CN117487921A - Casp3基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种CASP3基因检测引物探针组合、试剂盒以及应用，涉及基因检测领域。本发明使用ARMS结合荧光PCR技术具有高特异性以及高灵敏性，检测时耗短，成本低，结果直观好判读；实现口腔脱落细胞样本或全血样本中CASP3基因的SNP位点rs113420705的分型。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种CASP3基因检测引物探针组合、试剂盒以及应用。
背景技术
川崎病（Kawasaki disease，KD）又可称之为皮肤黏膜淋巴结综合征，常发生于5岁以下的儿童。川崎病病因不明，目前认为是由遗传因素、感染和免疫的复杂相互作用的结果，可并发冠状动脉病变（coronary artery lesions，CAL），川崎病导致的CAL是现阶段导致发达国家儿童罹患后天性心脏病的主要病因[1]。根据相关研究报道显示，在川崎病发病的早期阶段，若未采取积极有效的干预方式，15%-25%的患儿均会同时并发冠状动脉扩张，引发冠状动脉瘤[2]。
川崎病的诊断依据通常是具有发热症状，以及具有以下至少4项临床表现：双侧球结膜充血、口唇干红，草莓舌，口腔部粘膜弥漫性充血、皮疹、急性期手足发红、肿胀，恢复期甲周脱皮、非化脓性颈部淋巴肿大。但是有些患儿的临床表现少于4项，即不完全川崎病。这类患儿的诊断比较困难，很容易贻误治疗时期，从而引发CAL。因此对川崎病并发CAL相关基因的检测有助于对川崎病并发CAL的预后和风险评估。
目前的研究报道了多个川崎病并发CAL的相关基因，提示预后和风险评估。其中半胱天冬蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）是一种蛋白酶，能够特异性剪切多聚ADP核糖聚合酶（PARP1）和乙酰基-DEVD-7-氨基-4-甲基香豆素（Ac-DEVD-AMC），从而导致DNA裂解促进细胞凋亡。CASP3是与免疫细胞凋亡密切相关的半胱氨酸天蛋白酶，CASP3作为细胞凋亡途径中最为关键的酶类之一，与癌症的发生、衰老、心血管疾病的发生等有着重要联系。研究者通过对1173名汉族受试者（358名KD患者和815名对照组）进行了KD易感性SNP的基因分型发现CASP3（rs113420705）等位基因A的风险更高；且部分地区的研究结果都显示CASP3与KD并发CAL具有显著的相关性[3-4]。
人基因组中的CASP3基因的SNP位点rs113420705属于单核苷酸位点的多态性。单核苷酸多态性（SNP）全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组等位基因上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。常用SNP分析方法有PCR-测序法、Sanger测序法、高通量测序技术、PCR-芯片杂交法、突变扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）等。这些分析方法中，直接测序的方法时间周期较长，不能及时为医生提供指导；芯片法成本高，使应用受到一定限制。
鉴于此，特提出本发明。
参考文献：
[1] 中华医学会儿科学分会心血管学组, 中华医学会儿科学分会风湿学组, 中华医学会儿科学分会免疫学组, 等. 川崎病诊断和急性期治疗专家共识. 中华儿科杂志,2022, 60(1): 6-13.
[2] SHUMAN S T, ROWLEY A H. Kawasaki disease：insightsintopathogenesis and approaches to treatment [J]. Nat Rev Rheumatol,2015, 11(8)：475-482.
[3] Kuo et al. A replicationstudy for association of ITPKC and CASP3two-locus analysis in IVIG unresponsiveness and coronary artery lesion inKawasaki disease. Plos one, 2013; 8(7):e69685.
