ES2917175T3 - Degradación selectiva de ADN de tipo salvaje y enriquecimiento de alelos mutantes usando nucleasa - Google Patents

Degradación selectiva de ADN de tipo salvaje y enriquecimiento de alelos mutantes usando nucleasa Download PDF

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Abstract

La presente divulgación proporciona métodos para preparar un ácido nucleico mutante objetivo para el enriquecimiento posterior en relación con un ácido nucleico de tipo salvaje que usa nucleasas que tienen una actividad sustancialmente mayor en ADN de doble cadena versus ADN o ARN de una sola cadena. La presente divulgación también incluye métodos para enriquecer un ácido nucleico mutante objetivo y para preparar ácidos nucleicos no metilados/metilados de interés para el enriquecimiento posterior. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Degradación selectiva de ADN de tipo salvaje y enriquecimiento de alelos mutantes usando nucleasa
APOYO DEL GOBIERNO
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el número de concesión R21 CA175542 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Una situación común en el análisis genético implica la necesidad de identificar un bajo porcentaje de secuencias de ADN variantes ('alelos minoritarios') en presencia de un gran exceso de secuencias no variantes ('alelos mayoritarios'). Los ejemplos de tales situaciones incluyen lo siguiente: identificación y secuenciación de unos pocos alelos mutados en presencia de un gran exceso de alelos normales (de tipo salvaje), una situación común en el cáncer (por ejemplo, identificación de ADN circulante tumoral en la sangre o en la orina de pacientes con cáncer (o ADN anormal en personas sospechosas de tener cáncer) en presencia de un gran exceso de alelos de tipo salvaje); identificación de unos pocos alelos metilados en presencia de un gran exceso de alelos no metilados (o viceversa) en el análisis epigenético; identificación y determinación del genotipo de unas pocas secuencias de ADN fetal que circulan en la sangre materna, en la que también está presente un gran exceso de secuencias de ADN materno; identificación de cepas mutadas emergentes en agentes infecciosos (bacterias o virus); y detección de secuencias variantes para el desarrollo de cultivos.
Si bien se han descrito métodos confiables de detección de alto rendimiento para la línea germinal o mutaciones somáticas de alta prevalencia, la detección de mutaciones somáticas de baja prevalencia en tumores con heterogeneidad, contaminación estromal, o en fluidos corporales sigue siendo problemática. Y, sin embargo, la importancia clínica de identificar estas mutaciones es muy importante en varias situaciones. Por ejemplo, en el adenocarcinoma pulmonar, las mutaciones de EGFR de bajo nivel que no pueden identificarse mediante la secuenciación normal pueden conferir una respuesta positiva a los inhibidores de la tirosina cinasa o resistencia a los medicamentos. Las mutaciones en plasma útiles como biomarcadores para la detección temprana del cáncer, o la respuesta del cáncer al tratamiento, no se pueden secuenciar usando métodos convencionales, debido al alto exceso de alelos de tipo salvaje que se originan en tejidos normales. Además, las mutaciones en tumores con contaminación estromal frecuente, tal como el cáncer de páncreas o de próstata, pueden "enmascararse" por la presencia de alelos de tipo salvaje, requiriendo de este modo una microdisección laboriosa o dando como resultado la ausencia total de mutaciones.
La publicación de patente US7435794 describe un método para enriquecer ácidos nucleicos mutantes diana mediante la escisión selectiva de ácidos nucleicos de tipo salvaje en una muestra de ácido nucleico complejo con una nucleasa específica de doble hebra (DSN).
Más allá del cáncer, los bajos niveles de ADN diana en presencia de altos niveles de ADN no diana aparecen en muchos otros campos y aplicaciones. Por ejemplo, la detección de una pequeña cantidad de alelos fetales dentro de los alelos maternos es especialmente importante para el diagnóstico prenatal durante las primeras etapas del embarazo, en las que los alelos fetales comprenden una fracción baja. Una aplicación especialmente interesante para este fin es el hecho de que los alelos fetales están sustancialmente hipometilados en comparación con los alelos maternos. De este modo, existe una necesidad general de desarrollar técnicas que permitan la identificación de alelos minoritarios de bajo nivel (por ejemplo, alelos mutados o hipo/hipermetilados) en presencia de alelos mayoritarios no variantes de alto nivel.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente descripción se refiere a un nuevo desarrollo (enriquecimiento de mutaciones asistido por nucleasas, NaME) que da como resultado la escisión preferencial de los ácidos nucleicos de tipo salvaje, lo que permite el enriquecimiento posterior de las secuencias diana mutadas de interés. Las secuencias enriquecidas con mutaciones pueden examinarse entonces utilizando cualquier método actualmente disponible para identificar mutaciones, tales como la secuenciación de Sanger, la fusión de alta resolución (HRM), etc.
Por consiguiente, algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar un ácido nucleico mutante diana para el posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje. El método comprende someter una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de doble hebra de tipo salvaje y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra; poner en contacto los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra desestabilizados con un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de muíante diana-sonda parcialmente complementarios, en los que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa; y exponer los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios y los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios a una nucleasa específica de la doble hebra (DSN), en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar un ácido nucleico mutante diana para su posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, que comprende exponer una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una nucleasa específica de la doble hebra (DSN) y a un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para crear un mezcla de reacción, en la que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa; y someter la mezcla de reacción a una condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
En algunas realizaciones, la condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutantes de doble hebra para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante comprende añadir un disolvente orgánico y/o un aumento de temperatura combinado con una DSN termoestable.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar un ácido nucleico mutante diana para su posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, que comprende exponer una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para crear un mezcla de reacción, en la que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa; someter la mezcla de reacción a una temperatura desnaturalizante para permitir la desnaturalización del ácido nucleico de tipo salvaje y el ácido nucleico mutante diana; reducir la temperatura de la mezcla de reacción para permitir la formación de dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios; y exponer la mezcla de reacción a una nucleasa específica de la doble hebra (DSN), en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
En algunas realizaciones, el método se usa para preparar un ácido nucleico diana no metilado de interés para el posterior enriquecimiento, y en el que, antes de implementar el protocolo de NaME descrito aquí en la mezcla de reacción, la muestra de ácido nucleico se trata con bisulfito de sodio y una de las sondas oligonucleotídicas complementarias a la hebra superior del ácido nucleico metilado de interés, mientras que la otra sonda oligonucleotídica es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico metilado de interés.
En algunas realizaciones, el método se usa para preparar un ácido nucleico diana metilado de interés para el posterior enriquecimiento, y en el que, antes de implementar el protocolo de NaME descrito aquí en la mezcla de reacción, la muestra de ácido nucleico se trata con bisulfito de sodio y una de las sondas oligonucleotídicas complementarias a la hebra superior del ácido nucleico no metilado de interés, mientras que la otra sonda oligonucleotídica es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico no metilado de interés.
En algunas realizaciones, el método se utiliza para preparar tanto un ácido nucleico diana no metilado de interés como un ácido nucleico diana metilado de interés para el enriquecimiento posterior, en el que el método comprende: (i) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma metilada del ácido nucleico diana no metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma metilada del ácido nucleico diana no metilado de interés, (ii) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma no metilada del ácido nucleico diana metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma no metilada del ácido nucleico diana metilado de interés; y en el que, antes de implementar el protocolo de NaME descrito aquí en la mezcla de reacción, la muestra de ácido nucleico se trata con bisulfito de sodio.
En algunas realizaciones, el método se usa para preparar múltiples ácidos nucleicos diana de interés, algunos de los cuales son ácidos nucleicos diana metilados de interés y algunos de los cuales son ácidos nucleicos diana no metilados de interés, y el método comprende (i) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma metilada de cada ácido nucleico diana no metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma metilada de cada ácido nucleico diana no metilado de interés, (ii) una par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma no metilada de cada ácido nucleico diana metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma no metilada de cada ácido nucleico diana metilado de interés.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar un ácido nucleico mutante diana para el posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, comprendiendo el método las etapas de: (a) exponer una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una nucleasa termoestable específica de la doble hebra (DSN) y a un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para crear un mezcla de reacción, en la que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa; (b) someter la mezcla de reacción a una temperatura desnaturalizante para permitir la desnaturalización del ácido nucleico de tipo salvaje y el ácido nucleico mutante diana; y (c) reducir la temperatura para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
En algunas realizaciones, las etapas (b) y (c) se repiten durante dos o más ciclos. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la temperatura de desnaturalización está entre 65 y 852C.
Además, en algunas realizaciones, la etapa (c) de reducir la temperatura se realiza aplicando un gradiente de temperatura decreciente entre temperaturas que permiten la hibridación de sondas que tienen diferente Tm con sus secuencias correspondientes en el ADN diana. Por ejemplo, se puede aplicar un gradiente de temperatura decreciente de 67°C a 64°C durante la digestión con DSN, para permitir que diversas sondas que tienen distintas Tm de 64-67°C se hibriden de manera efectiva con sus dianas respectivas. ('Touch-down NaME'). El gradiente de temperatura puede oscilar preferiblemente entre 2-20°C.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para enriquecer un ácido nucleico mutante diana, comprendiendo el método las etapas de: (a) preparar una mezcla de reacción de amplificación que comprende: un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra, un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, una nucleasa termoestable específica de la doble hebra (DSN), un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, en la que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa y los componentes de la amplificación por PCR; (b) someter la mezcla de reacción a una temperatura desnaturalizante para permitir la desnaturalización del ácido nucleico de tipo salvaje y el ácido nucleico mutante diana; (c) reducir la temperatura para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios; y (d) someter la mezcla de reacción a una condición de amplificación, enriqueciendo así el ácido nucleico mutante diana no escindido con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje escindido.
En algunas realizaciones, la condición de amplificación es tal que la amplificación se aplica a las sondas en vez de al ácido nucleico hibridado. En algunas realizaciones, se aplica una etapa de purificación después de la unión de la sonda a las hebras diana de ADN superior e inferior, ya sea antes o después de la escisión con DSN, para eliminar el exceso de sondas no unidas. Después, tras la escisión con DSN, las sondas sin cortar se amplifican (en lugar de amplificar el ADN diana) y se identifican/cuantifican. Dado que las sondas que se unen al ADN WT habrán sido digeridas selectivamente por DSN, la presencia de cualquier sonda determinada después de la amplificación indica una mutación en la región cubierta por esta sonda.
En algunas realizaciones, las etapas (b) y (c) se repiten durante dos o más ciclos antes de ejecutar la etapa (d). En algunas realizaciones, las etapas (b), (c) y (d) se repiten durante dos o más ciclos. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la temperatura de desnaturalización está entre 65 y 85°C. En algunas realizaciones, los cebadores usados para la amplificación por PCR tienen una temperatura de fusión inferior a la temperatura aplicada en la etapa (c). En algunas realizaciones, la condición de amplificación es COLD-PCR.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar ácidos nucleicos no metilados de interés para su posterior enriquecimiento con respecto a los correspondientes ácidos nucleicos metilados, que comprende las etapas de: (a) ligar adaptadores resistentes al bisulfito a ácidos nucleicos de doble hebra de interés; (b) someter los ácidos nucleicos unidos a adaptadores a un tratamiento con bisulfito de sodio y a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, para formar ácidos nucleicos de doble hebra tratados con bisulfito; (c) someter los ácidos nucleicos tratados con bisulfito a una temperatura que permita la desnaturalización preferencial de los ácidos nucleicos no metilados, al tiempo que los ácidos nucleicos metilados permanecen en forma de doble hebra; (d) exponer los ácidos nucleicos no metilados y metilados a nucleasa específica de la doble hebra (DSN) y a condiciones para una actividad de DSN óptima, en el que la DSN escinde los ácidos nucleicos de doble hebra metilados pero no los ácidos nucleicos de hebra sencilla no metilados.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar ácidos nucleicos no metilados de interés para su posterior enriquecimiento con respecto a los correspondientes ácidos nucleicos metilados, que comprende las etapas de: (a) ligar adaptadores resistentes al bisulfito a ácidos nucleicos de doble hebra de interés; (b) someter los ácidos nucleicos unidos a adaptadores a un tratamiento con bisulfito de sodio y a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, para formar ácidos nucleicos de doble hebra tratados con bisulfito; (c) someter los ácidos nucleicos tratados con bisulfito a una temperatura de desnaturalización que permita la desnaturalización de los ácidos nucleicos metilados y no metilados, para formar ácidos nucleicos de hebra sencilla metilados y no metilados; (d) reducir la temperatura para permitir la formación preferencial de dúplex metilados, pero no de dúplex no metilados; y (e) exponer los ácidos nucleicos no metilados y metilados a nucleasa específica de la doble hebra (DSN) y a condiciones para una actividad de DSN óptima, en el que la DSN escinde preferentemente los dúplex metilados pero no los ácidos nucleicos de hebra sencilla no metilados.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar ácidos nucleicos metilados de interés para su posterior enriquecimiento con respecto a los correspondientes ácidos nucleicos no metilados, que comprende las etapas de: (a) ligar adaptadores resistentes al bisulfito a ácidos nucleicos de doble cadena de interés; (b) someter los ácidos nucleicos unidos a adaptadores a un tratamiento con bisulfito de sodio y a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para formar ácidos nucleicos de doble hebra tratados con bisulfito; (c) someter los ácidos nucleicos tratados con bisulfito a una temperatura que permita la desnaturalización preferencial de los ácidos nucleicos no metilados, al tiempo que los ácidos nucleicos metilados permanecen en forma de doble hebra; y (d) exponer los ácidos nucleicos no metilados y metilados a una exonucleasa y a condiciones para una actividad de exonucleasa óptima, en el que la exonucleasa escinde los ácidos nucleicos de hebra sencilla metilados pero no los ácidos nucleicos de doble hebra no metilados.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar ácidos nucleicos metilados de interés para su posterior enriquecimiento con respecto a los correspondientes ácidos nucleicos no metilados, que comprende las etapas de: (a) ligar adaptadores resistentes al bisulfito a ácidos nucleicos de doble hebra de interés; (b) someter los ácidos nucleicos unidos a adaptadores a un tratamiento con bisulfito de sodio y a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, para formar ácidos nucleicos de doble hebra tratados con bisulfito; (c) someter los ácidos nucleicos tratados con bisulfito a una temperatura de desnaturalización que permita la desnaturalización de los ácidos nucleicos metilados y no metilados, para formar ácidos nucleicos de hebra sencilla metilados y no metilados; (d) reducir la temperatura para permitir la formación preferencial de dúplex metilados, pero no de dúplex no metilados; y (e) exponer los ácidos nucleicos no metilados y metilados a una exonucleasa y a condiciones para una actividad de exonucleasa óptima, en el que la exonucleasa escinde preferentemente los ácidos nucleicos de hebra sencilla no metilados, pero no los dúplex metilados.
En algunas realizaciones, la reacción de amplificación de los ácidos nucleicos de la etapa (b) se selecciona del grupo que consiste en: PCR; COLD-PCR completa, COLD-PCR rápida; COLD-PCR en hielo, COLD-PCR tolerante a la temperatura, y COLD-PCR de tiempo de desnaturalización limitado. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de hebra sencilla no metilados escindidos y los dúplex metilados no escindidos se someten a una condición de amplificación usando los adaptadores resistentes al bisulfito ligados en la etapa (a). En algunas realizaciones, la condición de amplificación se selecciona del grupo que consiste en: PCR; COLD-PCR completa, COLD-PCR rápida; COLD-PCR en hielo, COLD-PCR tolerante a la temperatura, y COLD-PCR de tiempo de desnaturalización limitado. En algunas realizaciones, las secuencias naturalmente ricas en AT se eliminan antes del tratamiento con bisulfito de sodio.
En cualquiera de los métodos anteriores, las sondas están en un exceso molar de 100 a 1000 millones de veces en comparación con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana. En cualquiera de los métodos anteriores, una de las sondas se solapa con una secuencia en la hebra superior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, mientras que la otra sonda se solapa con una secuencia en la hebra inferior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, y las dos sondas se solapan parcialmente entre sí. En cualquiera de los métodos anteriores, cada sonda comprende un ácido nucleico bloqueado (LNA), un ácido nucleico peptídico (PNA), un ácido xenonucleico (XNA), un ácido nucleico con cualquier base modificada conocida o un ARN. En cualquiera de los métodos anteriores, el método se usa para preparar dos o más ácidos nucleicos mutantes diana diferentes para el posterior enriquecimiento con respecto a los ácidos nucleicos de tipo salvaje correspondientes, y el método comprende además uno o más pares adicionales de sondas dirigidas contra los diferentes ácidos nucleicos de tipo salvaje, en el que para cada par de sondas, una de las sondas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje. En cualquiera de los métodos anteriores, la muestra de ácido nucleico comprende ADN genómico o ADN circulante en orina, plasma u otros fluidos corporales.
