクレアーゼなどの酵素を使用した全ゲノムレベルにおける目的の対立遺伝子の温度ベースの優先的濃縮を使用して、目的の非メチル化核酸またはメチル化核酸を調製するための方法を提供する。このアプローチでは、プローブを使用する必要がない。ゲノムDNAをより小さい断片に消化する。末端修復および亜硫酸水素塩耐性アダプターのライゲーション後、亜硫酸水素塩処理を適用する。C>T変換を考慮すると、非メチル化配列はより低いTmに戻るが、メチル化配列は依然として高いTmである。次に、増幅された二本鎖DNAライブラリーを作製するために、ライゲーションアダプターを使用して、PCRを適用する。(あるいは、前記方法を反復配列にのみ適用するために、亜硫酸水素塩処理されたALU、LINE1およびゲノム全体に広がる他の反復エレメントに特異的なプライマーを使用した反復エレメントのPCR;または前記方法を大きい任意のゲノム画分に適用するために、任意プライムPCR(AP−PCR)を適用し得る;または、COLD−PCRを適用し得る。PCRに代えて、等温型増幅も使用し得る)。
以下のように、亜硫酸水素塩変換工程を実施する前に、このような「情報価値のない」配列をサンプルから実質的に枯渇させ得る。
選択Tmを有する配列をゲノムDNAサンプルから除去するための別のアプローチは、固体支持体ベースの温度分画を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、磁気ビーズを含む。さらなる処理の前に、ゲノムDNA断片を別個の温度ドメインに分離することを可能にするために、磁気ビーズをゲノムDNAサンプルの固定化に使用し得る(図17)。ゲノムDNA断片を別個の温度ドメインに分離した後、非メチル化対立遺伝子の優先的増幅を各ドメイン内で別々に適用して、いかなる濃縮利益も提供しない望ましくないより低いTmのDNA断片の増幅による干渉を最小限にし得る。このプロトコールを適用するために、ビオチン化亜硫酸水素塩耐性アダプターと非ビオチン化亜硫酸水素塩耐性アダプターとの混合物を用いて、図15に表されているライゲーション工程を実施し、その後、ゲノムDNA断片の大部分を一方の鎖のみからストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ上に捕捉する(逆鎖は依然としてビオチン化されていない)。適用される条件(全DNAに対する全ビーズ)は、十分な配列コピーが固定化されて、低レベルの事象が断片集団で保持されるように、数百ナノグラムのビオチン化DNAの固定化を可能にする。未結合DNAの洗浄後、5つの異なる連続工程(例えば、3℃異なる)で、温度を上昇させる。各工程中に、より低いTmの断片由来の非ビオチン化DNA鎖は徐々に変性して上清から溶出し、次いで、ビーズ磁化後にこれを回収する(図17)。約4〜5℃の間隔内で、DNAは、二本鎖からほぼ一本鎖に変化する。3℃の温度間隔で上清を回収することによって、所定の温度ドメイン内の配列において、ゲノムDNA断片を高濃縮する(例えば、10〜100倍)。
本開示のいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること;前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させて、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上の対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複し、前記プローブの一方または両方は、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、異種核酸(XNA)、またはPCR増幅を遮断することができる任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはRNAを含む);ならびに前記トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを増幅条件に供することを含む方法を提供する。突然変異位置と重複するプローブは、野生型トップDNA鎖および野生型ボトムDNA鎖のPCR増幅を遮断するように作用し(例えば、クランプとして作用し)、それにより、野生型核酸の増幅を阻害する。プローブが部分的に相補的な標的突然変異体配列と二重鎖形成する場合、それはPCR増幅をあまり阻害することができず、それにより、切断酵素(例えば、DSN)を必要とせずに、野生型と比較して突然変異体核酸を選択的に増幅することが可能になる。
NaMEは、一本鎖DNA(ssDNA)と対比して二本鎖DNA(dsDNA)に対して実質的により高い活性を有するヌクレアーゼ(DNase)を利用する。ネイティブなエビdsDNase、組換えエビdsDNase、カブトガニヌクレアーゼ(DSN)およびウシDNase Iを含む多くのDNaseは、このような活性を示す。以下のセクションでは、DSN耐熱性ヌクレアーゼに関するNaME実施形態が提供されるが、ssDNAと対比してdsDNAに対して実質的により高い活性を示すすべての他のヌクレアーゼについて、同じアプローチを使用し得る。耐熱性ヌクレアーゼ(DSN)は、二本鎖DNA(またはDNA/RNAハイブリッド)を選択的に分解するが、それは、一本鎖DNAまたは一本鎖RNAに対してほとんどまたは全く作用しない。
図5〜7は、単一KRAS標的配列または単一p53配列(図5)、同時に2つの標的(二重KRASおよびp53)(図6)、および単一標的反応で3つの異なるKRAS突然変異(図7A)について、ゲノムDNAに直接適用したNaMEを実証している。図5では、別々の反応において、約0.5%のKRAS突然変異またはp53突然変異を有するゲノムDNAを95℃で変性させ、重複ブロックプローブおよびDSNの存在下、65℃で20分間インキュベートした。突然変異存在量を定量するその後のデジタルPCRによって、KRA突然変異またはp53突然変異の濃縮を検出した。図6では、単一チューブ中で、KRAS突然変異ゲノムDNAおよびp53突然変異ゲノムDNAを混合したことを除いて、ゲノムDNAは図5と同じプロトコールを受けた。KRAS突然変異およびp53突然変異の両方を含有するSW480細胞株由来のゲノムDNAを野生型DNAと混合して、低存在量の突然変異を両遺伝子上に作った。2つの突然変異の割合を試験した:約5%および約0.3%。図7Aでは、1〜5%のKRAS突然変異を有するゲノムDNAであって、3つの異なる細胞株由来のゲノムDNAが、別々の反応で、上記と同じプロトコールを受けた。図7Bでは、DNAを変性させ、温度を67℃に低下させ、20分間のインキュベーションのために、DSNおよび重複プローブを添加した。DSNを不活化し、各標的アンプリコンに対してPCRおよびデジタルPCRを実施して、それらの各突然変異存在量を求めた。突然変異はすべて、NaMEによって同時に濃縮される。図7Bは、各標的上に公知の低レベル突然変異を含有する11個の標的に同時に(すなわち、Horizon Dxから入手したゲノムDNAから直接)NaMEを適用した場合の、突然変異の濃縮を表す。NaMEをゲノムDNAに直接適用した後、11個すべての標的が同時に濃縮されていることが実証されている。
図12Bおよび12Cは、TP53エクソン8における40〜80bpの領域の突然変異濃縮のためにNaMEを使用した場合の結果を表す。試験した4つの突然変異はすべて、NaMEによって濃縮される。図12Bでは、PFSK細胞株またはHCC細胞株由来の突然変異含有DNAをWT DNAに連続希釈し、次いで、1回目のPCRを適用して目的の標的(tp53)を増幅した。アンプリコンを変性させ、次いで、プローブおよびDSNの存在下、65℃でインキュベートした。2つのプローブは、それぞれWTのトップ鎖およびボトム鎖に対応する。突然変異の存在はDSN消化を阻害するので、PCRラウンド中に、突然変異DNAが増幅される。突然変異濃縮に対するプローブの長さおよび濃度の効果も図12Bに表されている。図12Cでは、PFSK細胞株、HCC細胞株、SW480細胞株およびMDAMB細胞株由来の突然変異含有DNA(これらはすべて、p53エクソン8上に異なる突然変異を有する)をWT DNAに連続希釈し、次いで、図12Bに記載されているのと同じプロトコールを実施した。NaME適用の前後両方にデジタルPCRを実施することによって、突然変異濃縮倍率を計算した。
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Claims (43)
- 野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること;
前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複し、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること;ならびに
前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複し、反応混合物を作ること;ならびに
前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件が、有機溶媒の添加および/または耐熱性DSNと組み合わせた温度の上昇を含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複し、反応混合物を作ること;
前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること;ならびに
