CN110564819A - 用于多重核酸鉴定的产品和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于检测多重靶核酸是否存在的产品和方法。某些方法包括扩增所述靶核酸或其部分；延伸与扩增子特异性杂交的寡核苷酸，其中所述延伸的寡核苷酸包括捕获剂；通过所述捕获剂将所述延伸的寡核苷酸捕获至固相；通过用竞争物的竞争释放所述延伸的寡核苷酸；检测所述延伸的寡核苷酸，并且从而通过所述延伸的寡核苷酸是否存在确定每种靶核酸是否存在。

Description

用于多重核酸鉴定的产品和方法
相关专利申请
本申请要求2011年5月19日提交的的美国临时专利申请61/488,082的权益，题为“多重核酸鉴定的产品和方法”，发明人为Christiane Honisch、Dirk Johannes Van DenBoom和Michael Mosko，代理人案卷编号为SEQ-6020-PV2，并且本专利申请涉及2009年10月27日提交的美国专利申请号13/126,684，题为“多重核酸鉴定的产品和方法”，发明人为Dirk Johannes Van Den Boom、Christiane Honisch、Andrew Timms和Smita Chitnis，代理人案卷编号为SEQ-6020-US，其为2009年10月27日提交的题为“多重核酸鉴定的产品和方法”的国际专利申请号PCT/US2009/062239的国家阶段申请，申请人和发明人为DirkJohannes Van Den Boom、Christiane Honisch、Andrew Timms和Smita Chitnis，代理人案卷编号为SEQ-6020-PC，该申请要求2008年10月30日提交的题为“多重核酸鉴定的产品和方法”的美国临时专利专利申请61/109,885的权益，发明人为Dirk Johannes Van Den Boom、Christiane Honisch、Andrew Timms和Smita Chitnis，代理人案卷编号为SEQ-6020-PV。上述专利申请的全部内容(包括所有文字、表格和附图)通过引用纳入本文。
领域
本技术部分涉及核酸鉴定过程，其中能够在一个过程中检测多种靶核酸。该技术也部分涉及核酸修饰的鉴定。
背景
特定核酸的检测是诊断医学和分子生物学研究的重要工具。目前，核酸测定在诸如以下方面起到重要的作用：鉴定感染性生物体如细菌和病毒，探查正常基因的表达和鉴定突变基因如癌基因，对组织移植之前的组织相容性进行分型、法医学上和为了探索不同物种的基因之间的同源性而对组织或血样进行配型。
概述
在一些实施方式中提供了测定组合物中多种靶核酸的存在与否的方法，所述方法包括：(a)通过在扩增条件下扩增靶核酸或其部分制备靶核酸的扩增子；(b)在杂交条件下将溶液中的扩增子与一组寡核苷酸接触，其中在所述组中的每个寡核苷酸包括当所述扩增子在所述溶液中存在时能够在杂交条件下与一个扩增子特异性杂交的杂交序列；(c)通过用一种或多种核苷酸延伸与所述扩增子杂交的寡核苷酸产生包括捕获剂的延伸的寡核苷酸，其中所述一种或多种核苷酸中的一种是终止核苷酸并且这些加至寡核苷酸的核苷酸中的一种或多种包括捕获剂；(d)在所述捕获剂与固相相互作用的条件下将延伸的寡核苷酸与固相接触；(e)通过竞争物的竞争释放已经与所述固相互相作用的延伸的寡核苷酸；以及(f)检测在(e)中释放的延伸的寡核苷酸；从而通过相应的延伸的寡核苷酸的存在与否确定每种靶核酸的存在与否。在特定实施方式中，(i)所述组中的一个寡核苷酸物质的质量不同于另一个寡核苷酸物质的质量；以及(ii)每个寡核苷酸物质特异性地对应于特定扩增子，从而特异性对应于特定的靶核酸。在一些实施方式中，(i)所述组中每个寡核苷酸包括位于杂交序列的5′端的质量可区分标签，(ii)所述组中一个寡核苷酸的质量可区分标签的质量与另一个寡核苷酸的质量可区分标签的质量不同；并且(iii)每个质量可区分标签特异性地对应于特定扩增子，从而特异性地对应于特定的靶核酸，通过质谱检测质量可区分标签的质量，并且通过相应的质量可区分标签的存在与否确定每种靶核酸的存在与否。在一些实施方式中，质量可区分标签的检测测定延伸的寡核苷酸。在一些特定的实施方式中，通过质谱检测在(e)中释放的延伸的寡核苷酸或者与释放的延伸的寡核苷酸关联或由其切割的质量可区分标签。
在一些实施方式中也提供了测定在组合物中多种靶核酸的存在与否的方法，所述方法包括：(a)通过在扩增条件下扩增靶核酸或其部分制备靶核酸的扩增子；(b)在杂交条件下将溶液中的扩增子与一组寡核苷酸接触，其中：(i)所述组中的每个寡核苷酸包括当所述扩增子存在于溶液中时能够在杂交条件下与一个扩增子特异性杂交的杂交序列，(ii)所述组中的每个寡核苷酸包括位于杂交序列5′端的质量区分标签，(iii)所述组中的一个寡核苷酸的质量区分标签的质量可检测地不同于另一个寡核苷酸的质量区分标签的质量；并且(iv)每个质量区分标签特异性地对应于特定扩增子，从而特异性地对应于特定靶核酸；(c)通过用一种或多种核苷酸延伸与扩增子杂交的寡核苷酸产生包括捕获剂的延伸的寡核苷酸，其中所述一种或多种核苷酸中的一种是终止核苷酸并且这些加至寡核苷酸的核苷酸中的一种或多种包括捕获剂；(d)在捕获剂与固相相互作用的条件下将延伸的寡核苷酸与固相接触；(e)通过竞争物的竞争释放已经与所述固相互相作用的延伸的寡核苷酸；以及(f)检测在(e)中释放的延伸的寡核苷酸；从而通过测定相应的质量可区分标签的存在与否确定每种靶核酸的存在与否。在某些实施方式中，通过质谱检测在(e)中释放的延伸的寡核苷酸，或者与释放的延伸的寡核苷酸关联或者由其切割的质量可区分标签。
在一些实施方式中，所述质量可区分标签不是从延伸的寡核苷酸中切割和释放，并且在某些实施方式中，所述质量可区分标签从延伸的寡核苷酸中切割和释放。在一些实施方式中，质量可区分标签是延伸的寡核苷酸。在某些实施方式中，可进行一次(c)中的延伸产生一个延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，(c)中的延伸可进行多次(例如，在扩增条件下)产生多拷贝的延伸的寡核苷酸。在某些实施方式中，用从未引入扩增子的任意核苷酸中去除末端磷酸的试剂处理含有扩增子(例如，在(a)中产生的扩增子)的溶液。有时通过将所述扩增子与磷酸酶接触去除末端磷酸，并且在某些实施方式中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶(例如虾碱性磷酸酶)。
在一些实施方式中也提供了确定在组合物中多种靶核酸存在与否的方法，所述方法包括(a)在杂交条件下将溶液中的靶核酸与一组寡核苷酸接触，其中(i)所述组中的每个寡核苷酸包括当所述靶核酸物质存在于溶液中时能够在杂交条件下与一个靶核酸物质特异性杂交的杂交序列；(b)通过在扩增条件下用一种或多种核苷酸延伸与扩增子杂交的寡核苷酸产生包括捕获剂的延伸的寡核苷酸，其中一种或多种核苷酸中的一种是终止核苷酸并且一种或多种被加至寡核苷酸的核苷酸包括捕获剂；(c)在捕获剂与固相相互作用的条件下将延伸的寡核苷酸与固相接触；(d)通过竞争物的竞争释放已经与所述固相互相作用的延伸的寡核苷酸；以及(e)检测在(d)中释放的延伸的寡核苷酸；从而通过相应的延伸的寡核苷酸的存在与否确定每种靶核酸的存在与否。在特定实施方式中，(i)所述组中一个寡核苷酸物质的质量不同于另一个寡核苷酸物质的质量；以及(ii)每个寡核苷酸物质特异性地对应于特定扩增子，从而特异性对应于特定的靶核酸。在一些实施方式中，(i)所述组中每个寡核苷酸包括位于杂交序列的5′端的质量可区分标签，(ii)所述组中一个寡核苷酸的质量可区分标签的质量与另一个寡核苷酸的质量可区分标签的质量不同；并且(iii)每个质量可区分标签特异性地对应于特定的靶核酸，通过质谱检测质量可区分标签的质量，并且通过相应的质量可区分标签的存在与否确定每种靶核酸的存在与否。在一些实施方式中，质量可区分标签的检测测定延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，质量可区分标签的检测测定延伸的寡核苷酸。在某些实施方式中，通过质谱检测在(d)中释放的延伸的寡核苷酸，或者与释放的延伸的寡核苷酸关联或由其切割的质量可区分标签。
能够在本文所述的多重检测分析中采用任意合适的扩增过程，并且有时在一些实施方式中采用以下过程，所述过程包括：(a)将靶核酸与一组第一多核苷酸接触，所述每个第一多核苷酸包括(1)与靶核酸杂交的第一互补序列和(2)位于互补序列5′端的第一标签；(b)通过延伸第一多核苷酸制备延伸的第一多核苷酸；(c)向延伸的第一多核苷酸的3′末端加入第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸包括第二标签；(d)将(c)的产物与引物接触并且延伸引物，其中所述引物与第一标签或第二标签杂交；以及(e)在扩增条件下用一组引物扩增(c)的产物，其中所述组中的一个引物与标签中的一个杂交而组中另一个引物与另一个标签的互补体杂交。在某些实施方式中，用一组引物实施线性扩增。在一些实施方式中，第二多核苷酸包括与靶核酸杂交的核苷酸序列。在一些实施方式中，第一标签的核苷酸序列和第二标签的核苷酸序列不同，在其他实施方式中，第一标签的核苷酸序列和第二标签的核苷酸序列相同或互补。在某些实施方式中，在(e)中产生的每个扩增产物中包括第一标签和第二标签。这样的扩增过程还能够包括(f)在杂交条件下，将溶液中的扩增子与一组寡核苷酸接触，其中组中每个寡核苷酸包括能够当所述扩增子存在于溶液中时在杂交条件下与一个扩增子特异性杂交的杂交序列；(g)通过一种或多种核苷酸延伸与扩增子杂交的寡核苷酸产生包括捕获剂的延伸的寡核苷酸，其中一种或多种核苷酸中的一种是终止核苷酸并且一种或多种被加至寡核苷酸的核苷酸包括捕获剂；(h)在捕获剂与固相相互作用的条件下将延伸的寡核苷酸与固相接触；(i)通过竞争物的竞争释放已经与所述固相互相作用的延伸的寡核苷酸；以及(j)检测在(i)中释放的延伸的寡核苷酸；从而通过相应的延伸的寡核苷酸的存在与否确定每种靶核酸的存在与否。在某些实施方式中，可进行一次(g)中的延伸产生一个延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，(g)中的延伸可进行多次(例如，在扩增条件下)产生多拷贝的经延伸的寡核苷酸。在特定实施方式中，(i)所述组中的一个寡核苷酸物质的质量与另一个寡核苷酸物质的质量不同；以及(ii)每个寡核苷酸物质特异性地对应于特定扩增子，从而特异性对应于特定的靶核酸。在一些实施方式中，(i)所述组中每个寡核苷酸包括位于杂交序列的5′的质量可区分标签，(ii)所述组中一个寡核苷酸的质量可区分标签的质量与组中另一个寡核苷酸的质量可区分标签的质量不同；并且(iii)每个质量可区分标签特异性地对应于特定的靶核酸，通过质谱检测质量可区分标签的质量，并且通过相应的质量可区分标签的存在与否确定每种靶核酸的存在与否。在一些实施方式中，质量可区分标签的检测测定延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，质量可区分标签的检测测定延伸的寡核苷酸。
在一些实施方式中，使用竞争物的竞争包括将所述固相与竞争物接触。在某些实施方式中，包括捕获剂的核苷酸是与核苷酸三磷酸(nucleotide triphosphate)偶联的捕获剂。在一些实施方式中，所述核苷酸三磷酸是双脱氧核苷酸三磷酸。
在某些实施方式中，所述捕获剂包括结合对的元件。在一些实施方式中，所述捕获剂包括生物素或生物素类似物，并且在某些实施方式中，所述固相包括亲和素或链霉亲和素。在一些实施方式中，所述捕获剂包括亲和素或链霉亲和素，并且在某些实施方式中，所述固相包括生物素。在一些实施方式中，在升高温度的条件下进行通过竞争物的竞争释放质量可区分标签。在某些实施方式中，升高温度的条件包括在约80摄氏度-约100摄氏度(例如，约80摄氏度(℃)、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃或100℃)下处理约1分钟-约10分钟(例如，约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟或约10分钟)。在一些实施方式中，升高温度的条件包括在约90摄氏度下处理约5分钟。在某些实施方式中，在一个容器中进行(c)(例如，通过一种或多种核苷酸延伸与扩增子杂交的寡核苷酸产生包括捕获剂的延伸的寡核苷酸，其中所述一种或多种核苷酸中的一种是终止核苷酸并且一种或多种被加至寡核苷酸的核苷酸包括所述捕获剂)并且所述方法还包括在(e)和(f)之间将释放的质量可区分标签转移至另一容器。
在一些实施方式中，用从未引入扩增子的任意核苷酸中去除末端磷酸的试剂处理含有(a)中产生的扩增子的溶液。在某些实施方式中，通过将所述溶液与磷酸酶接触去除所述末端磷酸。在一些实施方式中，所述磷酸酶是碱性磷酸酶，并且在某些实施方式中，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。
在一些实施方式中，在延伸的寡核苷酸中的末端核苷酸包括捕获剂。在某些实施方式中，在延伸的寡核苷酸中的一个或多个非末端核苷酸包括捕获剂。在一些实施方式中，所述杂交序列长约5-约200个核苷酸。在一些实施方式中，在每个寡核苷酸中的杂交序列长约5-约50个核苷酸。在某些实施方式中，在延伸的核苷酸中的末端核酸包括捕获剂，并且有时在延伸的寡核苷酸中的一个或多个非末端核苷酸包括捕获剂。在一些实施方式中，所述捕获剂包括生物素，或任选地亲和素或链霉亲和素，在这种情况下，所述固相分别包括亲和素或链霉亲和素，或生物素。
在某些实施方式中，部分通过质量区分所述可区分标签(例如，质量可区分标签中的可区分特征的质量)。在一些实施方式中，所述可区分标签由核苷酸组成，并且有时所述标签长约5个核苷酸-约50个核苷酸。在某些实施方式中，所述可区分标签是核苷酸复合体，其有时长约5-约35个核苷酸。在一些实施方式中，所述可区分标签是肽，其有时长约5-约100个氨基酸。在某些实施方式中的可区分标签是有机分子单元的多联体。在一些实施方式中，所述标签是三苯甲基分子多联体。
在某些实施方式中，所述固相选自平坦表面、硅芯片、珠、球体或前述的组合。固相有时是顺磁性的。在一些实施方式中，所述固相是顺磁性珠，并且在某些实施方式中，所述固相包括捕获剂。
在某些实施方式中，通过本文所述的方法检测约50种或更多靶核酸物质的存在与否。在一些实施方式中，检测约100或更多、150或更多、200或更多、250或更多、300或更多、325或更多、350或更多、375或更多、400或更多、425或更多、450或更多、475或更多或者500或更多的靶核酸。在一些实施方式中，通过本文所述的方法检测约2-500的靶核酸物质的存在与否或量(例如，约5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450种靶核酸物质)。在某些实施方式中所述靶核酸是基因组DNA(例如，人、微生物、病毒、真菌或植物基因组DNA；任意真核或原核核酸(RNA和DNA))。在一些实施方式中，所述寡核苷酸是RNA或DNA。
在一些实施方式中，所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。在某些实施方式中，所述质谱是电喷雾(ES)质谱。在一些实施方式中，检测约1-约50种或更多靶核酸的存在与否。在某些实施方式中，所述质量可区分标签由核苷酸组成。在一些实施方式中，质量可区分标签是核苷酸复合体。在某些实施方式中，所述核苷酸复合体长约5-150个核苷酸。在一些实施方式中，所述靶核酸是基因组DNA，并且在某些实施方式中，所述基因组DNA是人基因组DNA。
在一些实施方式中，检测包括当包括用竞争物的竞争的释放与不包括用竞争物的竞争的释放相比时增加的信噪比。在一些实施方式中，所述检测的信噪比大于在没有竞争物的竞争的释放之后检测的信噪比。在一些实施方式中，仅延伸突变体的信噪比大于延伸野生型和突变型等位基因的信噪比。在一些实施方式中，对于仅延伸突变型等位基因，检测突变型等位基因的灵敏度大于延伸野生型等位基因和突变型等位基因。在一些实施方式中，所述检测包括的信噪比大于不包括其中用竞争物的竞争释放的方法的信噪比。
在一些实施方式中，提供了检测组合物中多种遗传变异体的存在与否或量的方法，所述方法包括：(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中每种靶核酸物质包括第一变异体和第二变异体；(b)将所述扩增子与寡核苷酸物质杂交，其中每个寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的扩增子杂交，从而产生杂交的寡核苷酸物质；以及(c)在延伸条件下，将杂交的寡核苷酸物质与包括一种或多种终止核苷酸的衍生组合物接触；其中(i)所述一种或多种终止核苷酸中的至少一种包括捕获剂，并且(ii)与第一变异体杂交的杂交寡核苷酸物质通过终止核苷酸延伸并且与第二变异体杂交的杂交核苷酸物质没有通过终止核苷酸延伸，从而产生延伸的寡核苷酸物质；(d)所述延伸的寡核苷酸物质捕获至捕获了捕获剂的固相；(e)从固相上释放在(d)中结合到固相上的延伸的寡核苷酸物质；以及(f)通过质谱检测在(e)中从所述固相上释放的每个延伸寡核苷酸物质的质量；从而检测遗传变异体的存在与否或量。在一些实施方式中，没有检测第二变异体的延伸的寡核苷酸物质。在一些实施方式中，每个寡核苷酸物质包括位于杂交序列的5′端的质量可区分标签。在一些实施方式中，方法包括第一变异体和第二变异体，其中第一变异体是较低丰度变异体而第二变异体是较高丰度变异体。在一些实施方式中，所述遗传变异体是单核苷酸多态性(SNP)变异体，第一变异体是较低丰度的等位基因而第二变异体是较高丰度的等位基因。在一些实施方式中，一种或多种终止核苷酸由一种终止核苷酸组成。在一些实施方式中，一种或多种终止核苷酸由两种终止核苷酸组成。在一些实施方式中，一种或多种终止核苷酸由三种终止核苷酸组成。在一些实施方式中，一种或多种终止核苷酸独立地选自ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。在一些实施方式中，所述延伸组合物包括非终止核苷酸。在一些实施方式中，所述延伸组合物包括一种或多种延伸核苷酸，其中延伸核苷酸不含捕获剂。在一些实施方式中，释放延伸的核苷酸物质包括将固相与释放剂接触。在一些实施方式中，所述捕获剂包括生物素或生物素类似物，所述固相包括链霉亲和素并且所述释放剂包括游离的生物素或生物素类似物。在一些实施方式中，游离的生物素或生物素类似物是所述释放剂。在一些实施方式中，以约10-约100ug/ml的浓度加入游离的生物素或生物素类似物。在一些实施方式中，以约25ug/ml的浓度加入游离的生物素或生物素类似物。在一些实施方式中，对于固相，所述释放剂相比捕获剂具有较高的亲和力。在一些实施方式中，释放延伸的寡核苷酸物质包括加热至约30℃到约100℃。在一些实施方式中，释放延伸的寡核苷酸物质包括加热至约60℃到约100℃。在一些实施方式中，释放延伸的寡核苷酸物质包括加热至约89℃到约100℃。在一些实施方式中，释放延伸的寡核苷酸物质包括加热至约90℃。在一些实施方式中，在捕获衍生的寡核苷酸之后洗涤所述固相。在一些实施方式中，所述洗涤去除在质谱分析中产生干扰性加合物的盐。在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸不与树脂(例如离子交换树脂)接触。
在一些实施方式中，多种靶核酸物质是20种或更多的靶核酸物质。在一些实施方式中，多种靶核酸物质是200种或更多的靶核酸物质。在一些实施方式中，多种靶核酸物质是200-300种靶核酸物质。
在一些实施方式中，延伸条件包括循环20-300次。在一些实施方式中，延伸条件包括循环200-300次。
在一些实施方式中，包括多种遗传变异体的组合物包括合成模板。在一些实施方式中，包括多种遗传变异体的组合物包括合成模板并且测定组合物中第一变异体的量和/或百分比，其中所述合成模板包括与第一变异体和第二变异体不同的变异体并且与相同的寡核苷酸物质杂交。在一些实施方式中，多个扩增子包括合成模板并且测定组合物中第一变异体的量和/或百分比，其中所述合成模板包括与第一变异体和第二变异体不同的变异体并且与相同的寡核苷酸物质杂交。
在以下说明书、权利要求和附图中进一步描述某些实施方式。
附图简述
附图说明所述技术的某些非限制性实施方式并且不必按比例绘制。
图1显示使用具有通用PCR标签和连接第二常用标签的后续单链的基因特异性引物延伸，然后通过外切核酸酶清除和采用标签1和标签2扩增的感兴趣的基因的扩增(方法1)。
图2显示使用具有在模板上延伸然后在相同链上在下游连接基因特异性磷酸化寡核苷酸标签4的通用标签3的基因特异性生物素化引物的感兴趣的基因的扩增。后续采用标签3和标签4扩增这个产物(概念2)。
图3显示来自图1和图2的方法1和方法2过程的通用PCR产物，其能够使用PCR后反应鉴定(iPLEX Gold，塞昆纳姆股份有限公司(Sequenom))。
图4显示使用方法1的方案用于单核苷酸多态性(dbSNP#rs10063237)基因分型的MALDI-TOF MS谱。
图5A显示使用方法2的方案用于rs1015731基因分型的MALDI-TOF MS谱。
图5B显示使用方法2的方案用于12个目标(例如12重反应)的基因分型的MALDI-TOF MS谱。
图5C显示使用方法2的方案用于19重反应基因分型的MALDI-TOF MS谱。
图5D显示使用方法2的方案用于35重反应基因分型的MALDI-TOF MS谱。
图5E显示来自图5C(19重)和图5D(35重)的MALDI-TOF MS谱得到的基因分型。
图6显示使用含有等位基因特异性质量标签的等位基因特异性延伸引物的PCR扩增和PCR后引物延伸。
图7显示使用含有等位基因特异性质量标签作为读取的等位基因特异性延伸引物的PCR后引物延伸的35重基因分型的MALDI-TOF MS谱。
图8显示rs1000586和rs10131894的基因分型的MALDI-TOF MS谱。
图9显示相对于70重测试的寡核苷酸质量标签。所有的寡核苷酸被稀释至10pmol的最终总浓度并且在384孔芯片上点样。从Typer 3.4(塞昆纳姆)收集面积、峰高度和信噪比的值。
图10显示相对于通过核苷酸组合物的70重测试的寡核苷酸质量标签的峰面积。所有的寡核苷酸被稀释至10pmol的最终总浓度并且在384孔芯片上点样。从Typer 3.4(塞昆纳姆)收集面积值。
图11A显示相应于100重测试的寡核苷酸标签的MALDI-TOF MS谱(放大图)。图11B显示相应于100重测试的寡核苷酸标签的信噪比。所有的寡核苷酸被稀释至10、5、2.5或1pmol的最终总浓度并且在384孔芯片上点8个重复样品。从Typer 3.4(塞昆纳姆)收集信噪比的值。图11C显示在PCR扩增和使用含有等位基因特异性质量标签的等位基因特异性延伸引物的PCR后引物延伸之后的100重测试的MALDI-TOF MS谱(放大图)。