En cualquiera de los métodos anteriores, los métodos comprenden además el enriquecimiento de los ácidos nucleicos para las regiones de interés antes de implementar el protocolo de NaME descrito aquí de la siguiente manera: poner en contacto la muestra de ácido nucleico con oligonucleótidos cebo que se unen a diferentes ácidos nucleicos de interés en las hebras superior e inferior, lo que permite unir los oligonucleótidos cebo a los ácidos nucleicos de interés en las hebras superior e inferior, y aislar los oligonucleótidos cebo con los ácidos nucleicos de interés unidos a los mismos de los ácidos nucleicos restantes. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos cebo están biotinilados en un extremo. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos cebo se unen a perlas.
En cualquiera de los métodos anteriores, antes de implementar el protocolo de NaME descrito aquí, la muestra de ácido nucleico se somete a una condición de amplificación.
En cualquiera de los métodos anteriores, los métodos comprenden además enriquecer el ácido nucleico mutante diana con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje sometiendo la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos a una condición de amplificación, enriqueciendo así el ácido nucleico mutante diana no escindido con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje escindido. En algunas realizaciones, la condición de amplificación se selecciona del grupo que consiste en: PCR, COLD-PCR, PCR mediada por ligación o COLD-PCR usando adaptadores ligados comunes, PCR multiplex, y amplificación isotérmica.
En cualquiera de los métodos anteriores, cada sonda se puede modificar opcionalmente en el extremo 3' para evitar la extensión por polimerasa.
En cualquiera de los métodos anteriores, los métodos comprenden además enriquecer el ácido nucleico mutante diana con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje sometiendo la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos a una condición adicional de degradación del ADN que hidroliza enzimáticamente los dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos por DSN, con la degradación iniciada en la posición de la escisión.
En cualquiera de los métodos anteriores, los métodos comprenden además analizar la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos usando uno o más de los métodos seleccionados del grupo que consiste en: MALDI-TOF, fusión con HR, didesoxi-secuenciación, secuenciación de molécula única, secuenciación masivamente paralela (MPS), pirosecuenciación, SSCP, RFLP, dHPLC, CCM, PCR digital y PCR cuantitativa.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos proporcionados, la enzima DSN es una enzima guiada por ADN o guiada por ARN. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos proporcionados, la enzima es una enzima guiada por ARN, por ejemplo Cas9. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos proporcionados, la enzima es una enzima guiada por ADN, por ejemplo una enzima Argonauta.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar un ácido nucleico mutante diana para su posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, que comprende un ácido nucleico de doble hebra de tipo salvaje y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra; poner en contacto los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra desestabilizados con un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa, y en el que una o ambas sondas comprenden un ácido nucleico bloqueado (LNA), un ácido nucleico peptídico (PNA), un ácido xenonucleico (XNA), o un ácido nucleico con cualquier base modificada conocida o ARN que es capaz de bloquear la amplificación por PCR; y someter los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, a una condición de amplificación. La o las sondas que se solapan a la posición de mutación actúan bloqueando la amplificación por PCR, por ejemplo actuando como abrazadera, para las hebras de ADN superior e inferior de tipo salvaje, inhibiendo así la amplificación del ácido nucleico de tipo salvaje. Cuando la sonda se duplica con una secuencia mutante diana parcialmente complementaria, es menos capaz de inhibir la amplificación por PCR, permitiendo así la amplificación selectiva del ácido nucleico mutante en comparación con el tipo salvaje, sin necesidad de una enzima de corte (por ejemplo, DSN).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1A es un esquema de la degradación selectiva de ADN de doble hebra de tipo salvaje usando nucleasa específica de dúplex (DSN) y oligonucleótidos selectivos de secuencia ("sondas") a temperaturas elevadas. Se puede aplicar opcionalmente una etapa de desnaturalización del ADN antes de la acción de la DSN, para generar ADN monocatenario antes de la unión de la sonda y la degradación selectiva del tipo salvaje de ambas hebras de ADN. La Fig. 1B muestra la validación del enriquecimiento de la mutación a base de NaME como se describe en la Fig 1A a través de PCR digital (ddPCR) para un amplicón de KRAS mutado, con una abundancia de mutación original de 5% (abundancia de mutación = relación fraccional de ADN mutante a ADN de tipo salvaje, expresada como porcentaje). En este ejemplo, el ADN no se sometió a una etapa de desnaturalización a 95°C; se mezclaron el ADN, las dos sondas y la DSN, y se elevó la temperatura (67°C) para desestabilizar el dúplex y permitir la unión de la sonda. Se aplicó un intervalo de temperaturas para identificar las temperaturas óptimas para la digestión específica del WT. Tras la acción de la DSN, la DSN se inactivó mediante calentamiento a 95°C, y se aplicó PCR digital de gotas (ddPCR) a la muestra digerida. ddPCR cuantifica el enriquecimiento logrado de la mutación al medir la abundancia fraccional de la mutación antes y después de la acción de la DSN.
La Fig. 2 es un esquema que muestra el uso de sondas parcialmente solapantes para proporcionar selectividad simultáneamente en ambas hebras de ADN cuando se unen a una mutación. Las sondas están preferiblemente bloqueadas en 3' para evitar la posterior extensión por polimerasa.
La Fig. 3 es un esquema que muestra el uso de nucleasa específica de dúplex y oligonucleótidos selectivos de secuencias parcialmente solapantes para permitir la degradación selectiva de ADN de doble hebra, o desnaturalizado. Con la secuencia mutante, existe una complementariedad limitada entre las sondas de la hebra superior e inferior, lo que prohíbe las interacciones de sonda a sonda a temperaturas más altas.
La Fig. 4 es un esquema que muestra la degradación del alelo de tipo salvaje directamente desde el ADN genómico fragmentado (es decir, ADN no preamplificado). Tenga en cuenta que se puede adoptar un enfoque multiplex; se pueden usar miles de sondas simultáneamente en dianas de ADN seleccionadas de interés.
La Fig. 5 muestra los resultados de un ensayo uni-plex, que muestra el mayor aumento en la abundancia de mutaciones de secuencias mutacionales después de una reacción de DSN directamente en ADN genómico fragmentado para una secuencia diana del exón 8 de TP53 seleccionada. La abundancia de mutaciones se cuantifica antes y después del tratamiento de la muestra con DSN, utilizando ddPCR. La abundancia de mutaciones aumenta solo si se incluyen en la reacción las sondas superior e inferior, además de la nucleasa DSN.
La Fig. 6 muestra los resultados de un ensayo dúplex, que muestra la abundancia de mutaciones de una muestra que contiene KRAS mutado y p53 al 5% o al 0,3% de abundancia original, después de una reacción de DSN directamente en el ADN genómico fragmentado.
La Fig. 7A muestra los resultados de una reacción de DSN en el ADN genómico para un ensayo uni-plex que usa ADN mutado en tres posiciones diferentes en el exón 2 de KRAS en tres líneas celulares diferentes: H2009, A549 y HCT-15.
La Fig. 7B es una tabla que resume la abundancia de mutaciones encontrada en una reacción de DSN realizada directamente en ADN genómico fragmentado a través de un ensayo 11-plex. Las 11 dianas mutadas se formaron utilizando ADN de Horizon Dx. En la figura, la columna 1 muestra el nombre del gen diana, las columnas 2 y 3 representan la posición de la mutación y el tipo de mutación, respectivamente, la columna 4 muestra la abundancia de mutaciones derivada mediante PCR digital cuando se omite DSN; la columna 5 muestra la abundancia de mutaciones cuando se aplica DSN (NaME); la columna 6 representa la abundancia de mutaciones cuando se omiten tanto DSN como las sondas; y la columna 7 muestra la abundancia de mutaciones esperada según el fabricante Horizon, sin ningún tratamiento.
La Fig. 8 es un esquema que ilustra dos enfoques para la degradación selectiva del ADN de tipo salvaje antes de la resecuenciación dirigida: uno después de la PCR multiplexada (arriba) y uno antes de la PCR (abajo) usando la unión selectiva de dianas de ADN a perlas. En la última situación, las sondas utilizadas están diseñadas para solaparse parcialmente entre sí y unirse a las hebras diana de ADN superior e inferior. Además, están biotiniladas. Estas sondas se usan primero sin DSN para unirse a sus dianas y para inmovilizar dianas de ADN seleccionadas a perlas. A continuación, el ADN no inmovilizado se elimina de la disolución. A continuación, la temperatura se ajusta en consecuencia, y se aplica NaME como se ha descrito anteriormente.
La Fig. 9 es un esquema que ilustra la "reacción en cadena de la nucleasa". La degradación de tipo salvaje se combina con ciclos de desnaturalización durante el proceso de digestión con DSN, lo que da como resultado una mejor discriminación entre mutantes y WT, y, por lo tanto, un mejor enriquecimiento de mutaciones. Obsérvese que, después de una breve desnaturalización a 85°C y enfriamiento a 65°C, la reacción vuelve a realizar un ciclo a 85°C antes de que pueda producirse una rehibridación sustancial de las dos hebras.
La Fig. 10 es un esquema que ilustra la reacción en cadena de PCR-NaME, en la que tanto la amplificación por PCR como la reacción en cadena de la nucleasa operan simultáneamente en la muestra, en un solo tubo.
Los ciclos sucesivos de síntesis de PCR y degradación específica del tipo salvaje conducen a un enriquecimiento mejorado de secuencias mutadas.
La Fig. 11 es un esquema que ilustra COLD-PCR-NaME. Los ciclos sucesivos de síntesis específica de mutantes y degradación específica del tipo salvaje enriquecen las secuencias mutadas.
La Fig. 12A es un esquema que ilustra la exploración de mutaciones usando dos o más sondas más largas (no solapantes) en hebras opuestas. Las sondas se bloquean preferentemente en 3' para evitar la extensión por polimerasa, y pueden contener bases modificadas, tales como LNA, PNA, XNA, trifosfato de desoxinosina (dITP), o contener dUTP, o comprender ARN. En algunos casos, parte de las sondas puede comprender uno o más nucleótidos aleatorios, de manera que la sonda puede dirigirse contra una pluralidad de dianas de ADN. La secuencia combinada total bajo las dos sondas se interroga durante NaME: si hay una mutación en cualquier lugar debajo de las dos sondas, evitará el corte de la cadena.
La Fig. 12B muestra que la combinación de desnaturalización y DSN para la identificación de mutaciones como se describe en 12A da como resultado el corte preferencial del ADN de tipo salvaje. Una mutación presente en cualquier lugar debajo de las dos sondas da como resultado la amplificación del ADN mutado durante la posterior PCR o PCR digital. Los efectos de la longitud y la concentración de la sonda en el enriquecimiento de mutaciones se representan en los gráficos.
La Fig. 12C muestra la identificación de mutaciones usando dos sondas adyacentes y DSN en NaME como se describe en 12A. El gráfico presenta el promedio de enriquecimiento de mutaciones de cada mutación enumerada.
La Fig. 13 es un esquema que representa la aplicación de NaME con ARN o ADN de hebra sencilla. La degradación de ácido nucleico de tipo salvaje multiplexado se usa para enriquecer mutantes antes de la síntesis de ADNc o la PCR.
La Fig. 14 es un esquema que muestra el enriquecimiento por hipometilación a partir de ADN genómico fragmentado usando sondas diseñadas para coincidir con los alelos metilados en las secuencias diana.
La Fig. 15 muestra el enriquecimiento de secuencias de ADN no metiladas y COLD-PCR sensible a la metilación y tolerante a la temperatura después de la digestión preferencial con DSN de las secuencias que tienen una Tm mayor que la Tm de elección. Este esquema es una aplicación para todo el genoma, y no requiere el uso de sondas específicas de genes ni la selección de secuencias diana. El esquema enriquece y amplifica los alelos hipometilados en todo el genoma.
La Fig. 16 representa el procedimiento de usar el fraccionamiento por temperatura basado en exonucleasa de fragmentos de ADN para eliminar fragmentos de menor Tm antes de la conversión con bisulfito.
La Fig. 17 es un diagrama de flujo que muestra la elución basada en la temperatura de fragmentos de ADN genómico utilizando la unión de ADN a perlas magnéticas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En la mayoría de las aplicaciones que implican la detección de mutaciones somáticas de baja prevalencia, los alelos mutantes se detectan siguiendo una etapa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifica tanto los alelos mutantes como los de tipo salvaje. También se han descrito métodos para amplificar preferentemente los alelos mutados sobre los alelos de tipo salvaje (por ejemplo, co-amplificación a menor temperatura de desnaturalización o COLD-PCR y enriquecimiento mejorado y completo mediante COLD PCR o COLD-PCR en hielo; Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos GM. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant Dn A sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med 2008;14:579-84; Milbury CA, Li J, Makrigiorgos GM. Ice-COLD-PCR enables rapid amplification and robust enrichment for low-abundance unknown DNA mutations. Nucleic Acids Res;39:e2). Sin embargo, el enriquecimiento que se puede obtener a través de tales métodos basados en PCR tiene un límite, ya que después de varios ciclos de síntesis, la polimerasa inevitablemente introduce incorporaciones erróneas (errores de PCR) que posteriormente se califican como mutaciones. Las amplificaciones repetidas también pueden introducir un cebado incorrecto, que da como resultado la amplificación de secuencias no diana indeseadas. Además, actualmente están surgiendo poderosos métodos de análisis genético (sistemas Nanopore, Pac-Bio de 'secuenciación de tercera generación') que pueden obviar el uso de PCR por completo. Por lo tanto, son importantes los métodos de enriquecimiento de mutaciones que reducen la cantidad de PCR realizada, o que pueden operar sin PCR, o junto con PCR, si así se requiere.
La presente descripción se basa, al menos en parte, en el desarrollo novedoso de una técnica, enriquecimiento de mutaciones asistido por nucleasas (Nuclease-assisted Mutation Enrichment, NaME, por sus siglas en inglés), que da como resultado la escisión preferencial de ADN o ARN no variante/de tipo salvaje, lo que permite el posterior enriquecimiento selectivo de secuencias diana variantes (mutantes). De este modo, NaME se puede usar antes, durante o después de una etapa de amplificación, tal como PCR, o sin amplificación, según la aplicación. Posteriormente, las secuencias enriquecidas con mutaciones pueden examinarse a través de cualquier método actualmente disponible para identificar mutaciones, incluyendo la secuenciación de Sanger, fusión de alta resolución (HRM), SSCP, secuenciación paralela masiva de próxima generación, y MALDI-TOF, para mutaciones conocidas; y secuenciación de molécula única, o secuenciación de tercera generación para la secuenciación de alto rendimiento de mutaciones de bajo nivel. NaME también se puede aplicar para detectar niveles bajos de alelos no metilados (enriquecimiento de alelos minoritarios asistido por nucleasas sensible a la metilación, o MS-NaME) en un fondo de alelos metilados (o viceversa).
Los métodos descritos aquí mejoran enormemente los límites de detección actuales de las tecnologías de detección de mutaciones/metilaciones, lo que mejora de ese modo la fiabilidad de la detección de mutaciones específicas del paciente, por ejemplo en muestras de tumores heterogéneos o en el ADN circulante. Los métodos descritos aquí también permiten una alta multiplexidad de dianas (es decir, permiten la detección simultánea de un panel de regiones de ADN), lo que permite utilizar métodos de alto rendimiento para la detección de mutaciones somáticas (por ejemplo, secuenciación paralela masiva, MPS). NaME es particularmente útil en el campo de los biomarcadores circulantes para aplicaciones de cáncer, aplicaciones de diagnóstico prenatal, y aplicaciones de enfermedades infecciosas.
'Secuencia diana de tipo salvaje' se refiere a un ácido nucleico que es más prevalente en una muestra de ácido nucleico que una secuencia diana correspondiente (por ejemplo, misma región del gen pero diferente secuencia de ácido nucleico). La secuencia de tipo salvaje constituye alrededor del 50% de la secuencia de tipo salvaje total la secuencia diana mutante en una muestra. La secuencia de tipo salvaje se puede expresar a nivel de ARN y/o ADN 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 35X, 40X, 45X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X 100X, 150X, 200X o más que la secuencia diana. Por ejemplo, una muestra (por ejemplo, muestra de sangre) puede contener numerosas células normales y pocas células cancerosas. Las células normales contienen secuencias de alelos de tipo salvaje (no mutantes), mientras que el pequeño número de células cancerosas contienen secuencias diana. Como se usa aquí, una 'hebra de tipo salvaje' se refiere a una sola hebra de ácido nucleico de una secuencia de tipo salvaje. El término 'tipo salvaje' normalmente se refiere a la secuencia polinucleotídica o alelo más común para un determinado gen en una población. Generalmente, el alelo de tipo salvaje se obtendrá de células normales.
La secuencia de tipo salvaje tiene una longitud de alrededor de 13-2000 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia de tipo salvaje tiene 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias de tipo salvaje compartirán al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología con la secuencia diana correspondiente, pero diferirá en al menos un nucleótido de la secuencia diana. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido es una citosina metilada. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido es una citosina no metilada. Las secuencias de tipo salvaje se pueden amplificar mediante PCR con el mismo par de cebadores que se usó para la secuencia mutante.