前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 各プローブが、ロックド核酸、ペプチド核酸、異種核酸(XNA)、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはRNAを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記対応する野生型核酸に対する1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各標的突然変異体核酸およびプローブペアについて、前記プローブの一方が前記対応する野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記対応する野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムDNAまたは循環DNAを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を最初に濃縮することをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている、請求項10に記載の方法。
- 前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている、請求項11に記載の方法。
- 最初に前記核酸サンプルを増幅条件に供することをさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅条件が、PCR、COLD−PCR、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性PCRまたはCOLD−PCR、マルチプレックスPCRおよび等温増幅からなる群より選択される、請求項13または14に記載の方法。
- 各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、請求項13〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記DSN切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるDNA分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- MALDI−TOF、HR融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング(MPS)、パイロシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCRおよび定量PCRからなる群より選択される方法の1つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的の核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的の核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブは、前記目的の核酸のメチル化形態に相補的である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が亜硫酸水素塩変換した前記目的の核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが亜硫酸水素塩変換した前記目的の核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが亜硫酸水素塩変換した前記目的の核酸の非メチル化形態に相補的である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、前記核酸サンプルを、亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが、前記目的の非メチル化標的核酸を含む鎖に結合するオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが、前記目的のメチル化標的核酸を含む鎖に結合するオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む2つのオリゴヌクレオチドプローブペアを用いる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。 - 複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、一つのプローブが、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他のプローブが、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、一つのプローブが、目的の各メチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む複数のオリゴヌクレオチドプローブペアを用いる、請求項21に記載の方法。 - 野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複し、反応混合物を作ること;
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;ならびに
(c)前記反応混合物の温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、請求項23に記載の方法。
- 工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項23〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性温度が65〜85℃である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への、異なるTmを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程(c)を実施する、請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
- DSN消化中に67℃〜64℃の漸減温度勾配を適用して、64〜67℃の異なるTmを有するプローブがそれらの個々の標的にハイブリダイズすることを可能にする、請求項28に記載の方法。
- 前記温度勾配が2〜20℃の範囲である、請求項28または29に記載の方法。
- 切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項23〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項23〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項23〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であり、ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複するオリゴヌクレオチドプローブペアと、PCR増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること;
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
(c)前記反応混合物の温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成することであって、ここで、前記DSNは、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、前記温度を低下させること;ならびに
(d)切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮すること
を含む、方法。 - 工程(d)を行う前に、工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 工程(b)、(c)および(d)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項34〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性温度が65〜85℃である、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、請求項34〜39のいずれか一項に記載の方法。
- PCR増幅に使用されるプライマーが、工程(c)において適用された温度未満の融解温度を有する、請求項34〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 野生型核酸と比べて2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項34〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅条件がCOLD−PCRである、請求項34〜42のいずれか一項に記載の方法。
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