[4] Onouchi et al. ITPKC and CASP3 polymorphismsand risks for IVIGunresponsiveness and coronary artery lesion formation in Kawasaki disease.The Pharmacogenomics Journal, 2013; 13(1); 52-59。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种CASP3基因检测引物探针组合、试剂盒以及应用。
目前市场上还没有有关人CASP3基因多态性检测试剂盒，本产品基于实时荧光PCR技术，采用扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS），实现口腔脱落细胞样本或全血样本中CASP3基因的SNP位点rs113420705的分型。
本发明针对CASP3基因rs113420705位点设计特异性位点检测引物。对于CASP3基因T位点，PCR扩增时，由于CASP3基因TT引物3'末端的碱基与CASP3基因T位点的模板完全配对，引物延伸并对CASP3基因T位点的模板进行扩增，而与CASP3基因C位点的模板由于不能完全配对，引物的延伸被阻断，CASP3基因C位点的模板扩增被抑制，对于CASP3基因C位点的扩增反之。从而实现CASP3基因的分型。
并且CASP3基因的探针为FAM荧光标记，内源性内标基因（人类管家基因）为VIC荧光标记，通过不同的荧光标记可实现在同一管中进行2重反应。通过内标可以对待测样本的采集、核酸提取、PCR检测全过程实行监控。另外，本产品添加了防污染组分UNG酶，其作用机理是选择性水解断裂含有dU的双链或者单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明的第一方面提供一种引物探针组合，所述引物包括：选自核苷酸序列如SEQID NO：1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQID NO：2所示的下游引物，用于检测CASP3基因rs113420705位点的T位点；选自核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物，用于检测CASP3基因rs113420705位点的C位点；
所述探针包括SEQ ID NO：3所示的检测探针；SEQ ID NO：3即用于检测CASP3基因rs113420705位点的T位点；也用于检测CASP3基因rs113420705位点的C位点。
在一些实施方式中，所述引物还包括内参引物，所述探针还包括内参探针。
在一些实施方式中，所述内参引物和所述内参探针用于定量检测人管家基因的核酸片段的表达。
在一些实施方式中，所述内参引物的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如SEQID NO：5和SEQID NO：6所示；所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO：1～7所示的引物或探针具有大于60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
如本说明书使用的术语“探针”是指可指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如，SYBR Green和其他DNA结合染料是检测探针。可以是基于序列的检测探针，例如5’核酸酶探针。一些检测探针是本领域已知的，例如Taqman探针、茎环分子信标、MGB探针、ScorpionTM探针、锁核酸(LNA)探针、肽核酸（PNA）探针等。
在一些实施方式中，所述探针为自身淬灭探针。
在一些实施方式中，各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、TexasRed、Atto 590、Cy5、Quasar 670以及Cy5.5中的任一种。
在一些实施方式中，所述内参探针与所述检测探针的荧光发射基团信号可区分。
本发明可同时采用多通道进行，只需在不同通道采用单独的探针即可。在一些优选的实施方式中，检测探针和内参探针上的荧光发射基团在同一反应体系下可被区分。
在一个具体的实施例中，SEQ ID NO：3所示的探针上的荧光发射基团为FAM；SEQID NO：7所示的探针上的荧光发射基团为VIC。
在一些实施方式中，各探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种，优选BHQ1。
本发明的第二方面提供含有上述引物探针组合的试剂盒。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中，所述的试剂盒还包含扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、UNG 酶、DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品、防腐剂以及水中的至少一种。
适合于实施本发明的聚合酶是本领域熟知的，可以从多个来源获得。热稳定性DNA聚合酶可以从多种商业途径获得，使用本领域技术人员熟知的方法。优选的热稳定性的DNA聚合酶可以包括但不限于：TaqDNA聚合酶或其突变体、衍生物或片段。