Un 'ácido nucleico diana' o 'secuencia diana', usados aquí de manera intercambiable, se refiere a un ácido nucleico que es menos prevalente en una muestra de ácido nucleico que una secuencia de tipo salvaje correspondiente. La secuencia diana constituye menos del 50% de la cantidad total de secuencia de tipo salvaje la secuencia diana en una muestra. Preferiblemente, la secuencia diana se expresa a nivel de ARN y/o ADN 1:10, 1:15, 1:20, 1:25x, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:150, 1:200x o menos que la secuencia de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la secuencia diana es un alelo mutante. Por ejemplo, una muestra (por ejemplo, muestra de sangre) puede contener numerosas células normales y pocas células cancerosas. Las células normales contienen tipo salvaje (es decir, no mutantes), mientras que el pequeño número de células cancerosas contienen secuencias mutantes diana. En algunas realizaciones, la secuencia diana son secuencias repetidas que se producen en grandes cantidades en el genoma humano (incluyendo, pero sin limitarse a, elementos ALU, elementos LINE, elementos SINE, repeticiones de dinucleótidos, repeticiones de trinucleótidos). Las secuencias repetidas alteradas ocurren a menudo en estados patológicos, y es de interés la aplicación de la presente invención para detectar alteraciones en las secuencias repetidas. En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí están dirigidos a detectar ADN fetal en una muestra de ácido nucleico obtenida de una madre. En esta realización, el ADN fetal es la secuencia diana, mientras que el ADN materno más prevalente es la secuencia de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la secuencia diana es un alelo metilado. En algunas realizaciones, la secuencia diana es un alelo no metilado. Como se usa aquí, una "hebra diana" se refiere a una única hebra de ácido nucleico de una secuencia diana.
En algunas realizaciones, la secuencia diana tiene una longitud de 13-2000 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia diana tiene 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias diana compartirán al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología con la secuencia de tipo salvaje correspondiente, pero diferirá en al menos un nucleótido de la secuencia de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido es una citosina metilada. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido es una citosina no metilada. Las secuencias diana se pueden amplificar mediante PCR con el mismo par de cebadores que los usados para la secuencia de tipo salvaje.
"Secuencia muíante diana" o "secuencia diana muíante" se refiere a un ácido nucleico que es menos prevalente en una muestra de ácido nucleico que una secuencia de tipo salvaje correspondiente. La secuencia mutante diana constituye menos del 50% de la cantidad total de secuencia de tipo salvaje la secuencia mutante en una muestra. La secuencia mutante diana puede expresarse a nivel de ARN y/o ADN 1:10, 1:15, 1:20, 1:25x, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:150, 1:200x o menos que la secuencia de tipo salvaje. Por ejemplo, una muestra (por ejemplo, muestra de sangre) puede contener numerosas células normales y pocas células cancerosas. Las células normales contienen alelos de tipo salvaje (no mutantes), mientras que el pequeño número de células cancerosas contienen secuencias mutantes diana. En algunas realizaciones, la descripción se refiere a la detección de ADN fetal en una muestra de ácido nucleico obtenida de una madre. En esta realización, la secuencia mutante diana es el ADN fetal, mientras que el ADN materno más prevalente es la secuencia de tipo salvaje. Como se usa aquí, se pretende que una secuencia mutante diana incluya ADN fetal obtenido de una madre embarazada. En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a la detección de uno o más alelos metilados en presencia de un gran exceso de alelos no metilados, o viceversa, en el análisis epigenético.
La secuencia mutante diana tiene una longitud de alrededor de 13-2000 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia mutante diana tiene 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias mutantes diana compartirán al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología con la secuencia de tipo salvaje correspondiente, pero diferirá en al menos un nucleótido de la secuencia de tipo salvaje. Las secuencias mutantes diana se pueden amplificar mediante PCR con el mismo par de cebadores que los usados para la secuencia de tipo salvaje.
El término 'mutante' se refiere a un cambio de nucleótido (es decir, una sustitución, supresión, inserción o metilación de un único o múltiples nucleótidos, o alteración en el número de repeticiones de polinucleótidos) en una secuencia de ácido nucleico. Un ácido nucleico que porta una mutación tiene una secuencia de ácido nucleico (alelo mutante) que es diferente en secuencia de la correspondiente secuencia de tipo salvaje. Los métodos descritos aquí son especialmente útiles para escindir preferentemente secuencias de tipo salvaje, lo que permite el enriquecimiento selectivo de varias o numerosas secuencias diana mutantes simultáneamente. Los alelos mutantes pueden contener entre 1 y 500 cambios en la secuencia nucleotídica. Un alelo mutante puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 o 500 cambios en la secuencia nucleotídica en comparación con un alelo de tipo salvaje correspondiente. Típicamente, un alelo mutante contendrá entre 1 y 10 cambios en la secuencia nucleotídica, y más típicamente entre 1 y 5 cambios en la secuencia nucleotídica. El alelo mutante tendrá 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología con el alelo de tipo salvaje. Generalmente, el alelo mutante se obtendrá a partir de células o tejidos enfermos, y está asociado con un estado patológico.
Como se usa aquí, una "región de interés" es una secuencia que se interrogará en busca de variaciones, tales como mutaciones clínicamente relevantes, y patrones de metilación/no metilación.
‘Enriquecer una secuencia diana mutante' se refiere a aumentar la cantidad de una secuencia diana mutante y/o aumentar la relación de la secuencia diana mutante con respecto a la secuencia de tipo salvaje correspondiente en una muestra. Por ejemplo, cuando la relación entre la secuencia mutante y la secuencia de tipo salvaje es inicialmente del 5% al 95% en una muestra, la secuencia mutante puede amplificarse preferentemente en una reacción de amplificación para producir una relación de 70% de secuencia mutante frente a 30% de secuencia de tipo salvaje. Por tanto, en este ejemplo hipotético hay un enriquecimiento de 14 veces de la secuencia mutante con respecto a la secuencia de tipo salvaje. Generalmente, el enriquecimiento de una secuencia diana mutante da como resultado un aumento de 2X a 200X en la secuencia diana mutante con respecto a la secuencia de tipo salvaje antes del enriquecimiento. El enriquecimiento de la secuencia diana mutante es un enriquecimiento de al menos 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 35X, 40X, 45X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X 100X, 150X, 200X o más veces. El enriquecimiento de una secuencia diana mutante da como resultado una muestra que tiene 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, de secuencia diana mutante en comparación con la secuencia de tipo salvaje (por ejemplo, 10% de secuencia diana mutante: 90% de secuencia de tipo salvaje a 95% de secuencia diana mutante: 5% de secuencia de tipo salvaje).
'Alelo' se refiere a formas alternativas de un gen, porción del mismo o región no codificante de ADN que ocupan el mismo locus o posición en cromosomas homólogos que tienen al menos una diferencia en la secuencia nucleotídica El término alelo se puede usar para describir el ADN de cualquier organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, bacterias, virus, hongos, protozoos, mohos, levaduras, plantas, seres humanos, seres no humanos, animales, y arqueobacterias. Los alelos se pueden encontrar en una sola célula (por ejemplo, dos alelos, uno heredado del padre y otro de la madre) o dentro de una población de células (por ejemplo, un alelo de tipo salvaje de tejido normal y un alelo mutante somático de tejido enfermo).
Un alelo puede tener una longitud de 13-2000 nucleótidos. En una realización, el alelo tiene una longitud de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o más nucleótidos. Los alelos generalmente compartirán 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología entre sí. Los alelos se pueden amplificar por PCR con el mismo par de cebadores.
En una realización, los métodos descritos aquí se utilizan para enriquecer un polimorfismo. Cualquier gen dado puede tener ninguna, una, o muchas formas alélicas (polimorfismo). Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a los alelos pueden ser el resultado de supresiones, adiciones o sustituciones naturales o artificiales (por ejemplo, carcinógenos químicos) de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede ocurrir solo o en combinación con los demás, una o más veces en una secuencia determinada.
Como se usa aquí, la expresión "temperatura de fusión" o "Tm" se refiere a la temperatura a la que un polinucleótido se disocia de su secuencia complementaria. En general, la Tm se puede definir como la temperatura a la que la mitad de los pares de bases de Watson-Crick en una molécula de ácido nucleico dúplex se rompen o se disocian (es decir, se “derriten”), mientras que la otra mitad de los pares de bases de Watson-Crick permanecen intactos en una conformación de doble hebra. En otras palabras, la Tm se define como la temperatura a la que el 50% de los nucleótidos de dos secuencias complementarias se hibridan (hebras dobles) y el 50% de los nucleótidos se desnaturalizan (hebras simples). Tm, por lo tanto, define un punto medio en la transición de moléculas de ácido nucleico de doble hebra a hebra simple (o, por el contrario, en la transición de moléculas de ácido nucleico hebra simple a doble hebra).
La Tm se puede estimar mediante varios métodos, por ejemplo mediante un cálculo del vecino más cercano, según Wetmur 1991 (Wetmur, J. G. 1991. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol 227-229), y mediante programas comerciales, incluyendo Oligo™ Primer Design, y programas disponibles en internet. Alternativamente, la Tm se puede determinar a través de la experimentación real. Por ejemplo, se pueden usar tintes intercalantes o de unión a ADN de doble hebra, tal como bromuro de etidio o SYBR-green (Molecular Probes), en un ensayo de curva de fusión, para determinar la Tm real del ácido nucleico. Los métodos adicionales para determinar la Tm de un ácido nucleico son bien conocidos en la técnica, y se describen aquí.
Como se usa aquí, 'mezcla de reacción' se refiere a una mezcla de constituyentes que incluyen, entre otros, una muestra de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra que se sospecha que contiene una mutación, y un par de sondas oligonucleotídicas que son complementarias a las hebras superior e inferior del ácido nucleico de tipo salvaje. La mezcla de reacción también puede incluir reactivos tales como, pero sin limitarse a, sal o sales, amortiguador(es), y enzima(s), tales como nucleasa específica de doble hebra (DSN), exonucleasa y polimerasa.
Como se usa aquí, una muestra de ácido nucleico se refiere a cualquier sustancia que contiene o se supone que contiene un ácido nucleico de interés (secuencias diana y de tipo salvaje), o que es en sí misma un ácido nucleico que contiene o se supone que contiene un ácido nucleico diana de interés. La expresión "muestra de ácido nucleico" incluye, por lo tanto, una muestra de ácido nucleico (ADN genómico, ADNc, ARN), célula, organismo, tejido o líquido, incluyendo, pero sin limitarse a, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, líquido sinovial, orina, lágrimas, heces, secreciones externas de la piel, vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, saliva, células sanguíneas, tumores, órganos, tejidos, muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro, aislados naturales (tales como agua potable, agua de mar, materiales sólidos), especímenes microbianos, y objetos o especímenes que han sido "marcados" con moléculas trazadoras de ácido nucleico. La muestra de ácido nucleico se puede obtener de mamíferos, virus, bacterias o plantas. En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico es ADN que circula en plasma, orina u otros fluidos corporales.
Como se usa aquí, "sondas oligonucleotídicas" se refiere a moléculas que comprenden dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Los métodos descritos aquí utilizan un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje, y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje. Por "complementario" se entiende que las sondas se hibridan sin ningún desajuste con las secuencias en las posiciones superior e inferior del ácido nucleico de tipo salvaje. Las sondas oligonucleotídicas no son idénticas, es decir, las secuencias de las dos sondas son diferentes entre sí. En algunas realizaciones, las sondas no se solapan entre sí, es decir, no se unen entre sí. Al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa, es decir, la sonda se hibrida con la secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa con al menos un desajuste, formando así un dúplex mutante diana - sonda "parcialmente complementario".
En algunas realizaciones, una de las sondas se solapa con una secuencia en la hebra superior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, mientras que la otra sonda se solapa con una secuencia en la hebra inferior del ácido nucleico diana que contiene la mutación. Por lo tanto, las sondas se hibridan respectivamente con las secuencias superior e inferior del ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa con al menos un desajuste. En tales realizaciones, las sondas se solapan parcialmente entre sí. Sin embargo, no se unen sustancialmente entre sí.
Las sondas oligonucleotídicas pueden tener entre 5 y 100 bases de longitud. En algunas realizaciones, las sondas tienen una longitud de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 bases. En algunas realizaciones, las sondas están en un exceso molar de 100 a 1000 millones de veces en comparación con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana (por ejemplo, 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces, 500.000 veces, 1 millón de veces, 500 millones de veces, 100 millones de veces, mil millones de veces en exceso en comparación con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana). En algunas realizaciones, las sondas están en una concentración molar de 1 pM, 10 pM, 50 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM, 900 pM, o 1000 pM en la reacción.
Por "escindido selectivamente" o "escindido preferentemente" se entiende que los métodos en cuestión preferentemente cortan, es decir, escinden, moléculas de ácido desoxirribonucleico presentes en ácidos nucleicos de doble hebra perfectamente emparejados, por ejemplo dúplex de ADN-ADN y dúplex de ADN-ARN. Los ácidos nucleicos de doble hebra perfectamente emparejados son estructuras híbridas entre hebras complementarias en las que no hay errores de emparejamiento, en comparación con los dúplex de ácidos nucleicos parcialmente complementarios de la misma longitud. Por lo tanto, en los métodos descritos aquí, ADN complementario que contiene ácidos nucleicos dúplex (es decir, sin ningún desajuste) se escinde en un grado mucho mayor que los dúplex de ácido nucleico parcialmente complementarios (es decir, con uno o más desajustes), dúplex de ácidos nucleicos que no contienen ADN, y/o ácidos nucleicos de hebra sencilla. En otras palabras, los métodos en cuestión pueden escindir o cortar dúplex de ácidos nucleicos perfectamente emparejados en una muestra a una velocidad mucho mayor que otras moléculas de ácido nucleico que pueden estar presentes en la muestra que se está tratando, en los que la velocidad de escisión de los dúplex de ácidos nucleicos perfectamente emparejados es típicamente al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces mayor que la velocidad de escisión de otros ácidos nucleicos que pueden estar presentes en la muestra que se está tratando.
Como se usa aquí, "cebadores" se refiere a oligonucleótidos que se hibridan con hebras opuestas de una secuencia mutante diana y de tipo salvaje para formar un producto de amplificación durante una reacción de PCR.
NAME EN ADN DE DOBLE HEBRA
Por consiguiente, algunos aspectos de la descripción proporcionan métodos para preparar un ácido nucleico mutante diana para el posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje. El enriquecimiento posterior se puede lograr aplicando condiciones de amplificación a la mezcla de reacción producida.
En algunas realizaciones, el método comprende someter una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de doble hebra de tipo salvaje y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra; poner en contacto los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra desestabilizados con un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en los que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa; y exponer los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios y los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios a una nucleasa específica de la doble hebra (DSN), en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
En algunas realizaciones, el método comprende exponer una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una nucleasa específica de la doble hebra (DSN) y a un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para crear un mezcla de reacción, en la que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa; y someter la mezcla de reacción a una condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
NaME utiliza nucleasas (DNasas) que muestran una fuerte preferencia por escindir el ADN de doble hebra frente al ADN o el ARN de una sola hebra. Las DNasas que se pueden usar en los métodos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, dsDNasa de gamba nativa, dsDNasa de gamba recombinante, nucleasa de cangrejo real (DSN) y DNasa I bovina. NaME aprovecha las propiedades de la DSN para escindir secuencias específicas de las hebras de ADN tanto superior como inferior de ADN de tipo salvaje, como se muestra en la Fig. 1A. Por el contrario, el ADN que contiene la mutación no se escinde, o se escinde en un grado significativamente menor que el ADN de tipo salvaje. Por lo tanto, una reacción de PCR posterior después de la digestión con DSN amplifica preferentemente los alelos mutantes que permanecen sustancialmente intactos, y conduce al enriquecimiento de alelos mutantes frente a los de tipo salvaje.
Para los fines de la presente descripción, la expresión "nucleasa específica de la doble hebra" o "DSN" incluye enzimas guiadas por ADN/ARN que tienen actividad preferencial en el ADN de doble hebra, en comparación con el ADN de hebra sencilla. Los ejemplos de tales enzimas que se pueden emplear junto con NaME incluyen las enzimas Cas9 guiadas por ARN (Gu et al, Depletion of Abundant Sequences by Hybridization (DASH): Using Cas9 to remove unwanted high-abundance species in sequencing libraries and molecular counting applications Genome Biology 2016; 17, 41), o las enzimas guiadas por ADN Argonauta (Gao et al, DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute, Nature Biotechnology May 2016 publicación avanzada en línea). Estas enzimas guiadas por ADN/ARN digieren el ADN con gran preferencia cuando la sonda ("oligonucleótido guía") coincide completamente con el ADN diana, y menos cuando hay una falta de coincidencia. Mediante el empleo de sondas dirigidas tanto a la hebra superior como a la inferior de ADN de una manera solapante como se describe en la presente invención, NAME se puede aplicar con enzimas guiadas por ADN/ARN, de la misma manera que cuando se utilizan otras nucleasas DSN descritas aquí.
