CN116240200A - 一种基于可编程核酸酶的超灵敏目标核酸富集检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于可编程核酸酶的超灵敏目标核酸富集检测方法,属于生物技术领域。本发明富集方法基于可编程核酸酶的特异性切割,通过设计和优化sgRNA、guide DNA或guide RNA,使用sgRNA、guide DNA或guide RNA和Cas蛋白或Ago蛋白形成核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein),能够在恒温扩增的同时不断特异地去除非目标核酸,让样品中目标核酸的数量连续不断地呈指数增加,从而富集或检测低丰度突变基因或甲基化DNA等目标核酸。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种基于可编程核酸酶的超灵敏目标核酸富集检测方法。
背景技术
体细胞突变与肿瘤发生密切相关,突变检测对疾病早期筛查、精准治疗决策、复发监测具有重要意义。近年来,以液体活检为代表的非侵入性诊断成为一种趋势。液体活检通过检测体液中来源于肿瘤的游离核酸片段,分析肿瘤的基因型,具有无创性、易于实现动态监测等优势。然而,液体活检面临如下问题:1)突变核酸与野生型核酸具有较高的序列同源性,通常只有单个或几个核苷酸的差别,对于在大量游离的野生型等位基因中鉴定出低丰度的突变等位基因提出了挑战;2)对于体液中低丰度甲基化基因的检测也面临同样问题,甲基化基因与非甲基化基因序列相同,只存在碱基修饰的差异,对于在大量游离的非甲基化基因中鉴定出低丰度的甲基化基因提出了挑战。
目前突变等位基因的高灵敏检测通常使用下一代测序(NGS)或依赖数字PCR的蛮力计数来检测微弱的信号。尤其在微小残留病灶(MRD)检测中,针对极低丰度的突变基因,主要基于超深度(50000X)NGS测序,存在费用高,耗时长,难以普及到临床的问题。因此,亟需开发一种低成本的超灵敏极低丰度突变等位基因检测方法,以促进临床应用。
近年来,基于CRISPR-Cas可编程核酸酶的诊断技术成为研究热点。CRISPR-Cas系统是古细菌和大多数细菌在生物进化过程中抵御病毒入侵而形成的一种适应性免疫防御系统,由Cas效应蛋白和向导RNA组成,在向导RNA的引导下,Cas蛋白识别并切割含有5’端PAM位点的靶序列。基于CRISPR-Cas的低丰度突变等位基因检测方法,旨在通过特殊的向导RNA设计,使Cas蛋白特异性切割野生型等位基因,去除大量的野生型核酸,保留突变等位基因,以提高下游分析的灵敏度。同时,也有研究者基于Argonaute蛋白(Ago),通过和guideDNA形成复合物,建立了类似的低丰度突变等位基因检测方法。
Cas蛋白的切割受PAM位点的限制,当突变导致PAM位点的破坏时,在同一样品中,Cas蛋白靶向切割大量的野生型核酸,而保留突变核酸。已有研究者针对位于PAM位点的突变,分别开发了DASH(Depletion of Abundant Sequences by Hybridization)和CUT-PCR等低丰度突变等位基因检测方法。Argonaute蛋白不受PAM位点的限制,已有研究者开发了NAVIGATER(NucleicAcid enrichmentVia DNAGuidedArgonaute fromThermusthermophilus)低丰度突变等位基因检测方法。
DASH法和CUT-PCR虽然在一定程度上提高了下游分析的灵敏度,但现有的基于可编程核酸内切酶检测方法的有效性因酶和靶标之间的无效结合事件受到影响,由于cas9的解离效率非常缓慢,使得部分野生型等位基因靶标受到保护而不被切割,同时非特异的脱靶切割会耗尽极稀少的突变型等位基因。NAVIGATER也存在类似问题。为了克服这些缺点,研究人员采用了多轮选择性切割野生型等位基因,然后进行聚合酶链反应,使突变型等位基因的片段富集10倍。尽管有了这些改进,突变等位基因检测的高灵敏度仍然需要使用下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)或依赖于数字PCR,使得这些方法费力、耗时和昂贵。
对于液体活检中的低丰度甲基化基因检测,以上技术存在类似问题,也难以满足要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于可编程核酸酶的超灵敏肿瘤相关基因富集方法,使用本发明方法能够高效对低丰度突变基因以及甲基化基因进行富集,同时利用微流控芯片技术使本发明方法能够自动化。
为达到上述发明目的,采用如下技术方案:
一种核糖核蛋白复合物,包括:
组分(a),包含能够与靶核酸互补配对的核酸区域和0-4bp错配片段;或能够与靶核酸互补配对的核酸区域且相邻PAM包括易突变位点;
组分(b),能够与靶核酸结合并使靶核酸链断裂;
其中,组分(a)选自选自tracrRNA和/或crRNA和/或sgRNA和/或tracrRNA衍生物和/或crRNA衍生物和/或sgRNA衍生物和/或guide DNA和/或guide RNA ;组分(b)包括Cas蛋白和/或Cas蛋白衍生物和/或Ago蛋白和/或Ago蛋白衍生物;组分(a)和(b)能够结合。优选地,组分(a)可携带标记,标记包括链霉亲和素或生物素。
优选地,错配的核苷酸片段长度为0bp 或1bp或2bp或3bp或4bp。
优选地,组分(a)携带化学修饰,化学修饰包括硫取代氧或甲氧基修饰。
优选地,组分(a)中sgRNA、guide DNA或guide RNA包括错配核苷酸片段。本发明所设计的错配核苷酸片段有利于扩大sgRNA、guide DNA或guide RNA的使用范围,能够使sgRNA、guide DNA或guide RNA识别更多突变。
优选地,组分(a)中sgRNA相邻的PAM含有肿瘤热点突变位点。
优选地,组分(a)中sgRNA的spacer序列长度为16-22nt。
更优选地,sgRNA序列如下所示:
UCUUAAUUCCUUGAUAGCGA(SEQ ID NO.1);
UAGCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.2);
UAGCUACAGUGAAAUCACGA(SEQ ID NO.3);
GCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.4);
GUCUAGCUACAGUGAAA(SEQ ID NO.5);
GUCUAGCUGCAGUGAAA(SEQ ID NO.6);
GGCAGCCGAAGGGCAUGAGC(SEQ ID NO.27);
GGCAGCCGAAGAGCAUGAGC(SEQ ID NO.28);
AAUUUUUGUUUGAGUGGUUG (SEQ ID NO.37);
UCCAGCUGUAUCCAGUAUGU(SEQ ID NO.42)。
更优选地,guide DNA序列如下所示:
正向guide:p-TAGATTTCACTGTAGC-3’(SEQ ID NO.43);
反向guide:p-TTCTAGCTACAGTGAA -3’(SEQ ID NO.44)。
优选地,组分(b)包括以下至少一种:Cas12a,SacCas9,CjCas9,SpCas9,NmCas9,Sp-Cas9 HF1,evoCas9,HypaCas9,HiFi Cas9,Sniper-Cas9,xCas9,eSpCas9 1.1,SuperFiCas9,SaCas9,SaCas9-HF,efSaCas9,ScCas9,Cas9—Sc++,Cas9 HiFi-Sc++,SpaCas9,SpaCas9-HF,FnCas9,AnaCas9,SpyCas9,FnCas12a,LbCas12a,AsCas12a,CbAgo,TtAgo,PfAgo,KmAgo或KpAgo。
更优选地,Cas12a来自以下至少一个菌种:Francisella novicida;Acidaminococcus;Lachnospiraceae。
更优选地,SacCas9来自菌种Staphylococcus aureus。
更优选地,CjCas9来自菌种Campylobacter jejuni。
更优选地,SpCas9来自菌种Streptococcus pyogenes。
更优选地,NmCas9来自菌种Neisseria meningitidis。
更优选地,SaCas9来自菌种Staphylococcus aureus。
更优选地,ScCas9来自菌种Streptococcus canis。
更优选地,SpaCas9来自菌种Streptococcus pasteurianus。
优选地,核糖核蛋白复合物中,组分(a)的终浓度为0.1-2μM。
优选地,核糖核蛋白复合物中,组分(b)的终浓度为0.1-3μM。
优选地,核糖核蛋白复合物中,还包括氢离子缓冲剂。
更优选地,核糖核蛋白复合物中,氢离子缓冲剂终浓度为1mM-2 M。
本发明还公开了上述核糖核蛋白在富集和/或检测突变基因中的用途。
本发明还公开了上述核糖核蛋白在富集和/或检测甲基化DNA中的用途。
优选地,基因包括以下至少一种:EGFR,BRAF,PIK3CA,TP53,LRP1B,APC,CYP1A1,NP01,EPHX1,KRAS,BRCA1,BRCA2,MET,MLH1,MSH2,MSH3,MSH6,PALB2,BMPR1A,SMAD4,STK11,PTEN,AXIN2,BLM,BUB1B,CDH1,CEP57,CHEK2,ENG,EPCAM,FLCN,GALNTI2,GREM1,FAT4,KMT2D,KMT2C,ARID1A,FAT1,PTEN,ATM,ZFHX3,CREBBP,GRIN2A,NRAS或NF1。
本发明还公开了一种核糖核蛋白复合物的制备方法,包括:将Cas9、sgRNA和氢离子缓冲剂混合孵育,将Ago、guide DNA或RNA和氢离子缓冲剂混合孵育。
优选地,氢离子缓冲剂包括HEPES。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的Cas9的终浓度为0.1-3μM。
更优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的Cas9的终浓度为2.5μM。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的sgRNA的终浓度为0.1-2μM。
更优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的sgRNA的终浓度为2.5μM。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的HEPES的终浓度为1mM-2M。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的HEPES的终浓度为1M。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,反应温度为34-39℃,反应时间为3-18min。
更优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,反应温度为37℃,反应时间为10min。