图12显示5重反应的延伸率。比较有或没有脱氧肌苷的延伸寡核苷酸以及标准ddNTP或含有生物素部分的核苷酸。在Typer 3.4(塞昆纳姆)中通过延伸的产物的面积除以峰的总面积(延伸的产物和未延伸的寡核苷酸)计算延伸率。所有的实验比较6个DNA。
图13显示两种DNA的7重反应和5重反应的延伸率。结果比较了由单个生物素化ddNTP延伸或由生物素化dNTP延伸并且由未修饰的ddNTP终止，以及加入到反应中的最终量为210或420pmol的生物素化dNTP或ddNTP。在Typer 3.4中通过延伸的产物的面积除以总面积(延伸的产物和未延伸的寡核苷酸)计算延伸率。所有的实验包括两个人类多态性研究中心(CEPH)DNA，NA07019和NA11036的两个重复样品。
图14显示在使用70重测试的延伸反应中iPLEX Gold酶的浓度的比较。除了使用的iPLEX Gold酶的量以外，所有的测试使用相同的方案。所有的实验包括4个重复的CEPHDNA，NA06991和NA07019。结果比较了来自Typer 3.4(塞昆纳姆)的延伸产物的信噪比。
图15显示在使用70重测试的延伸反应中iPLEX Gold缓冲液浓度的比较。除了使用的iPLEX Gold缓冲液的量以外，所有的测试使用相同的方案。所有的实验包括两种CEPHDNA，NA06991和NA07019的4个重复样品。结果比较了来自Typer 3.4(塞昆纳姆)的延伸产物的信噪比。
图16、17、18和19显示在使用70重测试的延伸反应中延伸寡核苷酸浓度的比较。除了使用的延伸寡核苷酸的量以外，所有的测试使用相同的方案。所有的实验包括两种CEPHDNA，NA06991和NA07019的4个重复样品。结果比较了来自Typer 3.4(塞昆纳姆)的延伸产物的信噪比。
图20和21显示在使用70重测试的延伸反应中生物素化的ddNTP浓度的比较。除了使用的生物素化ddNTP的量(表示每个生物素化核苷酸的最终量的值)以外，所有的测试使用相同的方案。所有的实验包括两种CEPH DNA，NA06991和NA07019的4个重复样品。结果比较了来自Typer 3.4(塞昆纳姆)的延伸产物的信噪比。
图22显示用于捕获延伸的产物的Solulink和Dynabeads MyOne C1磁性链霉亲和素珠的比较。在水或变化量的生物素化dNTP(总共10、100或500pmol)存在的情况下，10pmol总量的对应于测试rs1000586的两种可能等位基因的每个寡核苷酸被结合到磁性链霉亲和素珠上。然后用10U的内切核酸酶V从结合的核苷酸上切下质量标签。结果比较了来自Typer3.4(塞昆纳姆)的质量标签峰面积并且列示与10pmol的具有相似质量的寡核苷酸比较。
图23显示内切核酸酶V在不同位置切开含有脱氧肌苷核苷酸的延伸产物的能力的分析。除了脱氧肌苷距离寡核苷酸的3’末端10、15、20或25个碱基以外，所述寡核苷酸相同。在寡核苷酸结合到磁性链霉亲和素珠之后，收集上清，通过核酸清除试剂盒(恰根(Qiagen))清洁并且然后通过用内切核酸酶V处理切割(称为未结合的寡核苷酸)。洗涤所述珠，并且用内切核酸酶V切割，参见方案章节(称为捕获的/切割的)。结果比较了来自Typer3.4(塞昆纳姆)的峰面积，并且列示作为没有结合到磁性链霉亲和素珠上的由内切核酸酶V切割的寡核苷酸的百分比。
图24显示使用70重测试的磁性链霉亲和素珠和内切核酸酶V浓度的比较。除了磁性链霉亲和素珠和内切核酸酶V的量以外，所有的测试使用相同的条件进行。所有的实验包括CEPH DNA NA11036的四个重复样品。结果比较了来自Typer 3.4的信噪比。
图25和26显示使用70重测试的磁性链霉亲和素珠和内切核酸酶V浓度的比较。除了磁性链霉亲和素珠和内切核酸酶V的量以外，所有的测试使用相同的方案。所有的实验包括两个CEPH DNA，NA06991和NA07019的四个重复样品。结果比较了来自Typer 3.4的信噪比。
图27A-G显示用于从链霉亲和素涂覆的磁性或顺磁性珠释放生物素化的感兴趣的扩增产物的生物素竞争方法的示意图。在组图A中，感兴趣的区域是PCR扩增的片段(例如，使用单重或多重方法)和后续使用虾碱性磷酸盐的扩增产物的脱磷酸化(图中未显示)。组图B表示生物素化的双脱氧核苷酸在组图A中扩增产物中的感兴趣的残基上的单碱基延伸。组图C表示通过链霉亲和素涂覆的磁性珠捕获生物素化的延伸产物。组图D表示去除未使用的反应组分的洗涤步骤，之后是捕获步骤，以捕获生物素化的延伸产物结合的链霉亲和素涂覆的磁性珠。组图E表示通过游离生物素的竞争从链霉亲和素涂覆的磁性珠释放生物素化的延伸产物。组图F表示纯化的生物素化延伸产物，其还能够使用多种方法分析，包括基质辅助激光解吸飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)。为了在MALDI-TOF质谱中使用，例如，分离的延伸产物能够被分配到(塞昆纳姆)上。组图G表示来自如上述产生的生物素化延伸产物的MALDI-TOF MS分析的代表性质谱。实验详细内容和结果参见实施例12。
图28是单个碱基延伸产物的MALDI-TOF MS分析测量的各种等位基因变异体(例如多态性)的质量差异的代表性质谱，所述单个碱基延伸产物通过使用生物素化的双脱氧核苷酸终止子产生并且通过本文所述的生物素竞争从固相表面释放，如图27A-G中所示。实验详细内容和结果参见实施例12。
图29A-G表示显示生物素竞争释放步骤的机制的流程图。
图30A表示显示肌苷切割释放步骤的机制的流程图。除了延伸寡核苷酸具有通过肌苷残基分离的5’质量标签以外，步骤与通过洗涤步骤的生物素捕获方法是一样的。通过对于肌苷残基特异性的内切核酸酶V切割，从捕获的产物中切割质量标签。
图30B表示在MALDI上切割的质量标签的检测。质量代表遗传变异体。
图31显示生物素竞争与使用不同浓度的3’-生物素化寡核苷酸和不同捕获珠的肌苷切割的比较结果。
图32显示生物素竞争与使用Dynal C1珠的肌苷切割的比较结果。通过向下的箭头表示代表检测的捕获寡核苷酸和检测的定量寡核苷酸的质谱峰。图32A显示使用用于捕获的Dynal C1链霉亲和素珠和用于竞争的游离生物素的生物素竞争结果。测试的生物素化的寡核苷酸和参比寡核苷酸(例如定量寡核苷酸)的浓度是0.031uM。图32B显示使用用于捕获的Dynal C1链霉亲和素珠和用于释放的内切核酸酶V的肌苷切割释放的结果。测试的生物素化的寡核苷酸和参比寡核苷酸(例如定量寡核苷酸)的浓度是0.031uM。
图33显示使用竞争物模板的不同捕获珠的评估。
图34显示每种测试的珠类型使用非常低竞争物模板(约30个分子)的测试的质谱结果。通过向下的箭头表示代表检测的捕获寡核苷酸和检测的定量寡核苷酸的质谱峰。图34A显示使用Dynal C1珠的结果。图34B显示使用Solulink珠的结果。图34C显示使用DynalM270珠的结果。
图35显示使用不同延伸组合物的BRAF-2和BRAF-15突变的检测并且证明当将对应于野生型的ddNTP(例如，更高丰度的变异体)排除在延伸组合物之外时信噪比增加。
图36显示用1％稀有等位基因的竞争测试的结果。
图37显示能够通过EcoRI限制性消化切割以分割区域并且更充分反映基因组结构的模型质粒。
详细描述
本文所述的用于在组合物中确定多种靶核酸的存在与否的方法对于本领域普通技术人员(下文称为“普通技术人员”)而言具有多种用途。这些方法能够用于，例如：(a)快速确定样品中是否存在特定的靶序列(例如包括遗传变异的靶序列)；(b)实施混合物分析，例如鉴定混合物和/或其组成或确定靶序列在混合物(例如混合的群落、准种)中的频率；(c)检测样品中的序列变异(例如例如突变、单核苷酸多态性)；(d)实施单倍型测定；(e)实施微生物(例如病原体)分型；(f)检测样品中微生物靶序列的存在与否；(g)鉴定疾病标记物；(h)检测微卫星；(i)鉴定短串联重复；(j)鉴定一种或多种生物体；(k)检测等位基因变异；(l)确定等位基因频率；(m)确定甲基化模式；(n)实施表观遗传测定；(o)生物分子区域的再测序(re-sequence)；(p)在人类临床研究和医学(例如癌症标记物检测、序列变异检测、适于或不适于特定药物给药的序列特征的检测)中实施分析；(q)实施HLA分类；(r)实施法医分析；(s)实施疫苗质量控制分析；(t)监测治疗；(u)实施载体鉴定分析；(v)实施疫苗或生产菌株质量控制以及(w)测试菌株鉴定；(x)植物。这样的方法也能在例如多个领域中使用，包括但不限于，商业、教育、医学、农业、环境、疾病监测、军用国防和法医学领域。
靶核酸
本文使用的术语“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸，包括但不限于天然核酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、合成核酸、非天然核酸(例如肽核酸(PNA))、未修饰的核酸、修饰的核酸(例如甲基化DNA或RNA、标记的DNA或RNA、具有一个或多个修饰的核苷酸的DNA或RNA)。以“多核苷酸”提及核酸是指通过共价键连接的两个或多个核苷酸或核苷酸类似物。核酸可以是适于本文所述的方法使用的任意类型的核酸。在某些实施方式中，核酸可以是DNA(例如互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)、质粒和载体DNA等)、RNA(例如病毒RNA、信使RNA(mRNA)、短抑制性RNA(siRNA)、核糖体RNA(rRNA)、tRNA等)、和/或DNA或RNA类似物(例如，包含碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)。核酸可以是可用于进行本文所述方法的任何形式(例如线性、环状、超螺旋、单链、双链等)。在某些实施方式中，核酸可以是或可以来自，质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体、细胞、细胞核或细胞的胞质。在一些实施方式中，核酸来自单个染色体(例如核酸样品可来自二倍体生物样品的一个染色体)。在胎儿核酸的情况中，所述核酸可以来自父本等位基因、母本等位基因或母本和父本等位基因。
本文中参照靶核酸、扩增子、引物、序列标签、多核苷酸或寡核苷酸使用的术语“物质”是指在比对核苷酸序列时，具有与另一个核酸的核苷酸序列存在一个或多个核苷酸差异的核苷酸序列的一个核酸。因此，当比对两个物质的序列时，第一核酸物质和第二核酸物质不同是由于一个或多个核苷酸(例如，约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或超过100个核苷酸差异)。在某些实施方式中，核酸物质如靶核酸物质、扩增子物质或延伸的寡核苷酸物质的数量包括但不限于约2-约10000个核酸物质、约2-约1000个核酸物质、约2-约500个核酸物质或有时约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个核酸物质。
在一些实施方式中，寡核苷酸物质与核酸模板(例如扩增子)杂交从而形成双链核酸并且与所述模板杂交的寡核苷酸物质在此称为杂交的寡核苷酸物质。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸物质能够包括一个或多个不与所述模板杂交的核苷酸。例如，杂交的寡核苷酸物质能够包括一个或多个错配的核苷酸(例如，非互补核苷酸)并且有时核酸的5’和/或3’端区域不杂交。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸物质包括标签(例如，质量可区分标签、序列标签、发光标签或放射性标签)。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸物质包括捕获剂(例如生物素或任意结合对元件)。在一些实施方式中，杂交的寡核苷酸物质包括终止核苷酸。
本文使用的术语“核苷酸”是指天然和非天然核苷酸。核苷酸包括但不限于，天然存在的核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸；脱氧腺苷单磷酸、脱氧腺苷二磷酸和脱氧腺苷三磷酸；脱氧鸟苷单磷酸、脱氧鸟苷二磷酸和脱氧鸟苷三磷酸；脱氧胸苷单磷酸、脱氧胸苷二磷酸和脱氧胸苷三磷酸；脱氧胞苷单磷酸、脱氧胞苷二磷酸和脱氧胞苷三磷酸；脱氧尿苷单磷酸、脱氧尿苷二磷酸和脱氧尿苷三磷酸；以及脱氧肌苷单磷酸、脱氧肌苷二磷酸和脱氧肌苷三磷酸(本文分别称为dA、dG、dT、dC、dU和dI，或A、G、T、C、U和I)。核酸还包括但不限于修饰的核苷酸和核苷酸类似物。修饰的核苷酸和核苷酸类似物包括但不限于脱氮嘌呤核苷酸，例如7-脱氮-脱氧鸟苷(7-脱氮-dG)单磷酸、二磷酸和三磷酸以及7-脱氮-脱氧腺苷(7-脱氮-dA)单磷酸、二磷酸和三磷酸、氘-脱氧胸苷(氘-dT)单磷酸、二磷酸和三磷酸、甲基化核苷酸，例如，5-甲基脱氧胞苷三磷酸、13C/15N标记的核苷酸和脱氧肌苷单磷酸、二磷酸和三磷酸。能够使用多种官能团和连接位置的组合得到修饰的核苷酸、富含同位素的核苷酸、损耗的核苷酸、标签和标记的核苷酸以及核苷酸类似物。
本文中参考核酸使用的术语“组合物”是指包括一种或多种核酸的有形物体。组合物有时是从来源提取的样品，但也是来源处所有样品的组合物，并且有时是一种或多种核酸的来源。组合物能够包括核酸。在一些实施方式中，组合物能够包括基因组DNA。在一些实施方式中，组合物能够包括母本DNA、胎儿DNA或母本和胎儿DNA的混合物。在一些实施方式中，组合物能够包括基因组DNA的片段。在一些实施方式中，组合物能够包括来自病毒、细菌、酵母、真菌、哺乳动物的核酸或其混合物。
核酸样品可来自一种或多种来源。例如，样品可采自例如生物体、矿物或地质地点(例如土壤、岩石、矿藏、化石)或法医学地点(例如罪案现场、走私品或疑似走私品)。因此，来源可以是环境的，例如地质、农业、战区(combat theater)或土壤来源。来源也可以来自任何类型的生物体如任意植物、真菌、原生动物、原核生物、病毒或动物，包括但不限于：人、非人、哺乳动物、爬行动物、牛、猫、狗、山羊、猪(swine)、小猪(pig)、猴、猿、猩猩、公牛、母牛、熊、马、绵羊、家禽、小鼠、大鼠、鱼、海豚、鲸鱼和鲨鱼，或具有可检测核酸的任意动物或生物体。来源也可指生物体的不同部分，如内部、外部、活细胞或死细胞、组织、液体等。因此，样品可以是“生物样品”，该术语是指获自活体或曾经为活体的来源，例如动物如人或其它哺乳动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒的任何材料。来源可采用任何形式，包括但不限于，固体材料如组织、细胞、细胞团块、细胞提取物、或活检样品，或者生物液体如尿液、血液、唾液、羊水、感染或炎症区域的渗出液、或含有口腔细胞的漱口水、毛发、脑脊液和关节液，以及器官。样品还可以在与另一样品不同的时间点分离得到，其中各样品来自相同或不同来源。核酸可来自核酸库，例如cDNA或RNA库。核酸可以是样品中核酸分子的核酸纯化或分离和/或扩增的产物。本文所述提供用于测序分析的核酸可含有来自一个或来自两个或两个以上样品(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多样品)的核酸。
可通过各种方式处理核酸。例如，核酸可以在大小上减小(例如，剪切、核酸酶或限制性酶消化、去磷酸化、去甲基化)、大小上增加(例如，磷酸化、与甲基化特异性试剂反应、与可检测标签连接)、用核酸切割抑制剂处理等。
在某些实施方式中，可提供未处理的核酸用于进行本文所述的方法。在一些实施方式中，提供处理后的核酸用于进行本文所述的方法。例如，可从样品提取、分离、纯化或扩增核酸。如本文所用术语“分离”指将核酸从其原始环境中取出(例如，天然发生核酸的天然环境或外源表达核酸的宿主细胞)，因此核酸从其原始环境通过“人工”而被改变。与来源样品中的组分含量相比，分离的核酸一般带有较少的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质)。包含分离核酸的组合物可以是基本分离的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分)。本文所用术语“纯化”是指提供的核酸与其所衍生自的样品来源相比包含更少的核酸物质。包含核酸的组合物可以是基本纯化的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含其它核酸物质)。
在某些实施方式中，在提供用于本文所述的方法的核酸之前，可以通过产生核酸片段的方法处理核酸。在一些实施方式中，经过片段化或切割的核酸，可具有约5到约10000个碱基对、约100到约1,00个碱基对、约100到约500个碱基对、或约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个碱基对的标称平均长度。可通过本领域已知的任何合适方法产生片段，且核酸片段的平均、等比中数或标称长度可通过选择适当的片段生成方法而加以控制。在某些实施方式中，较短长度的核酸可用来分析含有很少序列变异和/或含有较大量的已知核苷酸序列信息的序列。在一些实施方式中，具有较长长度的核酸可用来分析含有更多序列变异和/或含有较少量的未知核苷酸序列信息的序列。
本文使用的术语“靶核酸”或“靶核酸物质”是指在样品中任意感兴趣的核酸物质。靶核酸包括但不限于(i)两种或更多种可能的等位基因之间的特定等位基因，和(ii)具有或不具有特定突变、核苷酸取代、序列变异、重复序列、标记物或区分序列的核酸。本文使用的术语“不同靶核酸”是指在一个或多个特征上不同的核酸物质。本文使用的术语“遗传变异”是指在一个或多个特征上不同的核酸物质。本文使用的术语“变异体”是指在一个或多个特征上不同的核酸物质。特征包括但不限于，一个或多个甲基基团或甲基化状态、一个或多个磷酸基团、一个或多个乙酰基基团和一个或多个核苷酸的一个和或多个缺失、添加或取代。一个或多个核苷酸的一个或多个缺失、添加或取代的示例包括但不限于特定突变的存在与否、核苷酸取代(例如，单核苷酸多态性(SNP))的存在与否、重复序列(例如，双核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重复)的存在与否、标记物(例如，微卫星)的存在与否和区分序列(例如，区分一种生物与另一种生物的序列(例如，区分一种病毒毒株与另一种病毒毒株的序列))的存在与否。可通过任意已知的方式区分不同的靶核酸，例如，通过质量、结合、可区分标签等，如本文所述。
本文使用的术语“多种靶核酸”或“多种靶核酸物质”是指超过一种靶核酸物质。在某些实施方式中，多种靶核酸能够是约2-约10000个核酸物质、约2-约1000个核酸物质、约2-约500个核酸物质或有时约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个核酸物质。核酸的检测或鉴定的结果是目标的检测并且能够指出特定突变、序列变异(突变或多态性)或遗传变异(例如序列变异、序列差异或多态性)的存在与否。在所述多种靶核酸之内，可能存在相同或不同靶核酸的检测。就鉴定而言，可以定量地，也可以定性地鉴定多种靶核酸。也参考以下的多重技术。
扩增和延伸
在某些实施方式中，能够扩增核酸(例如靶核酸)。本文使用的术语“扩增”及其语法变体是指产生模板核酸拷贝的过程。例如，核酸模板可能经过线性或指数性产生两个或更多个核酸扩增子(拷贝)的过程，所述扩增子具有与模板或所述模板的部分的核酸序列相同或基本相同的核酸序列。核酸扩增通常是特异性的(例如，具有相同或基本相同序列的扩增子)，并且在某些实施方式中能够是非特异性的(例如具有不同序列的扩增子)。在样品中的靶序列含量低时，核酸扩增有时是有益的。因为靶核酸检测测试开始时需要较少靶序列，通过扩增靶序列和检测合成的扩增子能改善测试灵敏度。在某些情况下，有时在与延伸寡核苷酸杂交之前不扩增靶核酸。
扩增条件是已知的并且能够根据要扩增的特定核酸进行选择。扩增条件包括某些试剂，其中一些能够包括但不限于核苷酸(例如，核苷酸三磷酸)、修饰的核苷酸、寡核苷酸(例如，用于基于聚合酶的扩增的引物寡核苷酸和用于基于连接酶的扩增的寡核苷酸结构模块)、一种或多种盐(例如，含镁的盐)、一种或多种缓冲液、一种或多种聚合剂(例如，连接酶、聚合酶)、一种或多种切口酶(例如，切割双链核酸的一条链的酶)以及一种或多种核酸酶(例如，外切核酸酶、内切核酸酶、RNA酶)。可以使用任意适于扩增的聚合酶，例如具有或没有外切核酸酶活性的聚合酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶、这些酶的突变体形式。能够使用任意适于结合一个寡核苷酸的5′端与另一个寡核苷酸的3′端的连接酶。扩增条件也能够包括某些反应条件，如等温或温度循环条件。在扩增方法中循环温度的方法是已知的，如通过热循环设备。术语“循环”是指其中使用温度循环的采用单个引物或多个引物的扩增(例如，扩增反应或延伸反应)。在一些实施方式中，扩增条件也能够包括乳化剂(例如，油)，所述乳化剂用于形成多个反应隔室，在所述隔室中能够扩增单个核酸分子物质。有时扩增是指数性产物产生过程并且有时扩增是线性产物产生过程。
能够扩增单链核酸目标的链，并且能够扩增双链核酸目标的一条或两条链。在一些实施方式中，扩增产物(扩增子)长约10-约10000个核苷酸、长约10-约1000个核苷酸、长约10-约500个核苷酸、长约10-约100个核苷酸，并且有时长约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。
根据用于扩增的特定核酸，能够选择任意合适的扩增技术和扩增条件。已知的扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、延伸和连接、连接扩增(或连接酶链反应(LCR))和基于Q-β复制酶或模板依赖性聚合酶的应用的扩增方法(参见美国专利公开号US20050287592)。同样有用的是链置换扩增(SDA)、嗜热SDA、基于核酸序列的扩增(3SR或NASBA)和转录相关扩增(TAA)。用于实施扩增方法的试剂、装置和硬件是市售可得的，并且扩增条件是已知的并且能够根据手头的靶核酸选择。
在某些实施方式中，能够通过使用通用引物实现基于聚合酶的扩增。在这样的方法中，将与一个或多个通用引物杂交的杂交区域引入模板核酸中。这样的杂交区域能够被引入到例如(i)与靶核酸杂交并且延伸的引物，和/或(ii)与靶核酸或(i)的产物相连的寡核苷酸中。使用通用引物的扩增方法能够提供例如仅使用一条或两条扩增引物扩增多种靶核酸的优点。