Durante NaME, (Fig. 1A) DSN y un par de sondas oligonucleotídicas que coinciden con las hebras superior e inferior del ácido nucleico de tipo salvaje de interés se añaden a (es decir, se exponen a o se ponen en contacto con) una muestra de ácido nucleico que comprende ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y ácido nucleico diana de doble hebra que se sospecha que contiene una mutación, para crear una mezcla de reacción. La muestra de ácido nucleico se expone al DSN y a las sondas oligonucleotídicas a una temperatura baja a la que la DSN está inactiva (por ejemplo, 4°C). Al menos una de las sondas oligonucleotídicas se solapa con secuencias en el ácido nucleico diana que se sospecha que contienen mutaciones clínicamente importantes (por ejemplo secuencias del codón 12/13 de KRAS; secuencias de p53; secuencias repetidas de trinucleótidos; etc.). El segundo oligonucleótido se une a la hebra de ácido nucleico diana opuesta de la primera sonda oligonucleotídica, y puede tener una longitud similar a la del primer oligonucleótido. En algunas realizaciones, esta segunda sonda está diseñada para coincidir con una secuencia en el ácido nucleico diana que normalmente no contiene mutaciones. En algunas realizaciones, las sondas están en un exceso molar de 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces, 500.000 veces, 1 millón de veces, 500 millones de veces, 100 millones de veces, mil millones de veces en comparación con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana.
A continuación, la mezcla de reacción se somete a una condición que desestabiliza los ácidos nucleicos mutantes y de tipo salvaje de doble hebra para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos mutantes y de tipo salvaje, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior y superior, y dúplex de mutante-sonda parcialmente complementarios. Por "desestabilizar" se entiende que los ácidos nucleicos mutantes diana y de tipo salvaje de doble hebra se desnaturalizan hasta tal punto que permiten que las sondas se hibriden con sus secuencias correspondientes, pero los ácidos nucleicos mutantes diana y de tipo salvaje no se desnaturalizan completamente. Una condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutantes de doble hebra para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante incluye añadir un disolvente orgánico, tal como, pero sin limitarse a, DMSO, betaína o formamida, y/o un aumento de temperatura combinado con una DSN termoestable. El aumento de temperatura es tal que permite la hibridación de la sonda específica a su secuencia correspondiente. La temperatura de la mezcla de reacción se eleva a una temperatura que desestabiliza la estructura de doble hebra (por ejemplo, 65°C - 80°C, incluyendo 65°C, 70°C, 75°C, 80°C) pero no la desnaturaliza por completo. Esta temperatura de desestabilización es típicamente alrededor de 10-20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) de la secuencia de ácido nucleico. A esta temperatura, las sondas oligonucleotídicas invaden y se unen a sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos mutantes y de tipo salvaje. Las sondas coinciden completamente con las secuencias en el ácido nucleico de tipo salvaje, y de este modo pueden formar dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios (es decir, sin desajustes).
Si se sospecha que existe una mutación en el ácido nucleico diana, la unión entre la sonda y el ácido nucleico diana es ineficaz, y da como resultado dúplex de mutante-sonda parcialmente complementarios (es decir, con desajustes). Los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios son reconocidos y escindidos por la enzima DSN. Por el contrario, los dúplex de mutante-sonda parcialmente complementarios permanecen sustancialmente intactos.
En algunas realizaciones, una de las sondas oligonucleotídicas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que se sospecha que contiene una mutación, mientras que la segunda sonda está diseñada para coincidir con una secuencia en una posición diferente en el ácido nucleico diana que normalmente no contiene mutaciones (Fig 1 A). Por lo tanto, el enfoque que se muestra en la Fig. 1A generalmente conduce a la escisión de ambas hebras para el ácido nucleico de tipo salvaje, mientras que solo se escinde una única hebra de ADN del ácido nucleico mutante.
En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí se llevan a cabo desestabilizando primero el ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y el ácido nucleico diana de doble hebra que se sospecha que contiene una mutación. El ácido nucleico de tipo salvaje desestabilizado y el ácido nucleico mutante diana se ponen entonces en contacto con las sondas oligonucleotídicas para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios. Por "poner en contacto" se entiende que las sondas se añaden a los ácidos nucleicos y los componentes se mezclan, o los ácidos nucleicos se añaden a las sondas y los componentes se mezclan. A continuación, los dúplex se exponen a DSN, que preferentemente corta los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios, pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
Algunos aspectos de la descripción proporcionan métodos para preparar un ácido nucleico mutante diana para su posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, que comprende exponer una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para crear un mezcla de reacción, en la que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa; someter la mezcla de reacción a una temperatura desnaturalizante para permitir la desnaturalización del ácido nucleico de tipo salvaje y el ácido nucleico mutante diana; reducir la temperatura de la mezcla de reacción para permitir la formación de dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios; y exponer la mezcla de reacción a una nucleasa específica de la doble hebra (DSN), en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
En estos métodos, los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana de doble hebra en presencia de las dos sondas se desnaturalizan en primer lugar sometiendo la mezcla de reacción a una temperatura de desnaturalización, mientras que también se incluyen opcionalmente disolventes orgánicos como DMSO, betaína o formamida. La temperatura de desnaturalización debe ser lo suficientemente alta como para permitir la desnaturalización completa de los ácidos nucleicos de tipo natural y diana (por ejemplo, 75°C, 802C, 852C, 90°C, o 95°C). En algunas realizaciones, la temperatura de desnaturalización es alrededor de 1°C a 30°C por encima de la Tm de la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje (por ejemplo, 1 °C, 5°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C por encima de la Tm de la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje).
A continuación, se reduce la temperatura de la mezcla de reacción, lo que permite que los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana se hibriden con las sondas oligonucleotídicas para formar dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior (es decir, sin desajustes), y dúplex de mutante-sonda parcialmente complementarios (es decir, con desajustes). En algunas realizaciones, esta temperatura de hibridación es 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, o 75°C). A esta temperatura de hibridación, dado que las dos sondas están en un gran exceso con respecto al ácido nucleico diana, se unen primero a sus respectivas dianas, es decir, mientras que las dos hebras progenitoras de los ácidos nucleicos de tipo natural y diana todavía no se han vuelto a asociar y siguen siendo sustancialmente monocatenarias. En algunas realizaciones, las sondas están en un exceso molar de 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces, 500.000 veces, 1 millón de veces, 500 millones de veces, 100 millones de veces, mil millones de veces en comparación con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana.
En este método, opcionalmente, la DSN no se añade desde el principio, para evitar la inactivación parcial o total de la DSN a la temperatura de desnaturalización. La DSN se añade una vez que se reduce la temperatura para permitir la formación de dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior y dúplex de mutantesonda parcialmente complementarios. A continuación, DSN degrada preferentemente los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios, mientras que los dúplex de mutante-sonda parcialmente complementarios permanecen sustancialmente intactos. A continuación, la actividad de la DSN se puede detener, por ejemplo, calentando la muestra a 95°C durante 1-10 min para inactivar la DSN. Una reacción de PCR posterior amplifica preferentemente los alelos mutados que permanecen sustancialmente intactos, mientras que los alelos de tipo salvaje digeridos por DSN no se amplifican. La Fig. 1B demuestra la cuantificación de la abundancia de mutación fraccional después de esta reacción de PCR. Se puede observar que, en ausencia de DSN y/o ambas sondas, la abundancia de mutación es baja (4-6%), mientras que en presencia de DSN y ambas sondas, la abundancia de mutación resultante es 37-38%, es decir, lo que demuestra el enriquecimiento de los alelos mutados usando NaME.
En algunas realizaciones, la reacción de PCR posterior amplifica las sondas en lugar del ácido nucleico hibridado. En este enfoque, se aplica una etapa de purificación después de la unión de la sonda a las hebras diana de ADN superior e inferior, ya sea antes o después de la escisión con DSN, para eliminar el exceso de sondas no unidas (por ejemplo, usando una columna de afinidad de ADN, tal como el kit de purificación PCR QIAquick®, comercialmente disponible de QIAGEN). Después, tras la escisión con DSN, las sondas sin cortar se amplifican (en lugar de amplificar el ADN diana) y se identifican/cuantifican. Dado que las sondas que se unen al ADN WT habrán sido digeridas selectivamente por DSN, la presencia de cualquier sonda determinada después de la amplificación indica una mutación en la región cubierta por esta sonda.
NAME QUE USA SONDAS SOLAPANTES
En algunas realizaciones de los métodos descritos aquí, las sondas se construyen de manera que una de las sondas se solapa con una secuencia en la hebra superior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, mientras que la otra sonda se solapa con una secuencia en la hebra inferior del ácido nucleico diana que contiene la mutación de interés, y las dos sondas se solapan parcialmente entre sí (Figs. 2 y 3). Las dos sondas se solapan solo parcialmente, de modo que no se unen sustancialmente entre sí en disolución a las temperaturas usadas para NaME durante la digestión con DSN (por ejemplo, 652C-702C). En consecuencia, es importante durante la hibridación de la sonda con sus secuencias correspondientes mantener una temperatura lo suficientemente baja para que la sonda se una al molde, pero lo suficientemente alta para que no permita una unión sustancial de sonda a sonda. Este enfoque aumenta la especificidad del procedimiento para las secuencias mutadas, y el enriquecimiento de mutaciones se vuelve mucho más pronunciado que cuando se usa solo una sonda específica de la mutación con una segunda sonda que coincide con el ácido nucleico de tipo salvaje (Fig. 1A).
En algunas realizaciones, en los métodos descritos aquí se usa una DSN termoestable, tal como, pero sin limitarse a, nucleasa de cangrejo real. En algunas realizaciones, en los métodos descritos aquí se usa una DSN no termoestable, tal como, pero sin limitarse a, dsDNasa de gamba nativa, dsDNasa de gamba recombinante, y DNasa I bovina. Si se utiliza una DSN no termoestable durante NaME, entonces el solapamiento entre las sondas diseñadas debe ser tal que a la temperatura usada para la formación del dúplex sonda-ácido nucleico (por ejemplo, 37-45°C, haya una unión mínima de las sondas entre sí, mientras que todavía se unen específicamente a las dianas de ADN genómico). Una forma de reducir la Tm de las sondas para que coincida con la temperatura óptima de la nucleasa usada es añadir disolventes orgánicos (DMSO, formamida) que reducen la Tm de las sondas. Por ejemplo, en lugar de sondas con una Tm de 65°C que coincidan con la temperatura óptima de la enzima DSN termoestable, se puede usar nucleasa de gamba en presencia de 10% de DMSO, lo que reduce la Tm de la sonda, así como la Tm de las regiones de solapamiento de sonda-sonda.
Para los fines de la presente descripción, la expresión "nucleasa específica de la doble hebra" o "DSN" incluye enzimas guiadas por ADN/ARN que tienen actividad preferencial en el ADN de doble hebra, a diferencia del ADN de hebra sencilla. Los ejemplos de tales enzimas que se pueden emplear junto con NaME incluyen las enzimas Cas9 guiadas por ARN (Gu et al, Depletion of Abundant Sequences by Hybridization (DASH): Using Cas9 to remove unwanted highabundance species in sequencing libraries and molecular counting applications Genome Biology 2016; 17, 41), o las enzimas guiadas por ADN Argonauta (Gao et al, DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute, Nature Biotechnology May 2016 publicación avanzada en línea). Estas enzimas guiadas por ADN/ARN digieren el ADN con gran preferencia cuando la sonda ("oligonucleótido guía") coincide completamente con el ADN diana, y menos cuando hay una falta de coincidencia. Mediante el empleo de sondas dirigidas tanto a la hebra superior como a la inferior de ADN de una manera solapante como se describe en la presente invención, NAME se puede aplicar con enzimas guiadas por ADN/ARN, de la misma manera que cuando se utilizan otras nucleasas DSN descritas aquí.
En algunas realizaciones, antes de implementar los métodos descritos aquí, la muestra de ácido nucleico se somete a una condición de amplificación. En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí comprenden además enriquecer el ácido nucleico mutante diana con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje sometiendo la mezcla de reacción que contiene dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos a una condición de amplificación, enriqueciendo así el ácido nucleico mutante diana no escindido con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje escindido. Puede utilizarse cualquier condición de amplificación conocida. En algunas realizaciones, la condición de amplificación se selecciona del grupo que consiste en: PCR, PCR mediada por ligación usando adaptadores ligados comunes, PCR multiplex, que usa múltiples pares de cebadores, PCR de elementos repetidos, que usa cebadores específicos para ALU, LINE 1, repeticiones de polinucleótidos, microsatélites y otros elementos repetidos repartidos por el genoma, PCR cebada arbitrariamente (AP-PCR), y amplificación isotérmica (tal como, pero sin limitarse a, amplificación por desplazamiento basada en phi-29; o amplificación LAMP mediada por bucle; o cualquier otro modo isotérmico de amplificación). El ácido nucleico de tipo salvaje no se amplificará durante esta etapa de amplificación, ya que fue escindido selectivamente por DSN. El producto amplificado enriquecido con mutaciones se puede analizar entonces en busca de mutaciones usando cualquier método disponible, tal como MALDI-TOF, fusión de HR, didesoxi-secuenciación, secuenciación de una sola molécula, secuenciación masivamente paralela (MPS), pirosecuenciación, polimorfismo conformacional de hebra sencilla SSCP, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción RFLP, cromatografía de líquidos de alta precisión desnaturalizante dHPLC, escisión química de desajustes CCM, electroforesis capilar, PCR digital y PCR cuantitativa.
Las sondas usadas en los métodos descritos aquí contienen preferiblemente un bloqueo en 3' para la extensión por polimerasa, de modo que si el producto de reacción de NaME se amplifica posteriormente, no hay interferencia de las sondas con la reacción de amplificación. Un bloqueo de polimerasa en 3' puede comprender un fosfato simple; o un sitio abásico; o cualquier otra modificación que impida la síntesis de polimerasa más allá del bloqueo. Además, para la discriminación adicional de secuencias de tipo salvaje frente a secuencias mutantes durante NaME, en algunas realizaciones, cada sonda comprende un ácido nucleico bloqueado (LNA), un ácido nucleico peptídico (PNA), un ácido xenonucleico (XNA), un ácido nucleico con cualquier base natural o modificada conocida, tal como dITP o 2,6-diaminopurina dATP, o ARN que aumenta la desestabilización causada por el desajuste inducido por mutación entre la sonda oligonucleotídica y su ácido nucleico diana.
En algunos casos, parte de las sondas usadas en los métodos proporcionados aquí puede comprender uno o más nucleótidos aleatorios, de manera que la sonda puede dirigirse contra una pluralidad de dianas de ADN. Por ejemplo, una sonda puede incluir una región central de uno o más nucleótidos que son complementarios a la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje en una región de interés, por ejemplo un sitio sospechoso de mutación. Uno cualquiera o más de los nucleótidos restantes en la sonda pueden seleccionarse al azar de cualquiera o todos los nucleótidos posibles. La sonda que contiene la región central más uno o más nucleótidos aleatorios puede formar un dúplex con una secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje completamente complementaria que también contiene la región central. Se puede usar una enzima de escisión, por ejemplo DSN, para escindir los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios, pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí se usan para preparar dos o más ácidos nucleicos mutantes diana diferentes para el enriquecimiento posterior con respecto a los ácidos nucleicos de tipo salvaje correspondientes. En tales realizaciones, se usa uno o más pares adicionales de sondas dirigidas contra los diferentes ácidos nucleicos de tipo salvaje. Para cada par de sondas, una de las sondas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje.
En todas las realizaciones descritas anteriormente, también se entiende que la concentración de sondas para las hebras superior e inferior de ADN no tiene que ser necesariamente la misma. Así, se puede combinar una alta concentración de sonda para la hebra inferior y una baja concentración de sonda para la hebra superior, o viceversa. Las concentraciones de sonda también pueden ser diferentes para cada diana de ADN cuando se enriquecen simultáneamente muchas dianas. Se pueden aplicar concentraciones optimizadas según el contexto de la secuencia, la Tm de la secuencia local, y la mutación a la que se dirige. Además, una reacción de amplificación por PCR posterior a la aplicación de DSN puede utilizar cantidades iguales de cebadores o diferentes cantidades de cebadores para cada hebra de ADN (PCR asimétrica, o PCR lineal después de la exponencial, L.A.T.E PCR en inglés).