本发明还公开了一种用于可编程酶的突变基因的富集和/或甲基化DNA的富集的反应体系,该反应体系包括上述核糖核蛋白复合物。
优选地,核糖核蛋白复合物包括:
组分(a),包含能够与靶核酸互补配对的核酸区域和0-4bp错配片段;
组分(b),能够与靶核酸结合并使靶核酸链断裂;
其中,组分(a)选自tracrRNA和/或crRNA和/或sgRNA和/或tracrRNA衍生物和/或crRNA衍生物和/或sgRNA衍生物和/或guide DNA和/或guide RNA;组分(b)包括Cas蛋白和/或Cas蛋白衍生物和/或Ago蛋白和/或Ago蛋白衍生物;组分(a)和(b)能够结合。优选地,组分(a)携带标记,标记包括链霉亲和素或生物素。
优选地,错配的核苷酸片段长度为0bp 或1bp或2bp或3bp或4bp。
更优选地,组分(a)携带化学修饰,化学修饰包括硫取代氧或甲氧基修饰。
更优选地,组分(a)中sgRNA、guide DNA或guide RNA包括错配核苷酸片段。
更优选地,组分(a)中sgRNA、guide DNA或guide RNA的spacer序列长度为16-22nt。
更进一步优选地,sgRNA序列下所示:
UCUUAAUUCCUUGAUAGCGA(SEQ ID NO.1);
UAGCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.2);
UAGCUACAGUGAAAUCACGA(SEQ ID NO.3);
GCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.4);
GUCUAGCUACAGUGAAA(SEQ ID NO.5);
GUCUAGCUGCAGUGAAA(SEQ ID NO.6);
GGCAGCCGAAGGGCAUGAGC(SEQ ID NO.27);
GGCAGCCGAAGAGCAUGAGC(SEQ ID NO.28);
AAUUUUUGUUUGAGUGGUUG (SEQ ID NO.37);
UCCAGCUGUAUCCAGUAUGU(SEQ ID NO.42)。
更优选地,guide DNA序列如下所示:
正向guide:p-TAGATTTCACTGTAGC-3’(SEQ ID NO.43);
反向guide:p-TTCTAGCTACAGTGAA -3’(SEQ ID NO.44)。
更优选地,组分(b)包括以下至少一种:Cas12a,SacCas9,CjCas9,SpCas9,NmCas9,Sp-Cas9 HF1,evoCas9,HypaCas9,HiFi Cas9,Sniper-Cas9,xCas9,eSpCas9 1.1,SuperFiCas9,SaCas9,SaCas9-HF,efSaCas9,ScCas9,Cas9—Sc++,Cas9 HiFi-Sc++,SpaCas9,SpaCas9-HF,FnCas9,AnaCas9,SpyCas9,FnCas12a,LbCas12a,AsCas12a,CbAgo,TtAgo,PfAgo,KmAgo或KpAgo。
更进一步优选地,Cas12a来自以下至少一个菌种:Francisella novicida;Acidaminococcus;Lachnospiraceae。
更进一步优选地,SacCas9来自菌种Staphylococcus aureus。
更进一步优选地,CjCas9来自菌种Campylobacter jejuni。
更进一步优选地,SpCas9来自菌种Streptococcus pyogenes。
更进一步优选地,NmCas9来自菌种Neisseria meningitidis。
更优选地,SaCas9来自菌种Staphylococcus aureus。
更优选地,ScCas9来自菌种Streptococcus canis。
更优选地,SpaCas9来自菌种Streptococcus pasteurianus。
更优选地,核糖核蛋白复合物中,组分(a)的终浓度为0.1-2μM。
更优选地,核糖核蛋白复合物中,组分(b)的终浓度为0.1-3μM。
更优选地,核糖核蛋白复合物中,还包括氢离子缓冲剂。
更进一步优选地,核糖核蛋白复合物中,氢离子缓冲剂终浓度为1mM-2 M。
优选地,反应体系中,核糖核蛋白复合物的终浓度0.1-2μM。
优选地,反应体系还包括:引物、目的基因、酶和助色基团。
优选地,反应体系还包括:dNTP、单链结合蛋白。
更优选地,目的基因包括:基因组DNA或cell-free DNA。
更进一步优选地,目的基因包括从以下至少一种细胞株中提取的基因组DNA:
EGFR 19del野生型细胞株;EGFR 19 E746_A750 del(2235-2249del)细胞株;EGFR19 E746_A750 del(2236-2250del);BRAF V600E突变型;BRAFV600E野生型细胞株;B-CPAP细胞株。
更优选地,引物包括能够与目的基因结合并且引导合成的核苷酸序列。
更进一步优选地,引物包括以下至少一条序列:
GCATGTGGCACCATCTCACA(SEQ ID NO.15);
AGAGCAGCTGCCAGACATGA(SEQ ID NO.16);
CTACACCTCAGATATATTTC(SEQ ID NO.19);
TGGATCCAGACAACTGT(SEQ ID NO.20);
TACGTGATGGCCAGCGTGGA(SEQ ID NO.23);
ACTGGGAGCCAATATTGT(SEQ ID NO.24);
TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.33);
TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG(SEQ ID NO.34);
TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.35);
CAACGCCTCGAAACCTACG(SEQ ID NO.36)。
CCCCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT(SEQ ID NO.38);
GCAAATACACAGAGGAAGCCTTCGCCTGTCCTC(SEQ ID NO.39);
CAAGTGGTTATAGATGGTGA(SEQ ID NO.40);
CGCCTGTCCTCATGTATTGG(SEQ ID NO.41)。
更优选地,酶包括:DNA聚合酶和/或重组酶。
更优选地,助色基团包括MgOAc。
优选地,上述反应体系可用于富集MAF≥0.01%的突变型等位基因。
本发明还公开了上述反应体系的用途,包括以下至少一种:
(1)靶向结合靶核酸片段;
(2)靶向切割靶核酸片段;
(3)富集突变基因;
(4)检测突变基因;
(5)富集甲基化DNA;或,
(6)检测甲基化DNA。
优选地,上述富集包括自动化富集;上述检测包括自动化检测。
更优选地,上述自动化富集包括使用微流控芯片进行富集;上述自动化检测包括使用微流控芯片进行检测。
更进一步优选地,微流控芯片分为三部分,由顶层封装片、底层封装片以及中间的反应层构成。
更进一步优选地,顶层封装片结构包括:微流控芯片安装孔;微流控芯片封装定位孔;微流控芯片进样孔。
更进一步优选地,中间反应层结构包括:微流控芯片封装定位孔;微流控芯片安装孔;预扩增反应腔;虹吸阀;消化反应腔;预分配腔;PCR反应腔;废液腔;毛细阀;10:气体通路。
更进一步优选地,底层封装片结构包括:微流控芯片安装孔;微流控芯片封装定位孔;RNaseA加样腔;ProteinaseK加样腔。
优选地,突变基因包括癌症相关基因。
优选地,癌症相关基因包括以下至少一种:
EGFR,BRAF,PIK3CA,TP53,LRP1B,APC,CYP1A1,NP01,EPHX1,KRAS,BRCA1,BRCA2,MET,MLH1,MSH2,MSH3,MSH6,PALB2,BMPR1A,SMAD4,STK11,PTEN,AXIN2,BLM,BUB1B,CDH1,CEP57,CHEK2,ENG,EPCAM,FLCN,GALNTI2,GREM1,FAT4,KMT2D,KMT2C,ARID1A,FAT1,PTEN,ATM,ZFHX3,CREBBP,GRIN2A,NRAS或NF1。
优选地,甲基化DNA包括癌症相关甲基化基因和/或其启动子。
优选地,癌症相关甲基化基因包括以下至少一种:
PCDH-10,BRCA1,RASSF1A,ESR1,APC,p14ARF,p16INK4a,DAPK,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5,HIC1,PAX5,PGR,THBS1,ESR,COL23A1,C2CD4D,WNT6,OPCML,ZNF154,RARb2,ATM,MGMT,GSTP1,MIR129-2,LINC01158,CCDC181,PRKCB,TBR1,ZNF781,MARCH11,VWC2,SLC9A3,HOXA7,Septin9,IKZF1,BCAT1,hMLH1,WIF1,CDKN2A,SHOX2,3OST2,ASSF1A,RARb,PITX2,NID2,NEUROG2或HOXA1;
启动子包括以下基因的启动子中的至少一种:
PCDH-10,BRCA1,RASSF1A,ESR1,APC,p14ARF,p16INK4a,DAPK,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5,HIC1,PAX5,PGR,THBS1,ESR,COL23A1,C2CD4D,WNT6,OPCML,ZNF154,RARb2,ATM,MGMT,GSTP1,MIR129-2,LINC01158,CCDC181,PRKCB,TBR1,ZNF781,MARCH11,VWC2,SLC9A3,HOXA7,Septin9,IKZF1,BCAT1,hMLH1,WIF1,CDKN2A,SHOX2,3OST2,ASSF1A,RARb,PITX2,NID2,NEUROG2或HOXA1。
本发明还公开了上述核糖核蛋白复合物的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA。
优选地,基因包括:EGFR,BRAF,PIK3CA,TP53,LRP1B,APC,CYP1A1,NP01,EPHX1,KRAS,BRCA1,BRCA2,MET,MLH1,MSH2,MSH3,MSH6,PALB2,BMPR1A,SMAD4,STK11,PTEN,AXIN2,BLM,BUB1B,CDH1,CEP57,CHEK2,ENG,EPCAM,FLCN,GALNTI2,GREM1,FAT4,KMT2D,KMT2C,ARID1A,FAT1,PTEN,ATM,ZFHX3,CREBBP,GRIN2A,NRAS或NF1。
本发明还公开了Cas蛋白的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA。
本发明还公开了Ago蛋白的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA。