优选的，试剂盒中的核酸组分，例如引物、探针、阳性对照以及阴性对照以干粉形式存放于试剂盒中。阳性对照以及阴性对照也可以以质粒的方式存在。
各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后（在所述制造后物质通常作为粉末存在）被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分，特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。
本发明的第三方面提供上述引物探针组合制备CASP3基因的SNP位点rs113420705分型的试剂盒中的应用。
本发明所公开的组合产品和/或试剂盒中的核酸样品的来源包括但不限于，细胞，例如循环血液、培养的细胞、肿瘤细胞。样本的来源例如咽拭子、鼻拭子、痰液、呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、眼结膜拭子、唾液样品、粪便标本、抗凝血和血清标本中的一种或多种。DNA可以是基因组或者质粒或其他载体中的DNA。本发明用于检测基因组DNA中的突变，可以是灵长类动物（尤其是人）以及公知或未知的具有CASP3基因rs113420705位点（T>C）突变的其他任何动物或其他。在一些实施方式中，模板序列或核酸样品可以是gDNA。在一些实施方式中，模板序列或核酸样品可以是口腔脱落细胞样本DNA或全血样本DNA。DNA模板序列或核酸样品可以是任意类型的组织，包括例如福尔马林固定的石蜡包埋组织样品。模板核酸还可以是使用本领域已知的技术化学合成的。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明使用ARMS结合荧光PCR技术具有高特异性以及高灵敏性，检测时耗短，成本低，结果直观好判读。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例4中，1.5ng/μL全血样本C6 CASP3基因分型结果图；其中，a. CASP3TT PCR反应体系检测结果；b. CASP3 CC PCR反应体系检测结果；c. CASP3基因一代测序结果。
图2是实施例4中，0.5ng/μL口腔脱落细胞样本B6 CASP3基因分型结果图；其中，a.CASP3 TT PCR反应体系检测结果；b. CASP3 CC PCR反应体系检测结果；c. CASP3基因一代测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除有特殊说明外，本发明中所用的试剂、设备或方法等都是本领域技术人员所熟知的，在此不再赘述。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
实施例1：引物、探针筛选
步骤1：CASP3基因引物和探针设计和选择
查找CASP3基因rs113420705位点附近序列：在NCBI上查找CASP3基因rs113420705位点序列信息（NC_000004.12），截取rs113420705位点上下游300~500bp的序列进行引物探针设计，标记为下划线的[T/C]即是CASP3基因rs113420705位点（T>C）。
GCCCAGGCTCCCGCCTCCGGGCCAAGTCTCTCGCTCCGCGGGCTTCACTGCTCGCCCCCGCCCGGGCGAGGTGGCAAAACAAACACTCCGCCTTCCAGACCGGGCAGGTACCCGGGCGGGCGCAGGGCCTGGGAGAACGCAGGGAGCGGGGGCAGGGCTGACGGCCCGGAGCGAGGGCGGCAGTCACCGCACAGCCTCCTCATACCTTC[T/C]ACAACCGCCTCACAATAGCACCCATCCGCTAGGAGCCGCGTCTGCACTGCTTCCGCGGCCCGCCGCCGGGAGATGTGCTCCAGCGCCAGCCCCGCCTCCCGCCCGCCCCTGTCGGCCCCTCGCGCCGCCTCCGCTGCGGCCCGTCCCCTAGCTCCCGCCCGCCCGAGAACCCAGCCCCAGGCTGGGCCCCAGGAGGCGCCCGCCCACCGCAGCGCGCC
在引物和探针设计软件oligo 7和Primer Premier 5.0软件的辅助下对引物、探针序列进行设计。以CASP3基因rs113420705位点的碱基为上游引物3’末端的最后一个碱基，设计3条上游引物及2套下游引物和探针，见表1。
使用所设计的上下游引物及探针进行组合后对空白对照品（NTC）、野生型样本DNA、突变型样本DNA对待测位点引物、探针序列进行筛选。由表2可见每个位点的12对引物、探针组合的NTC检测结果均合格，均可用于下一步的扩增效率和特异性检测。由表3可见，通过对不同组合的扩增效率和特异性筛选出了最优的组合（表4）。
表1 CASP3基因rs113420705位点引物和探针序列信息表
注：表格中的小写字母标记的引物为人为引入的错配碱基。
表2 单重引物探针NTC筛选检测结果
表3 CASP3基因引物、探针特异性及扩增效率筛选结果
表4 筛选后最优的位点引物和探针序列信息
注：表格中的小写字母标记的引物为人为引入的错配碱基。
步骤2：内参引物和探针设计和选择