NAME APLICADO DIRECTAMENTE EN ADN GENÓMICO
En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí se llevan a cabo directamente en el ADN genómico. El ADN genómico se puede fragmentar opcionalmente antes de la aplicación de NaME (Fig. 4). En este enfoque, NaME se aplica (a) fragmentando el ADN genómico usando medios enzimáticos o físicos; (b) añadiendo sondas solapantes (o no solapantes) que se dirijan a las hebras de ADN superior e inferior y, opcionalmente, desnaturalizando los ácidos nucleicos tanto de tipo natural como diana (por ejemplo, a 95°C); (c) reduciendo la temperatura hasta, por ejemplo, 60-70°C, para permitir que las sondas encuentren sus respectivas dianas antes de la renaturalización sustancial de las hebras de ADN originales, y manteniendo la temperatura lo suficientemente alta para minimizar las interacciones de sonda con sonda; (d) añadiendo DSN para escindir selectivamente una o más (múltiples) dianas de ADN de dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios, mientras se dejan los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios sustancialmente intactos. La mezcla de reacción resultante con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos se puede amplificar usando métodos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, PCR, COLD-PCR, PCR mediada por ligación o COLD-PCR que usando adaptadores ligados comunes, PCR multiplex, o amplificación isotérmica (tal como la basada en phi-29; o basada en LAMP; o cualquier otro modo isotérmico de amplificación), enriqueciendo así el ácido nucleico mutante diana en comparación con el tipo salvaje. Este producto amplificado se puede examinar en busca de mutaciones usando cualquier método disponible, tal como, pero sin limitarse a, MALDI-TOF, fusión con HR, didesoxi-secuenciación, secuenciación de molécula única, secuenciación masivamente paralela (MPS), pirosecuenciación, SSCP, RFLP, dHPLC, CCM, PCR digital y PCR cuantitativa (el ácido nucleico de tipo salvaje no se amplificará durante esta etapa de amplificación ya que fue escindido selectivamente por DSN).
La Fig. 5 representa el enriquecimiento de una mutación original de ~1% a una mutación del 83%, y una mutación del 0,5% a una mutación del 14%, tras la aplicación de NaME directamente al ADN genómico. La Fig. 6 muestra una aplicación a dúplex de NaME simultáneamente en dos dianas mutadas, en los genes KRAS y TP53. La Fig 7A muestra la aplicación de NaME usando dos sondas solapantes que cubren 3 mutaciones diferentes en los codones 12 y 13 de Kras, e indica que cualquier mutación bajo las sondas se enriquecerá durante NaME. Y la Fig. 7B demuestra el enriquecimiento simultáneo de 11 dianas diferentes cuando NaME se aplica directamente desde ADN genómico. Para cada diana, se diseñó un par separado de sondas solapantes, y todas las sondas se incluyen en una única reacción durante NaME.
En algunas realizaciones, las sondas usadas se dirigen contra repeticiones de polinucleótidos que están muy extendidas por todo el genoma, de modo que se atacan simultáneamente múltiples dianas a través de NaME, usando un único par de sondas. Por ejemplo, si el diana es una secuencia que contiene poli-A, se usan dos sondas solapantes, una para la hebra inferior que contiene poli-T y otra para la hebra superior que contiene poli-A en este caso. Para aumentar la longitud de la sonda, también se puede añadir un número opcional de inosinas que pueden unirse genéricamente a bases vecinas.
COMBINACIÓN DE NAME CON SECUENCIACIÓN MASIVAMENTE PARALELA (MPS).
En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí se pueden usar junto con la secuenciación masivamente paralela (MPS). MPS es actualmente el enfoque más avanzado para la identificación de mutaciones. La preparación de muestras ("biblioteca") para MPS es una etapa muy importante antes de aplicar la secuenciación de todo el genoma o del exoma, o la resecuenciación dirigida. NaME proporciona una ventaja única para la preparación de muestras antes de MPS, ya que puede enriquecer dianas predeciblemente numerosas para mutaciones, permitiendo así que MPS identifique fácilmente mutaciones que originalmente tienen una abundancia muy baja, sin requerir una cantidad excesiva de lecturas de secuencia. Esto permite la reducción de costes y una mayor sensibilidad y simplicidad. La Fig. 8 proporciona un ejemplo de procedimiento de preparación de muestras mejorado por NaME antes de MPS. En este enfoque, se aplica NaME multiplexado (usando sondas solapantes contra numerosas mutaciones genéticas simultáneamente como se describe en secciones anteriores) al material de partida original, para escindir selectivamente el ácido nucleico de tipo salvaje en todas los dianas de interés simultáneamente. A continuación, la muestra se amplifica para enriquecer preferentemente las dianas de ADN mutado. Finalmente, el ADN resultante enriquecido en la mutación se usa para la construcción de bibliotecas de rutina antes de MPS.
En algunas realizaciones, la aplicación multiplexada de NaME en numerosas dianas de interés se puede aplicar directamente desde el ADN genómico desnaturalizado como se describe en la Fig. 4. Tras esto, se puede aplicar una PCR multiplexada usando cebadores que se dirigen contra las dianas de ADN de interés (por ejemplo, pero sin limitarse a, los cebadores usados en el kit Life-Technologies Ampliseq o el kit Illumina Trueseq). Los productos de PCR multiplexados ahora se enriquecerán en mutaciones en vista del tratamiento con NaME, por lo que la preparación de la biblioteca resultante proporcionará ADN enriquecido en mutaciones para la resecuenciación dirigida.
En algunas realizaciones, antes de implementar el método de NaME descrito aquí, se capturan dianas de interés del ADN genómico dentro de sondas de inversión molecular (MIPS); o usando el enfoque de oligonucleótidos "cebo". En algunas realizaciones, las MIPS o los oligonucleótidos cebo están biotinilados (por ejemplo, de forma similar a los incluidos en el kit Agilent SureSelectTM, pero rediseñados para capturar las hebras de ADN diana superior e inferior según las secciones anteriores). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos cebo se unen a perlas. La muestra de ácido nucleico se pone en contacto con los oligonucleótidos cebo que se unen a dianas de interés seleccionadas, y se permite la unión de los oligonucleótidos cebo a las dianas de interés. A continuación, los oligonucleótidos cebo con las regiones de interés unidas a ellos se aíslan de los ácidos nucleicos restantes. Finalmente, las dianas aisladas se liberan de las perlas, y se usa NaME multiplexado (usando sondas solapantes que se dirigen contra las hebras de ADN superior e inferior y se hibridan con numerosas mutaciones genéticas diana simultáneamente) para escindir los diferentes ácidos nucleicos de tipo salvaje simultáneamente. Después de esto, antes de la MPS se pueden usar la PCR y la construcción de bibliotecas usando la muestra enriquecida en mutación.
En algunas realizaciones, las sondas oligonucleotídicas que se pueden usar en los métodos descritos aquí forman sistemáticamente una región genómica de interés, por ejemplo el cromosoma Y. En algunas realizaciones, se sintetizan sondas oligonucleotídicas degeneradas que cubren todas las regiones ricas en AT, todas las regiones ricas en GC, promotores génicos; o islas de CpG. Cualquier fracción genómica de interés puede seleccionarse para la escisión selectiva 'a voluntad' usando múltiples sondas solapantes dirigidas contra las hebras superior e inferior y diseñadas como se describe aquí.
ENRIQUECIMIENTO DE MUTACIONES USANDO NAME EN AUSENCIA DE AMPLIFICACIÓN POSTERIOR.
En todas las realizaciones descritas hasta el momento, para producir una muestra con secuencias diana mutadas enriquecidas, se lleva a cabo una etapa de amplificación después de la aplicación de la digestión con DSN de los alelos de ADN de tipo salvaje. Alternativamente, otra forma de enriquecer las secuencias diana mutadas es eliminar las secuencias de tipo salvaje (sin amplificación). Por lo tanto, en algunas realizaciones, la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos se somete a una condición de degradación de ADN adicional que hidroliza enzimáticamente los dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos con DSN, con la degradación iniciada en la posición de la escisión. La "condición de degradación del ADN" incluye poner en contacto la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos con una exonucleasa (porejemplo, usando exo I o exo III, o el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E.coli, que digiere el ADN del extremo 3') en condiciones de actividad de exonucleasa óptima (es decir, la temperatura, las concentraciones de iones de pH, etc., se mantienen para proporcionar una actividad enzimática óptima).
En este enfoque, el ADN genómico puede no fragmentarse, o puede fragmentarse aleatoriamente como se describe en las secciones anteriores. Si el ADN se fragmenta, el ADN genómico fragmentado se liga en primer lugar a adaptadores que son resistentes a la digestión con exonucleasa en 3' (por ejemplo, mediante el uso de adaptadores que tienen un enlace de fosforotioato en el extremo 3'). A continuación, la muestra de ADN se desnaturaliza y se aplica NaME como se describe en las secciones anteriores, para generar la escisión de las secuencias de tipo salvaje y dejar intactas las secuencias mutadas. A continuación, se aplica una digestión con exonucleasa (porejemplo, usando exo I o exo III, o el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E.coli, que digiere el ADN del extremo 3'). La exonucleasa digerirá todas las secuencias que no tengan un extremo 3' resistente a la exonucleasa, es decir, sin fosforotioato 3'-terminal. Dado que los fragmentos mellados con DSN no tienen un fosforotioato 3'-terminal, la enzima los digerirá por completo, eliminando así las hebras de ADN de tipo salvaje. La digestión procederá desde la posición 3' de la muesca inducida por DSN hasta el extremo 5', al tiempo que deja intactas las secuencias diana mutadas (no melladas). Opcionalmente, también se pueden digerir secuencias de tipo salvaje desde el extremo 5' de la muesca hasta el extremo 3' usando ADN polimerasa I de E.coli, que tiene actividad de exonucleasa de 5' a 3'. Después de la digestión completa de las secuencias de tipo salvaje cortadas con DSN, se puede usar un método de detección de punto final que no requiere amplificación, tal como un enfoque de secuenciación de una sola molécula (sistema Nanopore; o sistema Pacific-Bio) para secuenciar la muestra de ADN enriquecida con mutaciones. Esta realización no se basa en ninguna forma de amplificación de ácido nucleico, y puede ser particularmente útil en la secuenciación de genomas pequeños (por ejemplo, genomas bacterianos o virales) en los que las mutaciones de bajo nivel son actualmente difíciles de detectar en vista de la tasa de error relativamente alta de estos sistemas de secuenciación. El enfoque se puede combinar con la captura selectiva de fragmentos genómicos en perlas, para reducir la complejidad de un genoma más grande, seguido de NaME, para eliminar el ADN de tipo salvaje y enriquecer las secuencias diana mutadas en ausencia de amplificación.
DETECCIÓN DE MUTACIONES USANDO NAME
A menudo, existe la necesidad de buscar mutaciones en regiones largas de ADN (en lugar de identificar mutaciones conocidas en una sola posición de punto de acceso, tal como KRAS). Usando dos sondas más largas que son complementarias a las secuencias de ADN adyacentes (una sonda en la hebra inferior, y la segunda, la sonda adyacente, en la hebra superior) se puede adaptar NaME para la 'detección de mutaciones'. Por ejemplo, se pueden usar sondas de 50-70 pb para cubrir una región de 100-140 pares de bases. Si hay una mutación en cualquier posición a lo largo de estos 140 pares de bases, la DSN no escindirá sustancialmente la hebra correspondiente. Por tanto, la hebra mutante sobrevivirá, y conducirá a un producto de PCR posterior que puede secuenciarse (Fig. 12A). De esta manera, las regiones más largas en genes supresores de tumores como p53 pueden enriquecerse para mutaciones, independientemente de la posición de la mutación (Fig. 12B y 12C).
APLICACIÓN DE NAME CON ARN O ADNMC
En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí se pueden usar para escindir selectivamente ADNc de tipo salvaje, o ARNm, o ADN en formato de hebra sencilla. Para este enfoque (Fig. 13), solo se necesitaría una única sonda por gen diana, a diferencia de una sonda en cada hebra opuesta usada en ADNbc.
NAME SENSIBLE A LA METILACIÓN (CON SONDAS)
En algunas realizaciones, los métodos descritos aquí se usan para preparar un ácido nucleico diana no metilado de interés para el enriquecimiento posterior. En dichas realizaciones, antes de implementar NaME en la mezcla de reacción, la muestra de ácido nucleico se trata con bisulfito de sodio (el bisulfito convierte todas las citosinas en uracilos, a menos que las citosinas estén metiladas en posiciones de dinucleótidos CpG). El par de sondas oligonucleotídicas usado en estos métodos son complementarios a las hebras superior e inferior del ácido nucleico metilado de interés, es decir, una de las sondas oligonucleotídicas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico metilado de interés, mientras que la otra sonda de oligonucleótidos es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico metilado de interés, después de la conversión con bisulfito. Las sondas formarán, de este modo, dúplex complementarios (es decir, sin desajustes) con las hebras superior e inferior en alelos que contienen ADN completamente metilado. Por el contrario, las sondas formarán dúplex parcialmente complementarios con los alelos que contienen citosinas no metiladas, debido a los desajustes en las posiciones de los uracilos (que solían ser citosinas antes de la conversión con bisulfito). Como resultado, los dúplex metilados serán escindidos por DSN, mientras que los dúplex no metilados permanecerán sustancialmente intactos para la amplificación posterior (Fig. 14).
Dado que NaME funciona bien con los desajustes causados por mutaciones de un solo punto, se puede esperar que la presencia de varios desajustes en una secuencia debido a la conversión de múltiples citosinas haga que la discriminación de coincidencia/desajuste de DSN funcione aún mejor. De este modo, con este enfoque también se pueden usar opcionalmente sondas que son más largas (por ejemplo, 50-200 pb o más). Además, a diferencia del ADN normal de doble hebra, el ADN convertido con bisulfito sigue siendo de hebra sencilla después del tratamiento químico, y las dos hebras de ADN ya no son complementarias entre sí. En consecuencia, se pueden usar opcionalmente sondas que coincidan solo con la hebra de ADN superior, o que coincidan solo con la hebra de ADN inferior después de la conversión de ADN con bisulfito.
Se pueden usar miles de sondas que cubran todos los promotores y que organicen en mosaico regiones genómicas completas. Por ejemplo, el ADN genómico se digiere en fragmentos más pequeños, usando cizallamiento físico para la fragmentación aleatoria, o la fragmentación con enzimas de restricción (usando enzimas que son independientes de la metilación). El ADN se fragmenta aleatoriamente, se repara en los extremos, y se liga a adaptadores metilados que son resistentes a la conversión con bisulfito. Este es una primera etapa estándar en las preparaciones de secuenciación con bisulfito de genoma completo. A continuación, la muestra se trata con bisulfito de sodio para convertir la C no metilada en U (Fig. 14). El ADN en este punto comprende principalmente secuencias de una sola hebra. A continuación, se aplica el procedimiento de NaME, añadiendo DSN más un gran conjunto de sondas oligonucleotídicas sintetizadas diseñadas para coincidir con la versión metilada convertida con bisulfito de las regiones de interés (por ejemplo, un gen supresor de tumores completo como TP53 o BRCA1; o un gran porción del cromosoma 21 si la trisomía 21 está bajo examen para diagnóstico prenatal; o todos los promotores en oncogenes; o regiones que están metiladas diferencialmente entre diversos tejidos, para ayudar a definir el tejido de origen al examinar el ADN circulante u otras biopsias líquidas). Las sondas formarán ADN perfectamente de doble hebra (es decir, dúplex complementarios) en alelos que contenían ADN completamente metilado. Tanto la hebra superior como la inferior del ADN original deben ser abordadas por los oligonucleótidos usados, ya que ambas hebras de ADN originales deben digerirse selectivamente y evitar la amplificación posterior. Los alelos con ADN no metilado permanecerán sin digerir, debido a que las sondas contendrán desajustes en las posiciones de los uracilos (citosinas convertidas con bisulfito). Como resultado, DSN no cortará estas secuencias, permitiendo así su posterior amplificación (Fig. 14). Después de la escisión selectiva de las dianas metiladas de interés, se puede aplicar una condición de amplificación, tal como PCR que usa adaptadores comunes, seguido de la secuenciación de la muestra. Alternativamente, se puede aplicar PCR de elementos repetidos, que usa cebadores específicos para ALU tratada con bisulfito, LINE 1 y otros elementos repetidos repartidos por el genoma; o PCR cebada arbitrariamente (AP-PCR); o COLD-PCR. También se pueden usar formas isotérmicas de amplificación, en lugar de PCR. Este enfoque es relevante para muchas aplicaciones, tales como el diagnóstico/terapia del cáncer (para detectar la hipometilación global), para el diagnóstico prenatal (por ejemplo para detectar ADN placentario que contiene secuencias fetales que están sustancialmente no metiladas), y para otras enfermedades que se sabe que dan como resultado/causan hipometilación, tal como el lupus eritematoso sistémico.
En algunas realizaciones, por ejemplo, después del tratamiento con bisulfito de sodio, el método se aplica de manera opuesta, es decir, para preparar un ácido nucleico diana metilado de interés para el enriquecimiento posterior. En tales realizaciones, el par de sondas oligonucleotídicas usadas son completamente complementarias a las hebras superior e inferior del ácido nucleico no metilado de interés, es decir, una de las sondas oligonucleotídicas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico no metilado de interés, mientras que la otra sonda oligonucleotídica es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico no metilado de interés, después de su conversión con bisulfito. Esto da como resultado la eliminación preferencial de las regiones no metiladas de los dianas de interés.