优选地,基因包括以下至少一种:EGFR,BRAF,PIK3CA,TP53,LRP1B,APC,CYP1A1,NP01,EPHX1,KRAS,BRCA1,BRCA2,MET,MLH1,MSH2,MSH3,MSH6,PALB2,BMPR1A,SMAD4,STK11,PTEN,AXIN2,BLM,BUB1B,CDH1,CEP57,CHEK2,ENG,EPCAM,FLCN,GALNTI2,GREM1,FAT4,KMT2D,KMT2C,ARID1A,FAT1,PTEN,ATM,ZFHX3,CREBBP,GRIN2A,NRAS或NF1。
优选地,Cas蛋白包括以下至少一种:Cas12a,SacCas9,CjCas9,SpCas9,NmCas9,Sp-Cas9 HF1,evoCas9,HypaCas9,HiFi Cas9,Sniper-Cas9,xCas9,eSpCas9 1.1,SuperFiCas9,SaCas9,SaCas9-HF,efSaCas9,ScCas9,Cas9—Sc++,Cas9 HiFi-Sc++,SpaCas9,SpaCas9-HF,FnCas9,AnaCas9,SpyCas9,FnCas12a,LbCas12a或AsCas12a。
优选地,Ago蛋白包括以下至少一种:CbAgo,TtAgo,PfAgo,KmAgo或KpAgo。
本发明还公开了一种用于可编程酶的突变基因的富集的试剂盒,试剂盒包括上述核糖核蛋白复合物。
优选地,核糖核蛋白复合物包括:
组分(a),包含能够与靶核酸互补配对的核酸区域和0-4bp错配片段;
组分(b),能够与靶核酸结合并使靶核酸链断裂;
其中,组分(a)选自tracrRNA和/或crRNA和/或sgRNA和/或tracrRNA衍生物和/或crRNA衍生物和/或sgRNA衍生物和/或guide DNA和/或guide RNA;组分(b)包括Cas蛋白和/或Cas蛋白衍生物和/或Ago蛋白和/或Ago蛋白衍生物;组分(a)和(b)能够结合。
优选地,错配的核苷酸片段长度为0bp 或1bp或2bp或3bp或4bp。
优选地,组分(a)携带标记,标记包括链霉亲和素或生物素。
更优选地,组分(a)携带化学修饰,化学修饰包括硫取代氧或甲氧基修饰。
更优选地,组分(a)中sgRNA包括错配核苷酸片段。
更优选地,组分(a)中sgRNA的spacer序列长度为16-22nt。
更进一步优选地,sgRNA序列如下所示:
UCUUAAUUCCUUGAUAGCGA(SEQ ID NO.1);
UAGCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.2);
UAGCUACAGUGAAAUCACGA(SEQ ID NO.3);
GCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.4);
GUCUAGCUACAGUGAAA(SEQ ID NO.5);
GUCUAGCUGCAGUGAAA(SEQ ID NO.6);
GGCAGCCGAAGGGCAUGAGC(SEQ ID NO.27);
GGCAGCCGAAGAGCAUGAGC(SEQ ID NO.28);
AAUUUUUGUUUGAGUGGUUG (SEQ ID NO.37);
UCCAGCUGUAUCCAGUAUGU(SEQ ID NO.42)。
更优选地,guide DNA序列如下所示:
正向guide:p-TAGATTTCACTGTAGC-3’(SEQ ID NO.43);
反向guide:p-TTCTAGCTACAGTGAA-3’(SEQ ID NO.44)。
更优选地,组分(b)包括以下至少一种:Cas12a,SacCas9,CjCas9,SpCas9,NmCas9,Sp-Cas9 HF1,evoCas9,HypaCas9,HiFi Cas9,Sniper-Cas9,xCas9,eSpCas9 1.1,SuperFiCas9,SaCas9,SaCas9-HF,efSaCas9,ScCas9,Cas9—Sc++,Cas9 HiFi-Sc++,SpaCas9,SpaCas9-HF,FnCas9,AnaCas9,SpyCas9,FnCas12a,LbCas12a,AsCas12a,CbAgo,TtAgo,PfAgo,KmAgo或KpAgo。
更进一步优选地,Cas12a来自以下至少一个菌种:Francisella novicida;Acidaminococcus;Lachnospiraceae。
更进一步优选地,SacCas9来自菌种Staphylococcus aureus。
更进一步优选地,CjCas9来自菌种Campylobacter jejuni。
更进一步优选地,SpCas9来自菌种Streptococcus pyogenes。
更进一步优选地,NmCas9来自菌种Neisseria meningitidis。
更优选地,SaCas9来自菌种Staphylococcus aureus。
更优选地,ScCas9来自菌种Streptococcus canis。
更优选地,SpaCas9来自菌种Streptococcus pasteurianus。
更优选地,核糖核蛋白复合物中,组分(a)的终浓度为0.1-2μM。
更优选地,核糖核蛋白复合物中,组分(b)的终浓度为0.1-3μM。
更优选地,核糖核蛋白复合物中,还包括氢离子缓冲剂。
更进一步优选地,核糖核蛋白复合物中,氢离子缓冲剂终浓度为1mM-2 M。
优选地,试剂盒还包括恒温切割-扩增反应体系。
优选地,反应体系中,核糖核蛋白复合物的终浓度0.1-2μM。
优选地,反应体系还包括:引物、目的基因、酶和助色基团。
优选地,反应体系还包括:dNTP、单链结合蛋白。
更优选地,目的基因包括:基因组DNA或cell-free DNA。
更进一步优选地,目的基因包括从以下至少一种细胞株中提取的基因组DNA:
EGFR 19del野生型细胞株;EGFR 19 E746_A750 del(2235-2249del)细胞株;EGFR19 E746_A750 del(2236-2250del);BRAF V600E突变型;BRAFV600E野生型细胞株;B-CPAP细胞株。
更优选地,引物包括能够与目的基因结合并且引导合成的核苷酸序列。
更进一步优选地,引物包括以下至少一条序列:
GCATGTGGCACCATCTCACA(SEQ ID NO.15);
AGAGCAGCTGCCAGACATGA(SEQ ID NO.16);
CTACACCTCAGATATATTTC(SEQ ID NO.19);
TGGATCCAGACAACTGT(SEQ ID NO.20);
TACGTGATGGCCAGCGTGGA(SEQ ID NO.23);
ACTGGGAGCCAATATTGT(SEQ ID NO.24);
TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.33);
TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG(SEQ ID NO.34);
TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.35);
CAACGCCTCGAAACCTACG(SEQ ID NO.36)。
CCCCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT(SEQ ID NO.38);
GCAAATACACAGAGGAAGCCTTCGCCTGTCCTC(SEQ ID NO.39);
CAAGTGGTTATAGATGGTGA(SEQ ID NO.40);或,
CGCCTGTCCTCATGTATTGG(SEQ ID NO.41)。
更优选地,酶包括:DNA聚合酶和/或重组酶。
更优选地,助色基团包括MgOAc。
优选地,上述反应体系可用于富集MAF≥0.01%的突变型等位基因。
本发明还公开了一种使用上述试剂盒进行检测和/或富集低丰度突变基因的方法,操作步骤包括:
收集样品;
制备核糖核蛋白复合物;
配制反应体系;
富集分析。
优选地,收集样品步骤包括使用核酸提取试剂盒对样品中的DNA和/或RNA进行提取。
更优选地,样品包括以下至少一种:血液、血浆/血清、脑脊液、尿液、唾液。
更进一步优选地,样品包括以下至少一种从癌症患者体内获得的:血液、血浆/血清、脑脊液、尿液、唾液。
优选地,制备核糖核蛋白复合物步骤包括:
将Cas9、sgRNA和氢离子缓冲剂混合孵育。
优选地,氢离子缓冲剂包括HEPES。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的Cas9的终浓度为0.1-3μM。
更优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的Cas9的终浓度为2.5μM。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的sgRNA的终浓度为0.1-2μM。
更优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的sgRNA的终浓度为2.5μM。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的HEPES的终浓度为1mM-2M。
更优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的HEPES的终浓度为1M。
优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,反应温度为34-39℃,反应时间为3-18min。
更优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,反应温度为37℃,反应时间为10min。
优选地,配制反应体系步骤包括配制恒温切割-扩增反应体系。
更优选地,反应体系中,核糖核蛋白复合物的终浓度0.1-2μM。
更优选地,反应体系还包括:引物、目的基因、酶和助色基团。
更优选地,反应体系还包括:dNTP、单链结合蛋白。
更进一步优选地,目的基因包括:基因组DNA。
更进一步优选地,目的基因包括从以下至少一种细胞株中提取的基因组DNA:
EGFR 19del野生型细胞株;EGFR 19 E746_A750 del(2235-2249del)细胞株;EGFR19 E746_A750 del(2236-2250del);BRAF V600E突变型;BRAFV600E野生型细胞株;B-CPAP细胞株。
更进一步优选地,引物包括能够与目的基因结合并且引导合成的核苷酸序列。
更进一步优选地,引物包括以下至少一条序列:
GCATGTGGCACCATCTCACA(SEQ ID NO.15);
AGAGCAGCTGCCAGACATGA(SEQ ID NO.16);
CTACACCTCAGATATATTTC(SEQ ID NO.19);
TGGATCCAGACAACTGT(SEQ ID NO.20);
TACGTGATGGCCAGCGTGGA(SEQ ID NO.23);
ACTGGGAGCCAATATTGT(SEQ ID NO.24);
TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.33);
TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG(SEQ ID NO.34);
TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.35);
CAACGCCTCGAAACCTACG(SEQ ID NO.36)。
CCCCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT(SEQ ID NO.38);
GCAAATACACAGAGGAAGCCTTCGCCTGTCCTC(SEQ ID NO.39);
CAAGTGGTTATAGATGGTGA(SEQ ID NO.40);或,
CGCCTGTCCTCATGTATTGG(SEQ ID NO.41)。
更进一步优选地,酶包括:DNA聚合酶和/或重组酶。
更进一步优选地,助色基团包括MgOAc。
优选地,富集分析步骤包括QPCR分析、测序、及时检测(POCT)以及上述基于可编程核酸酶的低丰度突变基因的检测方法。
更优选地,QPCR分析步骤包括配制QPCR反应体系。
更进一步优选地,QPCR反应体系包括:
引物、助色基团、dNTP、酶。
更进一步优选地,引物包括以下至少一条:
TGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGA(SEQ ID NO.17);
GCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGT(SEQ ID NO.18);
CCTCAGATATATTTCTTCATGA(SEQ ID NO.21);
TGTTCAAACTGATGGGAC(SEQ ID NO.22);
TGATGGCCAGCGTGGACAA(SEQ ID NO.25);或,
TTGTGTTCCCGGACATAGTC(SEQ ID NO.26)。
更进一步优选地,助色基团包括MgOAc。
更进一步优选地,酶包括DNA聚合酶。
本发明还公开了一种基于CRISPR系统的sgRNA的设计方法,sgRNA包括特异性识别核苷酸片段、错配核苷酸片段;其中,错配的核苷酸片段长度为0-4bp。
优选地,特异性识别核苷酸片段为spacer序列。
更优选地,spacer序列长度为18-22nt。
优选地,错配的核苷酸片段长度为0bp 或1bp或2bp或3bp或4bp。
使用本发明sgRNA设计方法设计的sgRNA能够有效区分野生型等位基因和突变型等位基因.,并且使用本发明sgRNA设计方法设计的sgRNA的spacer序列识别和切割效率高。本发明所设计的错配核苷酸片段有利于扩大sgRNA的使用范围,能够使sgRNA识别更多突变。
本发明还公开了一种sgRNA,该sgRNA包括特异性识别核苷酸片段、错配核苷酸片段;其中,错配核苷酸片段长度为0-4bp。
优选地,错配的核苷酸片段长度为0bp 或1bp或2bp或3bp或4bp。
优选地,上述sgRNA使用上述方法设计得到。
优选地,错配核苷酸的位点在突变基因的前5bp和/或突变基因的后5bp。
优选地,特异性识别核苷酸片段为spacer序列。
更优选地,spacer序列长度为18-22nt。
更优选地,sgRNA序列如下所示:
UCUUAAUUCCUUGAUAGCGA(SEQ ID NO.1);
UAGCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.2);
UAGCUACAGUGAAAUCACGA(SEQ ID NO.3);
GCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.4);
GUCUAGCUACAGUGAAA(SEQ ID NO.5);
GUCUAGCUGCAGUGAAA(SEQ ID NO.6);
GGCAGCCGAAGGGCAUGAGC(SEQ ID NO.27);
GGCAGCCGAAGAGCAUGAGC(SEQ ID NO.28);
AAUUUUUGUUUGAGUGGUUG (SEQ ID NO.37);
UCCAGCUGUAUCCAGUAUGU(SEQ ID NO.42)。
本发明还公开了上述sgRNA的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA。
本发明还公开了一种guide DNA或guide RNA,其特征在于,所述guide DNA或guideRNA包括特异性识别核苷酸片段、错配核苷酸片段;其中,错配的核苷酸片段长度为0-4bp。
优选地,错配的核苷酸片段长度为0bp 或1bp或2bp或3bp或4bp。
优选地,上述的guide DNA包括如下序列:
SEQ ID NO.43:正向guide:p-TAGATTTCACTGTAGC-3’;
SEQ ID NO.44:反向guide:p-TTCTAGCTACAGTGAA-3’。
本发明还公开了上述guide DNA或guide RNA的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA。
本发明还公开了一种基于可编程酶的突变基因和/或甲基化DNA的富集方法,使用CRISPR系统对野生型等位基因进行特异性切割,同时扩增突变型等位基因;其中,CRISPR系统包括:
组分(a),包含能够与靶核酸互补配对的核酸区域和0-4bp错配片段;
组分(b),能够与靶核酸结合并使靶核酸链断裂;
其中,组分(a)选自tracrRNA和/或crRNA和/或sgRNA和/或tracrRNA衍生物和/或crRNA衍生物和/或sgRNA衍生物和/或guide DNA和/或guide RNA;组分(b)包括Cas蛋白和/或Cas蛋白衍生物和/或Ago蛋白和/或Ago蛋白衍生物;组分(a)和(b)能够结合。优选地,组分(a)携带标记,标记包括链霉亲和素或生物素。
优选地,错配的核苷酸片段长度为0bp 或1bp或2bp或3bp或4bp。
优选地,组分(a)携带化学修饰,化学修饰包括硫取代氧或甲氧基修饰。
优选地,组分(a)中sgRNA包括错配核苷酸片段。本发明所设计的错配核苷酸片段有利于扩大sgRNA的使用范围,能够使sgRNA识别更多突变。
优选地,组分(a)中sgRNA的spacer序列长度为16-22nt。
优选地,组分(b)包括以下至少一种:Cas12a,SacCas9,CjCas9,SpCas9,NmCas9,Sp-Cas9 HF1,evoCas9,HypaCas9,HiFi Cas9,Sniper-Cas9,xCas9,eSpCas9 1.1,SuperFiCas9,SaCas9,SaCas9-HF,efSaCas9,ScCas9,Cas9-Sc++,Cas9 HiFi-Sc++,SpaCas9,SpaCas9-HF,FnCas9,AnaCas9,SpyCas9,FnCas12a,LbCas12a,AsCas12a,CbAgo,TtAgo,PfAgo,KmAgo或KpAgo。
更优选地,Cas12a来自以下至少一个菌种:Francisella novicida;Acidaminococcus;Lachnospiraceae。
更优选地,SacCas9来自菌种Staphylococcus aureus。
更优选地,CjCas9来自菌种Campylobacter jejuni。
更优选地,SpCas9来自菌种Streptococcus pyogenes。
更优选地,NmCas9来自菌种Neisseria meningitidis。
更优选地,SaCas9来自菌种Staphylococcus aureus。
更优选地,ScCas9来自菌种Streptococcus canis。
更优选地,SpaCas9来自菌种Streptococcus pasteurianus。
优选地,CRISPR系统中,组分(a)的终浓度为0.1-2μM。
优选地,CRISPR系统中,组分(b)的终浓度为0.1-3μM。
优选地,CRISPR系统中,还包括氢离子缓冲剂。
更优选地,CRISPR系统中,氢离子缓冲剂包括:HEPES。
更优选地,CRISPR系统中,氢离子缓冲剂终浓度为1mM-2 M。
优选地,扩增突变型等位基因的方法包括PCR、LAMP、RPA。
更优选地,扩增突变型等位基因的反应体系包括核糖核蛋白复合物。
优选地,反应体系中,核糖核蛋白复合物的终浓度0.1-2μM。
优选地,反应体系还包括:引物、目的基因、酶和助色基团。
优选地,反应体系还包括:dNTP、单链结合蛋白。
更优选地,目的基因包括:基因组DNA。
更进一步优选地,目的基因包括从以下至少一种细胞株中提取的基因组DNA:
EGFR 19del野生型细胞株;EGFR 19 E746_A750 del(2235-2249del)细胞株;EGFR19 E746_A750 del(2236-2250del);BRAF V600E突变型;BRAFV600E野生型细胞株;B-CPAP细胞株。
更优选地,引物包括能够与目的基因结合并且引导合成的核苷酸序列。
更进一步优选地,引物包括以下至少一条序列:
GCATGTGGCACCATCTCACA(SEQ ID NO.15);
AGAGCAGCTGCCAGACATGA(SEQ ID NO.16);
CTACACCTCAGATATATTTC(SEQ ID NO.19);
TGGATCCAGACAACTGT(SEQ ID NO.20);
TACGTGATGGCCAGCGTGGA(SEQ ID NO.23);
ACTGGGAGCCAATATTGT(SEQ ID NO.24);
TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.33);
TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG(SEQ ID NO.34);
TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.35);
CAACGCCTCGAAACCTACG(SEQ ID NO.36)。
CCCCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT(SEQ ID NO.38);
GCAAATACACAGAGGAAGCCTTCGCCTGTCCTC(SEQ ID NO.39);
CAAGTGGTTATAGATGGTGA(SEQ ID NO.40);或,
CGCCTGTCCTCATGTATTGG(SEQ ID NO.41)。
更优选地,guide DNA序列如下所示:
正向guide:p-TAGATTTCACTGTAGC-3’(SEQ ID NO.43);
反向guide:p-TTCTAGCTACAGTGAA-3’(SEQ ID NO.44)。
更优选地,酶包括:DNA聚合酶和/或重组酶。
更优选地,助色基团包括MgOAc。
更进一步优选地,核糖核蛋白复合物包括Cas9、sgRNA和氢离子缓冲剂。
更进一步优选地,核糖核蛋白复合物的制备方法包括:将Cas9、sgRNA和氢离子缓冲剂混合孵育。
更进一步优选地,氢离子缓冲剂包括HEPES。
更进一步优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的Cas9的终浓度为0.1-3μM。
更进一步优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的sgRNA的终浓度为0.1-2μM。