图1显示扩增方法的某些实施方式。在某些实施方式中，仅仅使用一条引物用于扩增(例如，图1A)。在某些实施方式中，使用两条引物。在扩增条件下，至少一条引物具有互补可区分标签。基因特异性延伸引物具有5’通用PCR标签1R(PCRTag1R)(例如，图1A)。可以在任意核酸上延伸，例如基因组DNA。DNA或PCR标签1R基因特异性延伸引物可以是生物素化的，以便于反应的清洁。然后通过单链连接酶将延伸的链与通用磷酸化寡核苷酸连接，其具有与标签2F反向互补的序列(通用PCR引物；图1B)。为了促进在下一步骤中清洁，所述的磷酸化的寡核苷酸能够在其3’末端包括外切核酸酶耐受性核苷酸。在外切核酸酶处理中，所有未连接的延伸的链被降解，而连接产物被保护并保留在反应物中(例如，图1C)。然后使用标签1R和标签2F引物实施通用PCR，以扩增多个目标(例如，图1D)。
图2也显示扩增方法的某些实施方式。在一些实施方式中，涉及引物延伸和连接的方法在相同的反应中进行(例如，图2A)。生物素化的PCR标签3R基因特异性引物是延伸引物。磷酸化的寡核苷酸具有基因特异性序列并且结合在DNA的同一条链上在距离引物延伸位点约40个(例如，4-100或更多)碱基的位置。因此，DNA聚合酶如Stoffel聚合酶延伸所述链直至其到达磷酸化的寡核苷酸。连接酶将所述磷酸化寡核苷酸的基因特异性序列与延伸的链连接。磷酸化寡核苷酸的3’末端具有PCR标签4(RC)F作为其通用标签。然后生物素化的延伸的链结合到链霉亲和素珠上。这个方法促进了反应的清洁(例如，图2B)。DNA，如基因组DNA，以及基因特异性磷酸化寡核苷酸被洗去。然后使用标签3R和标签4F作为引物实施通用PCR，以扩增不同的感兴趣基因(例如，图2C)。
在某些实施方式中，能够延伸某些核酸。本文使用的术语“延伸”及其语法变体是指核酸的一条链的延长。例如，在某些实施方式中，与靶核酸杂交的寡核苷酸或产生自靶核酸的扩增子能够被延伸。在延伸条件下进行延伸反应，并且大量这样的条件是已知的并且根据特定应用选择。延伸条件包括某些试剂，包括但不限于一种或多种寡核苷酸、延伸核苷酸(例如，核苷酸三磷酸(dNTP))、终止核苷酸(例如，一种或多种双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP))、一种或多种盐(例如，含镁的盐)、一种或多种缓冲液(例如，含有β-NAD、曲通X-100)以及一种或多种聚合剂(例如，DNA聚合酶、RNA聚合酶)。在某些实施方式中，能够在等温条件或非等温条件(例如，热循环条件)下进行延伸。能够在延伸反应中延伸一种或多种核酸物质，并且能够延伸每个核酸物质的一个或多个分子。能够通过一个或多个核苷酸延伸核酸，并且在一些实施方式中，延伸产物常长约10-约10000个核苷酸、长约10-约1000个核苷酸、长约10-约500个核苷酸、长10-约100个核苷酸，并且有时长约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。终止核苷酸(例如，ddNTP)的引入、杂交的位点或其他因素能够决定寡核苷酸延伸的长度。在某些实施方式中，在同一检测过程中进行扩增和延伸过程。
在一些实施方式中，延伸反应包括多个重复的温度循环以扩增在反应中延伸产物的量。在一些实施方式中，延伸反应循环2次或更多次。在一些实施方式中，延伸反应循环10次或更多次。在一些实施方式中，延伸反应循环约10、15、20、50、100、200、300、400、500或600或更多次。在一些实施方式中，延伸反应循环20-50次。在一些实施方式中，延伸反应循环20-100次。在一些实施方式中，延伸反应循环20-300次。在一些实施方式中，延伸反应循环200-300次。
在一些实施方式中，靶核酸(例如，靶核酸物质、寡核苷酸物质、杂交的核苷酸物质或扩增子)在延伸组合物存在的情况下被延伸，其中所述靶核酸由一个核苷酸延伸。延伸组合物能够包括一种或多种缓冲液、盐、酶(例如，聚合酶、Klenow等)、水、模板(例如，DNA、RNA、扩增子等)、引物(例如，寡核苷酸)、核苷酸三磷酸、大分子排阻分子和任意其他在本领域中使用的添加物。延伸组合物能够包括终止核苷酸(例如，双脱氧核苷酸(例如，ddNTP))、非终止或延伸核苷酸(例如，dNTP)或终止核苷酸和非终止核苷酸的混合物。基本由一种或多种特定终止核苷酸组成的延伸组合物能够含有任意其他延伸组合物的组分(例如，缓冲液、盐、模板、引物等)，但除了这些特定的终止核苷酸以外不含有任意其他终止核苷酸或核苷酸三磷酸(例如，dNTP)。例如，基本由ddTTP和ddCTP组成的延伸组合物不含ddATP、ddGTP或任意其他dNTP。在一些实施方式中，在延伸组合物中的核苷酸仅仅是终止核苷酸并且由一个核苷酸延伸靶核酸(例如，有时在所述延伸组合物中没有延伸核苷酸)。在一些实施方式中，延伸组合物基本由终止核苷酸(例如，ddNTP)组成。在一些实施方式中，终止核苷酸包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多)捕获剂。在一些实施方式中，终止核苷酸包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多)不同的捕获剂。在一些实施方式中，终止核苷酸包括(例如，共价结合的)一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多)捕获剂分子。在一些实施方式中，终止核苷酸包括一个捕获剂分子。在一些实施方式中，第一终止核苷酸包括捕获剂而第二终止核苷酸包括不同的捕获剂。在一些实施方式中，延伸组合物包括一种或多种终止核苷酸，其中每种终止核苷酸包括不同的捕获剂。在一些实施方式中，延伸组合物包括一种或多种终止核苷酸，其中每种终止核苷酸包括捕获剂并且所述捕获剂是相同的。在一些实施方式中，延伸组合物包括终止核苷酸和延伸核苷酸以及一种或多种包括捕获剂的核苷酸(例如，终止核苷酸和/或延伸核苷酸)。在一些实施方式中，终止核苷酸包括捕获剂并且所述捕获剂是生物素或生物素类似物。在一些实施方式中，所述延伸组合物基本由结合一种或多种捕获剂的终止核苷酸组成。在一些实施方式中，所述捕获剂是生物素或生物素类似物。生物素类似物能够是影响生物素与亲和素和链霉亲和素的结合性质的任意修饰的生物素(例如，9-甲基生物素、生物素甲酯(MEBio)、脱硫生物素(DEBio)、2′-亚氨基生物素(IMBio)、e-N-生物素基-L-赖氨酸、二氨基生物素(DABio)、包括所有在Lai-Qiang等.(Lai-Qiang Ying和Bruce P.Branchaud，Chemical Communications，2011，47，8593-8595)中描述的生物素类似物)。在一些实施方式中，所述捕获剂是亲和素、链霉亲和素或亲和素或链霉亲和素的修饰形式(例如，硝基亲和素、硝基链霉亲和素、中性链亲和素(NeutrAvidin)、凯普亲和素(CaptAvidin)及其衍生物)。
能够选择和使用任意合适的延伸反应。能够使用延伸反应，例如用于通过将脱氧核苷酸和/或双脱氧核苷酸引入到与在靶核酸中SNP位点相邻的区域杂交的延伸寡核苷酸来区分SNP等位基因。所述引物经常由聚合酶延伸。在一些实施方式中，所述寡核苷酸由仅仅一个与SNP位点互补的脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸延伸。在一些实施方式中，寡核苷酸通过掺入dNTP延伸并且由ddNTP终止，或在某些实施方式中寡核苷酸通过掺入ddNTP终止而没有dNTP延伸。在延伸反应中使用的一个或多个dNTP和/或ddNTP用允许固定于固相载体的部分标记，如在一些实施方式中的生物素。在一些实施方式中，使用未修饰的延伸寡核苷酸和未修饰的双脱氧核苷酸、未修饰的延伸寡核苷酸和生物素化双脱氧核苷酸、含有脱氧肌苷和未修饰的双脱氧核苷酸的延伸寡核苷酸、含有脱氧肌苷和生物素化的双脱氧核苷酸的延伸寡核苷酸、通过生物素化的双脱氧核苷酸的延伸、或通过生物素化的脱氧核苷酸和/或未修饰的双脱氧核苷酸的延伸进行延伸。
在一些实施方式中，寡核苷酸物质能够在杂交条件下与遗传变异或变异体相邻的模板(例如，靶核酸物质)杂交(例如，寡核苷酸物质的3’端可能位于遗传突变位点的5’端，并且可以是距离所述遗传变异位点的5’端0-10个核苷酸)。在靶核酸中的遗传变异的位点上可能存在几个变异体。遗传变异体是单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸变异体。在位于杂交的寡核苷酸3’端的模板目标上的单碱基位点上可能存在几个单核苷酸变异体。通过在位于杂交的寡核苷酸物质3’端的模板目标上位点的单碱基可能区分几个单核苷酸变异体。在一些实施方式中，通过一个在变异体位点的核苷酸延伸寡核苷酸物质。在一些实施方式中，取决于存在的变异体的数量，能通过五种终止核苷酸(例如，ddATP、ddUTP、ddTTP、ddGTP、ddCTP)中的任一种延伸所述寡核苷酸。靶核酸物质及其变异体，或相应的扩增子，能够作用为模板并且能够部分确定延伸反应中哪个终止核苷酸被加入到寡核苷酸上。靶核酸物质可能具有两个或更多变异体。在一些实施方式中，靶核酸物质包括两个变异体。在一些实施方式中，靶核酸物质包括三个变异体。在一些实施方式中，靶核酸物质包括四个变异体。在一些实施方式中，靶核酸物质不包括变异体。
在一些实施方式中，在不产生野生型(例如，高丰度物质)延伸产物的测试中存在的靶突变变异体的分子(例如，低丰度变异体)的量由包括在延伸反应中的合成模板的使用确定。在一些实施方式中，通过在延伸反应中包括已知量的合成模板定量靶突变变异体(例如，突变延伸产物)的量(例如，拷贝数、浓度、百分比)和/或靶突变变异体在样品中的百分比。在一些实施方式中，合成模板能够与寡核苷酸物质杂交并且含有刚好在位于待延伸寡核苷酸物质的3’端的突变位点上的碱基取代。在一些实施方式中，碱基取代与野生型或靶突变变异体(例如，第一变异体、低丰度变异体、SNP)不同。在一些实施方式中，在模板引入之前，在模板中存在的碱基取代并不存在于样品中。在一些实施方式中，与在合成模板中的碱基取代互补的ddNTP(例如，生物素-ddNTP)也被引入到反应中。在一些实施方式中，与靶突变变异体杂交的寡核苷酸物质也和与合成模板杂交的寡核苷酸物质共-扩增(例如，共-延伸)。在一些实施方式中，实施包括合成模板的连续稀释的多个反应以确定靶突变变异体的量和/或百分比。在一些实施方式中，通过产生与靶突变变异体等量的延伸产物的合成模板的量确定靶突变变异体的量和/或百分比。
在一些实施方式中，一个变异体能够比其他变异体有更大的丰度。在一些实施方式中，最大丰度的变异体称为野生型变异体。在一些实施方式中，靶核酸物质包括第一变异体和第二变异体，其中第二变异体代表较大的丰度(例如，存在较多的模板)。在一些实施方式中，靶核酸物质包括第一变异体、第二变异体和第三变异体，其中第二变异体代表相比第一变异体和第三变异体较大的丰度。在一些实施方式中，靶核酸物质包括第一变异体、第二变异体、第三变异体和第四变异体，其中第二变异体代表相比第一变异体、第三变异体和第四变异体较大的丰度。当与另一种变异体相比时，代表较大丰度的变异体通常以较高的浓度或较大数量的分子(例如，拷贝)存在。较高的浓度能够是2倍或更多。在一些实施方式中，较高的浓度是10倍或更多。在一些实施方式中，较高的浓度是100倍、1000倍或10000倍或更多。在一些实施方式中，第二变异体代表野生型序列并且以相比第一变异体100倍或更高的浓度存在。在一些实施方式中，第一变异体以相比第二变异体(例如，野生型)明显较低的浓度存在，其中所述第一变异体代表较少的靶核酸物质。在一些实施方式中，第一变异体代表少于30％、20％、15％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.8％、0.75％、0.5％、0.1％、.05％、.01％或更少的靶核酸物质。在一些实施方式中，第一变异体代表约5％-约0.75％的靶核酸物质。在一些实施方式中，第一变异体代表少于30％、20％、15％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.8％、0.75％、0.5％、0.1％、.05％、.01％或更少的组合物中的总核酸。
在一些实施方式中，在延伸组合物中存在的终止核苷酸(或在一些实施方式中不存在)决定了哪种核苷酸被加入到寡核苷酸中。在一些实施方式中，延伸组合物包括一个或多个终止核苷酸(例如，ddNTP)。在一些实施方式中，延伸组合物包括一个或多个终止核苷酸和一个或多个非终止核苷酸(例如，dNTP)。在一些实施方式中，延伸组合物仅包括对应于特定变异体(例如，第一变异体或较低丰度变异体)的终止核苷酸并且因此仅仅允许该特定变异体的延伸。在一些实施方式中，能够从延伸组合物中排除允许第二变异体(例如，野生型或较高丰度变异体)延伸的终止核苷酸，从而防止所述第二变异体的延伸。在一些实施方式中，延伸组合物仅包括相应于第一变异体和第三变异体的终止核苷酸，并且因此仅允许这些特定变异体的延伸。在一些实施方式中，延伸组合物仅包括相应于第一变异体、第三变异体和第四变异体的终止核苷酸，并且因此仅允许第一变异体、第三变异体和第四变异体的延伸。在一些实施方式中，延伸组合物基本上由相应于第一变异体的终止核苷酸组成。在一些实施方式中，方法包括在延伸条件下将杂交的寡核苷酸物质与包括一种或多种终止核苷酸的延伸组合物接触，其中(i)一种或多种终止核苷酸中的至少一种包括捕获剂，并且(ii)与所述第一变异体(例如，较低丰度变异体(例如，较低丰度SNP变异体))杂交的杂交寡核苷酸物质由终止核苷酸延伸并且与所述第二变异体(例如，野生型或更高丰度变异体)杂交的杂交寡核苷酸物质不由终止核苷酸延伸，从而产生延伸的寡核苷酸物质。在一些实施方式中，没有检测到第二变异体的延伸的寡核苷酸物质。
本文使用的术语“信噪比”是指当使用检测方法(例如，质谱)时，通过定量信号相对于噪音的强度的信号质量的定量测定。在一些实施方式中，在一个谱图上的密集峰具有比在另一个谱图上相同的分析物(例如，延伸的寡核苷酸物质)产生的低强度峰高的信噪比。在一些实施方式中，由衍生自丰富的变异体(例如，野生型等位基因、第二变异体、野生型变异体)的延伸的寡核苷酸物质产生噪音。在一些实施方式中，当使用质谱时，从衍生自低丰度变异体(例如，第一变异体、第三变异体、第四变异体、突变变异体、突变型等位基因、SNP)的延伸的寡核苷酸产生的信号被由高丰度延伸的寡核苷酸物质(例如，第二变异体、野生型变异体、野生型等位基因)产生的噪音遮蔽。在本文的词语“信噪比”中使用术语“信”是指延伸的寡核苷酸物质的信号峰的强度。在一些实施方式中，在本文“信噪比”中使用的术语“信”是指衍生自低丰度变异体(例如，第一变异体、突变变异体、突变型等位基因、SNP)的延伸的寡核苷酸物质的信号峰的强度。在一些实施方式中，从延伸组合物中排除使得第二变异体(例如，野生型或高丰度变异体)延伸的终止核苷酸，从而防止所述第二变异体的延伸并且增加低丰度变异体(例如，第一变异体、突变变异体、突变型等位基因、SNP)的信噪比。在一些实施方式中，方法包括在延伸条件下将杂交的寡核苷酸物质与包括一种或多种终止核苷酸的延伸组合物接触，其中(i)一种或多种终止核苷酸中的至少一种包括捕获剂，并且(ii)与所述第一变异体(例如，较低丰度变异体(例如，较低丰度SNP变异体))杂交的杂交寡核苷酸物质由终止核苷酸延伸并且与所述第二变异体(例如，野生型或更高丰度变异体)杂交的杂交寡核苷酸物质不由终止核苷酸延伸，从而产生延伸的寡核苷酸物质并且与第一变异体和第二变异体都被延伸的情况相比，增加信噪比。在一些实施方式中，(f)中的检测得到的信噪比大于在没有竞争物的竞争的释放之后检测的信噪比。在一些实施方式中，在(f)中的检测包括当包括竞争物的竞争的释放步骤(e)与不包括竞争物的竞争的释放步骤相比时，信噪比的增加。在一些实施方式中，仅延伸突变型等位基因的信噪比大于延伸野生型和突变型等位基因的信噪比。
本文使用的术语“灵敏度”是指当使用检测方法(例如，质谱)时，能够检测到给定信噪比的分析物的量。在一些实施方式中，能够通过减少背景噪音水平改善灵敏度。在一些实施方式中，由衍生自丰富的变异体(例如，野生型等位基因、第二变异体、野生型变异体)的延伸的寡核苷酸物质产生噪音。在一些实施方式中，当减少或消除从衍生自高丰度延伸的寡核苷酸物质(例如，第二变异体、野生型变异体、野生型等位基因)的延伸的寡核苷酸产生的信号时，灵敏度增加。在一些实施方式中，从延伸组合物中排除使得第二变异体(例如，野生型或高丰度变异体)延伸的终止核苷酸，从而防止所述第二变异体的延伸并且增加低丰度变异体(例如，第一变异体、突变变异体、突变型等位基因、SNP)的检测灵敏度。在一些实施方式中，方法包括在延伸条件下将杂交的寡核苷酸物质与包括一种或多种终止核苷酸的延伸组合物接触，其中(i)一种或多种终止核苷酸中的至少一种包括捕获剂，并且(ii)与所述第一变异体(例如，较低丰度变异体(例如，较低丰度SNP变异体))杂交的杂交寡核苷酸物质由终止核苷酸延伸并且与所述第二变异体(例如，野生型或更高丰度变异体)杂交的杂交寡核苷酸物质不由终止核苷酸延伸，从而产生延伸的寡核苷酸物质并且与第一变异体和第二变异体都被延伸的情况相比，增加所述第一变异体的检测灵敏度。在一些实施方式中，对于仅延伸突变型等位基因，在(f)中检测突变型等位基因的灵敏度大于延伸野生型等位基因和突变型等位基因。
可以将任意合适类型的核苷酸引入扩增产物或延伸产物中。在一些实施方式中，核苷酸可以是天然存在的核苷酸、终止核苷酸或非天然存在核苷酸(例如，核苷酸类似物或衍生物)。在一些实施方式中，某些核苷酸能够包括可检测的标记和/或结合对的元件(例如，结合对的另一个元件可与固相连接)。
扩增过程产生的含扩增子的溶液或延伸过程产生的含延伸产物的溶液可经进行进一步加工。例如，溶液可接触试剂，该试剂除去未掺入扩增子或延伸产物的游离核苷酸上的磷酸部分。这种试剂的一个示例是磷酸酶(如碱性磷酸酶)。扩增子和延伸产物也可与固相结合，可被清洗，可接触能去除末端磷酸的试剂(如暴露于磷酸酶)，可接触能去除末端核苷酸的试剂(如外切核酸酶)，可接触能切割的试剂(如内切核酸酶、核糖核酸酶)等。
本文使用的术语“寡核苷酸”是指两种或多种通过共价键连接的核苷酸或核苷酸类似物。寡核苷酸是任意合适长度的，并且在一些实施方式中，寡核苷酸长约5-约200个核苷酸、约5-约150个核苷酸、约5-约100个核苷酸、约5-约75个核苷酸或约5-约50个核苷酸，并且有时长约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175或200个核苷酸。寡核苷酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、天然存在和/或非天然存在的核苷酸或其组合及其任意化学或酶修饰(例如，甲基化DNA、修饰的核苷酸的DNA)。有时寡核苷酸的长度比扩增子或靶核酸短，但不必短于用于扩增的引物或聚核苷酸。寡核苷酸通常包括核苷酸序列或者与扩增子、靶核酸或其补体互补、或基本互补的杂交序列(例如，当比对时，与所述扩增子或靶核酸补体约95％、96％、97％、98％、99％或超过99％相同)。寡核苷酸可含有与扩增子、靶核酸或其补体不互补或基本不互补的核苷酸亚序列(例如，在与所述扩增子互补或基本互补的引物中的核苷酸亚序列的3’或5’端)。在某些实施方式中，寡核苷酸可含有可检测的分子(例如，标签、荧光团、放射性同位素、发色剂、颗粒、酶等)和/或在某些实施方式中的结合对的元件(例如，生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素)。
本文使用的术语“溶液中”是指液体，如含有例如一种或多种核酸的液体。溶液中的核酸和其他组分可完全分散，并且溶液通常包括水(例如，水性溶液)。溶液可含有任意合适数量的寡核苷酸物质，并且经常存在至少与存在的待检测的扩增子物质或靶核酸物质相同数量的寡核苷酸物质。
本文使用的术语“杂交序列”是指在寡核苷酸中能够与扩增子、靶核酸或其补体特异性杂交的核苷酸序列。易于设计和选择杂交序列并且该序列能够是适于与本文所述的溶液中的扩增子、靶序列或其补体杂交的长度。在一些实施方式中，在每个寡核苷酸中的杂交序列长约5-约200个核苷酸(例如，长约5-10、约10-15、约15-20、约20-25、约25-30、约30-35、约35-40、约40-45或约45-50、约50-70、约80-90、约90-110、约100-120、约110-130、约120-140、约130-150、约140-160、约150-170、约160-180、约170-190、约180-200个核苷酸)。
本文使用的术语“杂交条件”是指在该条件下两条具有互补核苷酸序列的核酸能够相互作用的条件。杂交条件能够是高严谨性、中等严谨性或低严谨性的，并且这些变化的严谨性程度的条件是已知的。根据感兴趣的应用，通常选择允许扩增和/或延伸的杂交条件。
本文使用的术语“与一种扩增子或靶核酸特异性杂交”是指基本与一种扩增子物质或靶核酸物质杂交而基本不与溶液中的其他扩增子物质或靶核酸物质杂交。特异性杂交排除了错配，使得例如可以设计寡核苷酸以与特定等位基因并且仅与该等位基因特异性杂交。与等位基因均匀匹配或互补的寡核苷酸会与该等位基因特异性杂交，而如果存在一个或多个碱基错配，那么不会发生杂交。
本文使用的术语“杂交位点”是指扩增子或靶核酸上的特定位点，另一个核酸与所述位点杂交。在某些实施方式中，寡核苷酸的末端与同另一种扩增子物质或靶核酸物质具有不同序列的扩增子物质或靶核酸物质上的位点相邻或基本相邻。当在位点与寡核苷酸末端之间没有核苷酸时，所述寡核苷酸的末端与所述位点“相邻”。在某些实施方式中，当位点与寡核苷酸的末端之间存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸时，所述寡核苷酸的末端与所述“基本相邻”。
捕获剂和固相
可采用一种或多种捕获剂用于本文所述的方法。存在几种不同类型的可用于本文所述的方法的捕获剂，包括但不限于，例如结合对的元件。结合对的示例包括但不限于(a)非共价结合对(例如，抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体片段、抗体/抗体受体、抗体/蛋白质A或蛋白质G、半抗原/抗半抗原、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸盐结合蛋白、受体/配体或其结合部分以及维生素B12/内源因子)；和(b)共价连接对(例如，巯基/马来酰亚胺、巯基/卤化乙酰基衍生物、胺/异三硫氰酸盐或酯(isotriocyanate)、胺/琥珀酰亚胺酯以及胺/磺酰卤化物)等。在一些实施方式中，结合对的一个元件与延伸的寡核苷酸或扩增产物关联，而另一个元件与固相关联。本文使用的术语“关联”是指至少两个单元之间的互相作用，例如其中所述两个单元互相结合或连接。