En algunas realizaciones, por ejemplo después del tratamiento con bisulfito, el método se utiliza para preparar tanto un ácido nucleico diana no metilado de interés como un ácido nucleico diana metilado (diferente) de interés para el enriquecimiento posterior. El método comprende: (i) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma metilada del ácido nucleico diana no metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma metilada del ácido nucleico diana no metilado de interés, (ii) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma no metilada del ácido nucleico diana metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma no metilada del ácido nucleico diana metilado de interés; y en el que, antes de implementar el protocolo de NaME descrito aquí en la mezcla de reacción, la muestra de ácido nucleico se trata con bisulfito de sodio.
En algunas realizaciones, el método se usa para preparar múltiples ácidos nucleicos diana de interés, algunos de los cuales son ácidos nucleicos diana metilados de interés, y algunos de los cuales son ácidos nucleicos diana no metilados de interés. En tales realizaciones, se usa (i) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma metilada de cada ácido nucleico diana no metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma metilada de cada ácido nucleico diana no metilado de interés, y (ii) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma no metilada de cada ácido nucleico diana metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma no metilada de cada ácido nucleico diana metilado de interés. Antes de implementar NaME en la mezcla de reacción, la muestra de ácido nucleico se trata con bisulfito de sodio. De este modo, los métodos descritos aquí permiten la eliminación simultánea de (a) promotores no metilados en genes supresores de tumores (para que sea fácil revelar los genes metilados de interés), y (b) promotores metilados de oncogenes (para que sea fácil para revelar los genes no metilados de interés). De esta manera, se puede enriquecer en promotores de oncogenes metilados, así como en promotores de oncogenes no metilados, simultáneamente.
Finalmente, enfoques similares a los descritos anteriormente, que usan el tratamiento con bisulfito del ADN para enriquecer selectivamente regiones de ADN metiladas/no metiladas diferencialmente, en base a 5-metilcitosina (5 mC), también pueden aplicarse para enriquecer selectivamente diferentes modificaciones epigenéticas de ADN de interés, tal como 5-hidroxi-metilación (5hmC). La 5-hidroxi-metilación es una modificación epigenética funcional y biológicamente diferente de la modificación con 5-metilcitosina. Por lo tanto, es importante medir por separado estas dos modificaciones. Una forma de separar el ADN que contiene 5hmC del que contiene 5mC es TAB-seq (secuenciación con bisulfito asistida por tet, Ito S et al, Science 2011 333(6047):1300-1303; y Yu M et al, Cell 2012: 149:1368-80). En TAB-seq, el 5hmC genómico se protege primero mediante glucosilación antes de realizar la conversión con bisulfito. Después, el ADN se trata con una enzima Tet, que convierte 5 mC en 5caC, al tiempo que deja intacta la 5-hidroxi-metilación glicosilada. Cualquier C leída en la secuenciación resultante se interpreta de este modo como 5-hidroxi-metilada. Por consiguiente, dependiendo de si el tratamiento con bisulfito se aplica directamente, o después de la glucosilación, la presente invención puede estar dirigida a enriquecer el ADN que contiene 5-metilcitosina o el ADN que contiene 5-hidroximetilcitosina.
REACCIÓN EN CADENA DE LA NUCLEASA
Algunos aspectos de la descripción se refieren a un método para preparar un ácido nucleico mutante diana para el posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, usando un 'enfoque de reacción en hebra'. El método comprende las etapas de: (a) exponer una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una nucleasa termoestable específica de la doble hebra (DSN) y a un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para crear un mezcla de reacción, en la que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa; (b) someter la mezcla de reacción a una temperatura desnaturalizante para permitir la desnaturalización del ácido nucleico de tipo salvaje y el ácido nucleico mutante diana; y (c) reducir la temperatura para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante dianasonda parcialmente complementarios.
Más específicamente, en algunas realizaciones, NaME se puede aplicar en forma de ciclos de temperatura, incluyendo ciclos breves de desnaturalización seguidos de incubación con DSN en presencia de sondas (Fig. 9). La DSN termoestable se incluye en la mezcla de reacción desde el principio, a pesar del uso de la temperatura de desnaturalización. La temperatura se eleva de modo que permita la desnaturalización del ácido nucleico de tipo salvaje y del ácido nucleico mutante diana sin destruir la enzima DSN que está presente simultáneamente en la mezcla de reacción. En algunas realizaciones, esta temperatura de desnaturalización es 65°C, 70°C, 75°C, 802C, o 852C). En algunas realizaciones, en la mezcla de reacción se incluye un disolvente orgánico que puede reducir la Tm de los ácidos nucleicos. El disolvente reduce la Tm de los ácidos nucleicos, sin inhibir la actividad de DSN. Los ejemplos de dichos disolventes incluyen, pero no se limitan a, DMSO, betaína o formamida. En algunas realizaciones, en la mezcla de reacción se incluye 10-15% de DMSO.
Después de desnaturalizar brevemente los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana, la temperatura se reduce para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutantes. Esta temperatura de hibridación permite la actividad de DSN. En algunas realizaciones, esta temperatura de hibridación es 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, o 70°C). Dado que las sondas oligonucleotídicas están en gran exceso en comparación con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana, se unen a sus secuencias correspondientes y forman dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante-sonda parcialmente complementarios. La DSN termoestable digiere entonces los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios, mientras que los dúplex de mutante-sonda parcialmente complementarios permanecen intactos.
En algunas realizaciones, las etapas (b) (etapa de desnaturalización) y (c) (etapa de hibridación/incubación con DSN) se repiten durante uno o más ciclos. En algunas realizaciones, estas etapas se repiten durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, o 50 ciclos. La etapa de hibridación/incubación con DSN solo se aplica de manera intermitente (por ejemplo, 2-4 min), y se interrumpe por otro ciclo de desnaturalización, seguido de una reducción de la temperatura nuevamente para la digestión con DSN, y así sucesivamente. De esta forma, es posible maximizar la diferencia entre la escisión del ácido nucleico de tipo salvaje y el mutante, al mismo tiempo que se evita la rehibridación sustancial de las dos hebras de ácido nucleico originales (lo que conduciría a la destrucción indiscriminada del ácido nucleico, ya sea mutante o no).
En algunas realizaciones, el método comprende además enriquecer el ácido nucleico mutante diana con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje sometiendo la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos a una condición de amplificación, tal como, pero sin limitarse a, PCR, COLD-PCR, PCR mediada por ligación, o COLD-PCR que usa adaptadores ligados comunes, PCR multiplex, y amplificación isotérmica (tal como, pero sin limitarse a, amplificación por desplazamiento basada en phi-29; o amplificación LAMP mediada por bucle; o cualquier otro modo isotérmico de amplificación).
En algunas realizaciones, una de las sondas se solapa con una secuencia en la hebra superior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, mientras que la otra sonda se solapa con una secuencia en la hebra inferior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, y las dos sondas se solapan parcialmente entre sí.
En algunas realizaciones, el método se usa para preparar dos o más ácidos nucleicos mutantes diana diferentes para el posterior enriquecimiento con respecto a los ácidos nucleicos de tipo salvaje correspondientes, y el método comprende además uno o más pares adicionales de sondas dirigidas contra los diferentes ácidos nucleicos de tipo salvaje, en el que para cada par de sondas, una de las sondas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje.
NAME-PCR
Algunos aspectos de la presente descripción proporcionan métodos que combinan el procedimiento de NaME con la amplificación por PCR en una sola etapa, como se muestra en la Fig. 10. En consecuencia, los aspectos de la descripción proporcionan un método para enriquecer un ácido nucleico mutante diana, comprendiendo el método las etapas de: (a) preparar una mezcla de reacción de amplificación que comprende: un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra, un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, una nucleasa termoestable específica de la doble hebra (DSN), un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, en la que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa y los componentes de la amplificación por PCR; (b) someter la mezcla de reacción a una temperatura desnaturalizante para permitir la desnaturalización del ácido nucleico de tipo salvaje y el ácido nucleico mutante diana; (c) reducir la temperatura para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que la DSN escinde los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios pero no los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios; y (d) someter la mezcla de reacción a una condición de amplificación, enriqueciendo así el ácido nucleico mutante diana no escindido con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje escindido.
En este enfoque, NaME y PCR se llevan a cabo en un solo tubo. Todos los componentes de la PCR, tales como, pero sin limitarse a, cebadores, dNTP, polimerasa, y amortiguador de polimerasa, se incluyen junto con las sondas oligonucleotídicas y la DSN en la mezcla de reacción. De esta manera, el ácido nucleico de tipo salvaje es sucesivamente destruido selectivamente por DSN mientras también se resintetiza por PCR, de modo que el ADN diana total permanece igual o aumenta, mientras que al mismo tiempo se enriquece continuamente el ADN mutado durante el procedimiento de ciclado. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo en formato COLD-PCR, en lugar de la PCR estándar.
La DSN es compatible con la mayoría de los amortiguadores de PCR usados comercialmente; por lo tanto, la escisión con DSN funciona en un entorno de PCR. Dado que ambas enzimas, DSN y polimerasa, son termoestables, es posible operar una reacción combinada en un termociclador común. La condición de amplificación aplicada en la etapa (d) permite la hibridación de pares de cebadores con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, seguido de la extensión, enriqueciendo así el ácido nucleico mutante diana con respecto al tipo salvaje.
En algunas realizaciones, las etapas (b) (etapa de desnaturalización) y (c) (etapa de hibridación/incubación con DSN) se repiten durante dos o más ciclos antes de ejecutar la etapa (d) (amplificación por PCR). En algunas realizaciones, estas etapas se repiten durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, o 50 ciclos. En algunas realizaciones, las etapas (b) (etapa de desnaturalización), (c) (etapa de hibridación/incubación con DSN) y (d) (etapa de amplificación) se repiten durante dos o más ciclos. En algunas realizaciones, estas etapas se repiten durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, o 50 ciclos.
En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además un disolvente orgánico que puede reducir la Tm de los ácidos nucleicos que se incluyen en la mezcla de reacción. El disolvente reduce la Tm de los ácidos nucleicos, sin inhibir la actividad de DSN. Los ejemplos de dichos disolventes incluyen, pero no se limitan a, DMSO, betaína o formamida.
La temperatura de desnaturalización usada es tal que permite la desnaturalización del ácido nucleico de tipo salvaje y del ácido nucleico mutante diana sin destruir la enzima DSN que está presente simultáneamente en la mezcla de reacción. En algunas realizaciones, esta temperatura de desnaturalización es 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, o 85°C, aplicada durante períodos de tiempo de 1 s, 30 s, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min, o 10 min.
En algunas realizaciones, una de las sondas se solapa con una secuencia en la hebra superior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, mientras que la otra sonda se solapa con una secuencia en la hebra inferior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, y las dos sondas se solapan parcialmente entre sí. En algunas realizaciones, las sondas se modifican en el extremo 3' para evitar la extensión por polimerasa, y para garantizar que las sondas no actúen como cebadores durante NaME-PCR. En algunas realizaciones, los cebadores usados para la amplificación por PCR tienen una temperatura de fusión inferior a la temperatura aplicada en la etapa (c). Esto asegura que los cebadores no se unan a los ácidos nucleicos durante el tiempo que se usa DSN para escindir selectivamente el ácido nucleico de tipo salvaje. Por ejemplo, la Tm de los cebadores puede ser 55°C, mientras que la etapa de de hibridación/incubación con DSN se lleva a cabo por encima de 65°C, a la que los cebadores no interfieren.
En algunas realizaciones, el método se usa para enriquecer dos o más ácidos nucleicos mutantes diana diferentes con respecto a los ácidos nucleicos de tipo salvaje, y el método comprende además uno o más pares adicionales de sondas dirigidas contra los diferentes ácidos nucleicos de tipo salvaje, en el que para cada par de sondas, una de las sondas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje.
La Figura 10 muestra un procedimiento de síntesis de ADN secuencial a través de PCR (durante el cual DSN no tiene tiempo suficiente para la escisión sustancial de los ácidos nucleicos, mientras que la polimerasa actúa en segundos para sintetizar moldes), seguido de la detención de la amplificación durante 10 min a 65°C, durante lo cual DSN actúa selectivamente sobre el ácido nucleico de tipo salvaje. A esta temperatura, los cebadores no se unen, y, por lo tanto, no se produce la síntesis de la polimerasa. Entonces, esto es seguido por más síntesis de ADN a través de PCR y más digestión con DSN, y así sucesivamente en un procedimiento secuencial. El producto final es ADN que comprende principalmente ADN mutante. El producto puede secuenciarse o analizarse directamente en busca de mutaciones usando otros métodos conocidos.
La Figura 11 representa la combinación de NaME con COLD-PCR (COLD-NaME-PCR) para un enriquecimiento aún mayor del ácido nucleico que contiene la mutación. Se aplican condiciones para COLD-PCR que permiten la amplificación selectiva del ácido nucleico que contiene la mutación durante la PCR, seguido de la escisión selectiva del ácido nucleico de tipo salvaje usando DSN en reacciones secuenciales en un solo tubo. Se pueden usar todos los tipos de COLD-PCR, incluyendo, pero sin limitarse a, COLD completa, COLD rápida, COLD PCR en hielo, o LDT-COLD-PCR de tiempo de desnaturalización limitado. Los métodos para llevar a cabo COLD-PCR son altamente compatibles con NaME-PCR, y se han descrito previamente (véanse, por ejemplo, Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos Gm . Nat Med 2008;14:579-84; Milbury CA, Li J, Makrigiorgos GM. Nucleic Acids Res;39:e2; Murphy DM, Castellanos-Rizaldos E, Makrigiorgos GM. Clin Chem. 201460:1014-6)
NAME SENSIBLE A LA METILACIÓN - SIN SONDAS
Algunos aspectos de la descripción proporcionan métodos para preparar ácidos nucleicos de interés no metilados o metilados usando un enriquecimiento preferencial basado en la temperatura de los alelos de interés a nivel de todo el genoma usando enzimas tales como DSN o exonucleasa. En este enfoque, no es necesario usar sondas. El ADN genómico se digiere en fragmentos más pequeños. Después de la reparación del extremo y la ligadura del adaptador resistente al bisulfito, se aplica el tratamiento con bisulfito. Ahora las secuencias no metiladas vuelven a una Tm más baja en vista de la conversión C>T, mientras que las secuencias metiladas permanecen a Tm elevada. A continuación, se aplica la PCR que usa los adaptadores ligados para generar una biblioteca de ADN de doble hebra amplificada. (Alternativamente, se puede aplicar PCR de elementos repetidos usando cebadores específicos para ALU tratada con bisulfito, LINE 1 y otros elementos repetidos repartidos por el genoma, para aplicar el método solo a secuencias repetidas; o PCR cebada arbitrariamente (AP-PCR), para aplicar el método a grandes fracciones genómicas arbitrarias, o se puede aplicar COLD-PCR. También se pueden usar formas isotérmicas de amplificación, en lugar de PCR).
Después de la amplificación, se puede usar un enfoque de desnaturalización preferencial, o un enfoque de hibridación preferencial para enriquecer las secuencias no metiladas. Los dos enfoques se describen a continuación.
Para el enfoque de desnaturalización preferencial, la temperatura se eleva hasta un nivel de elección que genera una desnaturalización parcial o completa de las secuencias de menor Tm. Estas incluyen las secuencias originalmente no metiladas que, debido a la conversión C>U, dieron como resultado una conversión C>T en el producto de PCR final, volviendo a una Tm más baja que las secuencias metiladas. Las secuencias de Tm elevada permanecen bicatenarias. Estas incluyen las secuencias ricas en GC altamente metiladas. Un experto en la técnica puede determinar la Tm de las secuencias usando métodos conocidos en la técnica y como se describe aquí. La temperatura usada para esta desnaturalización preferencial de las secuencias de baja Tm incluye, pero no se limita a, 50°C, 55°C, 60°C, 66°C, 70°C, 75°C, 78°C, 80°C, o 85°C). A continuación, se añade DSN, y los ácidos nucleicos se exponen a condiciones óptimas para la actividad de DSN. Las condiciones óptimas para la actividad de DSN incluyen las condiciones más favorables que permiten que la enzima funcione de manera más eficiente para escindir dúplex complementarios. La actividad de DSN óptima puede verse afectada por condiciones que incluyen la temperatura; pH; y concentraciones de sal. En algunas realizaciones, la temperatura usada para la actividad de DSN óptima incluye, pero no se limita a, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, o 70°C. Las secuencias originalmente no metiladas con Tm más baja (así como las secuencias naturalmente ricas en AT con menor Tm) se desnaturalizarán (es decir, se convertiran en monocatenarias), y por lo tanto escaparán a la digestión por DSN, mientras que las secuencias originalmente metiladas se escindirán, ya que permanecerán en formación de doble hebra a la temperatura de desnaturalización escogida. Una amplificación posterior de las secuencias restantes usando los adaptadores comunes ligados amplificará preferentemente las secuencias no metiladas intactas, y permitirá la secuenciación masivamente paralela aguas abajo de los alelos no metilados. En algunas realizaciones, la desnaturalización preferencial del ADN genómico se lleva a cabo en presencia de disolventes orgánicos que pueden reducir la Tm de los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, betaína, DMSO, o formamida. Se sabe que la betaína genera un pico de fusión más estrecho para los dúplex de ADN, por lo tanto, al añadir betaína, la discriminación entre secuencias de Tm alta y baja a una temperatura de desnaturalización dada será "más nítida".