更进一步优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,所使用的HEPES的终浓度为1mM-2M。
更进一步优选地,核糖核蛋白复合物的制备中,反应温度为34-39℃,反应时间为3-18min。
本发明还公开了一种基于可编程核酸酶的低丰度突变基因和/或甲基化DNA的检测方法,使用上述CRISPR系统或Ago系统对野生型等位基因进行特异性切割,同时扩增突变型等位基因;包括如下步骤:
设计sgRNA;
目的基因的获取;
扩增与切割;
突变基因检测。
优选地,sgRNA包括错配核苷酸片段。
优选地,sgRNA的spacer序列长度为16-22nt。
优选地,目的基因包括EGFR,BRAF,PIK3CA,TP53,LRP1B,APC,CYP1A1,NP01,EPHX1,KRAS,BRCA1,BRCA2,MET,MLH1,MSH2,MSH3,MSH6,PALB2,BMPR1A,SMAD4,STK11,PTEN,AXIN2,BLM,BUB1B,CDH1,CEP57,CHEK2,ENG,EPCAM,FLCN,GALNTI2,GREM1,FAT4,KMT2D,KMT2C,ARID1A,FAT1,PTEN,ATM,ZFHX3,CREBBP,GRIN2A,NRAS或NF1。
优选地,扩增方法包括:PCR、LAMP和RPA。
优选地,突变基因检测方法包括Sanger测序。
优选地,扩增使用的反应体系包括:目的基因、核糖核蛋白复合物、MgOAc、引物、DNA聚合酶、重组酶和单链结合蛋白。
优选地,切割使用的反应体系包括:目的基因、核糖核蛋白复合物、MgOAc。
本发明还公开了一种自动化富集和/或检测突变基因和/或甲基化DNA的微流控芯片。
优选地,微流控芯片分为三部分,由顶层封装片、底层封装片以及中间的反应层构成。
更优选地,顶层封装片结构包括:微流控芯片安装孔;微流控芯片封装定位孔;微流控芯片进样孔。
更优选地,中间反应层结构包括:微流控芯片封装定位孔;微流控芯片安装孔;预扩增反应腔;虹吸阀;消化反应腔;预分配腔;PCR反应腔;废液腔;毛细阀;10:气体通路。
更优选地,底层封装片结构包括:微流控芯片安装孔;微流控芯片封装定位孔;RNaseA加样腔;ProteinaseK加样腔。
本发明还公开了一种自动化富集和/或检测突变基因和/或甲基化DNA的方法,包括如下步骤:
1)加样:预扩增体系加入预扩增反应腔;将RNaseA加入RNaseA加样腔;将ProteinaseK加入ProteinaseK加样腔;将qPCR体系加入PCR反应腔;
2)密封;
3)装载并完成实验:将密封后的微流控芯片装载在离心微流控平台上。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明基于CRISPR系统、可编程核酸酶以及核酸扩增技术,在核酸扩增的同时,利用可编程核酸酶特异性切割野生型核酸,让样品中突变等位基因的数量连续不断地呈指数增加,达到廉价的sanger测序可检出的水平。不仅达到了可与超深度NGS测序相媲美的检测灵敏度,还有检测周期短、无需依赖大型仪器设备等特点,大大降低了检测成本,极大推动了低丰度突变等位基因检测在临床上的应用。本发明富集方法能够用于富集MAF≥0.01%的突变型等位基因,能够使突变型等位基因的频率明显增加。
附图说明
图1为本发明富集低丰度突变型等位基因的原理图;
图2为实施例1中sgRNA切割验证结果图;
图3为实施例1中使用SpCas9处理ED2前后野生型等位基因和ED2的测序结果;
图4为实施例1中使用Hypa Cas9处理ED2后ED2的测序结果;
图5为实施例1中使用SpCas9 HF1处理ED1前后野生型等位基因和ED1的测序结果;
图6为实施例1中使用Evo Cas9处理ED1后ED1的测序结果;
图7为实施例2中sgRNA切割验证结果图;
图8为实施例2中使用HiFi Cas9处理前后野生型等位基因和突变型等位基因测序结果;
图9为实施例2中使用SuperFi Cas9处理后突变型等位基因测序结果;
图10为实施例2中使用HiFi SC++进行处理0min突变型等位基因测序结果;
图11为实施例2中使用HiFi SC++进行处理5min突变型等位基因测序结果;
图12为实施例2中使用HiFi SC++进行处理10min突变型等位基因测序结果;
图13为实施例2中使用HiFi SC++进行处理15min突变型等位基因测序结果;
图14为实施例2中使用HiFi SC++进行处理20min突变型等位基因测序结果;
图15为实施例3中sgRNA切割验证结果图;
图16为实施例3中使用Cas9进行处理前后野生型等位基因和突变型等位基因测序结果;
图17为实施例4中0.1%甲基化DNA经富集处理前后富集程度对比;
图18为本发明富集甲基化DNA的原理图;
图19为实施例5中使用Cas12处理NRAS前后野生型等位基因和突变型等位基因测序结果;
图20为微流控芯片结构示意图;
图21为顶层封装片结构示意图;
图22为中间反应层结构示意图;
图23为顶层封装片结构示意图;
图24为本发明基于Ago切割的原理图;
图25为实施例7中MAF=0.1%经PASEA处理前后对比。
附图标号:1-顶层封装片;
11-微流控芯片安装孔;12-微流控芯片封装定位孔;13-微流控芯片进样孔;
2-中间反应层;
21-微流控芯片封装定位孔;22-微流控芯片安装孔;23-预扩增反应腔;24-虹吸阀;25-消化反应腔;26-预分配腔;27-PCR反应腔;28-废液腔;29-毛细阀;210-气体通路;
3-底层封装片;
31-微流控芯片安装孔;32-微流控芯片封装定位孔;33-RNaseA加样腔;34-ProteinaseK加样腔。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明,以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反,它们仅是与本公开的一些方面相一致的方法的例子。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中测序使用的引物与qPCR引物相同。
实施例1
EGFR基因del19突变的富集
1、设计引物
从NCBI数据库获得人EGFR基因第19号外显子基因序列,根据该序列进行引物设计:
19del预扩增F引物:GCATGTGGCACCATCTCACA(SEQ ID NO.15);
19del预扩增R引物:AGAGCAGCTGCCAGACATGA(SEQ ID NO.16);
19del qPCR F引物:TGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGA(SEQ ID NO.17);
19del qPCR R引物:GCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGT(SEQ ID NO.18)。
2、设计sgRNA
设计长度为20nt并且能够与野生型等位基因序列完全配对的sgRNA序列,如SEQID NO.1所示:
UCUUAAUUCCUUGAUAGCGA(SEQ ID NO.1)。
使用sgRNA引导Cas蛋白与野生型等位基因结合,并特异性切割野生型等位基因,而不切割突变型等位基因,原理如图1所示。
3、目的基因的获取
以下为本实施例中所使用的作为marker的基因短链序列:
EGFR-WT-S:
CTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGA(SEQ ID NO.7);
EGFR-WT-AS:
TCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCTTAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTTCTGGGATCCAGAG(SEQ ID NO.8);
EGFR-del1-S:
CTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTG(SEQ ID NO.9);
EGFR-del1-AS:
CAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTTCTGGGATCCAGAG(SEQ ID NO.10);
EGFR-del2-S:
CTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTG(SEQ ID NO.11);
EGFR-del2-AS:
CAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTTCTGGGATCCAGAG(SEQ ID NO.12);
EGFR-del3-S:
TCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTG(SEQ ID NO.13);
EGFR-del3-AS:
CACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTTCTGGGATCCAGA(SEQ ID NO.14);
由上海生工(生物)有限公司合成。
EGFR 19del野生型等位基因来源为B-CPAP细胞株;突变型等位基因EGFR 19E746_A750 del(2235-2249del)和EGFR 19 E746_A750 del(2236-2250del)来源分别为NCI-H1650和HCC827细胞株。细胞株均购自上海中乔新舟生物科技有限公司。使用QIAGENDNeasy Blood&Tissue Kit按说明书提取两种细胞株的基因组DNA,并且将两种基因组DNA配制成突变比例MAF=5%、1%、0.5%、0.1%和0.01%的模板,用于突变的富集和检测。
4、sgRNA的切割验证
a)核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein)的形成,见表1。
表1核糖核蛋白复合物
终浓度 | |
Cas9 | 2.5μM |
sgRNA | 2.5μM |
HEPES | 1M |
此处Cas蛋白包括SpCas9 HF1(用于ED1的富集和检测),EvoCas9(用于ED1的富集和检测),SpCas9(用于ED2的富集和检测),Hypa Cas9(用于ED2的富集和检测)中的一种。
37℃,恒温孵育10min;
b)切割体系配制,见表2。
表2 切割体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 2.5μM |
MgOAc | 14mM |
模板 | 0.25μM |
37℃,恒温切割1h;
c)消化
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min。
d)跑胶
使用PAGE凝胶电泳,加loading buffer于切割产物中,点样;电泳150V,10min;