本文使用的术语“竞争物”是指与所述捕获剂竞争与所述固相关联(例如结合)的任意分子。竞争物的非限制性例子包括游离的捕获剂(例如，结合对的一种或另一种元件、游离的生物素、游离的亲和素/链霉亲和素)、捕获剂的竞争片段(例如，亲和素/链霉亲和素的竞争片段)、捕获剂的竞争多聚体(例如，生物素多聚体)、另一种竞争分子或其片段或其多聚体、与所述固相特异性竞争结合的分子、升高的盐条件、升高温度条件或其组合。在一些实施方式中，捕获剂的多聚体包括约2-约50之间个单体。在一些实施方式中，捕获剂的多聚体包括约2-约10之间个单体。在一些实施方式中，捕获剂的多聚体包括约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体。在一些实施方式中，包括捕获剂多聚体的捕获剂包括互相共价结合的单体。在一些实施方式中，包括捕获剂多聚体的捕获剂包括非互相共价结合的单体。本文使用的术语“游离的捕获剂”是指不与固相或延伸的寡核苷酸关联的捕获剂。在一些实施方式中，游离的捕获剂能够是生物素或其竞争部分或片段。在某些实施方式中，游离的捕获剂能够是亲和素、链霉亲和素或其竞争部分或片段。术语“竞争部分或片段”是指小于完全尺寸，但仍然保持完整捕获剂相对于与结合对的另一元件的相互作用(例如，仍然能够与亲和素或链霉亲和素结合的生物素片段或部分、仍然能够与生物素结合的亲和素或链霉亲和素的片段或部分)的功能的捕获剂(例如，捕获剂与所述固相载体之间相同、较少或较多的互相作用活性)。在一些实施方式中，游离的捕获剂的片段(例如，生物素的片段)是仍然保持完整捕获剂的功能的任意尺寸。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，生物素的片段)是仍然保持完整捕获剂的部分功能的任意尺寸。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，生物素的片段)是仍然保持完整捕获剂约30％-约100％的功能的尺寸。在一些实施方式中，游离的捕获剂(例如，生物素的片段)是仍然保持完整捕获剂约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的功能的尺寸。
在一些实施方式中，以约0.1-约5000ug/ml的浓度加入游离的捕获剂(例如，游离的生物素)。在一些实施方式中，以约0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、400、800、1000、2000、4000、5000ug/ml或更高的浓度加入游离的捕获剂(例如，游离的生物素)。在一些实施方式中，以约10-约100ug/ml的浓度加入游离的捕获剂(例如，游离的生物素)。在一些实施方式中，以约10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ug/ml的浓度加入游离的捕获剂(例如，游离的生物素)。在一些实施方式中，以约25ug/ml的浓度向包括延伸的寡核苷酸物质的组合物加入游离的捕获剂(例如，游离的生物素)。
如本文所用术语“固相载体”或“固相”指核酸能与之关联的不溶性材料。用于本文所述方法的固相载体的示例包括但不限于，阵列、珠(如顺磁珠、磁性珠、微米珠、纳米珠)和颗粒(如微米颗粒、纳米颗粒)。可使用标称平均直径为约1纳米-500微米的颗粒或珠，例如标称平均直径为约10纳米-100微米；约100纳米-100微米；约1-100微米；约10-50微米；约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800或900纳米；或约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500微米的那些颗粒或珠。本文使用的术语“顺磁性”是指通常仅在外部施加的磁场存在的情况下出现的磁性。因此，顺磁性珠能够被外部施加的磁场源吸引，但是通常在没有外部施加的磁场的情况下并不发挥其自身的磁场。包括铁核心的磁性珠通常发挥它们自身的磁场。
固相载体事实上可包含任何不溶性或固体材料，并通常选用不溶于水的固相载体组合物。例如，固相载体可包含硅胶、玻璃(如可控孔度玻璃(controlled-pore glass，CPG))、尼龙、纤维素、金属表面(如钢、金、银、铝、硅和铜)、磁性材料、塑料材料(如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF))等，或基本由这些材料组成。珠或颗粒可以是可溶胀的(例如，聚合物珠如王氏树脂)或不可溶胀的(如CPG)。珠的市售示例包括但不限于王氏树脂、梅氏树脂(Merrifield resin)和与SoluLink。固相(例如，珠)能够包括结合对的元件(例如，亲和素、链霉亲和素或其衍生物)。在一些实施方式中，固相基本是亲水的。在一些实施方式中，固相(例如，珠)基本是疏水的。在一些实施方式中，固相包括结合对的元件(例如，亲和素、链霉亲和素或其衍生物)并且是基本疏水的或基本亲水的。在一些实施方式中，固相包括结合对的元件(例如，亲和素、链霉亲和素或其衍生物)并且具有每mg固相载体超过约1350pmole游离的捕获剂(例如，游离的生物素)的结合能力。在一些实施方式中，包括结合对的元件的固相的结合能力为每mg固相载体超过800、900、1000、1100、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1800、2000pmole游离的捕获剂。
固相载体可以以固相载体集合的形式提供。固相载体集合包含两种或两种以上不同的固相载体物质。本文所用术语“固相载体物质”是指与一种特定的固相核酸物质或者不同固相核酸物质的特定组合相关联的固相载体。在某些实施方式中，固相载体集合包含2到10,000种固相载体物质、10到1,000种固相载体物质或者约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种独特的固相载体物质。固相载体集合中的固相载体(例如珠粒)可以是均一的(例如均为王氏树脂珠)或非均一的(例如一些为王氏树脂珠，一些为磁珠)。固相载体集合中的各固相载体物质有时标记有特定的识别标记。在某些实施方式中，用于特定固相载体物质的识别标记有时是具有独特序列的核酸(如“固相核酸”)。识别标记可以是可检测且与其它固相载体物质上的识别标记可区分的任何分子。
通常固相核酸是单链的并且是任意类型的适于杂交的核酸(例如，DNA、RNA、其类似物(例如，肽核酸(PNA))、其嵌合体(例如，单链包括RNA碱基和DNA碱基)等)。固相核酸与固相载体以任意本领域普通技术人员已知的方式关联并且适于固相核酸与核酸杂交。固相核酸可以通过共价连接键或非共价互相作用与固相载体关联。非共价互相作用的非限制性示例包括疏水性互相作用(例如，C18涂覆的固相与三苯甲基化核酸)、极性互相作用等。固相核酸可以通过普通技术人员已知的不同方法与固相载体关联，其包括但不限于(i)依次在固相上直接合成核酸，以及(ii)合成核酸，得到溶液相中的核酸并且将所述核酸连接到固相载体上。固相核酸可以在所述核酸中的多个位点与所述固相载体共价连接，例如在所述核酸的末端核苷酸或非末端核苷酸的(i)糖部分的1’、2’、3’、4’或5’部分或(ii)嘧啶或嘌呤碱基部分。在某些实施方式中，所述固相核酸的5’末端核苷酸与所述固相支撑物连接。
在延伸的寡核苷酸与固相关联之后(即捕获后)，通常洗去或降解未延伸的寡核苷酸和/或未结合的不需要的反应组分。在一些实施方式中，在捕获延伸的寡核苷酸物质之后洗涤固相。在一些实施方式中，在捕获延伸的寡核苷酸物质之后并且在释放延伸的寡核苷酸物质之前洗涤固相。在一些实施方式中，洗涤固相去除盐。在一些实施方式中，洗涤固相去除在质谱中产生干扰性加合物的盐。在一些实施方式中，洗涤固相去除干扰质谱的盐。在一些实施方式中，在洗涤所述固相之后，将延伸的寡核苷酸物质与阴离子交换树脂接触。在一些实施方式中，在洗涤所述固相之后，延伸的寡核苷酸物质不与阴离子交换树脂接触。在一些实施方式中，在固相上捕获延伸的寡核苷酸物质，洗涤一次或多次，从所述固相释放并且不与阴离子交换树脂接触。在检测之前可以通过一种或多种过程处理延伸的寡核苷酸。例如，可以在检测之前调整延伸的寡核苷酸(例如，通过离子交换匀化与捕获的核酸关联的阳离子和/或阴离子的类型)。在某些实施方式中，可以在检测之前从固相释放延伸的寡核苷酸。
在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸(例如，延伸的寡核苷酸物质)与包括结合对的一个元件(例如，生物素或亲和素/链霉亲和素)的捕获剂关联。在某些实施方式中，通过将结合对元件与包括结合对的另一个元件(例如，亲和素/链霉亲和素或生物素)的固相接触来捕获包括捕获剂的延伸的寡核苷酸。在某些实施方式中，延伸的寡核苷酸被生物素化，并且通过将生物素部分与亲和素或链霉亲和素涂覆的固相接触来捕获带有延伸的寡核苷酸产物的所述生物素部分。在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸包括质量可区分标签，并且在某些实施方式中，检测所述质量可区分标签包括检测延伸的寡核苷酸的存在与否。在一些实施方式中，通过一个、两个、三个或更多核苷酸来延伸延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，通过竞争物的竞争来从固相中释放与所述固相结合的延伸的寡核苷酸并且检测所述延伸的寡核苷酸。在一些实施方式中，通过竞争物的竞争来从固相中释放与所述固相结合的延伸的寡核苷酸并且检测在所述延伸的寡核苷酸中或与所述延伸的寡核苷酸关联的可检测标记。在一些实施方式中，通过竞争物的竞争来从固相中释放与所述固相结合的延伸的寡核苷酸，从所述的延伸的寡核苷酸释放的可区分标记，并且检测所述释放的可检测标记。
可区分标记和释放
本文使用的术语“可区分标记”和“可区分标签”是指能够互相区分并且被用于鉴定所述标签连接的核酸的标记或标签的类型。可以选择多种类型的标记和标签并且用于本文提供的多重方法。例如，可以使用寡核苷酸、氨基酸、小型有机分子、光发射分子、光吸收分子、光散射分子、发光分子、同位素、酶等作为可区分标记或标签。在某些实施方式中，也能够使用寡核苷酸、氨基酸和/或各种长度、各种荷质比、各种电泳迁移率(毛细管电泳迁移率)和/或各种质量的小分子有机分子作为可区分标记或标签。因此，可以使用荧光团、放射性同位素、发色剂、发光剂、化学发光剂、光散射剂等作为标记。标记的选择取决于所需灵敏度、与核酸偶联的难易、稳定性要求以及可用的设备。本文使用的相对于可区分标记和标签的“可区分特征”是指能够与另一种标记或标签区分的一种标记或标签的任意特征(例如，质量或本文所述的其他)。在一些实施方式中，能够选择或设计所述可区分标记和标签的标记组成以得到质谱中的最优飞行表现并且允许在高的多重水平上区分标记和标签。
对于本文使用的方法，特定靶核酸物质、扩增子物质和/或延伸的寡核苷酸物质经常与可区分可检测标记物质配对，使得特定标记或标签物质的检测直接鉴定了在特定组合物中特定靶核酸物质、扩增子物质和/或延伸的寡核苷酸物质的存在。因此，例如，能够使用标记物质的一种可区分的特征，以鉴定组合物中的一个靶核酸物质，因为特定可区分特征对应于特定靶核酸。标记和标签可以通过任意已知的方法并且在任意位置(例如，寡核苷酸的5′端)与核酸(例如，寡核苷酸)连接。因此，如本文所述，提及每个特定的标记物质“特异性对应”于每个特定的靶核酸，是指一种标记物质与一种靶物质配对。在某些实施方式中，当检测到标记物质的存在时，从而检测到与标记物质相关的靶核酸物质的存在。
本文使用的对应于可区分标签或标记(统称“标记”)的“物质”是指相对于另一种标记可检测可区分的一种标记。在某些实施方式中，标记物质的数量包括但不限于约2-约10000个标记物质、约2-约500000个标记物质、约2-约100000个标记物质、约2-约50000个标记物质、约2-约10000个标记物质和约2-约500个标记物质，或有时约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000个标记物质。
本文使用的术语“质量可区分标记”是指通过作为特征的质量区分的标记。能够选择和使用多种质量可区分标记，例如复合体、氨基酸和/或多联体。能够通过质量区分核苷酸串(nucleotide string)(例如，核酸；复合体)、氨基酸串(例如，肽；多肽；复合体)和/或多联体的不同长度和/或组成，并用作标记。在质量可区分标记中能够采用任意数量的单元，并且这样的单元的上限和下限部分取决于质量窗和用于检测和区分这样的标记的系统的分辨率。因此，能够部分基于用于检测和区分标记的质量窗和检测器的分辨率选择质量可区分标记的长度和组成。
本文使用的术语“复合体”是指一组单体单元的组成而不是所述单体单元的特定序列。对于核酸，术语“复合物”是指具有单体单元作为碱基的核酸的碱基组成。每种类型的碱基的数量能够表示为Bn(例如：AaCcGgTt，其中A0C0G0T0表示“空”复合物或不含碱基的复合物)。天然复合物是所有的组分单体单元(例如，多肽的核酸和氨基酸的碱基)都大于或等于0的复合体。在某些实施方式中，a、c、g或t中至少一个等于1或更高(例如，A0C0G1T0、A1C0G1T0、A2C1G1T2、A3C2G1T5)。为了比较序列以确定序列变异的目的，在本文提供的方法中，能够通过处理数据采用的算法产生含有负数数量的单体单元的“非天然”复合体。对于多肽，复合体是多肽片段的氨基酸组合物，其中每种氨基酸类型的数量具有相似表示。复合体物质能够对应于多种序列。例如，复合体A2G3对应于序列AGGAG、GGGAA、AAGGG、GGAGA和其他。通常，独特的复合体对应于序列，但是超过一条序列可以对应于相同的复合体。在某些实施方式中，一种复合体物质与一种靶核酸物质、扩增子物质和/或寡核苷酸物质配对(对应)。在本文的一些实施方式中，不同的复合体物质具有不同的碱基组成以及可区分的质量(例如，A0C0G5T0和A0C5G0T0是不同并且质量可区分的复合体物质)。在一些实施方式中，一组复合体物质通过碱基组成区分并且具有相同的长度。在某些实施方式中，一组复合体物质通过碱基组成和长度区分。
用作质量可区分标记的核苷酸复合体能够是任意长度的，因此所有的复合体物质能够是可检测区分的，例如长约1-15、5-20、1-30、5-35、10-30、15-30、20-35、25-35、30-40、35-45、40-50或25-50，或有时约55、60、65、70、75、80、85、90、85或100个核苷酸。用作质量可区分标记的肽或多肽能够是任意长度的，因此所有的复合体物质能够可检测区分，例如长约1-20、10-30、20-40、30-50、40-60、50-70、60-80、70-90或80-100个氨基酸。如上述，在复合体中单元数量的限制经常是受到用于区分所述复合体物质的质量窗和检测方法的分辨率的限制。
本文使用的术语“多联体”和“多联物”可互换使用(统称“多联体”)，并且是指含有两个或更多个互相连接的单元的分子(例如，通常串联；在某些实施方式中有时是分支连接的)。在一些实施方式中，多联体有时是核酸和/或人工多聚物。在一些实施方式中，多联体能够包括相同类型的单元(例如，均多联体(homoconcatemer))，并且有时多联体能够含有不同类型的单元(例如，杂多联体(heteroconcatemer))。多联体能够含有任意类型的单元，包括核苷酸单元、氨基酸单元、小有机分子单元(例如，三苯甲基)、特定核苷酸序列单元、特定氨基酸序列单元等。在一个实施方式中，三个特定序列单元ABC的均多联体是ABCABCABC。只要每个多联体物质能够与其他物质可检测区分，多联体能够含有任意数量的单元。例如，在一些实施方式中，三苯甲基多联体物质能够含有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000个三苯甲基单元。
在某些实施方式中，能够从核酸产物(例如，延伸的寡核苷酸)中释放可区分标记。所述可区分标记和核酸之间的连接键能够是能被转录和切割，被切割并且允许检测释放的一种或多种标记(例如，Ehrich等题为“目标特异性复合体以及使用方法”的美国专利申请公开号US20050287533A1)的任意类型。这样的连接键和切割所述连接键的方法(“切割条件”)是已知的。在某些实施方式中，标记能够从其相连的分子的其他部分中分离。在一些实施方式中，从核酸的较大串(例如，延伸的寡核苷酸)中切割标记(例如，复合体)。连接键的非限制性示例包括能够由核酸酶(例如，核糖核酸酶、内切核酸酶)切割的连接键；能够由化学物切割的连接键；能够由物理处理切割的连接键；以及能够由光切割的光可切割接头(例如，邻硝基苄基、6-硝基藜芦氧羰基(nitroveratryloxycarbonyl)、2-硝基苄基基团)。当使用发射光的检测系统(例如，包括光的激光发射的基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱)时，光可切割接头提供了优势，即切割和检测能够合并并且发生在单个步骤中。
在某些实施方式中，标记能够是较大单元的部分，并且在检测之前能够从那个单元中分离。例如，在某些实施方式中，标记是在较大核苷酸序列中的一组毗连的核苷酸，并且从所述较大核苷酸序列中切割所述标记。在这些实施方式中，所述标记通常位于其所在的核苷酸序列或核酸的一个末端。在一些实施方式中，所述标记或其前体位于转录盒中，所述转录盒包括与编码所述标记的前体序列可操作地连接的启动子序列。在后面的实施方式中，所述启动子有时是产生包括或组成所述标记的RNA的RNA聚合酶募集启动子。在检测之前，包括标记的RNA能够被切割(例如，用RNA酶)以释放所述标记。
在某些实施方式中，不从延伸的寡核苷酸中切割可区分的标记或标签，并且在一些实施方式中，可区分的标记或标签包括捕获剂。在某些实施方式中，检测可区分特征包括检测延伸的寡核苷酸的存在与否，并且在一些实施方式中，延伸的寡核苷酸包括捕获剂。在一些实施方式中，通过竞争物的竞争从固相上释放延伸的寡核苷酸，并且在某些实施方式中，用竞争物的竞争包括将固相与竞争物接触。在一些实施方式中，在升高的温度条件下进行从固相释放延伸的寡核苷酸。在某些实施方式中，升高的温度条件在约80摄氏度和约100摄氏度之间。在一些实施方式中，从捕获剂释放所述延伸的寡核苷酸在升高的温度条件下维持约1分钟-约10分钟时发生。在某些实施方式中，从固相上释放延伸的寡核苷酸包括在约90摄氏度下用竞争物(例如，捕获剂、游离的捕获剂的竞争片段、游离的捕获剂的多聚体、特异性竞争结合所述固相的任意分子等及其组合)处理约5分钟。在一些实施方式中，竞争物是生物素并且固相包括亲和素/链霉亲和素，而在某些实施方式中，竞争物是亲和素/链霉亲和素并且固相包括生物素。
在某些实施方式中，多重分析包括一些延伸的寡核苷酸以及一些在延伸之后未延伸的寡核苷酸。在这些实施方式中，未延伸的寡核苷酸通常不与固相结合，并且在一些实施方式中，未延伸的寡核苷酸能够与固相互相作用。
在一些实施方式中，竞争物与连接到核苷酸或核酸的捕获剂(例如，延伸的寡核苷酸和结合的捕获剂(例如，生物素))的比例能够是1∶1。在某些实施方式中，可使用超过与寡核苷酸关联的捕获剂的竞争物，并且在一些实施方式中，与寡核苷酸关联的捕获剂可以超过竞争物。在这些实施方式中，过量有时是约5倍过量-约50000倍过量(例如，约10倍过量、约100倍过量、约1000倍过量或约10000倍过量)。
检测和多重化程度
本文使用的术语标记的“检测”是指标记物质的鉴定。能够使用任意合适的检测设备以区分样品中的标记物质。适于检测质量可区分标记的检测设备包括但不限于某些质谱和凝胶电泳设备。质谱形式的例子包括但不限于：基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)、MALDI正交TOF质谱(OTOF MS；二维)、激光解吸质谱(LDMS)、电喷雾(ES)质谱、离子回旋共振(ICR)质谱和傅立叶变换质谱。文中所述的方法容易应用于其中分析物被气化和离子化的质谱形式(“电离质谱”，例如MALDI-TOF MS、LDMS、ESMS、线性TOF、OTOF)。正交离子提取(ion extraction)MALDI-TOF和轴向MALDI-TOF能够产生相对高的分辨率，并且因此，相对高水平的多重化。适于检测光发射、光吸收和/或光散射标记的检测设备包括但不限于某些光检测器和光电检测器(例如，检测荧光、化学发光、吸收和/或光散射标记)。
本文提供的方法使得能够在多种靶核酸中高通量检测或发现靶核酸物质。多重化是指同时检测超过一种靶核酸物质。与质谱联合进行多重反应的常规方法是已知的(参见美国专利号6,043,031、5,547,835与国际PCT申请号WO 97/37041)。相较各单独的靶核酸物质必须在不同质谱分析中进行，多重化提供的优势能在少至单个质谱中鉴定多种靶核酸物质(例如，一些具有不同的序列变异)。在一些实施方式中，本文提供的方法能用于快速且准确分析序列变化的高通量、高度自动化过程。在一些实施方式中，本文的方法可在单一反应中以高水平多重化。当位于基因座的基因型未知时多重化是适用的，并且在一些实施方式中，位于基因座的基因型是已知的。