Por consiguiente, en algunas realizaciones, el método comprende las etapas de: (a) ligar adaptadores resistentes al bisulfito a ácidos nucleicos de doble hebra de interés; (b) someter los ácidos nucleicos unidos a adaptadores a un tratamiento con bisulfito de sodio y a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, para formar ácidos nucleicos de doble hebra tratados con bisulfito; (c) someter los ácidos nucleicos tratados con bisulfito a una temperatura que permita la desnaturalización preferencial de los ácidos nucleicos no metilados, al tiempo que los ácidos nucleicos metilados permanecen en forma de doble hebra; y (d) exponer los ácidos nucleicos no metilados y metilados a nucleasa específica de la doble hebra (DSN) y a condiciones para una actividad de DSN óptima, en el que la DSN escinde los ácidos nucleicos de doble hebra metilados pero no los ácidos nucleicos de hebra sencilla no metilados.
Alternativamente, para el enfoque de rehibridación preferencial, se aplica una etapa de desnaturalización completa. La temperatura de desnaturalización debe ser lo suficientemente alta como para permitir la desnaturalización completa de los ácidos nucleicos (por ejemplo, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, o 95°C). En algunas realizaciones, la temperatura de desnaturalización se aplica durante 30 segundos, 1 min, 2 min, o 3 min. En algunas realizaciones, la temperatura de desnaturalización de 95°C se aplica durante 2 min. Después de esto, la temperatura se reduce hasta un nivel que permite que las secuencias metiladas (u otras Tm altas) se vuelvan a hibridar rápidamente (debido a su Tm más alta), mientras que las secuencias no metiladas permanecen sustancialmente monocatenarias. A continuación, la aplicación de la enzima DSN en condiciones para una actividad de DSN óptima digiere preferentemente los dúplex metilados. En algunas realizaciones, la rehibridación tiene lugar en presencia de un disolvente orgánico tal como DMSO, que reduce la Tm del ácido nucleico, en combinación con la digestión concurrente usando DSN (es decir, en lugar de añadir DSN en una etapa posterior). El uso de disolventes orgánicos tal como DMSO permite que se apliquen temperaturas compatibles con la acción de DSN (por ejemplo, 60-75°C) durante la rehibridación. Finalmente, se puede aplicar una etapa de amplificación por PCR para amplificar preferentemente los alelos no digeridos y no metilados, seguido de la secuenciación.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, el método comprende las etapas de: (a) ligar adaptadores resistentes al bisulfito a ácidos nucleicos de doble hebra de interés; (b) someter los ácidos nucleicos unidos a adaptadores a un tratamiento con bisulfito de sodio y a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, para formar ácidos nucleicos de doble hebra tratados con bisulfito; (c) someter los ácidos nucleicos tratados con bisulfito a una temperatura de desnaturalización que permita la desnaturalización de los ácidos nucleicos metilados y no metilados, para formar ácidos nucleicos de hebra sencilla metilados y no metilados; (d) reducir la temperatura para permitir la formación preferencial de dúplex metilados, pero no de dúplex no metilados; y (e) exponer los ácidos nucleicos no metilados y metilados a nucleasa específica de la doble hebra (DSN) y a condiciones para una actividad de DSN óptima, en el que la DSN escinde preferentemente los dúplex metilados pero no los ácidos nucleicos de hebra sencilla no metilados.
La conversión con bisulfito del ADN ha formado la base para identificar el estado de metilación de genes individuales. Con la llegada de los métodos de secuenciación en paralelo de alto rendimiento, esta tecnología se ha extendido a la secuenciación de bibliotecas de ADN tratado con bisulfito. El enfoque implica la fragmentación del ADN, la ligadura de adaptadores, el tratamiento con bisulfito, y a continuación, la amplificación de las bibliotecas para la secuenciación de alto rendimiento (véanse, por ejemplo, los documentos US 2013/0059734, US 2008/0254453, US 2009/0148842 y US 8440404).
En un enfoque inverso que tiene como objetivo enriquecer los alelos metilados, tras la desnaturalización preferencial de las secuencias de Tm más bajas (que incluyen alelos no metilados), se aplica el tratamiento con cualquier enzima con acción selectiva contra ADN de hebra sencilla (en oposición a ADN de doble hebra), tal como, pero sin limitarse a, exonucleasa I o III, para eliminar las secuencias monocatenarias. Posteriormente, las secuencias restantes (incluyendo los alelos sustancialmente metilados) pueden amplificarse y secuenciarse. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el método comprende las etapas de: (a) ligar adaptadores resistentes al bisulfito a ácidos nucleicos de doble cadena de interés; (b) someter los ácidos nucleicos unidos a adaptadores a un tratamiento con bisulfito de sodio y a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para formar ácidos nucleicos de doble hebra tratados con bisulfito; (c) someter los ácidos nucleicos tratados con bisulfito a una temperatura que permita la desnaturalización preferencial de los ácidos nucleicos no metilados, al tiempo que los ácidos nucleicos metilados permanecen en forma de doble hebra; y (d) exponer los ácidos nucleicos no metilados y metilados a una exonucleasa y a condiciones para una actividad de exonucleasa óptima, en el que la exonucleasa escinde los ácidos nucleicos de hebra sencilla metilados pero no los ácidos nucleicos de doble hebra no metilados.
En algunas realizaciones, el método comprende las etapas de: (a) ligar adaptadores resistentes al bisulfito a ácidos nucleicos de doble hebra de interés; (b) someter los ácidos nucleicos unidos a adaptadores a un tratamiento con bisulfito de sodio y a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, para formar ácidos nucleicos de doble hebra tratados con bisulfito; (c) someter los ácidos nucleicos tratados con bisulfito a una temperatura de desnaturalización que permita la desnaturalización de los ácidos nucleicos metilados y no metilados, para formar ácidos nucleicos de hebra sencilla metilados y no metilados; (d) reducir la temperatura para permitir la formación preferencial de dúplex metilados, pero no de dúplex no metilados; y (e) exponer los ácidos nucleicos no metilados y metilados a una exonucleasa y a condiciones para una actividad de exonucleasa óptima, en el que la exonucleasa escinde preferentemente los ácidos nucleicos de hebra sencilla no metilados, pero no los dúplex metilados.
En algunas realizaciones, la reacción de amplificación de ácidos nucleicos usada para formar ácidos nucleicos tratados con bisulfito de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en: PCR; COLD-PCR completa, COLD-PCR rápida; COLD-PCR en hielo; COLD-PCR tolerante a la temperatura; LDT-COLD-PCR; AP-Pc R; y PCR de elementos repetidos (ALU, LINE1, y otras secuencias repetidas). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de hebra sencilla no metilados escindidos resultantes y los dúplex metilados no escindidos se someten a una condición de amplificación usando los adaptadores ligados resistentes al bisulfito. En algunas realizaciones, la condición de amplificación se selecciona del grupo que consiste en: PCR; LDT-COLD-PCR; AP-PCR; y PCR de elementos repetidos (ALU, LINE1, y otras secuencias repetidas).
La ventaja específica de llevar a cabo la amplificación de todo el genoma en formato COLD-PCR es que, al emplear una temperatura de desnaturalización deseada durante la amplificación, COLD-PCR proporciona un enriquecimiento adicional de secuencias de menor Tm, como se ha demostrado anteriormente mediante el uso de COLD-PCR en secuencias de un solo gen no metilado (Castellanos-Rizaldos, E., Milbury, C.A., Karatza, E., Chen, C.C., Makrigiorgos, G.M. and Merewood, A. (2014) COLD-PCR amplification of bisulfite-converted DNA allows the enrichment and sequencing of rare un-methylated genomic regions. PLoS One, 9, e94103.). Las secuencias con Tm por encima de la temperatura de desnaturalización seleccionada no se amplifican durante COLD-PCR. Cualquiera de los formatos de COLD-PCR descritos se puede usar para amplificar fracciones seleccionadas de secuencias no metiladas del genoma (COLD-PCR completa (11); COLD-PCR rápida (11); COLD-PCR en hielo (12); COLD-PCR tolerante a la temperatura (13); y LDT-COLD-PCR de tiempo de desnaturalización limitado, Murphy DM, Castellanos-Rizaldos E, Makrigiorgos Gm . Clin Chem. 2014 60:1014-6). Cada formato de COLD-PCR logrará la amplificación de diferentes fracciones genómicas. Por ejemplo, COLD-PCR rápida utiliza una sola temperatura de desnaturalización, por lo que cualquier secuencia con Tm por encima de esta temperatura no se amplificará en absoluto. Alternativamente, la COLD-PCR tolerante a la temperatura utiliza etapas sucesivas de aumento de las temperaturas de desnaturalización que cubren un amplio intervalo de temperaturas (por ejemplo, un intervalo de 10°C en 10 etapas de 1°C cada una), amplificando así un intervalo más amplio de secuencias no metiladas del genoma. Dependiendo de la aplicación, se pueden emplear diferentes programas de COLD-PCR. La Fig. 15 describe la combinación de la digestión con DSN de secuencias metiladas con la amplificación por COLD-PCR tolerante a la temperatura en tándem de secuencias no metiladas, para un mayor enriquecimiento de alelos globalmente no metilados.
En algunas realizaciones de los métodos usados para preparar ácidos nucleicos de interés no metilados o metilados sin usar sondas oligonucleotídicas, las secuencias naturalmente ricas en AT se eliminan antes del tratamiento con bisulfito de sodio. Específicamente, en los enfoques descritos aquí para la amplificación preferencial de ADN no metilado (o ADN metilado), se aplica una etapa de bisulfito que convierte las secuencias que originalmente tenían una Tm más alta (secuencias ricas en GC que no están metiladas) en secuencias de Tm más bajas (debido a la conversión C>T). Por el contrario, los alelos metilados conservan su Tm elevada. De esta forma, una etapa preferencial de desnaturalización, seguida de digestión con DSN y posterior amplificación, enriquece preferentemente los alelos no metilados. Sin embargo, durante esta etapa de amplificación, las secuencias con una Tm naturalmente baja también se amplificarán, independientemente de su estado de metilación (por ejemplo, secuencias ricas en AT). En algunas realizaciones, tales secuencias con temperatura de fusión (Tm) por debajo de una temperatura de elección se eliminan para evitar que estas múltiples secuencias 'normales, no informativas' con baja Tm se amplifiquen en competencia con las secuencias diana, abrumando así la amplificación de las secuencias de interés.
Tales secuencias 'no informativas' pueden eliminarse sustancialmente de la muestra antes de realizar la etapa de conversión con bisulfito de la siguiente manera:
1. (a) Eliminando secuencias de Tm más bajas. Justo antes del tratamiento con bisulfito de sodio se realiza un fraccionamiento basado en la temperatura del material de partida (Fig. 16). Después del cizallamiento del ADN genómico, el ADN se trata con una enzima que crea extremos romos (por ejemplo, 'reparación de los extremos'), tal como, pero sin limitarse a, T7 ADN polimerasa. A continuación, la temperatura se eleva hasta la temperatura de corte deseada. Esta temperatura de corte deseada es la temperatura a la que deben eliminarse selectivamente las secuencias que tienen una Tm más baja. Como ejemplo, supongamos que la temperatura de corte deseada es 80°C. Al elevar la temperatura hasta 80°C durante períodos de tiempo de 1 s a 5 min (por ejemplo, 1 s, 5 s, 15 s, 30 s, 45 s, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, o 5 mins), los fragmentos de ADN con Tm por debajo de 80°C se desnaturalizarán sustancialmente, mientras que otros fragmentos con Tm por encima de 80°C permanecerán sustancialmente bicatenarios. A continuación, la temperatura se reduce rápidamente, por ejemplo colocando la muestra en hielo. A continuación, se añade una enzima que degrada preferentemente el ADN de hebra sencilla (por ejemplo, exonucleasas I o III), y se eleva la temperatura hasta la temperatura óptima para esta actividad enzimática (por ejemplo, 37°C) durante 1 min -60 min (por ejemplo, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min, o 60 min). Debido a la complejidad del ADN genómico, durante este período de tiempo no hay una renaturalización sustancial de los fragmentos de hebra sencilla que sufren desnaturalización, y la enzima los degrada. Finalmente, la exonucleasa se inactiva por calor. Este procedimiento produce fragmentos de ADN de doble hebra con una Tm mayor que alrededor de 80°C. De esta forma, los fragmentos con Tm sustancialmente más baja que la temperatura de corte escogida se agotan sustancialmente. En algunas realizaciones, el procedimiento se repite para rondas adicionales si se necesita un fraccionamiento por temperatura más riguroso. Las rondas adicionales pueden estar a la misma temperatura (por ejemplo, 80°C) o diferentes temperaturas (por ejemplo, 82-85°C). Después de la eliminación de secuencias con Tm por debajo de la temperatura de corte deseada, se aplica una etapa de bisulfito de sodio para convertir selectivamente C en U en posiciones CpG no metiladas en ácidos nucleicos. En consecuencia, estos fragmentos de ADN no metilados ahora volverán a las secuencias con una Tm más baja. Debido a que la mayoría de las secuencias con Tm naturalmente más bajas (por ejemplo, secuencias ricas en AT) se eliminaron durante el fraccionamiento por temperatura basado en exonucleasas, ahora es posible eliminar secuencias metiladas con Tm más altas mediante digestión con DSN preferencial de secuencias de doble hebra, así como amplificar preferentemente las secuencias no metiladas a través de una etapa de amplificación, tal como PCR (o COLD-PCR), sin interferencia de las secuencias ricas en AT de menor Tm.
2. (b) Fraccionamiento por temperatura basado en soporte sólido
Otro enfoque para eliminar secuencias con una Tm seleccionada de una muestra de ADN genómico incluye el fraccionamiento por temperatura basado en un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende perlas magnéticas. Pueden usarse perlas magnéticas para la inmovilización de la muestra de ADN genómico a fin de permitir la separación de fragmentos de ADN genómico en dominios de temperatura discretos antes del tratamiento posterior (Fig. 17). Después de separar los fragmentos de ADN genómico en dominios de temperatura discretos, la amplificación preferencial de alelos no metilados se puede aplicar por separado dentro de cada dominio, con una interferencia mínima de la amplificación de fragmentos de ADN de menor Tm no deseados que no brindan ninguna ventaja de enriquecimiento. Para aplicar este protocolo, la etapa de ligadura representada en la Fig. 15 se lleva a cabo con una mezcla de adaptadores resistentes al bisulfito biotinilados y no biotinilados, después de lo cual la mayoría de los fragmentos de ADN genómico se capturan en perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina a partir de solo una hebra (la hebra opuesta permanece sin biotinilar). Las condiciones aplicadas (perlas totales con respecto al ADN total) permiten la inmovilización de varios centenares de nanogramos de ADN biotinilado, de manera que se inmovilizan suficientes copias de la secuencia para retener eventos de bajo nivel en la población de fragmentos. Después del lavado del ADN no unido, la temperatura se eleva en 5 etapas consecutivas diferentes que difieren, por ejemplo, en 3°C. Durante cada etapa, las hebras de ADN no biotiniladas de los fragmentos de menor Tm se desnaturalizan gradualmente y se eluyen en el sobrenadante, que después se recolecta tras la magnetización de las perlas (Fig. 17). El ADN pasa de ser de doble hebra a ser mayoritariamente de hebra sencilla en un intervalo de ~4-5°C. Al recolectar el sobrenadante en intervalos de temperatura de 3°C, los fragmentos de ADN genómico se enriquecen mucho (por ejemplo, 10-100 veces) en secuencias dentro de dominios de temperatura predefinidos.
SIN DSN
Algunos aspectos de la descripción proporcionan un método para preparar un ácido nucleico mutante diana para su posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, que comprende un ácido nucleico de doble hebra de tipo salvaje y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra; poner en contacto los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra desestabilizados con un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que al menos una de las sondas se solapa con una secuencia en el ácido nucleico diana que contiene la mutación sospechosa, y en el que una o ambas sondas comprenden un ácido nucleico bloqueado (LNA), un ácido nucleico peptídico (PNA), un ácido xenonucleico (XNA), o un ácido nucleico con cualquier base modificada conocida o ARN que es capaz de bloquear la amplificación por PCR; y someter los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, a una condición de amplificación. Las sondas que se solapan a la posición de mutación actúan bloqueando la amplificación por PCR, por ejemplo actuando como abrazadera, para las hebras de ADN superior e inferior de tipo salvaje, inhibiendo así la amplificación del ácido nucleico de tipo salvaje. Cuando la sonda se duplica con una secuencia mutante diana parcialmente complementaria, es menos capaz de inhibir la amplificación por PCR, permitiendo así la amplificación selectiva del ácido nucleico mutante en comparación con el tipo salvaje, sin necesidad de una enzima de corte (por ejemplo, DSN).