电泳结束后使用gelred 染料染色15min后拍照(见图2)。图2中5条泳道从左向右依次为:Marker,WT,ED1,ED2,ED3,其中ED1代表E746_A750 del(2235-2249del)突变,ED2代表EGFR 19 E746_A750 del(2236-2250del)突变,ED3代表EGFR 19 E746_A750 del(2240-2257del)突变;由图2可见,在sgRNA的引导下,野生型被切割,其他突变型几乎没有被切割。
5、突变型等位基因的富集和检测
本步骤富集和检测的突变为ED1和ED2。
a)预扩增:
核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein)的形成,见表3。
表3核糖核蛋白复合物
终浓度 | |
Cas9 | 1μM |
sgRNA | 1μM |
HEPES | 1M |
此处Cas蛋白包括SpCas9 HF1(用于ED1的富集和检测),EvoCas9(用于ED1的富集和检测),SpCas9(用于ED2的富集和检测),Hypa Cas9(用于ED2的富集和检测)中的一种;具体操作时,本步骤制备核糖核蛋白复合物使用的Cas蛋白与步骤4、sgRNA的切割验证所使用的Cas9对应;
37℃,恒温孵育10min即得核糖核蛋白复合物;
预扩增体系配制,见表4。
表4预扩增体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 1μM |
预扩增F引物 | 0.5μM |
预扩增R引物 | 0.5μM |
MgOAc | 14mM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
Recombinase | 900ng/μl |
SSB | 150ng/μl |
模板 | 60ng |
37℃,恒温反应20min;后95℃,10min终止反应;
消化:
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min;
qPCR体系配制,见表5。
表5 qPCR体系
终浓度 | |
qPCR F引物 | 1μM |
qPCR R引物 | 1μM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
反应程序:
预变性:95℃,5min;
45 cycles;
95℃,10s;
60℃,30s;
扩增后将扩增产物进行sanger测序,测序结果如图3-9所示,为避免冗余,仅展示MAF=0.1%的样本的富集结果;由图3-9可见,富集后野生型等位基因明显增加。说明本发明富集方法能够有效对突变型等位基因进行富集。
实施例2
BRAF基因V600E突变的富集和检测
1、设计引物
从NCBI数据库获得人BRAF基因序列,根据该序列进行引物的设计,如下所示:
预扩增F引物:CTACACCTCAGATATATTTC(SEQ ID NO.19);
预扩增R引物:TGGATCCAGACAACTGT(SEQ ID NO.20);
qPCR F引物:CCTCAGATATATTTCTTCATGA(SEQ ID NO.21);
qPCR R引物:TGTTCAAACTGATGGGAC(SEQ ID NO.22)。
2、设计sgRNA
设计长度为17-20nt并且能够与野生型等位基因序列完全配对的sgRNA序列,如SEQ ID NO.2-6所示:
guide1:UAGCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.2);
guide2:UAGCUACAGUGAAAUCACGA(SEQ ID NO.3);
guide3:GCUACAGUGAACUCUCGA(SEQ ID NO.4);
guide4:GUCUAGCUACAGUGAAA(SEQ ID NO.5);
guide5:GUCUAGCUGCAGUGAAA(SEQ ID NO.6)。
3、基因组DNA获取
BRAF V600E突变型和野生型等位基因分别来源于B-CPAP和HCC827细胞株(购自上海中乔新舟生物科技有限公司);使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit按说明书提取两种细胞株的基因组DNA,并且将两种DNA配制成突变比例MAF=5%、1%、0.5%、0.1%和0.01%的模板,用于突变的富集和检测。
4、sgRNA的切割验证
a)核糖核蛋白复合物的形成
配制如下反应体系,见表6。
表6 反应体系
终浓度 | |
Cas9 | 2.5μM |
sgRNA | 2.5μM |
HEPES | 1M |
此处Cas9包括HiFi Cas9,SuperFi Cas9,HiFi SC++中的一种;
37℃,恒温孵育10min即得核糖核蛋白复合物;
b)切割体系配制,见表7。
表7 切割体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 2.5μM |
MgOAc | 14mM |
模板 | 0.25μM |
37℃,恒温切割1h;
c)消化
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min;
d)跑胶
使用PAGE凝胶电泳,加loading buffer于切割产物中,点样;电泳150V,10min;
电泳结束后使用gelred染料染色15min后拍照(见图7),其中1,3,5,7,9,11泳道为野生型核酸,2,4,6,8,10,12泳道为突变型核酸;分别对比1、2,3、4,5、6,7、8,9、10,11、12泳道可见,野生型等位基因较突变型等位基因更易被切割;对比1,3,5,7,9,11泳道可知,guide3几乎不切割野生型等位基因。
5、突变型等位基因的富集和检测
a)预扩增:
核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein)的形成,见表8。
表8核糖核蛋白复合物
终浓度 | |
Cas9 | 1μM |
sgRNA | 1μM |
HEPES | 1M |
37℃,恒温孵育10min即得核糖核蛋白复合物;
预扩增体系配制,见表9。
表9预扩增体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 1μM |
预扩增F引物 | 0.5μM |
预扩增R引物 | 0.5μM |
MgOAc | 14mM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
Recombinase | 900ng/μl |
SSB | 150ng/μl |
模板 | 60ng |
此处Cas9包括:HiFi Cas9,SuperFi Cas9,HiFi SC++中的一种;具体操作时,本步骤制备核糖核蛋白复合物使用的Cas蛋白与步骤4、sgRNA的切割验证所使用的Cas9对应;
37℃,恒温反应20min;后95℃,10min终止反应;
消化:
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min;
qPCR体系配制,见表10。
表10 qPCR体系
终浓度 | |
qPCR F引物 | 1μM |
qPCR R引物 | 1μM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
反应程序:
预变性:95℃,5min;
45 cycles;
95℃,10s;
60℃,30s;
扩增后将扩增产物进行sanger测序,测序结果如图5所示,为避免冗余,仅展示MAF=0.1%的样本的富集结果;由图8-14可见,富集后野生型等位基因明显增加;并且,对比图10-14可知,随着使用Cas蛋白进行处理的时间增加,富集效果明显变好。说明本发明富集方法能够有效对突变型等位基因进行富集。
实施例3
EGFR基因T790M突变的富集和检测
1、设计引物
从NCBI数据库获得人EGFR基因序列,根据该序列进行引物的设计,如下所示:
预扩增F引物:TACGTGATGGCCAGCGTGGA(SEQ ID NO.23);
预扩增R引物:ACTGGGAGCCAATATTGT(SEQ ID NO.24);
qPCR F引物:TGATGGCCAGCGTGGACAA(SEQ ID NO.25);
qPCR R引物:TTGTGTTCCCGGACATAGTC(SEQ ID NO.26)。
2、设计sgRNA
设计长度为17-20nt并且能够与野生型等位基因序列完全配对的sgRNA序列,如SEQ ID NO.27-28所示:
guide1:GGCAGCCGAAGGGCAUGAGC(SEQ ID NO.27);
guide2:GGCAGCCGAAGAGCAUGAGC(SEQ ID NO.28);
3、目的基因的获取
以下为本实施例中所使用的作为marker的基因短链序列:
T790M-WT-S:
GACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCGTGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGC(SEQ ID NO.29);
T790M-WT-AS:
GCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTC(SEQ ID NO.30);
T790M-MUT-S:
GACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGC(SEQ ID NO.31);
T790M-MUT-AS:
GCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTC(SEQ ID NO.32);
由上海生工(生物)有限公司合成。
基因组DNA的获得:
EGFR T790M野生型等位基因来自B-CPAP细胞株,购自上海中乔新舟生物科技有限公司,使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit提取基因组DNA。EGFR T790M突变等位基因序列标准品购自GeneCopoeia公司。将基因组DNA与突变等位基因序列标准品配制成突变比例MAF=5%、1%、0.5%、0.1%和0.01%的模板。
4、sgRNA的切割验证
a)核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein)的形成,见表11。
表11核糖核蛋白复合物
终浓度 | |
Cas9 | 2.5μM |
sgRNA(guide2) | 2.5μM |
HEPES | 1M |
37℃,恒温孵育10min;
b)切割体系配制,见表12。
表12切割体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 2.5μM |
MgOAc | 14mM |
模板 | 0.25μM |
37℃,恒温切割1h;
c)消化
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min。
d)跑胶
使用PAGE凝胶电泳,加loading buffer于切割产物中,点样;电泳150V,10min;
电泳结束后使用gelred 染料染色15min后拍照(见图15)。图15中2条泳道从左向右依次为野生型和突变型。