在某些实施方式中，多重核酸物质的数量包括但不限于约2-1000个物质，有时约1-3、3-5、5-7、7-9、9-11、11-13、13-15、15-17、17-19、19-21、21-23、23-25、25-27、27-29、29-31、31-33、33-35、35-37、37-39、39-41、41-43、43-45、45-47、47-49、49-51、51-53、53-55、55-57、57-59、59-61、61-63、63-65、65-67、67-69、69-71、71-73、73-75、75-77、77-79、79-81、81-83、83-85、85-87、87-89、89-91、91-93、93-95、95-97、97-101、101-103、103-105、105-107、107-109、109-111、111-113、113-115、115-117、117-119、121-123、123-125、125-127、127-129、129-131、131-133、133-135、135-137、137-139、139-141、141-143、143-145、145-147、147-149、149-151、151-153、153-155、155-157、157-159、159-161、161-163、163-165、165-167、167-169、169-171、171-173、173-175、175-177、177-179、179-181、181-183、183-185、185-187、187-189、189-191、191-193、193-195、195-197、197-199、199-201、201-203、203-205、205-207、207-209、209-211、211-213、213-215、215-217、217-219、219-221、221-223、223-225、225-227、227-229、229-231、231-233、233-235、235-237、237-239、239-241、241-243、243-245、245-247、247-249、249-251、251-253、253-255、255-257、257-259、259-261、261-263、263-265、265-267、267-269、269-271、271-273、273-275、275-277、277-279、279-281、281-283、283-285、285-287、287-289、289-291、291-293、293-295、295-297、297-299、299-301、301-303、303-305、305-307、307-309、309-311、311-313、313-315、315-317、317-319、319-321、321-323、323-325、325-327、327-329、329-331、331-333、333-335、335-337、337-339、339-341、341-343、343-345、345-347、347-349、349-351、351-353、353-355、355-357、357-359、359-361、361-363、363-365、365-367、367-369、369-371、371-373、373-375、375-377、377-379、379-381、381-383、383-385、385-387、387-389、389-391、391-393、393-395、395-397、397-401、401-403、403-405、405-407、407-409、409-411、411-413、413-415、415-417、417-419、419-421、421-423、423-425、425-427、427-429、429-431、431-433、433-435、435-437、437-439、439-441、441-443、443-445、445-447、447-449、449-451、451-453、453-455、455-457、457-459、459-461、461-463、463-465、465-467、467-469、469-471、471-473、473-475、475-477、477-479、479-481、481-483、483-485、485-487、487-489、489-491、491-493、493-495、495-497、497-501个物质或更多。
用多重分析获得解析质谱的设计方法可包括引物和寡核苷酸设计方法和反应设计方法。就多重分析中的引物与寡核苷酸设计而言，单重反应采用相同的引物设计总体方针，例如避免假引发和引物二聚体，只是多重反应涉及更多引物。另外，在一个分析的质谱中的分析物峰从任意分析的产物中充分解析，所述分析是多重化的，包括暂停峰(pausingpeak)和任意其它副产物峰多重分析。还有，分析物峰优选落入用户指定的质量窗，例如，在5,000-8,500Da范围内。在一些实施方式中，相对于给定的SNP链的靶序列设计延伸寡核苷酸。在一些实施方式中，长度通常在限度之间，例如能够是用户特异性的(例如，17-24个碱基或17-26个碱基)并且通常不含在靶序列中不确定的碱基。有时通过计算序列依赖性解链(或杂交/解离)温度Tm测量杂交强度。特定的引物选择可能被禁止，或相对于其他引物选择不利，因为其发夹潜在性、假引发潜在性、引物二聚体潜在性、低复杂性区域和问题子序列如GGGG。用于设计延伸寡核苷酸(例如，按照这些标准)的方法和软件是已知的，并且包括，例如SpectroDESIGNER(塞昆纳姆)。
本文使用的术语“检出率”或“检测率”是指相对于尝试得到的检出的数量得到的检出的数量。换而言之，对于12-重反应，如果从实施本文所述的方法最终测定10个基因型，那么已经得到10个检出，检出率10/12。不同的事件能够导致特定尝试测定的失败，并且导致低于100％的检出率。有时，在dNTP和用于终止的ddNTP的混合物的情况中，在引入一个非终止核苷酸(例如，dNTP)之后由于聚合酶的暂停而出现未适当延伸的产物，得到提前终止的延伸引物。在多态性位点上的错误终止的和正确终止的引物质量延伸反应之间的质量差异有时太小无法持续分辨并且如果使用非适当终止的混合物时可导致错误检出。正确终止与错误终止(即，由暂停造成)之间，正确终止与盐加合物之间以及正确终止和非特异性引入之间的质量差异尽可能大以减少错误检出的数量。
可以通过评价在一个或多个分析中得到的检出数(例如，正确或准确测量的)和/或假阳性和/或假阴性事件的数量来确定多重分析的准确性。也可以通过比较多重分析中评估的每个目标相应的在单重分析中的的准确性来评估准确性。在某些实施方式中，可以使用一种或多种方法确定检出率。例如，人工方法可以与自动化或计算机方法联合使用以产生检出，并且在一些实施方式中，可以汇总每种方法的检出率以计算总检出率。在某些实施方式中，当多重化两种或更多种靶核酸(例如，50或更多种靶核酸)时，准确性或检出率能够是例如约99％或更高、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、87-88％、85-86％、83-84％、81-82％、80％、78-79％或76-77％。在一些实施方式中，在包括约2-200个靶物质的多重分析中每个靶物质的检出率大于或等于80％或更高(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。
在某些实施方式中，可以基于检出率或准确率确定错误率。例如，错误率可以是错误产生的检出的数量。在一些实施方式中，例如，错误率可以是低于检出率或准确率100％。错误率也可以称为“失败率”。假阳性和/或假阴性的鉴定能够在此调整检出率和错误率。在某些实施方式中，进行更多的测定能够帮助鉴定假阳性和/或假阴性，从而调节检出率和/或错误率。在某些实施方式中，当多重化两种或更多种靶核酸(例如，50或更多种靶核酸)时，错误率能够是例如约1％或更低、2％、3％、4，％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。
应用
以下是本文所述的多重技术的非限制性应用的示例。
1.检测序列变异(例如，遗传变异体)
本文提供了用于鉴定疾病或其标记物的基因组基础的改进方法。能够通过本文提供的方法鉴定的序列变异(例如，遗传变异体)候选包括含有多态性的序列变异的序列。多态性包括天然存在的、体细胞的序列变异和来自突变的序列变异。多态性包括但不限于：序列微变体(microvariant)，其中个体之间在局部区域中的一个或多个核苷酸上不同，插入和删除，其能够在一个核苷酸到上百万个碱基中变化，以及微卫星或通过重复数量变化的核苷酸重复。核苷酸重复包括均匀重复如双核苷酸、三核苷酸、四核苷酸或较大的重复，其中相同序列重复多次，以及杂核苷酸重复，其中发现序列基序重复。对于给定的位点，核苷酸重复的数量能够根据个体变化。
多态性标记物或位点是发生差异的基因座。这样的位点能够小至一个碱基对(SNP)。多态性标记物包括但不限于，限制性片段长度多态性(RFLP)、可变数目串联重复(VNTR)、高变区、小卫星、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复和其他重复形式、单序列重复和插入元素，如Alu。多态性形式可表现为基因的不同孟德尔等位基因。能够通过蛋白、蛋白修饰、RNA表达修饰、DNA和RNA甲基化、改变基因表达和DNA复制的调节因子以及任意其他在基因组核酸或细胞器核酸中变化的表现中的差异观察到多态性。
另外，许多基因具有多态性区域。由于个体具有多态性区域的各种等位基因变体中的任意一种，能够通过基于基因的多态性区域的等位基因变体的类型鉴定个体。这可以用于，例如法医学目的。在其他情况下，了解个体具有的等位基因变体的相同性是重要的。例如，在某些基因如主要组织相容性复合物(MHC)基因中的等位基因差异与骨髓移植中的移植排斥或移植物抗宿主病有关。因此，非常需要开发快速、灵敏和准确的用于确定基因或遗传损伤的多态性区域的等位基因变体的相同性的方法。能够使用本文提供的方法或试剂盒以通过确定对象的一个或多个基因或染色体中的一个或多个多态性区域的一个或多个等位基因变体的相同性对所述对象进行基因分型。使用本文提供的方法对于对象进行基因分型能够被用于法医学或同源性测试目的并且所述多态性区域能够以线粒体基因存在或能够是短串联重复。
单核苷酸多态性(SNP)通常是双等位基因系统，即对于任意特定标记物，个体能够具有两个等位基因。这表示当与具有10个以上等位基因的微卫星标记物比较时，每个SNP标记物的信息含量是相对低的。SNP也趋向于变得非常群体-特异性；在一个群体中是多态性的标记物在另一个群体中可能不是非常多态性的。大约每千个碱基发现的SNP(参见Wang等.(1998)Science280：1077-1082)，提供了产生非常高密度遗传图谱的潜力，其对于开发用于感兴趣基因或区域的单倍型系统会是特别有用的，并且因为SNP的性质，事实上它们是与研究中的疾病表现型相关的多态性。SNP的低突变率可使得它们成为用于研究复杂遗传性状的出色标记物。
基因组学的很多焦点已经集中在SNP的鉴定上，由于多种原因其是非常重要的。它们能够实现间接测试(单倍型的关联)和直接测试(功能性变异体)。它们是最高丰度和稳定的遗传标记物。通过共同的遗传变化最好地解释了共同的疾病，并且人群中的天然变异帮助理解疾病、治疗和环境相互作用。
对于癌症研究界，体细胞突变的灵敏检测是特别有价值的，其价值在于肿瘤的引发和增殖的遗传决定簇的鉴定。从灵敏性方法得到的信息也能被用于描绘突变以预测患者的后果以及告知相关的治疗选项。在一些实施方式中，需要能够检测占对应的野生型序列低于或等于5％的遗传变异的灵敏性检测方法。在一些实施方式中，可执行能够检测小于或等于野生型的1％的检测方法。在一些实施方式中，可执行能够检测低于或等于野生型的5％、4％、3％、2％、1％、0.8％、0.75％、0.5％、0.1％、.05％或.01％的检测方法。另外，在产前诊断中，该类型的方法会阐明出生前父性衍生的突变。
在一些实施方式中，能够通过从负载一个或多个体细胞突变(例如，SNP、疾病标记物等或其组合)的核酸目标中产生延伸的寡核苷酸实施等位基因分析。在一些实施方式中，能够采用检测释放的、延伸的代表负载一个或多个体细胞突变的等位基因的寡核苷酸的作为在目标群中筛选特定突变存在与否的快速方法。在某些包括从突变型等位基因产生延伸的寡核苷酸的实施方式中，由于合适的等位基因产生延伸的寡核苷酸产物，能够检测所述延伸的寡核苷酸。
2.鉴定疾病标记物
本文提供了用于快速和准确鉴定作为疾病的遗传标记物的序列变异的方法，该方法能够被用于疾病的诊断或确定预后。通过遗传标记物表征的疾病包括但不限于动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病、自身免疫病和癌症。所有生物体中的疾病具有遗传组分，无论是遗传或来自身体对于环境压力(如病毒和毒素)的反应。正在进行的基因组研究的最终目标是使用该信息开发鉴定、治疗并且潜在治愈这些疾病的新方式。第一步骤是筛选这些疾病组织并且在个体样品的水平上鉴定基因组变化。这些“疾病”标记物的鉴定依赖于检测在基因组标记物中的变化的能力以鉴定偏离的基因或序列变异体。基因组标记物(包括单核甘酸多态性(SNP)、微卫星和其他非编码基因组区域、串联重复、内含子和外显子的所有基因座)能够用于所有生物体包括人的鉴定。这些标记物提供了不仅鉴定群也允许按照它们对于疾病、药物治疗、环境试剂的耐受性和其他因素的反应的群分层的方法。在一些实施方式中，疾病标记物有时是突变，并且能够是相对稀有的等位基因，例如，对于野生型等位基因背景的体细胞突变(例如，癌症与正常组织、突变体病毒型与正常病毒型(例如，HIV))。在一些实施方式中，稀有的等位基因或突变表示占野生型小于5％、4％、3％、2％、1％、0.8％、0.75％、0.5％、0.1％、.05％或.01％。在一些实施方式中，稀有等位基因或突变能够表示占野生型低于1％。
3.微生物鉴定
本文提供了用于鉴定微生物和病毒属、种、株、克隆或亚型的过程或方法。所述微生物和病毒选自多种生物体，包括但不限于细菌、真菌、原生动物、纤毛虫和病毒。所述微生物包括但不限于特定的属、种、株、亚型或血清型或任意其他分类。能够通过确定在目标微生物序列中相对于一条或多条参比序列或样品的序列变异鉴定微生物和病毒参比序列能够从例如其他来自相同或不同属、种、株或血清型或任意其他分类的微生物，或宿主原核或真核生物或任意混合群中得到。
在感染性疾病的临床控制中，病原体(例如，细菌或病毒)的鉴定和分类是关键。微生物的精确鉴定不仅用于从健康状态中区分疾病状态，也是确定感染及其传播来源以及确定是否和哪种抗生素或其他抗微生物治疗最适于治疗的基础。另外，能够监测治疗。传统病原体分类的方法已经使用多种表型分类特征来鉴定微生物(例如，细菌)，包括生长特征、颜色、细胞或菌落形态、抗生素易感性、染色、气味、血清型、生化分类和与特异性抗体的反应性。所有这些方法需要怀疑的病原体的培养，这存在一些严重的缺点，包括高的材料和劳动力成本、工作者暴露的危险、由于处理不当的假阳性和由于活细胞低数量的假阴性或由于很多病原体的苛刻的培养要求。另外，培养方法需要相对长的事件以实现诊断，并且由于这样的感染的可能危及生命的性质，经常在能够得到结果之前开始抗微生物治疗。一些微生物不能在培养中维持或表现出非常慢的生长速率(例如，对于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)长达6-8周)。
在很多情况下，病原体以小量存在和/或与组成正常菌群的生物体非常相似，并且通过上述的方法与无毒菌株能够是不可区分的。在这些情况下，病原体菌株的存在的检测需要较高的分辨率，其由本文提供的分子分类方法得到。
4.指示感染的病毒或细菌核酸序列存在的检测
本文提供的方法能够通过鉴定在病毒或细菌核酸序列中相对于一条或多条参比序列的序列变异用于确定指示感染的病毒或细菌核酸序列的存在。所述参比序列能够包括但不限于从感染性生物、相关的非感染生物得到的序列，或来自宿主生物的序列。
病毒、细菌、真菌和其他感染性生物含有不同的核酸序列，包括序列变异体，其与宿主细胞中含有的序列不同。靶DNA序列能够是外来遗传序列如入侵的微生物基因组的部分，这种微生物包括，例如细菌及其噬菌体、病毒、真菌、原生动物等。本文提供的方法特别适用于区分微生物的不同变体或菌株(例如，致病性、低致病性、耐药性对非耐药性等)，从而例如选择合适的治疗干预。感染人和动物并且能够由公开的方法检测的引起疾病的病毒的示例包括但不限于：逆转录病毒科(例如，人免疫缺陷病毒如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV；Ratner等，Nature，313：227-284(1985)；Wain Hobson等，Cell，40：9-17(1985)，HIV-2(Guyader等，Nature，328：662-669(1987)；欧洲专利公开号：0269520；Chakrabarti等，Nature，328：543-547(1987)；欧洲专利申请号0655501)，和其他分离物如HIV-LP(国际公开号WO 94/00562)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒(Gust等，Intervirology，20：1-7(1983))；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(Calcivirdae)(例如，引起胃肠炎的毒株)；披盖病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如，例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；日冕形病毒科(Coronoviridae)(例如，冠形病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副黏病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流行性感冒病毒，腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒、本呷(bunga)病毒、白蛉病毒和内罗(Nairo)病毒)；沙状病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠病毒、环状病毒和轮状病毒)；双股双节RNA病毒科(Bimaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；微小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)；乳头泡病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(1型(HSV-1)和2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；和未分类病毒(例如，海绵样脑病的病因、丁型肝炎的病因(认为是乙肝病毒的缺陷性卫星型)、非甲非乙型肝炎(1类＝内部传染；2类＝胃肠外传染(即丙型肝炎))的病因；诺瓦克(Norwalk)和相关病毒以及星状病毒。
感染性细菌的示例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(Mycobacteria sp.)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、沙门菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrheae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)、链球菌属(Streptococcussp.)(易变型(viridans group))、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(Streptococcus sp.)(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、巴氏杆菌(Pasturella multocida)、变形细菌属(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)和以色列氏放线菌(Actinomyces israelli)以及包括抗生素耐药性变体的任意变体。
感染性真菌的示例包括但不限于新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)。其他感染性生物包括原生生物如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)和鼠弓形体(Toxoplasma gondii)。
5.抗生素概况
本文提供的方法能够改善涉及药物耐药性，包括抗生素耐药性的核苷酸变化的检测的速度和准确性。已经鉴定了与异烟肼、利福平、链霉素、氟喹诺酮和乙硫异烟胺耐药性相关的基因座[Heym等，Lancet 344：293(1994)和Morris等，J.Infect.Dis.171：954(1995)]。异烟肼(inh)和利福平(rif)与吡嗪酰胺和乙胺丁醇或链霉素的组合通常被用作对结核分枝杆菌的确诊病例的第一线攻击[Banerjee等，Science 263：227(1994)]。这样的耐药性菌株增加的频率需要检测它们的快速测定的开发，从而减少追求无效并且可能不利的治疗的成本和公共卫生的损害。一些与药物耐药性相关的基因座的鉴定已经促进了用于快速筛选导致药物耐药性的核苷酸变化的突变检测技术的采用。另外，该技术促进治疗监测和追踪或微生物种群结构以及治疗中的监控。另外，能够实施混合的种群的相关性和监控。
6.单倍型
能够使用本文提供的方法监测单倍型。在任意二倍体细胞中，在含有至少一个可区分变异的任意基因或其他染色体区段中存在两个单倍体。在很多充分研究的遗传系统中，单倍体相比单核苷酸变异与表型更加有效相关。因此，单倍体的测定对于理解表型变化，包括疾病倾向或易感性、对于治疗干预的反应和在医学、动物饲养和农业中的其他感兴趣表型的遗传基础很有价值。
本文提供的单倍体测定过程使得能够从个体的两个同源性染色体中的一个中选择部分序列并且在该部分序列上基因分型连接的SNP。单倍体的直接分辨率能够产生增加的信息内容，改善任意关联的疾病基因的诊断或鉴定与这些疾病关联的连接键。
7.微卫星
本文提供的方法使得能够进行微卫星序列变异的快速、明确的检测。微卫星(有时称为可变数目串联重复或VNTR)是1-7个或更多碱基的短串联重复核苷酸单元，它们中最显著的是双核苷酸重复、三核苷酸重复和四核苷酸重复。在基因组DNA中每100000bp中存在微卫星(J.L.Weber和P.E.Can，Am.J.Hum.Genet.44，388(1989)；J.Weissenbach等，Nature359，794(1992))。例如，CA双核苷酸重复，占人线粒体外基因组约0.5％；CT和AG重复共占约0.2％。CG重复是稀有的，最可能是由于CpG岛的调节功能。微卫星对于长度和在全基因组中的广泛分布是高度多态性的，主要丰度在非编码序列中，并且它们在基因组内的功能未知。微卫星在法医学应用中很重要，由于种群会保持该种群的多个微卫星特征并且与其他不存在品种间杂交的种群相区别。
很多微卫星中的变化是沉默的，但是有些会导致基因产物或表达水平的显著改变。例如，在基因的编码区域中发现的三核苷酸重复在一些肿瘤中受到影响(C.T.Caskey等，Science 256，784(1992))并且这些微卫星的改变能够造成遗传不稳定性，其导致癌症倾向(P.J.McKinnen，Hum.Genet.1 75，197(1987)；J.German等，Clin.Genet.35，57(1989))。
8.短串联重复