Ejemplo
NaME en ADN de doble hebra
NaME utiliza nucleasas (DNasas) que tienen una actividad sustancialmente mayor sobre el ADN de doble hebra (ADNbc) frente al ADN de hebra sencilla (ADNmc). Muchas DNasas presentan dicha actividad, incluyendo la dsDNasa de gamba nativa, la dsDNasa de gamba recombinante, la nucleasa de cangrejo real (DSN), y la DNasa I bovina. En las secciones siguientes, se proporcionan realizaciones de NaME para la nucleasa termoestable DSN, pero se pueden usar los mismos enfoques para todas las otras nucleasas que presentan una actividad sustancialmente mayor para el ADNbc frente al ADNmc. La nucleasa termoestable (DSN) degrada selectivamente el ADN de doble hebra (o híbridos de ADN/ARN), mientras que tiene una acción mínima o nula sobre el ADN o el ARN de una sola hebra.
Para los fines de la presente descripción, la expresión "nucleasa específica de la doble hebra" o "DSN" incluye enzimas guiadas por ADN/ARN que tienen actividad preferencial en el ADN de doble hebra, a diferencia del ADN de hebra sencilla. Los ejemplos de tales enzimas que se pueden emplear junto con NaME incluyen las enzimas Cas9 guiadas por ARN (Gu et al, Depletion of Abundant Sequences by Hybridization (DASH): Using Cas9 to remove unwanted highabundance species in sequencing libraries and molecular counting applications Genome Biology 2016; 17, 41), o las enzimas guiadas por ADN Argonauta (Gao et al, DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute, Nature Biotechnology May 2016 publicación avanzada en línea). Estas enzimas guiadas por ADN/ARN digieren el ADN con gran preferencia cuando la sonda ("oligonucleótido guía") coincide completamente con el ADN diana, y menos cuando hay una falta de coincidencia. Mediante el empleo de sondas dirigidas tanto a la hebra superior como a la inferior de ADN de una manera solapante como se describe en la presente invención, NAME se puede aplicar con enzimas guiadas por ADN/ARN, de la misma manera que cuando se utilizan otras nucleasas DSN descritas aquí.
NaME aprovecha las propiedades de DSN para degradar secuencias específicas de las hebras de ADN tanto superior como inferior del ADN de tipo salvaje (WT) (Figura 1A). Por el contrario, el ADN que contiene la mutación no se degrada, o se degrada mucho menos que el ADN WT. Por lo tanto, una reacción de PCR posterior después de la digestión con DSN amplifica específicamente los alelos mutantes que permanecen sustancialmente intactos.
Un ejemplo de la aplicación de este enfoque se demuestra en la Figura 1B: un amplicón de PCR KRAS bc de 114 pb con una mutación del 5% se sometió al procedimiento de la Figura 1 A. El molde de ADN usado consistió en el amplicón PCR KRAS con una mutación del 5% (1:1000, 1:10.000 (aproximadamente 0,001 nM) y 1:100.000) y una sonda wtDAN-Taqman (500 nM), y con o sin cortador de KRAS (500 nM). A continuación, las muestras se incubaron con DSN (1U) o sin DSN. Para las muestras 1:1000 y 1:100.000, la mezcla se calentó a 67°C durante 10 minutos, y después a 94° durante 2 minutos. Para las muestras 1:10.000, la mezcla se calentó a una temperatura seleccionada (63°C, 67°C, 70°C, o 73°C) durante 10 minutos, y después se calentó a 94°C durante dos minutos. Al comparar la abundancia de mutaciones en reacciones paralelas sin DSN frente a reacciones con DSN, los datos en la Figura 1B y la Tabla 1 demuestran enriquecimientos de mutación de alrededor de 10 veces para temperaturas de 63-67°C.
Tabla 1: Abundancia de mutaciones de KRAS a diferentes temperaturas
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NaME aplicado directamente en ADN genómico
Las Figuras 5-7 muestran NaME aplicado directamente al ADN genómico para una única secuencia diana de KRAS, o una única secuencia de p53 (Figura 5), dos dianas simultáneamente, KRAS dúplex y p53 (Figura 6), y tres mutaciones de KRAS diferentes en una reacción de una sola diana (Figura 7A). En la Figura 5, el ADN genómico con aproximadamente una mutación KRAS del 0,5%, o una mutación p53 en una reacción separada, se desnaturalizó a 95°C, y se incubó a 65°C durante 20 minutos en presencia de sondas bloqueadas solapantes y DSN. El enriquecimiento de las mutaciones KRAS o p53 se detectó mediante una PCR digital posterior que cuantifica la abundancia de mutaciones. En la Figura 6, el ADN genómico se sometió al mismo protocolo que en la Figura 5, excepto que el ADN genómico mutado con KRAS y p53 se mezcló en un solo tubo. El ADN genómico de la línea celular SW480 que contenía mutaciones tanto en KRAS como en p53 se mezcló con ADN de tipo salvaje para crear mutaciones de baja abundancia en ambos genes. Se ensayaron dos porcentajes de mutación: aproximadamente el 5% y aproximadamente el 0,3%. En la Figura 7A, el a Dn genómico con 1-5% de mutaciones KRAS de tres líneas celulares diferentes, en reacciones separadas, se sometió al mismo protocolo descrito anteriormente. En la Figura 7B, el ADN se desnaturalizó, la temperatura se redujo hasta 67°C, se añadieron DSN y sondas solapantes para una incubación de 20 minutos. La DSN se inactivó, y se llevaron a cabo PCR y PCR digital en cada amplicón diana para obtener sus respectivas abundancias mutacionales. Todas las mutaciones se enriquecen simultáneamente a través de NaME. La Figura 7B muestra el enriquecimiento de mutaciones cuando se aplica NaME en 11 dianas simultáneamente, directamente del ADN genómico obtenido de Horizon Dx, que contiene mutaciones conocidas de bajo nivel en las respectivas dianas. Se demuestra que los 11 dianas se enriquecen simultáneamente después de la aplicación de NaME directamente al ADN genómico.
Detección de mutaciones usando NaME
Las Figuras 12B y 12C representan los resultados cuando se usa NaME para el enriquecimiento de mutaciones de una región de 40-80 pb en el exón 8 de TP53. Las 4 mutaciones analizadas se enriquecen mediante NaME. En la Figura 12B, el ADN que contenía la mutación de las líneas celulares PFSK o HCC se diluyó en serie en ADN WT, y entonces se aplicó una primera PCR para amplificar la diana de interés (tp53). El amplicón se desnaturalizó, y entonces se incubó a 65°C en presencia de sondas y DSN. Las dos sondas corresponden a las hebras superior e inferior de WT, respectivamente. La presencia de una mutación inhibe la digestión de DSN, por lo que el ADN mutado se amplifica durante las rondas de PCR. Los efectos de la longitud y la concentración de la sonda sobre el enriquecimiento de mutaciones también se representan en la Figura 12B. En la Figura 12C, el ADN que contenía la mutación de las líneas celulares PFSK, HCC, SW480 y MDAMB, todas las cuales tienen diferentes mutaciones en el exón 8 de p53, se diluyó en serie en ADN WT, y entonces se llevó a cabo el mismo protocolo como se describe en la Figura 12B. El número de veces del enriquecimiento de mutaciones se calculó realizando una PCR digital tanto antes como después de la aplicación de NaME.
Referencias
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar un ácido nucleico muíante diana para su posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, en el que el ácido nucleico mutante diana corresponde a la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje y difiere en al menos un nucleótido de la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje, comprendiendo el método
someter una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra sospechoso de contener una mutación, a una condición que desestabiliza pero no desnaturaliza completamente los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra;
poner en contacto los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra desestabilizados con un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaje, para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios, en el que al menos una de las sondas se solapa con la mutación sospechosa; y
exponer los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios y los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios a una nucleasa específica de la doble hebra (DSN),
en el que la DSN escinde preferentemente los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios con respecto a los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
2. Un método para preparar un ácido nucleico mutante diana para su posterior enriquecimiento con respecto a un ácido nucleico de tipo salvaje, en el que el ácido nucleico mutante diana corresponde a la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje y difiere de la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje en al menos un nucleótido, comprendiendo el método
exponer una muestra de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico de tipo salvaje de doble hebra y un ácido nucleico diana de doble hebra que se sospecha que contiene una mutación, a una nucleasa específica de la doble hebra (DSN) y a un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior de ácido nucleico de tipo salvaje, para crear una mezcla de reacción, en el que al menos una de las sondas se solapa con la mutación sospechosa; y
someter la mezcla de reacción a una condición que desestabiliza pero no desnaturaliza completamente los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana de doble hebra para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante diana, formando así dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios en las hebras superior e inferior, y dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios,
en el que la DSN escinde preferentemente los dúplex de tipo salvaje-sonda complementarios con respecto a los dúplex de mutante diana-sonda parcialmente complementarios.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la condición que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutantes de doble hebra para permitir la hibridación de las sondas con sus secuencias correspondientes en los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante comprende añadir un disolvente orgánico y/o un aumento de temperatura combinado con una DSN termoestable cuando los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante de doble hebra se desestabilizan por un aumento de la temperatura en presencia de DSN,
opcionalmente en el que el aumento de temperatura que desestabiliza los ácidos nucleicos de tipo salvaje y mutante de doble hebra es 10-20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) de los ácidos nucleicos, y preferentemente 652C-852C.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que las sondas están en un exceso molar de 100 a 1000 millones de veces en comparación con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana,
y opcionalmente en el que una de las sondas se solapa con una secuencia en la hebra superior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, mientras que la otra sonda se solapa con una secuencia en la hebra inferior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, y las dos sondas se solapan parcialmente entre sí, y/o
en el que cada sonda comprende un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un ácido xenonucleico (XNA), un ácido nucleico con cualquier base modificada conocida o un ARN.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el método se usa para preparar dos o más ácidos nucleicos mutantes diana diferentes para el posterior enriquecimiento con respecto a los ácidos nucleicos de tipo salvaje correspondientes, y el método comprende además uno o más pares adicionales de sondas dirigidas contra los diferentes ácidos nucleicos de tipo salvaje, en el que para cada ácido nucleico mutante diana y par de sondas, una de las sondas es complementaria a la hebra superior de la contraparte de tipo salvaje del ácido nucleico mutante diana, y la otra es complementaria a la hebra inferior de la contraparte de tipo salvaje del ácido nucleico mutante diana.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la muestra de ácido nucleico comprende ADN genómico o ADN circulante en orina, plasma u otros fluidos corporales, en el que el método comprende preferentemente además enriquecer en primer lugar los ácidos nucleicos para regiones de interés poniendo en contacto la muestra de ácido nucleico con oligonucleótidos cebo que se unen a diferentes ácidos nucleicos de interés en las hebras superior e inferior, lo que permite unir los oligonucleótidos cebo a los ácidos nucleicos de interés en las hebras superior e inferior, y aislar los oligonucleótidos cebo con los ácidos nucleicos de interés unidos a ellos de los ácidos nucleicos restantes, en el que los oligonucleótidos cebo están opcionalmente biotinilados en un extremo y/o están unidos a perlas.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además someter en primer lugar la muestra de ácido nucleico a una condición de amplificación,
y opcionalmente enriquecer el ácido nucleico mutante diana con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje sometiendo la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos a una condición de amplificación, enriqueciendo así el ácido nucleico mutante diana no escindido con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje escindido, en el que la condición de amplificación se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en: PCR, COLD-PCR, PCR mediada por ligación o COLD-PCR usando adaptadores ligados comunes, PCR multiplex, y amplificación isotérmica,
y opcionalmente en el que cada sonda se modifica en el extremo 3' para evitar la extensión por polimerasa.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además enriquecer el ácido nucleico mutante diana con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje sometiendo la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos a una condición adicional de degradación del ADN que hidroliza enzimáticamente los dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos por DSN, con la degradación iniciada en la posición de la escisión,
y opcionalmente analizar la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos usando uno o más de los métodos seleccionados del grupo que consiste en: MALDI-TOF, fusión con HR, didesoxi-secuenciación, secuenciación de molécula única, secuenciación masivamente paralela (MPS), pirosecuenciación, SSCP, Rf Lp , dHPLC, CCM, PCR digital y PCR cuantitativa.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en el que el método se usa para preparar un ácido nucleico diana no metilado de interés para el enriquecimiento posterior, y en el que la muestra de ácido nucleico se trata en primera lugar con bisulfito de sodio, y una de las sondas oligonucleotídicas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico metilado de interés, mientras que la otra sonda oligonucleotídica es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico metilado de interés, y en el que la sonda que se solapa con la mutación sospechosa es complementaria al ácido nucleico metilado de interés.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el método se usa para preparar un ácido nucleico diana metilado de interés para el enriquecimiento posterior, y en el que la muestra de ácido nucleico se trata en primera lugar con bisulfito de sodio, y una de las sondas oligonucleotídicas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico no metilado de interés convertido con bisulfito, mientras que la otra sonda oligonucleotídica es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico no metilado de interés convertido con bisulfito, y en el que la sonda que se solapa con la mutación sospechosa es complementaria al ácido nucleico no metilado de interés convertido con bisulfito.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el método se usa para preparar tanto un ácido nucleico diana no metilado de interés como un ácido nucleico diana metilado de interés para el enriquecimiento posterior, en el que la muestra de ácido nucleico se trata en primer lugar con bisulfito de sodio, y en el que se usan dos pares de sondas oligonucleotídicas, que comprende:
(i) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma metilada del ácido nucleico diana no metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma metilada del ácido nucleico diana no metilado de interés, y en el que la sonda que se solapa con la mutación sospechosa se une a la hebra que contiene el ácido nucleico no metilado,
(ii) un par de sondas oligonucleotídicas, una de las cuales es complementaria a la hebra superior de la forma no metilada convertida con bisulfito del ácido nucleico diana metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma no metilada convertida con bisulfito del ácido nucleico diana metilado de interés, y
en el que la sonda que se solapa con la mutación sospechosa se une a la hebra que contiene el ácido nucleico metilado.
12. El método de la reivindicación 11, en el que el método se usa para preparar múltiples ácidos nucleicos diana de interés, algunos de los cuales son ácidos nucleicos diana metilados de interés, y algunos de los cuales son ácidos nucleicos diana no metilados de interés, y en el que se usan múltiples pares de sondas oligonucleotídicas que comprenden:
(i) pares de sondas oligonucleotídicas, en los que una sonda es complementaria a la hebra superior de la forma metilada de cada ácido nucleico diana no metilado de interés, mientras que la otra sonda es complementaria a la hebra inferior de la forma metilada de cada ácido nucleico diana no metilado ácido de interés,
(ii) pares de sondas oligonucleotídicas, en las que una sonda es complementaria a la hebra superior de la forma no metilada convertida con bisulfito de cada ácido nucleico diana metilado de interés, mientras que la otra es complementaria a la hebra inferior de la forma no metilada convertida con bisulfito de cada ácido nucleico diana metilado de interés.
13. El método de la reivindicación 2, en el que la DSN es una DSN termoestable, en el que la temperatura de desestabilización está entre 65-852C, y en el que dicho sometimiento se repite durante dos o más ciclos.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13, en el que las sondas están en un exceso molar de 100 a 1000 millones de veces en comparación con los ácidos nucleicos de tipo salvaje y diana.
15. El método de la reivindicación 13 o 14, en el que una de las sondas se solapa con una secuencia en la hebra superior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, mientras que la otra sonda se solapa con una secuencia en la hebra inferior del ácido nucleico diana que contiene la mutación, y las dos sondas se solapan parcialmente entre sí.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el método comprende además enriquecer el ácido nucleico mutante diana con respecto al ácido nucleico de tipo salvaje sometiendo la mezcla de reacción con dúplex de tipo salvaje-sonda escindidos y ácidos nucleicos mutantes diana no escindidos a una condición de amplificación.
17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el método se usa para preparar dos o más ácidos nucleicos mutantes diana diferentes para el posterior enriquecimiento con respecto a los ácidos nucleicos de tipo salvaje correspondientes, y el método comprende además uno o más pares adicionales de sondas dirigidas contra los diferentes ácidos nucleicos de tipo salvaje, en el que para cada par de sondas, una de las sondas es complementaria a la hebra superior del ácido nucleico de tipo salvaje y la otra es complementaria a la hebra inferior del ácido nucleico de tipo salvaj
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