5、突变型等位基因的富集和检测
a)预扩增:
核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein)的形成,见表13。
表13核糖核蛋白复合物
终浓度 | |
Cas9 | 1.4μM |
sgRNA | 1.4μM |
HEPES | 1M |
37℃,恒温孵育10min即得核糖核蛋白复合物;
预扩增体系配制,见表14。
表14预扩增体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 1μM |
预扩增F引物 | 0.5μM |
预扩增R引物 | 0.5μM |
MgOAc | 14mM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
Recombinase | 900ng/μl |
SSB | 150ng/μl |
模板 | 60ng |
37℃,恒温反应20min;后95℃,10min终止反应;
消化:
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min;
qPCR体系配制,见表15。
表15 qPCR体系
终浓度 | |
qPCR F引物 | 1μM |
qPCR R引物 | 1μM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
反应程序:
预变性:95℃,5min;
45 cycles;
95℃,10s;
60℃,30s;
扩增后将扩增产物进行sanger测序,测序结果如图16所示,为避免冗余,仅展示MAF=5%的样本的富集结果;由图16可见,富集后野生型等位基因明显增加。说明本发明富集方法能够有效对突变型等位基因进行富集。
实施例4
PCDH10基因甲基化的富集和检测
1、设计引物
从NCBI数据库获得人PCDH10基因序列,根据该序列进行引物的设计,如下所示:
预扩增F引物:TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.33);
预扩增R引物:TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG(SEQ ID NO.34);
qPCR F引物:TCGTTAAATAGATACGTTACGC(SEQ ID NO.35);
qPCR R引物:CAACGCCTCGAAACCTACG(SEQ ID NO.36)。
2、设计sgRNA
设计长度为17-20nt并且能够与野生型等位基因序列完全配对的sgRNA序列,如SEQ ID NO.37所示:
guide:AAUUUUUGUUUGAGUGGUUG(SEQ ID NO.37);
3、基因组DNA的获取
A549为PCDH10非甲基化细胞株,购自上海中乔新舟生物科技有限公司。使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit提取基因组DNA。Methylated Human Control购自promega公司。配制成甲基化比例MAF=5%、1%、0.5%、0.1%和0.01%的模板。
4、甲基化DNA的富集和检测
a)预扩增:
核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein)的形成,见表16。
表16核糖核蛋白复合物的组成
终浓度 | |
Cas9 | 1μM |
sgRNA | 1μM |
HEPES | 1M |
37℃,恒温孵育10min即得核糖核蛋白复合物;
预扩增体系配制,见表17。
表17预扩增体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 1μM |
预扩增F引物 | 0.5μM |
预扩增R引物 | 0.5μM |
MgOAc | 14mM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
Recombinase | 900ng/μl |
SSB | 150ng/μl |
模板 | 60ng |
37℃,恒温反应20min;后95℃,10min终止反应;
消化:
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min;
qPCR体系配制,见表18。
表18 qPCR体系
终浓度 | |
qPCR F引物 | 1μM |
qPCR R引物 | 1μM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
反应程序:
预变性:95℃,5min;
30 cycles;
95℃,10s;
60℃,30s;
72℃,30s。
扩增后将扩增产物进行sanger测序,测序结果如图17所示,为避免冗余,仅展示MAF=0.1%的样本的富集结果;由图17可见,富集后甲基化DAN明显增加。说明本发明富集方法能够有效对甲基化DAN进行富集。
实施例5
NRAS基因Q61R突变的富集
1、设计引物
从NCBI数据库获得人NRAS基因第61号外显子基因序列,根据该序列进行引物的设计,如下所示:
预扩增F引物:CCCCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT(SEQ ID NO.38);
预扩增R引物:GCAAATACACAGAGGAAGCCTTCGCCTGTCCTC(SEQ ID NO.39);
qPCR F引物:CAAGTGGTTATAGATGGTGA(SEQ ID NO.40);
qPCR R引物:CGCCTGTCCTCATGTATTGG(SEQ ID NO.41)。
2、设计sgRNA
设计长度为20nt并且能够与野生型等位基因序列完全配对的crRNA序列,如SEQID NO.42所示:
UCCAGCUGUAUCCAGUAUGU(SEQ ID NO.42);
使用crRNA引导Cas蛋白与野生型等位基因结合,并特异性切割野生型等位基因,而不切割突变型等位基因,原理如图18所示。
3、目的基因的获取
NRAS Q61R野生型等位基因来源为IOSE80细胞株;突变型等位基因NRAS Q61R来源为SK-MEL-2细胞株。细胞株均购自上海中乔新舟生物科技有限公司。使用QIAGENDNeasyBlood&Tissue Kit按说明书提取两种细胞株的基因组DNA,并且将两种基因组DNA配制成突变比例MAF=10%、5%、2.5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.03%和0.01%的模板,用于突变的富集和检测。
4、突变型等位基因的富集和检测
a)预扩增:
核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein)的形成,见表19。
表19核糖核蛋白复合物的组成
终浓度 | |
Cas12 | 10μM |
crRNA | 10μM |
此处Cas蛋白为FnCas12a,37℃,恒温孵育10min即得核糖核蛋白复合物;
预扩增体系配制,见表20。
表20预扩增体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 10μM |
预扩增F引物 | 0.48μM |
预扩增R引物 | 0.48μM |
MgOAc | 14mM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
Recombinase | 900ng/μl |
SSB | 150ng/μl |
模板 | 60ng |
37℃,恒温反应20min;后95℃,10min终止反应;
消化:
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min;
qPCR体系配制,见表21。
表21 qPCR体系
终浓度 | |
qPCR F引物 | 1μM |
qPCR R引物 | 1μM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
反应程序:
预变性:95℃,5min;
45 cycles;
95℃,10s;
60℃,30s;
扩增后将扩增产物进行sanger测序,测序结果如图19所示,为避免冗余,仅展示MAF=0.05%的样本的富集结果;由图19可见,富集后野生型等位基因明显增加。说明本发明富集方法能够有效对突变型等位基因进行富集。
实施例6
PASEA自动化
上述实施例中所进行的富集和检测的实验操作可使用微流控芯片实现自动化,微流控芯片结构(见图20)分为三部分,由顶层封装片1、底层封装片3以及中间的反应层2构成;
顶层封装片1(见图21)结构为:微流控芯片安装孔11;微流控芯片封装定位孔12;微流控芯片进样孔13;
中间反应层2(见图22)结构为:微流控芯片封装定位孔21;微流控芯片安装孔22;预扩增反应腔23;虹吸阀24;消化反应腔25;预分配腔26;PCR反应腔27;废液腔28;毛细阀29;气体通路210。
底层封装片3(见图23)结构为:微流控芯片安装孔31;微流控芯片封装定位孔32;RNaseA加样腔33;ProteinaseK加样腔34。
具体操作步骤如下:
1)加样:预扩增体系加入预扩增反应腔;将5μl RNaseA(10mg/ml)加入RNaseA加样腔;将5μl ProteinaseK(20mg/ml)加入ProteinaseK加样腔;将qPCR体系加入PCR反应腔。
2)密封:采用适配的密封铝箔压敏膜将进样口密封。
3)装载并完成实验:将密封后的微流控芯片装载在离心微流控平台上。
设置流程:
a:37℃,恒温反应20min(预扩增);
b:转速 3000 rpm 持续时间1min(转动时将预扩增液离心至消化腔,并且停止时打开虹吸阀);
c:不加热放置10min(RNaseA消化);
d:56℃恒温30min(ProteinaseK消化);
e:转速1000rpm 持续时间1min(预分配);
f:转速3000rpm 持续时间2min(将定量的消化后的预扩增液离心至PCR腔);
g:95℃,5min;45 cycles :95℃,10s60℃,30s(PCR反应)。
实施例7
基于Ago蛋白的 BRAF V600E突变的富集和检测
1、设计引物
从NCBI数据库获得人BRAF基因序列,根据该序列进行引物的设计,如下所示:
预扩增F引物:CTACACCTCAGATATATTTC(SEQ ID NO.19);
预扩增R引物:TGGATCCAGACAACTGT(SEQ ID NO.20);
qPCR F引物:CCTCAGATATATTTCTTCATGA(SEQ ID NO.21);
qPCR R引物:TGTTCAAACTGATGGGAC(SEQ ID NO.22)。
2、设计guide DNA
设计长度为16-20nt并且能够与野生型等位基因序列完全配对的guide DNA序列,如SEQ ID NO.43-44所示:
正向guide:p-TAGATTTCACTGTAGC-3’ (SEQ ID NO.43);
反向guide:p-TTCTAGCTACAGTGAA -3’ (SEQ ID NO.44);