能够使用本文提供的方法鉴定相对于例如不含STR区域的人基因组中的参比序列，在人基因组的一些靶序列中的短串联重复(STR)区域。STR区域是不与任意疾病或病症相关的多态性区域。在人基因组中的很多基因座含有多态性短串联重复(STR)区域。STR基因座含有3-7个碱基对长度的短、重复序列元件。估计存在200000种期望的三聚体和四聚体STR，其在人基因组中以每15kb出现一次的频率存在(参见例如，国际PCT申请号WO 9213969A1，Edwards等，Nucl.Acids Res.19：4791(1991)；Beckmann等，(1992)Genomics 12：627-631)。这些STR基因座中几乎一半是多态性的，提供了遗传标记物的丰富来源。在特定基因座中重复单元的数量的变化是观察到的序列变异的原因，其表明表明核苷酸串联重复(VNTR)基因座(Nakamura等，(1987)Science 235：1616-1622)；和小卫星基因座(Jeffreys等，(1985)Nature 314：67-73)，其含有较长的重复单元，以及微卫星或双核苷酸重复基因座(Luty等，(1991)Nucleic Acids Res.19：4308；Litt等，(1990)Nucleic Acids Res.18：4301；Litt等，(1990)Nucleic Acids Res.18：5921；Luty等，(1990)Am.J.Hum.Genet.46：776-783；Tautz(1989)Nucl.Acids Res.17：6463-6471；Weber等，(1989)Am.J.Hum.Genet.44：388-396；Beckmann等，(1992)Genomics 12：627-631)。VNTR分型在微生物分型中是非常确定的工具，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(MIRU分型)。
STR基因座的示例包括但不限于在人CD4基因座中的五核苷酸重复(Edwards等，Nucl.Acids Res.19：4791(1991))；人芳香酶细胞色素P-450基因中的四核苷酸重复(CYP19；Polymeropoulos等，Nucl.Acids Res.19：195(1991))；人凝集因子XIII A亚基基因中的四核苷酸重复(F13A1；Polymeropoulos等，Nucl.Acids Res.19：4306(1991))；F13B基因座中的四核苷酸重复(Nishimura等，Nucl.Acids Res.20：1167(1992))；人c-les/fps，原癌基因中的四核苷酸重复(FES；Polymeropoulos等，Nucl.Acids Res.19：4018(1991))；LFL基因中的四核苷酸重复(Zuliani等，Nucl.Acids Res.18：4958(1990))；人胰腺磷脂酶A-2基因的三核苷酸重复序列变异(PLA2；Polymeropoulos等，Nucl.Acids Res.18：7468(1990))；VWF基因中的四核苷酸重复序列变异(Ploos等，Nucl.Acids Res.18：4957(1990))；和人甲状腺过氧化物酶(hTPO)基因座中的四核苷酸重复(Anker等，Hum.Mol.Genet.1：137(1992))。
9.生物体鉴定
多态性STR基因座和基因的其他多态性区域是用于人鉴定、亲子鉴定、遗传图谱、迁移和遗传争议、双胞胎中的杂合性测试、人近亲交配的测试、人培养细胞的质量控制、人残留物的鉴定以及在法医学中精液样品、血渍、微生物和其他材料的测试中的极其有用的标记物的序列变异。在商业动物交配和族谱分析中以及在商业植物育种中，这样的基因座是有用的标记物。能够通过使用多态性DNA标记物的连接键分析鉴定植物作物和动物中有经济重要性的性状。本文提供了确定这样的基因座的相同性的有效和准确方法。
10.检测等位基因变异
本文提供的方法使得能够进行高通量、快速和准确的等位基因变异检测。等位基因变异的研究不仅包括在复杂背景中特定序列的检测，也包括区分序列之间几个或单个核苷酸差异。一种用于通过PCR检测等位基因特异性变体的方法是基于以下事实，即当模板链和引物的3′末端之间存在错配时，Taq聚合酶很难合成DNA链。能够通过使用仅与可能的等位基因中的一个完美配对的引物检测到等位基因特异性变体；与其他等位基因的错配作用为阻止引物的延伸，从而阻止该序列的扩增。本文所述的方法也适用于相关的研究、拷贝数变异、疾病标记物的加粗呢和用于分型的SNP组等。
11.测定等位基因频率
本文所述的方法对于鉴定一个或多个遗传标记物是特别有价值的，所述标记物的频率在人群中随着年龄、种族、性别或其他标准变化。例如，在本领域中已知ApoE基因型的年龄依赖性分布(参见例如，Schechter等，(1994)Nature Genetics 6：29-32)。已知在一些程度上与疾病相关的序列变异的频率也能够被用于检测或监测疾病状态的发展。例如，脂蛋白脂肪酶基因的N291S多态性(N291S)，其产生在氨基酸密码子291处丝氨酸取代天冬酰胺，导致降低的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，高密度脂蛋白胆固醇与男性动脉硬化，尤其是心肌梗塞的风险增加相关(参见Reymer等，(1995)Nature Genetics 10：28-34)。另外，测定在等位基因频率中的变化使得能够进行鉴定之前未知的序列变异并且最终与疾病的发作和发展相关的基因或通路。
12.表观遗传学
本文提供的方法能够被用于研究靶核酸或蛋白中相对于参比核酸或蛋白的变异，该变异不是基于序列，例如，天然存在的核酸或蛋白的单体单元的碱基或氨基酸的相同性。例如，本文提供的方法能够被用于识别序列非依赖性特征中的差异，如靶分子和参比分子之间甲基化模式、修饰的碱基或氨基酸的存在、或较高级结构中的差异，以产生在序列非依赖性位点切割的片段。表观遗传学是基于基因表达而不是基因序列中差异的信息遗传的研究。表观遗传变化是指在基因功能中有丝分裂和/或减数分裂的可遗传变化或在较高级别核酸结构中的变化，不能通过核酸序列中的变化解释这些变化。经过表观变异或变化的特征的示例包括但不限于，动物中的甲基化模式、组蛋白修饰和多梳-三胸组(Pc-G/tx)蛋白复合物(参见例如，Bird，A.，Genes Dev.，16：6-21(2002))。
虽然并不一定，但表观变化通常造成基因表达的变化，而这种基因表达的变化虽然不一定但通常是可遗传的。例如，如下文中进一步讨论，甲基化模式中的变化是癌症和其他疾病发生和发展的早期事件。在很多癌症中，由于异常的甲基化，某些基因不合理地被关闭或打开。甲基化模式抑制或激活转录的能力能够被遗传。Pc-G/trx蛋白复合物，像甲基化那样，能够以可遗传的方式抑制转录。Pc-G/trx多蛋白组件靶向基因组的特定区域，在那里其有效冻结基因的胚胎基因表达状态，无论所述基因是活性或失活的，并且在发育中稳定地增殖该状态。Pc-G/trx组蛋白的靶向和结合基因组的能力仅影响在基因组中含有的基因的表达水平，而不影响该基因产物的性质。本文提供的方法能够与特异性切割试剂或特异性延伸反应一起使用，基于序列非依赖性变化，如表观变化鉴定在靶序列中相对于参比序列的变异。
13.甲基化模式
本文提供的方法能够被用于检测在靶序列中的表观变化的序列变异，如在靶序列中甲基化模式中的变化。细胞甲基化的分析是一个新兴的研究学科。胞嘧啶共价添加甲基主要在CpG双核苷酸(微卫星)中存在。虽然，不位于启动子区域的CpG岛的功能还有待探索，在启动子区域的CpG岛是特别有令人感兴趣的，因为它们的甲基化状态调节相关的基因的转录和表达。启动子区域的甲基化导致基因表达的沉默。这个沉默是永久性的并且在有丝分裂的过程中持续。由于其在基因表达中的显著作用，DNA甲基化对发育过程、印记(imprinting)、X-染色体失活和肿瘤发生、衰老和寄生DNA的抑制有影响。甲基化被认为与很多广泛的肿瘤的癌症发生有关，如肺癌、乳腺癌和结肠癌和白血病。甲基化和蛋白功能障碍(长Q-T综合症)或代谢疾病(暂时性新生儿糖尿病，2型糖尿病)之间也存在联系。
能够使用基因组DNA的亚硫酸氢盐处理以分析所述DNA内甲基化胞嘧啶残基的位置。用亚硫酸氢盐处理核酸使得胞嘧啶残基脱氨称为尿嘧啶残基，而甲基化的胞嘧啶保持未修饰。因此，通过在本文提供的方法中比较未用亚硫酸氢盐处理的靶核酸的序列与用亚硫酸氢盐处理的核酸的序列，能够推测出在核酸中的甲基化程度以及胞嘧啶被甲基化的位点。
通过使用具有甲基化特异性识别位点的限制性酶，如HpaII和MSPI使得通过限制性内切核酸酶反应的甲基化分析成为可能。其基本原理是某些酶被在识别序列中的甲基化胞嘧啶阻断。一旦实现这个差异，能够使用本文提供的方法实施所得的片段的后续分析。
这些方法能够与联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)一起使用。在扩增的PCR产物中，用亚硫酸氢盐的处理造成BstUI识别位点的丢失，相比未处理的样品，其造成在分析中出现新的可检测片段。本文提供的方法能够与甲基化位点的特异性切割联用，以提供在靶核酸序列中甲基化模式的快速、可靠信息
14.重测序
来自各种生物的可得的基因组序列信息的显著增长量增加了技术的需要，该技术使得能够进行大规模比较序列分析以将序列信息与功能、表型或同源性相关。用于比较序列分析的这样的技术的应用能够是广泛的，包括SNP发现和病原体的序列特异性鉴定。因此，重测序和高通量突变筛选技术对于鉴定突变背后的疾病，以及遗传变异性背后的不同药物反应是关键的。
已经开发了几种方法用于满足这些需要。用于高通量DNA测序的现有技术包括使用电泳和激光诱导的荧光检测的DNA测序仪。基于电泳的测序方法对于检测杂合子具有局限性并且受到GC压缩物的影响。因此，产生数字数据而不使用电泳的DNA测序平台能够克服这些问题。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测量核酸片段并具有数字数据输出。本文提供的方法使得能够提供在序列相同性和相对于参比序列的序列变异的检测中的高通量、高速度和高准确性。该方法使得通常使用MALDI-TOF MS测序用于准确的突变检测，如筛选与乳腺癌的发展相联系的BRCA1和BRCA2中的基础突变成为可能。
15.疾病爆发监测
在全球运输和旅行的时期，需要密切监控致病性地方病的爆发以预防它们在全世界传播并能够控制。通过高通量技术的基于DNA的分型使得在比较短的时间内能够进行快速样品处理，这在爆发的情况下是需要的(例如，在医院环境、早期警告系统中监测)。监测依赖于使用的微生物标记物区域，但能够促进对于属、种、株或亚型的特异性水平的监测。在临床和药学监测以及宏基因组应用(例如，肠道菌群的分析)中，这样的方法能够用于生物防御。这样的治疗过程或失败的监测在美国专利号7,255,992、美国专利号7,217,510、美国专利号7,226,739和美国专利号7,108,974中描述，其通过引用纳入本文。
16.疫苗质量控制和生产克隆质量控制
本文提供的方法能够被用于控制重组生产克隆(不限于疫苗)的相同性，所述克隆能够是疫苗或例如胰岛素或任意其他生产克隆或生物或医疗产物。
17.在药理学中用于生产控制和质量的微生物监测
本文提供的方法能够被用于通过，例如监测在产物中某些微生物靶核酸的存在与否，控制药理学产物的质量。
试剂盒
在一些实施方式中，提供了用于进行本文所述方法的试剂盒。试剂盒通常包含含有一种或多种本文所述组分的一个或多个容器。试剂盒在任意数量的独立容器、包、管、小管、多孔板等中包含一种或多种组分，或者组分可以在此类容器中以不同组合合并。例如一种或多种下列组分可以包含在试剂盒中：(i)一种或多种核苷酸(例如，终止核苷酸和/或非终止核苷酸)；(ii)一种或多种包括捕获剂的核苷酸；(iii)一种或多种寡核苷酸(例如，寡核苷酸引物、一种或多种延伸寡核苷酸、包括标签的寡核苷酸、包括捕获剂的寡核苷酸)；(iv)游离的捕获剂(例如，游离的生物素)；(v)包括结合对的一个元件的固相(例如，珠)(viii)；(ix)一种或多种酶(例如，聚合酶、内切核酸酶、限制性酶等)；(x)对照组分(例如，对照基因组DNA、引物、合成模板、靶核酸等)；(xi)一种或多种缓冲液以及(xii)印刷品(例如，指南、标记等)。
试剂盒有时与处理联用，并且能包含实行一种或多种方法的说明书和/或一种或多种组合物的说明。试剂盒可以用于进行本文所述的方法(例如，使用固相)。说明书和/或说明可以是有形形式(如纸等)或电子形式(如有形介质(如压缩盘)等上的计算机可读文件)，并且可以包含在试剂盒附件(kit insert)中。试剂盒也可以包括提供这样的说明或说明书的因特网地址的书面说明。
实施例
下述实施例说明而不限制本技术。
实施例1：预-PCR反应
所述的方法提供了替代常规PCR的生物化学方法，通常具有扩增相同目标的两条基因特异性引物。所述方式适于例如含有SNP的靶区域的扩增。
方法1：该方法仅使用1条引物延伸，参见图1。基因特异性延伸引物具有5’通用PCR标签1R。其在基因组DNA上延伸。DNA或PCR标签1R基因特异性延伸引物可以是生物素化的，以促进反应的清洁。延伸的链然后与通用的磷酸化的寡核苷酸连接，其具有反向互补的标签2F(通用PCR引物)。为了促进在下一步骤中清洁，所述的磷酸化的寡核苷酸具有在其3’末端的外切核酸酶耐受性核苷酸。在外切核酸酶处理中，所有未连接的延伸链被消化，其中在反应中保护和保留连接的产物。然后使用标签1R和标签2F引物实施通用PCR，以扩增多个目标。概念-1的概况见于图1。
方法2：在这个方法中，在相同的反应中发生引物延伸和连接。图2显示使用生物素化的PCR标签3R基因特异性引物作为延伸引物。磷酸化的寡核苷酸具有基因特异性序列并且结合在DNA的同一条链上在距离引物延伸位点40个左右的碱基的位置。因此，StoffelDNA聚合酶延伸所述链直至其到达磷酸化的寡核苷酸。Amp连接酶(艾比森德(Epicentre))将所述磷酸化寡核苷酸的基因特异性序列与延伸的链连接。磷酸化寡核苷酸的3’末端具有PCR标签4(RC)F作为其通用标签。然后生物素化的延伸的链结合到链霉亲和素珠上。这促进了反应的清洁。将会洗去基因组DNA和基因特异性磷酸化寡核苷酸。然后使用标签3R和标签4F作为引物实施通用PCR，以扩增不同的感兴趣基因。构思-2的概况见于图2。
来自方法1和方法2的通用PCR产物可以使用后-PCR方案反应鉴定，如图3所示。使用SAP以清洁PCR反应。刚好在芯片微阵上点样SNP和单个碱基延伸的产物之前使用基因特异性寡核苷酸结合实施后-PCR反应，并且在质谱上分析该反应。
另外，本文提供的方法可用于后-PCR读数。
实施例2：来自实施例1的预-PCR反应材料
方法1：
1a)延伸：用18ng的质粒插入物、含Mg的1×恰根(Qiagen)PCR缓冲液、2.82mM的总MgCl2、10mM Tris、pH 9.5、50uM dNTP、0.5uM 5’PCR标签1R基因特异性延伸引物、5.76U热测序酶(Thermosequenase)实施90ul的反应。使用的热循环条件是94℃下2分钟，然后是以下的45个循环：在94℃下变性10秒；56℃下退火10秒；72℃下延伸20秒。
1b)连接：将5ul的延伸的产物与500pmol磷酸化寡核苷酸(标签2F引物的反向互补)连接，其在3’末端是外切核酸酶耐受的。在65℃/10分钟下变性磷酸化的寡核苷酸，在用50mM Tris-HCl、pH 7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP和50U T4 RNA连接酶1将体积加至50ul之前冷却。在37℃/4小时，65℃/20分钟下进行孵育。
1c)外切核酸酶处理：在95℃/5分钟下变性10ul的连接产物，冷却并且用含有20U外切核酸酶I和100U外切核酸酶III的总体积20ul的0.5×外切核酸酶III缓冲液稀释。在37℃/4小时，80℃/20分钟下孵育所述反应。
1d)通用PCR：在含有含1.5mM MgCl2、200uM dNTP和0.625U Hot star DNA聚合酶的1×恰根缓冲液的25ul反应中，用每个0.4uM的M13正向和反向引物扩增2ul外切核酸酶处理的产物。使用的热循环条件是94℃下15分钟，然后是以下的45个循环：在94℃下变性30秒；55℃下退火30秒；72℃下延伸1分钟。
使用的引物和PCR标签是：
通用标签1R(rs10063237)＝5’GGAAACAGCTATGACCATG-(GTAATTGTACTGTGAGTGGC)基因特异性序列3’，
通用标签2(RC)F＝5’P-CATGTCGTTTTACAACGTCG*T*G*ddC 3’
(*代表在核苷酸之间的外切核酸酶耐受性连接)
标签1R(M13R)＝5’GGAAACAGCTATGACCATG 3’
标签2F(M13F)＝5’CACGACGTTGTAAAACGAC 3’
rs10063237_E1(用于后-PCR反应)：5’TCAAAGAATTATATGGCTAAGG 3’
来自方法1的结果示于图4。
方法2：
2a)延伸和连接：用16-35ng基因组DNA、1×Amp连接酶缓冲液(艾比森德(Epicentre))、200uM dNTP、10nM生物素化的延伸引物、50nM基因特异性磷酸化寡核苷酸、1U Stoffel片段DNA聚合酶和4U Amp连接酶(艾比森德)进行20ul的反应。使用的热循环条件：94℃下5分钟，然后是以下的19次循环：94℃下变性30秒；58.5℃下退火150秒，其中每次循环温度降低0.2℃；在72℃下延伸45秒。在60℃下用40ug的蛋白酶K处理延伸和连接反应20分钟。
2b)珠清洁：用1×结合缓冲液(5mM Tris-HCl pH 7.5、1M NaCl、0.5mM EDTA)洗涤15ul Dynabeads M-280链霉亲和素珠三次。在所有的洗涤中，所述珠结合到磁体上然后弃去上清。收集和稀释两个延伸反应以得到1×结合缓冲液浓度，然后与所述珠混合。在室温下，在温和搅拌下孵育所述珠20分钟。然后用1×洗涤缓冲液(10mM Tris、pH 8，1mM EDTA)洗涤所述珠3次并用水洗涤2次。然后在室温下用0.1N NaOH处理所述珠10分钟。然后用1×洗涤缓冲液洗涤所述珠2次并且用水洗涤2次。最后在15ul的水中重悬所述的珠。
2c)通用PCR：2ul的珠被加入到25ul PCR反应中，所述反应含有1×PCR Gold缓冲液(应用生物系统公司(Applied Biosystems))、250uM dNTP、2.5mM MgCl2以及每个0.4uM的标签4F和标签3R引物、1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶和0.05％吐温20。使用的热循环条件是94℃下12分钟，然后是以下的60个循环：在94℃下变性30秒；68℃下退火30秒；72℃下延伸45秒，最后的72℃延伸2分钟。
使用的引物和标签序列是：
通用标签3R＝5’GAGCTGCTGCACCATATTCCTGAAC-基因特异性序列3’，
通用标签4(RC)F＝5’P-基因特异性序列-GCTCTGAAGGCGGTGTATGACATGG 3’
标签3R＝5’GAGCTGCTGCACCATATTCCTGAAC 3’
标签4F＝5’CCATGTCATACACCGCCTTCAGAGC 3’
方法2的基因特异性延伸的引物、磷酸化寡核苷酸和后-PCR反应延伸引物分别列于表1、表2和表3。对于表1，PCR标签区域用下划线表示。在方法2中，通过Stoffel DNA聚合酶，5’-生物素化的和PCR-标签的基因特异性引物在基因组DNA上延伸并且同时通过Amp连接酶(艾比森德)与下游的结合到相同链的特异性PCR-标签的磷酸化寡核苷酸连接。来自方法2的结果示于图5A-5。
实施例3：在实施例1和实施例2之后的后-PCR反应
SAP/后-PCR反应：在384孔板中分配5ul的通用PCR，并且在37℃下加入含有0.6USAP(虾碱性磷酸酶)的2ul SAP反应孵育40分钟并且最终在85℃下维持5分钟使酶失活。以2ul的量加入衍生试剂，其含有0.9mM非环状终止剂和1.353U的后-PCR酶。延伸寡核苷酸混合物在浓度上不同，根据其质量：0.5uM的低质量物：4000-5870道尔顿、1.0uM的中等质量物：6000-7350道尔顿和1.5uM的高质量物：7400-8700道尔顿，以9ul的终体积加入。用于后-PCR反应的循环条件是94℃/30秒和40个11温度循环(94℃/5秒和5个内部循环(52℃/5秒和80℃/5秒))的循环以及72℃/3分钟的最终延伸。MALDI-TOF质谱：
用16ul的水稀释延伸反应并且加入CLEAN树脂(塞昆纳姆)以对所述反应脱氧。室温下旋转该反应2小时。15nl的后-PCR反应被机械分配到预加载基质的硅片上(塞昆纳姆)。使用Mass ARRAY小型分析仪(MALDI-TOF质谱仪，塞昆纳姆)得到质谱。
实施例4：用于增加SNP基因分型中的多重化和灵活性的后-PCR反应
本发明所述的方法提供了可替代的goldPLEX引物延伸后-PCR形式以增加SNP基因分型的多重化和灵活性的概念。其采用等位基因特异性延伸引物，其包括每个SNP设计2条延伸引物以在SNP位点上杂交。每条引物含有用来与感兴趣的SNP位点特异性杂交的基因和等位基因特异性3’端核苷酸以及对应于质量标签的变化的定义的5’寡核苷酸序列。所述测试的特异性由引物的3’末端与模板的配对决定，其只有当对应于特异性SNP时才会由DNA聚合酶延伸。所述方法的概况见于图6。
由dNTP掺入延伸并且由ddNTP终止所述的延伸引物或者另外由ddNTP掺入终止而没有dNTP延伸。在延伸反应中使用的一个或多个dNTP和/或ddNTP由使其固定于固相载体的部分如生物素标记。
延伸产物随后固定于固相载体上，如链霉亲和素涂覆的珠，其中仅会结合延伸的/终止的产物。未延伸的引物和不需要的反应组分不会结合并且被洗去。
从延伸产物中切下5’端寡核苷酸序列或对应于质量标签的可替换基团，留下与固相载体结合的延伸产物3’端部分。能够通过多种方法实现所述切割，包括酶处理、化学处理和物理处理。在这个实施例中所述的可能采用内切核酸酶V以在引物内切割脱氧肌苷。所述反应切割脱氧肌苷3’端方向的第二个磷酸二酯键以释放寡核苷酸质量标签。
然后5’端寡核苷酸序列(质量标签)被转移到芯片阵列上并用质谱(例如，MALDI-TOF质谱)进行分析。与标签相符的质量信号的存在表明等位基因特异性引物被延伸，从而表明该特异性等位基因的存在。
实施例5：脱氧肌苷的内切核酸酶V切割
在延伸反应之前，在5μl的反应体积中进行35重的PCR，所述反应体积使用以下试剂：5ng DNA、1×PCR缓冲液、500μM的每个dNTP、100nM的每个PCR引物(列于表4)、3mM MgCl2和0.15U Taq(塞昆纳姆)。使用以下条件进行热循环：在95℃下7分钟；然后是以下的45个循环：95℃下20秒，56℃下30秒以及72℃下1分钟；并且在72℃下3分钟后结束。
用SAP(虾碱性磷酸酶)处理PCR反应以将未引入的dNTP脱磷酸化。向PCR产物中加入2μl含有0.6U SAP的混合物并且然后经过在37℃下40分钟和85℃下5分钟。
延伸反应试剂合并入3μl的体积，其被加到SAP处理的PCR产物中。总延伸反应含有以下试剂：1X goldPLEX缓冲液、17μM每个生物素ddNTP、0.8μM每个延伸引物(列于表5)以及1×goldPLEX后酶。
使用有以下组成的200循环的程序进行热循环：94℃下2分钟；然后是以下的40个循环：在94℃下5秒，之后5个循环的52℃下5秒和72℃下5秒；以及在72℃下3分钟后结束。含有质量标签的延伸引物序列和所得的对应于特异性等位基因的切割产物的质量列于表5。