内参基因选用人类管家基因（GAPDH），在引物和探针设计软件oligo 7和PrimerPremier 5.0软件的辅助下，以taqman探针设计的原理设计出2套引物和对应的探针，探针5’端采用荧光报告基团（VIC）标记，3’端采用非荧光淬灭剂（BHQ-1）标记，以降低背景干扰，内参引物探针设计见表5。
用设计的2套内参引物探针对空白对照品、野生型样本DNA、突变型样本DNA进行检测，通过分析后筛选到GAPDH-F3、GAPDH-R3、GAPDH-P的效果更优。
表5 内参引物和探针序列信息
步骤3：多重体系引物探针组合
综合上述对CASP3基因位点检测引物探针和内参引物探针选择的结果，入选的序列（见表4）进入下一步多重体系引物探针的组合（见表6、表7），并且对组合后的引物、探针进行用量优化，最终筛选出的最优用量可见表9、表10。根据表9、表10配制相应的引物、探针混合液，对不同基因型的口腔脱落细胞样本、全血样本，具体检测结果见实施例2。
综上，通过上述对CASP3基因以及内参基因引物探针的筛选，最终确定优选的引物探针组合和内参引物探针组合见表8。
表6 CASP3 TT组合引物、探针序列信息
表7 CASP3 CC组合引物、探针序列信息
表8 最优选引物探针组合序列信息
实施例2：反应体系及反应程序的优化
通过对不同Mix使用量、不同引物、探针浓度及用量、DNA模板不同用量的研究，建立了最佳反应体系，通过对不同退火温度、时间、循环数的研究，建立了最佳反应程序。反应体系及反应程序见表9～表14。
具体的，人CASP3基因多态性检测试剂盒（荧光PCR法），包括以下步骤：
S1：核酸提取；
S2：反应液配置；
S3：加样；
S4：qPCR扩增；
S5：数据分析。
步骤 S1 具体为：
（1）口腔脱落细胞样本：将装有口腔拭子的离心管涡旋震荡1 min，使口腔脱落细胞彻底洗脱下来，丢掉拭子；使用核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20211439号）进行核酸提取；
（2）全血样本：使用核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20230207）进行核酸提取。
步骤S2具体为：根据待测标本数量n（需包含阴性质控品、阳性质控品）分装PCR反应液，按照23μl/管分装至PCR反应管/板中。步骤S2中PCR反应液共有3个，其中包含CASP3TT、CASP3 CC引物、探针混合液，配制如表9、表10所示，以及1个PCR反应缓冲液，配制如表11所示，PCR反应液配制用到的引物、探针序列见表4（本发明中若非特别强调，则采用的都是该组检测体系）。
表9 CASP3 TT引物、探针混合液的配制
表10 CASP3 CC引物、探针混合液的配制
表11 PCR反应缓冲液的配制
步骤S3具体为：将待测样本提取的核酸、阴性质控品提取的核酸、阳性质控品分别加入PCR反应液中，盖紧管盖或封好膜，瞬时离心数秒使液体集中至管底部，转入核酸扩增区。反应体系配制如下表12、表13所示。
表12 CASP3 TT PCR反应体系
表13 CASP3 CC PCR反应体系
步骤S4具体为：①将PCR反应管/板置入定量PCR仪的样品槽，按对应名称设置阳性质控品、阴性质控品和未知样本，并设置样本名称、检测靶标名称；②荧光检测通道选择：CASP3：FAM，GAPDH：VIC；淬灭基团选择“none”；参比染料Passive Reference选择“none”；③反应程序设置；④选择反应体系为25μL；⑤设置完毕，保存文件，运行反应程序。步骤S4中用到的反应程序如表14。
表14 反应程序
步骤S5具体为：①结果分析条件设定，调整基线、阈值线：②质控品判定；③检测结果的判断。步骤S5中使用的质控标准如表15，结果判断标准如表16。
表15 质控标准
表16 结果判断表
因此，人CASP3基因多态性检测试剂盒的组成成分、包装及数量（24人份/盒），如表17。
表17 试剂盒的组成成分、包装及数量
实施例3：试剂盒的准确性检测实验
选取32例CASP3基因rs113420705位点不同基因型的口腔脱落细胞样本进行本发明的试剂盒的准确性检测实验，样本编号为A1-A32。参照实施例2的步骤，样本按照步骤S1的口腔脱落细胞样本提取方法对32例样本进行核酸提取，按照S2步骤的表9、表10、表11配制PCR反应液，配制后的PCR反应液按照步骤S3的表12、表13配制2个反应体系并按顺序加入A1-A32 DNA样本以及阴性质控品和阳性质控品。体系配制完成后，盖紧PCR反应管/板盖，充分混匀，8,000 rpm离心15秒后转移至扩增检测区。扩增程序的设置以及荧光通道的选择按照步骤S4所示。扩增结束后按照步骤S5对结果进行质控和结果判断。32例临床样本的检测结果如表18所示。
表18 口腔脱落细胞样本检测结果
由表18可见，检测的32例口腔脱落细胞样本中，CASP3基因的rs113420705位点基因分型结果为1例TT型、15例TC型、16例CC型，使用本发明试剂盒的分型结果与一代测序所验证的基因型结果完全一致。
实施例4：试剂盒的检测限研究实验