使用guide DNA引导Ago蛋白与野生型等位基因结合,并特异性切割野生型等位基因,而不切割突变型等位基因,原理如图23所示。
3、基因组DNA获取
BRAF V600E突变型和野生型等位基因分别来源于B-CPAP和HCC827细胞株(购自上海中乔新舟生物科技有限公司);使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit按说明书提取两种细胞株的基因组DNA,并且将两种DNA配制成突变比例MAF=5%、1%、0.5%、0.1%和0.01%的模板,用于突变的富集和检测。
5、突变型等位基因的富集和检测
a)预扩增:
Ago- Guide DNA 复合物的形成,见表22。
表22 Ago- Guide DNA 复合物的组成
终浓度 | |
Ago | 1μM |
GuideDNA | 10μM |
HEPES | 1M |
37℃,恒温孵育10min即得核糖核蛋白复合物;
预扩增体系配制,见表23。
表23预扩增体系
终浓度 | |
核糖核蛋白复合物 | 1μM |
预扩增F引物 | 0.5μM |
预扩增R引物 | 0.5μM |
MgOAc | 14mM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
Recombinase | 900ng/μl |
SSB | 150ng/μl |
模板 | 60ng |
此处Ago包括:CbAgo,TtAgo,KmAgo,KpAgo中的一种;
37℃,恒温反应20min;后95℃,10min终止反应;
消化:
加入1μl RNaseA(10mg/ml),室温放置10min;加入1μl ProteinaseK(20mg/ml),56℃恒温30min;之后95℃恒温10min;
qPCR体系配制,见表24。
表24 qPCR体系
终浓度 | |
qPCR F引物 | 1μM |
qPCR R引物 | 1μM |
dNTP | 0.45mM |
DNA polymerase | 30ng/μl |
反应程序:
预变性:95℃,5min;
45 cycles;
95℃,10s;
60℃,30s;
扩增后将扩增产物进行sanger测序,测序结果如图25所示,为避免冗余,仅展示MAF=0.1%的样本的富集结果;由图25可见,富集后野生型等位基因明显增加。说明本发明富集方法基于Ago蛋白的特异切割也能够有效对突变型等位基因进行富集。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (22)
1.一种核糖核蛋白复合物,其特征在于,包括组分(a)和组分(b):
组分(a),所述组分(a)包括:能够与靶核酸互补配对的核酸区域和0-4bp错配片段;或能够与靶核酸互补配对的核酸区域且相邻PAM包括易突变位点;
组分(b),能够与靶核酸结合并使靶核酸链断裂;
其中,所述组分(a)选自tracrRNA和/或crRNA和/或sgRNA和/或三者的衍生物和/或guide DNA和/或guide RNA;所述组分(b)包括Cas蛋白和/或Cas蛋白衍生物和/或Ago蛋白和/或Ago蛋白衍生物;所述组分(a)和(b)能够结合。
2.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,所述组分(a)中sgRNA、guide DNA或guideRNA的spacer序列长度为16-22nt。
3.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,所述组分(b)包括以下至少一种:Cas12a,SacCas9,CjCas9,SpCas9,NmCas9,Sp-Cas9 HF1,evoCas9,HypaCas9,HiFi Cas9,Sniper-Cas9,xCas9,eSpCas9 1.1,SuperFi Cas9,SaCas9,SaCas9-HF,efSaCas9,ScCas9,Cas9-Sc++,Cas9 HiFi-Sc++,SpaCas9,SpaCas9-HF,FnCas9,AnaCas9,SpyCas9,FnCas12a,LbCas12a,AsCas12a,CbAgo,TtAgo,PfAgo,KmAgo或KpAgo。
4.一种用于可编程酶的突变基因的富集和/或甲基化DNA的富集的反应体系,其特征在于,所述反应体系包括权利要求1中所述核糖核蛋白复合物。
5.权利要求4所述反应体系的用途,包括以下至少一种:
(1)靶向结合靶核酸片段;
(2)靶向切割靶核酸片段;
(3)富集突变基因;
(4)检测突变基因;
(5)富集甲基化DNA;
(6)检测甲基化DNA。
6.如权利要求5所述用途,其特征在于,所述富集包括自动化富集;所述检测包括自动化检测。
7.如权利要求6所述用途,其特征在于,所述自动化富集包括使用微流控芯片进行富集;所述自动化检测包括使用微流控芯片进行检测。
8.如权利要求5所述用途,其特征在于,所述突变基因包括癌症相关基因。
9.如权利要求8所述用途,其特征在于,所述癌症相关基因包括以下至少一种:
EGFR,BRAF,PIK3CA,TP53,LRP1B,APC,CYP1A1,NP01,EPHX1,KRAS,BRCA1,BRCA2,MET,MLH1,MSH2,MSH3,MSH6,PALB2,BMPR1A,SMAD4,STK11,PTEN,AXIN2,BLM,BUB1B,CDH1,CEP57,CHEK2,ENG,EPCAM,FLCN,GALNTI2,GREM1,FAT4,KMT2D,KMT2C,ARID1A,FAT1,PTEN,ATM,ZFHX3,CREBBP,GRIN2A,NRAS或NF1。
10.如权利要求5所述用途,其特征在于,所述甲基化DNA包括癌症相关甲基化基因和/或其启动子。
11.如权利要求10所述用途,其特征在于,所述癌症相关甲基化基因包括以下至少一种:
PCDH-10,BRCA1,RASSF1A,ESR1,APC,p14ARF,p16INK4a,DAPK,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5,HIC1,PAX5,PGR,THBS1,ESR,COL23A1,C2CD4D,WNT6,OPCML,ZNF154,RARb2,ATM,MGMT,GSTP1,MIR129-2,LINC01158,CCDC181,PRKCB,TBR1,ZNF781,MARCH11,VWC2,SLC9A3,HOXA7,Septin9,IKZF1,BCAT1,hMLH1,WIF1,CDKN2A,SHOX2,3OST2,ASSF1A,RARb,PITX2,NID2,NEUROG2或HOXA1;
所述启动子包括以下基因的启动子中的至少一种:
PCDH-10,BRCA1,RASSF1A,ESR1,APC,p14ARF,p16INK4a,DAPK,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5,HIC1,PAX5,PGR,THBS1,ESR,COL23A1,C2CD4D,WNT6,OPCML,ZNF154,RARb2,ATM,MGMT,GSTP1,MIR129-2,LINC01158,CCDC181,PRKCB,TBR1,ZNF781,MARCH11,VWC2,SLC9A3,HOXA7,Septin9,IKZF1,BCAT1,hMLH1,WIF1,CDKN2A,SHOX2,3OST2,ASSF1A,RARb,PITX2,NID2,NEUROG2或HOXA1。
12.一种用于可编程酶的突变基因的富集的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的核糖核蛋白复合物。
13.如权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括恒温切割-扩增反应体系,所述恒温切割-扩增反应体系包括:引物、目的基因、酶和助色基团。
14.一种使用权利要求12所述试剂盒进行突变基因的富集的方法,包括如下步骤:
收集样品;
制备核糖核蛋白复合物;
配制反应体系;
富集分析。
15.一种sgRNA,其特征在于,所述sgRNA包括特异性识别核苷酸片段、错配核苷酸片段;其中,错配的核苷酸片段长度为0-4bp。
16.如权利要求15所述的sgRNA,其特征在于,包括如下序列:
SEQ ID NO.1:UCUUAAUUCCUUGAUAGCGA;
SEQ ID NO.2:UAGCUACAGUGAACUCUCGA;
SEQ ID NO.3:UAGCUACAGUGAAAUCACGA;
SEQ ID NO.4:GCUACAGUGAACUCUCGA;
SEQ ID NO.5:GUCUAGCUACAGUGAAA;
SEQ ID NO.6:GUCUAGCUGCAGUGAAA;
SEQ ID NO.27:GGCAGCCGAAGGGCAUGAGC;
SEQ ID NO.28:GGCAGCCGAAGAGCAUGAGC;
SEQ ID NO.37:AAUUUUUGUUUGAGUGGUUG;
SEQ ID NO.42:UCCAGCUGUAUCCAGUAUGU。
17.权利要求16所述sgRNA的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA。
18.一种guide DNA或guide RNA,其特征在于,所述guide DNA或guide RNA包括特异性识别核苷酸片段、错配核苷酸片段;其中,错配的核苷酸片段长度为0-4bp。
19.如权利要求17所述的guide DNA,其特征在于,包括如下序列:
SEQ ID NO.43:正向guide:p-TAGATTTCACTGTAGC-3’;
SEQ ID NO.44:反向guide:p-TTCTAGCTACAGTGAA-3’。
20.权利要求18所述guide DNA或guide RNA的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA。
21.Cas蛋白的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA;
其中,所述Cas蛋白包括以下至少一种:Cas12a,SacCas9,CjCas9,SpCas9,NmCas9,Sp-Cas9 HF1,evoCas9,HypaCas9,HiFi Cas9,Sniper-Cas9,xCas9,eSpCas9 1.1,SuperFiCas9,SaCas9,SaCas9-HF,efSaCas9,ScCas9,Cas9-Sc++,Cas9 HiFi-Sc++,SpaCas9,SpaCas9-HF,FnCas9,AnaCas9,SpyCas9,FnCas12a,LbCas12a,AsCas12a,CbAgo,TtAgo,PfAgo,KmAgo或KpAgo。
22.Ago蛋白的用途,包括以下至少一种:
(1)富集基因突变;
(2)检测基因突变;
(3)富集甲基化DNA;或,
(4)检测甲基化DNA;
其中,所述Ago蛋白包括以下至少一种:CbAgo,TtAgo,PfAgo,KmAgo或KpAgo。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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