通过用50mM Tris-HCl pH 7.5和1M NaCl，0.5mM EDTA，pH 7.5洗涤3次调节Solulink磁性链霉亲和素珠。然后延伸反应与300μg调节后的珠合并。在室温下，在温和搅拌下孵育珠30分钟然后用磁性挂盒粒化。然后除去上清。随后用50mM Tris-HCl、1M NaCl、0.5mM EDTA，pH 7.5洗涤3次并用水洗涤3次。对于每个洗涤步骤，粒化所述的珠并且去除上清。
通过加入30U的内切核酸酶V和0.4×缓冲液4(NEB)并且在37℃下孵育1小时从延伸产物切下质量标签。在孵育之后，用磁性挂盒将磁性珠粒化并且去除含有质量标签产物的上清。
通过加入6mg的CLEAN树脂(塞昆纳姆)实现脱盐。15nl的切割反应被机械分配到预加载基质的硅片上(塞昆纳姆)。使用MassARRAY小型分析仪(MALDI-TOF质谱仪，塞昆纳姆)得到质谱。图7显示使用本文所述的后-PCR读取的35重基因分型的MALDI-TOF质谱。
实施例6：核糖核苷酸的RNA酶切割
材料和方法
在延伸反应之前，在5μl的反应体积中进行2重的PCR，所述反应体积使用以下试剂：2ng DNA、1.25×HotStar Taq缓冲液、500μM的每个dNTP、100nM的每个PCR引物(列于表1)、3.5mM MgCl2和0.15U HotStar Taq(恰根)。使用以下条件进行热循环：在95℃下15分钟；然后是以下的45个循环：95℃下20秒，56℃下30秒以及72℃下1分钟；并且在72℃下3分钟后结束。
用SAP(虾碱性磷酸酶)处理PCR反应以将未引入的dNTP脱磷酸化。向PCR产物中加入2μl含有0.3U SAP的混合物并且然后经过在37℃下40分钟和85℃下5分钟。
表6
使用的PCR引物
SNP ID 正向引物 反向引物
rs1000586 ACGTTGGATGTACCAGAACCTACACTCCCC ACGTTGGATGTCTCAAACTCCAGAGTGGCC
rs10131894 ACGTTGGATGACGTAAGCACACATCCCCAG ACGTTGGATGAGCTGTTCCACACTTCTGAG
延伸反应试剂合并入2μl的体积，其被加到SAP处理的PCR产物中。所述延伸反应含有以下试剂：21μM每种生物素ddNTP、1μM每种包括用于后续RNA酶切割的核糖核苷酸的延伸引物(列于表7)以及1.25U热测序酶(Thermo Sequenase)。使用以下循环条件进行热循环：在94℃下2分钟；然后是以下的100个循环：94℃下5秒，52℃下5秒以及72℃下5秒；并且在72℃下3分钟后结束。使用QIAquick核苷酸去除试剂盒(恰根)按照生产商的推荐进行未结合的核苷酸的去除。
然后洗脱的延伸反应与30μg制备的Dynabeads M-280链霉亲和素珠(代纳公司(Dynal))结合(用5mM Tris-HCl pH 7.5，1M NaCl，0.5mM EDTA洗涤3次)。在室温下，在温和搅拌下孵育珠15分钟然后用磁性挂盒粒化。然后移去上清。随后用5mM Tris-HCl pH 7.5，1M NaCl，0.5mM EDTA洗涤所述珠6次。对于每个洗涤步骤，粒化所述的珠并且去除上清。
通过加入RNA酶并在37℃下孵育1小时从延伸产物中切下质量标签。在孵育之后，用磁性挂盒将磁性珠粒化并且去除含有质量标签产物的上清。通过加入6mg的CLEAN树脂(塞昆纳姆)实现脱盐。
15nl的切割反应被机械分配到预加载基质的硅片上(塞昆纳姆)。使用MassARRAY小型分析仪(MALDI-TOF质谱仪，塞昆纳姆)得到质谱。
含有质量标签的延伸引物序列和所得的对应于特异性等位基因的切割产物的质量列于表7。示例性的质谱示于图8。对于两个SNP中的每个，纯合样品和杂合样品都被展示并且显示出相应的质量标签显著差别。
表7
延伸引物及在切割之后释放的质量标签
测定名称 延伸引物序列 质量标签序列 质量
rs1000586_C <u>TTTCTCCCC</u>ACCTGACCCTG<u>C</u> <u>TTTCTCCCC</u> 2697.73
rs1000586_T <u>TTTTCTCCCC</u>ACCTGACCCTG<u>T</u> <u>TTTTCTCCCC</u> 3001.93
rs10131894_C <u>TTATTCCCAGGU</u>GCATGCATGCGCACA<u>C</u> <u>TTATTCCCAGGU</u> 3694.37
rs10131894_G <u>TTATTTCCCAGGU</u>GCATGCATGCGCACA<u>G</u> <u>TTATTTCCCAGGU</u> 3998.57
在表7中，核糖核苷酸被标为粗体，SNP特异性核苷酸用下划线表示并且质量标签用下划线表示。在图8中，显示rs1000586和rs10131894的基因分型的MALDI-TOF质谱。
实施例7：质量标签设计
质量标签被设计为至少相差16道尔顿以避免潜在盐加合物的任意重叠，并且因此任意质量信号的双电荷不会影响质量标签信号。质量标签的计算必须考虑脱氧肌苷和脱氧肌苷3’端方向的核苷酸。
核苷酸质量标签：检测寡核苷酸的MALDI-TOF飞行表现，这些寡核苷酸对应于在70重(图9和图10)和100重(图11A和11B)中使用的质量标签。
所有对应于70重测定的寡核苷酸都通过标准塞昆纳姆Typer 3.4软件使用三个参数：在相当水平的面积、峰高和信噪比被检出(图9)。使用代表70重测定的寡核苷酸时，每个峰的面积与那个寡核苷酸的序列组成有关。较高的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸百分比产生较大面积值；而腺嘌呤的百分比对应于较低的面积值(图10)。使用代表100重测定的寡核苷酸时，我们检测了寡核苷酸浓度(每种寡核苷酸终浓度10、5、2.5和1pmol)对信噪比的影响(图11B)。2.5和1pmol的较低的寡核苷酸浓度相比10和5pmol的寡核苷酸浓度一致得到较高的信噪比值。通过在Typer 3.4中的峰的人工观察证实了这个观察。然而，这4种寡核苷酸浓度得到了相当的面积值(数据未显示)。
实施例8：延伸引物设计和dNTP/ddNTP引入
使用塞昆纳姆的分析设计软件采用以下参数：SBE质量延伸/goldPLEX延伸、引物长度20-35个碱基(和相应质量窗)以及对于分析物10道尔顿的最小峰分离和对于质量延伸引物0道尔顿的最小峰分离来设计延伸序列。
在延伸反应中延伸的寡核苷酸和ddNTP的作用：为了研究延伸寡核苷酸(含有/不含脱氧肌苷)以及ddNTP组合物(含有/不含生物素部分)对于引物延伸的效果，我们研究了5重的延伸速率(图12)。分析通常显示使用未修饰的延伸寡核苷酸和ddNTP的最佳延伸速率。含有脱氧肌苷的延伸寡核苷酸没有显示出在延伸速率上的显著降低。然而，当使用包括生物素部分的ddNTP时，在使用任意类型的延伸寡核苷酸的所有分析中看到延伸速率的降低。
生物素化dNTP/ddNTP延伸：为了比较由单个生物素化ddNTP延伸或由生物素化dNTP的延伸并且用未修饰的ddNTP终止的效果，我们比较了在7重和5重中的延伸速率。通过生物素化ddCTP或生物素化dCTP以及ddATP、ddUTP或ddGTP延伸所述7重。通过生物素化ddUTP或生物素化dUTP以及ddATP、ddCTP或ddGTP延伸所述5重。该实验也比较了生物素化dNTP或ddNTP的两个浓度，210或420pmol。
在两种重中，在所有个体分析中，当与由单个生物素化ddNTP延伸比较时，由生物素化的dNTP延伸并且由未修饰的ddNTP终止的延伸速率显著降低(图13)。
这些结果表明用单个生物素化ddNTP的延伸得到较高的延伸效率。
PCR扩增
在延伸反应之前，在5μl的反应体积中进行PCR，所述反应体积使用以下试剂：5ngDNA、1×PCR缓冲液、500μM每种dNTP、100nM每个PCR引物、3mM MgCl2和0.15U Taq(塞昆纳姆)。
使用以下条件进行热循环：在95℃下7分钟；然后是以下的45个循环：95℃下20秒，56℃下30秒以及72℃下1分钟；并且在72℃下3分钟后结束。
SAP处理
用SAP(虾碱性磷酸酶)处理PCR反应以将未引入的dNTP脱磷酸化。向PCR产物中加入2μl含有0.6U SAP的混合物并且然后在热循环仪中经过在37℃下40分钟和85℃下5分钟。
延伸反应：
延伸反应试剂合并入3μl的体积，其被加到SAP处理的PCR产物中。总延伸反应含有以下试剂：1×goldPLEX缓冲液、0.2μl的250μM母液的每种生物素化ddNTP(终浓度50pmol)、0.8μl的2.5μM溶液每种延伸引物(终浓度2pmol)(IDT)以及0.05μl goldPLEX酶(塞昆纳姆)。
使用以下组成的300循环程序进行热循环：在94℃下2分钟；然后是以下的60个循环：94℃下5秒之后是52℃下5秒以及80℃下5秒的5个循环；并且在72℃下3分钟后结束。
捕获
为了调节，用100μl的50mM Tris-HCl，1M NaCl，0.5mM EDTA，pH 7.5洗涤磁性链霉亲和素珠2次。延伸反应与50μg(5μl)调节后的珠合并。在室温下，在温和搅拌下孵育珠1小时然后用磁性挂盒粒化。然后除去上清。随后用100μl的50mM Tris-HCl，1M NaCl，0.5mMEDTA，pH 7.5洗涤3次并用水洗涤3次。对于每个洗涤步骤，粒化所述的珠并且去除上清。
MALDI-TOF
通过加入6mg的CLEAN树脂(塞昆纳姆)实现脱盐。15nl的切割反应被机械分配到预加载基质的硅片上(塞昆纳姆)。使用MassARRAY小型分析仪(MALDI-TOF质谱仪)得到质谱。
实施例9：酶、缓冲液、寡核苷酸和生物素ddNTP滴定
酶滴定：检测在延伸反应中使用的后-PCR酶的量。除了酶以外，使用标准PCR、延伸和固定化/切割条件(如实施例8的方案中所示)。使用的酶的量在个体测试的人工检出或信噪比值中没有产生差异(图14)。
缓冲液滴定：检测在延伸反应中使用的goldPLEX缓冲液的量。除了调节缓冲液的量以外，使用标准PCR、延伸和固定化/切割条件(如实施例8的方案中所示)。使用的缓冲液的量在个体测试的人工检出或信噪比值中没有产生差异(图15)。
寡核苷酸滴定：检测在延伸反应中使用的寡核苷酸的量。除了调节寡核苷酸的量以外，使用标准PCR、延伸和固定化/切割条件(如在方案部分中所示)。
在初始实验(图16)中，测试了最终量为15pmol、10pmol和5pmol的每种寡核苷酸。10和15pmol的量得到相似的结果，但是5pmol得到的明显更多的人工和软件基因分型检出。这能够通过观察信噪比值看出(图9)，其中当使用较低量的寡核苷酸时，表现不佳的分析显示增加的信噪比。
在后续的实验中，测试了最终量为5pmol、2.5pmol和1pmol的每种寡核苷酸(图17)。通过信噪比和人工基因分型检出评估，所有三个量的结果提供了相似的结果。然而，三个个体分析中，当使用2.5或1pmol的浓度时，清晰看见峰，而当使用5pmol的终浓度时由于低强度而很难检出。当使用两种70重分析比较终浓度为2pmol、1pmol和0.5pmol的每种寡核苷酸时，对于所有浓度能够看到相同量的人工检出。然而，当使用更多的寡核苷酸时，看到更大的信噪比(图18和图19)。
这些结果显示当使用70重测试时，每种寡核苷酸的最优量是2pmol。然而，当每种寡核苷酸的最终量的范围为0.5-5pmol时，能够看到相似的结果。
生物素化ddNTP浓度：检测在延伸反应中使用的生物素化ddNTP的量。除了调节生物素化ddNTP的量以外，使用标准PCR、延伸和固定化/切割条件(如实施例8的方案中所示)。
在初步实验中，测试了在每个延伸反应中最终量为100、200、300和400pmol的每种生物素化ddNTP。人工检出和信噪比(图20)显示所有测试量的生物素化ddNTP看到相似的结果。
为了进一步研究在每个延伸反应中需要的生物素化ddNTP的量，实验比较了在另选的70重测试中50和100pmol的生物素化ddNTP。这些测试再次显示在人工检出或信噪比中没有差异(图21)。这表明当使用70重测试时，50pmol的每种生物素化ddNTP足够用于得到最优延伸反应。
实施例10：捕获和切割优化
固定化和寡核苷酸切割：链霉亲和素珠的结合能力。Solulink和Dynabeads MyOneC1磁性链霉亲和素珠用于按照实施例8中所述的捕获方案捕获生物素化寡核苷酸的比较。该实验使用两种对应于两种可能等位基因的延伸产物的寡核苷酸，用于为SNP rs1000586设计的分析。所述寡核苷酸还含有脱氧肌苷核苷酸和3’端生物素化的核苷酸。在水或变化的量的生物素化dNTP存在的情况下，所述寡核苷酸与磁性链霉亲和素结合，并且通过用内切核酸酶V处理切割。
在10或100pmol生物素化ddNTP存在的情况下，Dynabeads MyOne C1磁性链霉亲和素珠没有显示出面积减少。然而，当加入500pmol的生物素化ddNTP时看到信号大量减少。
在最高并包括500pmol的生物素化dNTP存在的情况下，Solulink磁性珠没有显示出信号的减少。这表明来自延伸反应的未引入的生物素化ddNTP不会造成最终信号的减少，如果其总共不超过500poml。
这些结果与未在本报告中所示的实验结合表明Solulink珠具有更强的对于抑制生物素化延伸产物的结合的生物素化小分子的耐受性。这可能是由于所述珠较强的结合能力，其被报道为2500相对于500pmol生物素寡核苷酸/mg(图22)。
切割
通过加入含有12U内切核酸酶V(NEB)和10mM乙酸镁(西格玛(Sigma))并且在热混合器R(Eppendorf)中在37℃下以1500rpm摇晃孵育4小时从延伸产物上切割质量标签。在孵育之后，用磁性挂盒将磁性珠粒化并且去除上清。
脱氧肌苷位点对于切割性质的影响：设计这个实验以分析内切核酸酶V在不同位置切割含有脱氧肌苷核苷酸的延伸产物的能力。设计四种寡核苷酸以模拟延伸产物(含有3’端生物素和脱氧肌苷核苷酸)，差别仅在于脱氧肌苷核苷酸的位置。脱氧肌苷位于距离含有生物素部分的核苷酸的3’端10、15、20和25个碱基对处。
在对来自结合步骤的上清(未结合的寡核苷酸)切割后看到的质量标签信号表明对于所有的寡核苷酸，相似量的寡核苷酸结合到磁性链霉亲和素珠上。然而，在切割与磁性链霉亲和素珠结合的寡核苷酸后看到清晰的图案。脱氧肌苷与寡核苷酸的3’末端的距离越大，信号及其推测的切割越强。这些结果造成需要设计所有的延伸寡核苷酸，使得所述脱氧肌苷位于距离延伸的产物的推定的3’末端至少20个核苷酸(图23)。
珠和内切核酸酶V滴定：在使用70重分析的一系列实验中评估用于有效捕获生物刷延伸产物的Solulink磁性链霉亲和素珠的量，以及用于切割捕获的产物以释放质量标签的内切核酸酶V的量。
初步实验比较了10、20和30μl的Solulink磁性链霉亲和素珠以及10、20和30单位的内切核酸酶V。除了当使用20和30μl磁性珠与10单位的内切核酸酶V结合时，所有结合测试的信噪比显示相似结果(图24)。当通过人工检出基因型来比较30μl的珠和30U内切核酸酶V与10μl的珠和10U内切核酸酶V时，看到相同的结果。
为了跟踪这些结果，进行比较以下条件的实验：10μl珠/10U内切核酸酶V、5μl珠/10U内切核酸酶V、10μl珠/5U内切核酸酶V和5μl珠/5U内切核酸酶V。检测人工基因型检出或信噪比时，当使用10或5μl磁性珠时，看到相似的结果(图25)。然而，当使用5U内切核酸酶V时，与10U内切核酸酶V相比，在人工检出和信噪比中都有显著的降低。
为了证实这些结果，进行比较以下条件的另外实验：10μl珠/12U内切核酸酶V、5μl珠/6U内切核酸酶V、5μl珠/12U内切核酸酶V和5μl珠/18U内切核酸酶V。比较人工基因型检出和信噪比时，当比较10或5μl的Solulink磁性珠时，看到相似结果(图26)。当比较不同量的内切核酸酶V时，12和18U内切核酸酶V中看到相似的结果。然而，当使用6U的内切核酸酶V时观察到信号的减少(图26)。
实施例11：替代的寡核苷酸切割机制
核糖核苷酸：初步实验使用包括核糖核苷酸的延伸寡核苷酸。在延伸和后续的在磁性链霉亲和素珠上的捕获之后，通过所述核糖核苷酸的RNA酶A切割释放质量标签。在以下部分描述所述方法。开发所述测试用于结合的SNP rs1000586和rs10131894。2重反应运行良好并且清楚地看到基因型(图8)。在未来需要克服的挑战是含有核糖核苷酸的寡核苷酸的由于冻融造成的切割。
光可切割：为了探索使用的内切核酸酶V的脱氧肌苷的切割的替代，测试了含有光可切割接头的寡核苷酸(IDT)。所述接头含有10-原子间隔臂，其能够通过暴露于300-350nm光谱范围内的UV光切割。
甲基膦酸酯：作为使用内切核酸酶V的脱氧肌苷的切割的另一种替代，检测含有甲基膦酸酯修饰的寡核苷酸。所述寡核苷酸在单个位点上含有磷酸酯主链的修饰，其中氧被取代为甲基。这导致电中性的主链，其能够被氢氧化钠(NaOH)、或氢氧化钾(KOH)或热切割。一系列实验显示能够通过加入少至50mM的NaOH或200mM KOH和在70℃下加热1小时切割。
dSpacer，硫代磷酸酯/亚磷酰胺：三种还没有被详细探索的可选切割机制是用1’，2’-双脱氧核糖(dSpacer)取代核苷酸以及主链修饰产生的硫代磷酸酯或亚磷酰胺。硫代磷酸酯修饰是用硫取代桥连的氧。这使得主链能够用30/50mM硝酸银水溶液(含有/不含二硫苏糖醇)或水性丙酮中50mM碘处理切割。亚磷酰胺修饰是用酰胺基代桥连的氧。所得的P-N键能够用80％CH3COOH处理或在MALDI-TOF过程中被切割。
实施例12：使用生物素竞争释放方法的生物素化延伸产物的分离
本文描述了用于纯化生物素化延伸产物并且用游离的生物素从链霉亲和素涂覆的磁性珠释放所述产物的方法，并且示于图27A-G。在一些实施方式中，采用所述方法以纯化和分离并且分析单个碱基延伸反应用于多态性鉴定。
能够使用基于PCR的方法靶向感兴趣的基因组区域(例如，具有遗传变异的区域)(参见图27A)。在感兴趣的区域的PCR扩增之后，用虾碱性磷酸酶(SAP)处理反应产物以将未引入的寡核苷酸三磷酸脱磷酸化。能够通过使用对应于感兴趣的核苷酸残基(例如，多态性；参见图27B)的单个碱基延伸(SBE)反应的核苷酸探针靶向感兴趣的区域，包括感兴趣的多态性。SBE反应采用生物素标记的双脱氧核苷酸三磷酸终止剂。随后捕获生物素化的延伸产物(参见图27C)，洗涤并且采用链霉亲和素涂覆的磁性珠和磁性分离从未使用的反应组分中纯化(参见图27D)该延伸产物。
然后，通过在升高的温度条件下，用游离的生物素的竞争从链霉亲和素涂覆的磁性珠上洗脱纯化的延伸产物(参见图27E)。含有来自感兴趣区域的生物素化延伸产物的洗脱液被分配(参见图27F)在(塞昆纳姆)上，并且用MALDI-TOF质谱分析(参见图27G)。在此描述反应组分和条件。
方法
在PCR扩增反应中使用的反应组分。
在虾碱性磷酸酶脱磷酸化反应中使用的反应组分。
在单个碱基延伸反应中使用的反应组分。
分离和纯化生物素化延伸产物使用的结合和洗涤溶液。
用于制备链霉亲和素涂覆的磁性珠的组分和过程。
试剂 每个反应中体积[μl]
珠 10
在磁体上放置至少3分钟以浓缩珠；去除上清。
如下向管中加入2×结合缓冲液：
试剂 每个反应中体积[μl]
2×结合缓冲液 10
温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；
去除上清。
重复总共2次向管中加入如下的2×结合缓冲液：
试剂 每个反应中体积[μl]
2×结合缓冲液 10
温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；
去除上清。
如下在的2×结合缓冲液中重悬珠：
试剂 每个反应中体积
25
使用链霉亲和素涂覆的磁性珠捕获生物素化延伸产物的组分和过程。
向每个PCR反应孔中加入等体积的含有珠的2×结合缓冲液：
在2×结合缓冲液中的25μl珠
25μl延伸产物
在室温下，旋转该板15-30分钟来混合。
在磁性分离器上放置板，去除上清。
使用链霉亲和素涂覆的磁性珠纯化和洗涤生物素化延伸产物的组分和过程。
加入以下的1×洗涤缓冲液：
温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；
去除上清。
如下向管中加入1×洗涤缓冲液重复总共2次洗涤：
温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；
去除上清。
如下加入水：
温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；
去除上清。
如下向管中加入水重复总共2次洗涤：
温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；
去除上清。
从链霉亲和素涂覆的磁性珠上洗脱捕获的生物素化延伸产物以用于后续的分析。
在升高的温度下使用游离的生物素竞争从链霉亲和素涂覆的磁性珠上洗脱生物素化延伸产物。反应条件列于下表。
加入15μl的生物素(树脂处理的，25ng/μl)。
加热至90℃维持5分钟，然后冷却至4℃。
在磁体上放置2-3分钟以捕获珠。
在如表中所述捕获磁性珠之后，从所述珠中移去洗脱液并且准备用于进一步分析。在一些实施方式中，进一步分析的准备包括在适于在MALDI-TOF质谱中使用的固相载体上分配或点样。在某些实施方式中，所述固相载体是(塞昆纳姆)固相载体。有时通过MALDI-TOF质谱分析生物素化延伸产物，其使用延伸产物质量中的差异以表明在感兴趣的区域上样品的基因型(例如，在多态性位点)。代表性的质谱踪迹(spectrumtracing)示于图28。
图28表示通过MALDI-TOF质谱分析的单个碱基反应产物中的质量差异。在质谱踪迹上约5997道尔顿的质量处显示未延伸的引物。在图28中也显示两种延伸反应产物，ddU反应产物占输入模板的约10％并且具有约6665道尔顿的质量，而ddA反应产物占输入模板的约90％并且具有约6687道尔顿的质量。在质量6510和6579处的另外的虚线是BRAF_2_WT和BRAF_2_R标记物单个碱基延伸产物的等位基因的期望质量。
实施例13：延伸和从固相上释放延伸的寡核苷酸
在典型的多重(例如，iPLEX)之后是所述延伸步骤(例如，实施例8)。实施感兴趣其余的PCR扩增，之后是未引入的核苷酸的SAP脱磷酸化。单个碱基延伸采用生物素化双脱氧核苷酸。通过仅包括对应于少量物质的核苷酸或包括所有四种核苷酸实施该延伸。使用来自不同生产商的链霉亲和素珠捕获生物素化寡核苷酸。对于释放步骤，肌苷切割方法与使用游离的生物素以竞争脱下结合的生物素化寡核苷酸作比较。该反应的其他组分与之前所述的分析相似(例如，实施例8)。PCR扩增、SAP脱磷酸化和延伸使用的条件示于以下表8。
表8
PCR扩增参数
SAP设定
SAP孵育
延伸设定
延伸参数