选取CASP3基因rs113420705位点不同基因型的口腔脱落细胞样本及全血样本各3例进行检测限研究实验。口腔脱落细胞样本的编号为B4-B6，全血样本的编号为C4-C6。参照实施例2的步骤，样本B4-B6和C4-C6分别按照步骤S1的口腔脱落细胞样本提取方法和全血样本提取方法进行核酸提取，样本提取后将B4-B6分别稀释至0.3ng/μL、0.5ng/μL、0.8ng/μL和1ng/μL，样本C4-C6分别稀释至1ng/μL、1.5ng/μL、2ng/μL和2.5ng/μL。按照S2步骤的表9、表10、表11配制PCR反应液，配制后的PCR反应液按照步骤S3的表12、表13配制2个反应体系并按顺序加入B4-B6、C4-C6、阴性质控品和阳性质控品，每个样本做3个重复实验。体系配制完成后，盖紧PCR反应管/板盖，充分混匀，8,000 rpm离心15秒后转移至扩增检测区。扩增程序的设置以及荧光通道的选择按照步骤S4所示。扩增结束后按照步骤S5对结果进行质控和结果判断，检测结果如表19、表20、表21、表22以及图1、2所示。
表19 全血样本CASP3 TT PCR反应体系检测结果
表20 全血样本CASP3 CC PCR反应体系检测结果
表21 口腔脱落细胞样本CASP3 TT PCR反应体系检测结果
表22 口腔脱落细胞样本CASP3 CC PCR反应体系检测结果
由表19、表20、表21、表22以及图1、2可见，全血样本的检测限为1.5ng/μL，口腔脱落细胞样本的检测限为0.5ng/μL。当全血样本浓度大于或等于1.5ng/μL时或口腔脱落细胞样本的浓度大于或等于0.5ng/μL时，分别所检测的3例样本的3次重复实验的CASP3基因rs113420705位点的基因型与使用一代测序法验证的基因型一致。
实施例5：临床应用实验
选取20例全血临床样本对本发明的试剂盒进行临床应用实验，样本编号为1-20。参照实施例2的步骤，临床样本按照步骤S1的全血样本提取方法对20例样本进行核酸提取，按照S2步骤的表9、表10、表11配制PCR反应液，配制后的PCR反应液按照步骤S3的表12、表13配制2个反应体系并按顺序加入1-20例 DNA样本以及阴性质控品和阳性质控品。体系配制完成后，盖紧PCR反应管/板盖，充分混匀，8,000 rpm离心15秒后转移至扩增检测区。扩增程序的设置以及荧光通道的选择按照步骤S4所示。扩增结束后按照步骤S5对结果进行质控和结果判断。20例临床样本的检测结果如表23所示。
表23 全血样本检测结果
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由表23可见，检测的20例全血样本中，CASP3基因的rs113420705位点基因分型结果为1例TT型、11例TC型、8例CC型，使用本发明试剂盒的分型结果与一代测序所验证的基因型结果完全一致。
通过上述方法检测人口腔脱落细胞样本或全血样本中的CASP3基因rs113420705位点多态性。口腔脱落细胞样本的提取方法简单，快速，能够满足产品检测需求；产品设计选用常用化学物质及普通Taqman探针，成本低，检测结果可靠；灵敏度高，最低可以检出0.5ng/μL DNA；检测准确性高，对不同基因型的口腔脱落细胞样本和全血样本进行检测，检测结果与一代测序检测的基因型结果完全一致。填补了目前市场上人CASP3基因多态性检测试剂盒（荧光PCR法）的空白状况，可为临床具有川崎病症状的患儿提供川崎病并发CAL的预后和风险评估。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.引物探针组合，其特征在于：所述引物包括：选自核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物，用于检测CASP3基因rs113420705位点的T位点；选自核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物，用于检测CASP3基因rs113420705位点的C位点；
所述探针包括SEQ ID NO：3所示的检测探针；SEQ ID NO：3即用于检测CASP3基因rs113420705位点的T位点；也用于检测CASP3基因rs113420705位点的C位点。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于：所述引物还包括内参引物，所述探针还包括内参探针。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于：所述内参引物和所述内参探针用于定量检测人管家基因的核酸片段的表达。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于：所述内参引物的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
5.根据权利要求2～4任一项所述的引物探针组合，其特征在于：所述探针为自身淬灭探针，且所述内参探针与所述检测探针的荧光发射基团信号可区分。
6.权利要求1～5任一项所述的引物探针组合在制备CASP3基因的SNP位点rs113420705分型的试剂盒中的应用。
7.含有权利要求1～5任一项所述的引物探针组合的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含扩增缓冲液、dNTP、Mg2 +、UNG 酶、DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品、防腐剂以及水中的至少一种。
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