在延伸之后，向链霉亲和素涂覆的磁性珠引入反应。使得在短的期间内捕获延伸的产物。进行后续的洗涤步骤以除去除捕获的延伸产物以外的反应组分(表9)。这个过程去除了在MALDI-TOF质谱中产生干扰加合物的盐，其允许进行现在采用现有iPLEX流程的阴离子交换色谱过程的去除。在洗涤时候，通过引入25ng/ul高摩尔的游离生物素溶液从所述珠洗脱捕获的延伸产物。在洗脱之后，延伸的产物保留在洗脱液中。清洁的分析物现在准备好用于在生物阵列芯片上分配并且基本不含未延伸的引物、盐或其他能够在MALDI-TOF质谱上遮蔽低丰度物质的污染物，因此允许能够进行更灵敏的检测。图29A-G显示这个过程的流程图。
表9
珠调节
-涡流MyOne链霉亲和素C1珠以完全重悬珠。
-如下将珠转移至管中：
试剂 每个反应中体积
珠 10
-在磁体上放置至少3分钟以浓缩珠；去除上清。
-如下向管中加入2×结合缓冲液：
试剂 每个反应中体积
2×结合缓冲液 10
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠。
-如下向管中加入2×结合缓冲液以重复总共2次洗涤：
试剂 每个反应中体积
2×结合缓冲液 10
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
捕获
-如下在2×结合缓冲液中重悬珠：
试剂 每个反应中体积
2×结合缓冲液 25
-向每个PCR反应孔中加入等体积的含有珠的2×结合缓冲液：
25μl在2×结合缓冲液中的珠
25 μl PCR产物
50ul
-在室温下，旋转该板15-30分钟来混合。
-在磁性分离器上放置板，去除上清。
珠洗涤
-如下加入1×洗涤缓冲液：
试剂 每个反应中体积
1×洗涤缓冲液 50
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
-如下向管中加入1×洗涤缓冲液以重复总共2次洗涤：
试剂 每个反应中体积
1×洗涤缓冲液 100
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
-如下加入水：
试剂 每个反应中体积
水 100
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
-如下向管中加入水以重复总共2次洗涤：
试剂 每个反应中体积
水 100
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；移去上清。
洗脱
-加入15μl的生物素(树脂处理的，25ng/μl)。
-加热至90℃维持5分钟，然后冷却至4℃。
-在磁体上放置2-3分钟以捕获珠。
-将上清移至干净的96孔板并运行MALDI。
肌苷切割
作为另一个洗脱方法，实施来自捕获的延伸产物的质量标签的肌苷切割。这个方法在延伸寡核苷酸设计中与生物素竞争方法存在差异。该方法在对应于延伸产物的延伸引物的5’末端需要非模板的序列。另外，这个寡核苷酸用肌苷残基合成，其将目标的互补序列与质量标签序列标识物隔开。通过这个肌苷残基，由内切核酸酶V活性将所述质量标签从捕获剂上切下。这个工艺的切割部分示于图30A和30B。
链霉亲和素珠选择和洗脱评估(生物素相对与肌苷切割)
选择5种链霉亲和素珠产物用于评估。该选择是基于游离的生物素的表面特征和结合能力。这些特征列于表10。
表10
珠特征
使用具有3’端生物素的合成的寡核苷酸评估所述珠的性能。用相同的“序列特异性”区域设计两种寡核苷酸；一种没有5’端修饰而另一种含有5’端含肌苷残基质量标签。为了评估捕获和洗脱策略的效率，在每个质谱内使用比较度量(comparative measure)。设计另外的寡核苷酸，使得它们的相对大小在用于比较的洗脱产物的可接受质量范围之内。
测试过程包括捕获3’生物素化寡核苷酸，实施一组洗涤，以及后续的洗脱(生物素竞争相对于肌苷切割)。这个策略减轻可能已经被引入PCR和延伸步骤的差异。通过对于限制可捕获的寡核苷酸的反应评估珠和洗脱策略。通过连续稀释3’端生物素化寡核苷酸从2uM至0.031uM实施这个评估。对于每个测试的浓度，向所述洗脱液中加入等量的定量寡核苷酸以测量珠捕获和洗脱效率。
对于每个评估的珠，在每个浓度下测量捕获的寡核苷酸与定量寡核苷酸高度的比率。这个初步实验显示生物素竞争方法胜过洗脱方法。两种洗脱方法都展现出在最低起始输入的捕获产物，但是如比率所示，生物素捕获明显显示出更多捕获的和洗脱的产物。无论使用哪种珠，这个结果是显著的，并且选择生物素竞争作为洗脱策略。数据也显示DynalM280和Dynal T1表现不佳。能在图31和图32中看到反映这个实验的数据。
珠的评估
下一个方法是分析捕获珠以进一步开发。这个实验采用提出的超灵敏检测流程的所有步骤以从PCR模板脱离的延伸的产物的评估株的性能。为了控制输入的材料，使用竞争寡核苷酸作为模板材料。如前述实施PCR、SAP、延伸和捕获。模板互补体，生物素-ddUTP，是在延伸反应中使用的唯一核苷酸。竞争寡核苷酸模板浓度从约60000个分子被连续稀释至约30个分子。每个稀释重复6次。对于所有的反应，使用1ul的1uM延伸寡核苷酸溶液。被评估的珠是Dynal M270、Dynal C1和Solulink。为了证明每种珠的结合性能，使用在之前的研究中采用的相同的策略，在生物素捕获后向洗脱液中加入1ul的1uM定量寡核苷酸溶液。
这个评估的结果证明在所有的模板浓度下，Dynal C1胜过Solulink和M270。M270无法捕获任意产物。对于Dynal C1，观察到使用高度或面积作为度量时，延伸产物与定量寡核苷酸的比率逐渐下降。在Solulink中没有观察到相同的关系，这表明捕获的限制。能够在图33和图34中看到这个实验的数据。
基因组变异(例如，基因组混合模型)
用建立的工艺的基本的组分和过程，进行对于实际样品的开发。使用在先前验证(Oncocarta验证)中特征良好的样品和分析开发模型系统。使用的遗传物质购自ATCC并且已知携带体细胞突变。样品HTB-26D(衍生自乳腺癌的细胞系的基因组DNA)携带在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-Raf(BRAF)编码区域的突变。具体地，这个样品先前显示在BRAF-2中的体细胞突变(野生型-G；突变型-T)。这个样品的特征是30％突变体。样品HTB-38D(衍生自结直肠腺癌的细胞系的基因组DNA)也在BRAF区域中携带突变。这个样品先前显示在BRAF-15中的体细胞突变(野生型-T；突变型-A)。这个样品的特征是15％突变体。HTB-26D是BRAF-15的野生型而HTB-38D是BRAF-2的野生型。
除了容易得到遗传物质以外，这些分析和样品的选择的一个原理是其包含的特定基因型。生物素-ddCTP和生物素-ddTTP在质量上仅相隔1Da。虽然这个质量差异在MALDI-TOF仪器的分辨率之内，评估产品之间较大的质量差异。随后，找到不同的生产商提供16个碳的接头的生物素-ddUTP(相比原始组的11个碳的接头)。在这个分析中用16个碳的接头替代11个碳的接头消除了任意的潜在设计问题。
为了评估在这个模型系统中的灵敏度，两种样品混合以进一步稀释各自相应的体细胞突变。这两种样品以不同的比率混合，对于样品26D，在BRAF-2中体细胞突变从30％滴定至1.5％，而对于样品38B，在BRAF-15变异从15％滴定至0.75％。每个滴定点重复进行并且在SAP后重新结合。混合的分析物重新分配到两个不同的反应中。反应之一是使用所有四种生物素-ddNTP而另一个反应仅使用生物素-ddUTP(对于BRAF-2)和生物素-ddATP(对于BRAF-15)。用Dynal-C1珠和游离生物素竞争实施捕获和稀释。图35显示这四种情形的结果。
BRAF-2突变体在使用所有4种生物素-ddNTP进行的反应中显示轻微信号(图35的左上图)。通常这类信号不会被认为在基线噪音上显著。仅使用生物素-ddUTP(对于BRAF-2反应，图35的左下图)时，观察到清晰和明显的突变体信号。这在样品38D的BRAF-15分析中0.75％突变体中得到相同的观察。当在延伸组合物中仅包括生物素-ddATP(图35的右下图)时，观察到非常清晰和明显的BRAF-15突变体信号。这个数据证明通过排除相对于更高丰度的野生型序列的生物素-ddNTP，信噪比(SNR)显著增加。在BRAF-15的情况中，当在延伸反应中包括所有4种生物素-ddNTP时，在反应中没有观察到的突变体信号(图35的右上图)。
低丰度突变体的检测和定量
在一些实施方式中，在不产生野生型(例如，高丰度物质)延伸产物的测试中靶突变变体的分子(例如，低丰度变体)的量由包括在延伸反应中的合成模板的使用确定。这个评估的初始目标是评价在灵敏水平上可靠检测在混合物中的少量存在物(例如，低丰度突变体)的能力。本文总结的后-PCR富集策略定义了通过有效去除野生型(例如，高丰度物质)延伸产物，这个能力是可能的。如果模板的输入量已知，可能确定在分析(例如，延伸反应)中存在的靶突变体分子(例如，突变延伸产物)的量(例如，拷贝数、浓度、百分比)。通过包括在延伸反应中已知量的合成模板定量靶突变变体(例如，突变延伸产物)的量(例如，拷贝数、浓度、百分比)和/或靶突变变体在样品中的百分比。合成模板能够与寡核苷酸物质杂交并且含有刚好在位于待延伸寡核苷酸物质的3’端的突变位点上的碱基取代。碱基取代与野生型或靶突变变体(例如，第一变体、低丰度变体、SNP)不同。在模板引入之前，在模板中存在的碱基取代并不存在于样品中。与合成模板中的碱基取代互补的ddNTP也被引入到反应中。与靶突变变体杂交的寡核苷酸物质也和与合成模板杂交的寡核苷酸物质共-扩增(例如，共-延伸)。通过实施多重反应，其包括合成模板的连续稀释，能够确定靶突变变体的量和/或百分比。通过产生与靶突变变体等量的延伸产物的合成模板的量确定靶突变变体的量和/或百分比。
如本文所述，在基因组混合模型上进行突变体定量。关于5、1、0.5和0.1的恒定突变体百分比，应用合成模板滴定以20ng的总输入DNA理论分子数作为目标。结果显示5％和1％样品的突变体分子的精确量。该工艺在较低水平上并不那样精确，推测是由于有限模板的PCR取样偏差。图36显示1％突变体的滴定概况。
结论
消除野生型延伸产物能够增加本文公开的多重分析的灵敏度。在一些实施方式中，相同重的分析具有相同的野生型基因型，或具有相同的突变体基因型。在一些实施方式中，能够使用具有针对健康种群(例如，HAPMAP聚生体样品)的基因组DNA设计的“突变”的合成模板或质粒构建体。这个策略能够减轻设计考虑并且能够具有在相同重(仅竞争物)的不同分析中人为产生不同突变体百分比的明显优势。在一些实施方式中，使用合成模板(例如，质粒或寡核苷酸模板)作为对照。在一些实施方式中，合成模板(例如，质粒或寡核苷酸模板)包括在试剂盒中。
在一些实施方式中，针对野生型核苷酸(例如，更高丰度)调整设计。在这个方式中，在一个重中的所有分析对于野生型具有相同的核苷酸并且使用的延伸混合物没有该核苷酸。在一些实施方式中，能够根据突变体调整设计。在一些实施方式中，在一个重中的所有分析共同具有相同的突变体碱基。在某些实施方式中，仅延伸混合物含有突变体碱基。在一些实施方式中，存在与大量背景野生型DNA的非特异性互相作用的风险。在一些实施方式中，存在至少一种代表每种去除的野生型碱基或每种根据选择设计模式剩余的突变体碱基的对照重。
工作流程改进
本文所述的工艺可进行自动化。自动化需要考虑的关键步骤能够是珠的调节、珠的添加、珠的洗涤和洗脱产物的吸除。
实施例14：使用多重分析和试剂盒检测“野生型”和“突变体”基因型
分析设计
针对更灵敏的检测的阻碍是野生型峰的强度达到使得其中低水平的突变体不再是在基线之上可见的点。从检测中去除野生型峰可改善灵敏度和信噪比。在单个重中设计的分析共同具有与从延伸反应中去除的相应野生型碱基的相同的野生型峰，或设计共同具有与在延伸反应中仅包括该特异性碱基相同的突变体峰(表11)。就材料成本而言，模型系统使用选择针对仅具有一个在延伸反应中使用的突变型等位基因的重的策略。
多重(例如，Plex)设计被分成三类分析。该三类代表其他三种作为野生型的核苷酸中的每一种。使用这个原理设计4种多重分析(例如，多重(plexes))，每组靶向不同的突变碱基。这个测试设计策略使得能够进行所有可能的野生型/突变型组合的探索。
该设计包括来自肺板(Lung Panel)的六个区域。每个设计的“突变体”在正向和反向研究以促进所有可能的野生型/突变体组合的要求。该设计避免延伸寡核苷酸和PCR引物的重叠，使得避免任意潜在的外切核酸酶衍生的额外信号。在模型中设计的突变代表在肺板中使用的实际体细胞突变。多重的设计示于表12。设计四种多重使得它们能够被在使用非环状延伸混合物中也能一起被多重化。所述设计包括分隔区域之间的EcoRI位点(图37)。在使用该模型之前，能够通过EcoRI限制性消化切割质粒以分割区域并且更充分反映基因组结构。
表11
表12
对照
所述方法的元件产生用于下游分析的对照。无法捕获产物可能是由于有限的模板，失败的PCR/延伸或失败的捕获和洗脱。为了评估这些特定变数的问题，在每个设计的重中包括对照试验。设计的对照靶向人白蛋白基因。在每个反应中代表的对照，其用合适的功能性PCR和延伸充分模板化。对于这个对照准备了4种分开的延伸寡核苷酸。这些延伸寡核苷酸靶向代表4个核苷酸中的每种的残基并且与合适的延伸核苷酸混合物一起使用。
在延伸试验之后，具有3’端反向dTTP的5’端生物素化寡核苷酸被掺入到所有分析中作为捕获和洗脱的对照。这个信号的缺失与任意分析物的缺失一致时提供用户失败的捕获和/或洗脱。这个特定对照的摩尔浓度应该不超过反应以避免屏蔽在检测中的任意低水平突变体。
洗脱优化
捕获的和洗涤的产物被稀释至15ul的高摩尔生物素溶液中。对于15ul洗脱，用Matrix PlateMate 2×2和/或Epimotion 5075优化用于所述工艺的在合适的高度下粒化珠的新硬件。使用滴定实验以评估新的平板的表现。在该工艺的测试中，对于每个捕获的对照的稀释，这个评估进行3次。捕获对照被掺入iPLEX模拟物溶液中。使用所述硬件，使得测试溶液经过典型的延伸后过程。
在洗脱实验之前进行PlateMate的自动化调节。所述滴定包括12个步骤的连续稀释，其将输入的捕获寡核苷酸从2500个分子稀释至约1个分子。优化使用新硬件的方法以能够在洗涤中维持颗粒而不损失珠。最终，通过如捕获寡核苷酸的检测证明的灵敏度判断其表现。
品质控制
使用仅在质粒上非环化延伸混合物的典型iPLEX工艺初始运行4种多重。这作为质粒制造的品质测量。也优化限制性消化并且在琼脂胶中观察以确保将完全消化为组分片段。
捕获对照优化
存在初始的实验以确定捕获对照的何种浓度适于后续的实验。这个对照对于这些反应是有用的，在这些反应中没有突变体并且因此没有延伸峰。在这种情况下，有必要确定峰的缺失是否是缺少重组模板以产生延伸产物或失败的捕获或洗脱的结果。质粒的滴定进行四次。对于每个重复样品，使用不同浓度的捕获寡核苷酸。质粒的滴定反映了具有从50％突变体到0.01％突变体的8个稀释度和一个不含突变体的反应的灵敏性实验。使用的捕获对照的最低浓度是从洗脱优化实验中确定。这个浓度的一个重复样品被用作输入而其他三个重复样品浓度翻倍。通过捕获剂对照峰的存在如何影响突变体测试检测来评估捕获对照的表现。所述峰应该不会由于在质谱中太常见而遮蔽低水平的突变。然而，在低水平突变体浓度下，捕获对照峰必须被清楚地检测到。这个实验的发现是在后续的灵敏度、特异性和一致性分析中的捕获对照的浓度的基础。在这些反应中，3’端反向的dT不是必需的，由于寡核苷酸不包括于延伸反应中。然而，以这种方式设计对照使得在延伸反应自身中包括对照。
灵敏性和特异性
建立所述方法的灵敏性阈值包括相对于人DNA滴定质粒DNA。当没有检测到突变体分析物或单个拷贝的变体用于少数模板时，测定灵敏性阈值。使用各种稀释度的混合物。模板突变体分子的数量是15000、3750、938、235、59、15、4和0。野生型拷贝相应数量是15000、26250、29062、29765、29941、29985、29996和30000。合并下，这8个混合物分别代表50％、12.5％、3.13％、0.78％、0.2％、0.05％、0.01％和0％的突变体浓度。总模板是90ng/反应(rxn)或30000个基因组拷贝。每组的每个稀释度以48个重复样品运行。另外的两个平板进行对每个多重的48个非模板反应作为对照以评估非特异性互相作用的程度。另外，采用50％突变体和12.5％突变体具有合适比率的重复样进行的48个样品的“黄金标准”平板。灵敏性和特异性试验需要总共19块96孔板。按照现有的iPLEX方案实施PCR和SAP。SAP后反应经过含有生物素-ddNTP’s作为另外的终止核苷酸底物的延伸反应(除了所述“黄金标准板”)。所有其他的反应组分将保持相同。表13显示以每个组分DNA的分子数和重量计的模型系统稀释设定。表14和表15以每个反应基础上的每个组分的浓度列示了从PCR到延伸的全部过程。
初始分析考虑在哪个点上没有观察到信号以建立统计学上显著的灵敏性阈值。这个分析考虑包括所有多重的完整数据，并且也考虑当延伸特异性碱基时可能出现的差异以及如果任意野生型背景基因型存在对于成功的延伸的反应。这个分析评估灵敏性如何影响特异性。
表13
延伸混合物表
一致性
一致性分析考虑从灵敏性和特异性实验中收集的数据。评估在每个实验中以及实验之间的所有的重复样品的一致。通过在模型系统质量对照中运行模型系统自身来建立“黄金标准基因型”。
用由地平线诊断公司(Horizon Diagnostics)提供的样品实施一致性的另外测量。地平线诊断公司提供了遗传定义的gDNA和FFPE细胞参比标准。评估考虑不超过23个FFPE制备的样品。从地平线诊断公司制备的表单中选择8-15个突变。为了探索检测系统的功效，购买选择的突变体与其相应的野生型版本，或与内部健康种群样品混合。由地平线诊断公司提供的样品是50％突变体的状态并且需要稀释以评估在本文中的灵敏性检测。连续的稀释度与在灵敏性和特异性评估中采用的相同。另外，运行非模板对照，使总样品数为24。所有的样品以4个重复样品进行，总共8块96孔板。该实验设计会包括使用地平线诊断公司样品的未稀释iPLEX“黄金标准”。这个评估不仅进一步评价传统iPLEX的一致性，但也提供对于实际FFPE样品的性能的信息。
对照变量
富集前加工：直到延伸步骤的所有的反应都按照iPLEX SOP进行。这些过程详细列于表14和表15。控制使用的所有实际，使得在研究之间使用相同批次的试剂。
珠加工：已经从其他研究中建立调节、洗涤和稀释步骤以产生可靠的系统。在根据测试前阶段决定稀释策略之后，对于所有以下实验使用定义的方案。
样品DNA：对于所有研究，使用来自三个来源的DNA。第一个来源是含有模型系统的质粒DNA。第二个来源是来自北欧血统的犹他州居民的HapMap样品。最后是由地平线诊断公司提供的DNA。
仪器：PCR前和后-PCR仪器包括PlateMate 2X2和/或Hamilton Micro Lab 4000。在Sequenom Nanodispenser RS1000上实施纳米分配并且使用MassARRAY Analyzer 4进行分析物检测。编录了所有的仪器系列号。
表14
PCR设定
SAP添加
表15
延伸反应
反应变量
在这个测试计划中使用的实验被评估几个参数。对照变量对于几个参数有潜在影响。评估该过程生成可靠和需要的结果的能力。考虑能够通过控制变量不难确定的任意对于反应变量的影响。
·峰高度
·峰置信评分
·期望的基因型
表16
-涡流MyOne链霉亲和素C1珠以完全重悬珠。
-如下将珠转移至管中：
试剂 每个反应中体积
珠 10
-在磁体上放置至少3分钟以浓缩珠；去除上清。
-如下向管中加入2×结合缓冲液：
试剂 每个反应中体积
2×结合缓冲液 10
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠。
-如下向管中加入2×结合缓冲液以重复总共2次洗涤：
试剂 每个反应中体积
2×结合缓冲液 10
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
捕获
-如下在2×结合缓冲液中重悬珠：
试剂 每个反应中体积
2×结合缓冲液 25
-向每个PCR反应孔中加入等体积的含有珠的2×结合缓冲液：
在2×结合缓冲液中的25μl珠
25μl PCR产物
50μl
-在室温下，旋转该板15-30分钟来混合。
-在磁性分离器上放置板，去除上清。
珠洗涤
-如下加入1×洗涤缓冲液：
试剂 每个反应中体积
1×洗涤缓冲液 50
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
-如下向管中加入1×洗涤缓冲液以重复总共2次洗涤：
试剂 每个反应中体积
1×洗涤缓冲液 100
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
-如下加入水：
试剂 每个反应中体积
水 100
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
-如下向管中加入水以重复总共2次洗涤：
试剂 每个反应中体积
水 100
-温和混合，然后在磁体上放置2-3分钟以捕获珠；去除上清。
洗脱
-加入15μl的生物素(树脂处理的，25ng/μl)。
-加热至90℃维持5分钟，然后冷却至4℃。
-在磁体上放置2-3分钟以捕获珠。
-将上清移至干净的96孔板并运行MALDI。
珠加工
在2×结合缓冲液中调节珠并且向9ul的延伸反应中加入终体积为25ul的调节的珠。加入水使总体积达到50ul。在96孔板中执行珠捕获以容纳该体积。在室温下在血液学旋转器上进行延伸产物的捕获30分钟。在捕获之后，所述珠在1×Tris缓冲溶液中洗涤反应组分。重复这个过程，总共2次洗涤。然后用水洗涤所述珠。也重复水洗涤，总共再洗涤2次。每个洗涤步骤采用100ul的总体积。使用96孔板磁体以粒化珠。能够人工或通过自动化的使用进行所述洗涤步骤。在15ul浓缩的游离生物素溶液(25ng/ul；树脂处理的)中重悬洗涤的珠。在90℃下，使得游离的生物素竞争胜过生物素化的延伸产物5分钟。在15ul的重悬液中，吸出10ul同时珠在磁体下粒化。将这10ul澄清的洗脱液分配在384个孔中用于分配。珠调节和洗涤参数示于表16。
分配参数需要一些对于典型分配方案给定的体积高度和分析物特征的修改。吸取补偿(aspiration offset)设定为8mm并且考虑到这个分析物与典型iPLEX生物化学的粘度差异，分配速度变为约150mm/秒或其他更高的分配速度。
实施例15：实施方式的非限制性示例
下文提供了本技术某些实施方式的非限制性例子。
A1.一种测定组合物中是否存在多种靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)通过在扩增条件下扩增所述靶核酸或其部分制备所述靶核酸的扩增子；
(b)在杂交条件下将溶液中的所述扩增子与一组寡核苷酸接触，其中在所述组中的每个寡核苷酸包括当所述扩增子在所述溶液中存在时能够在杂交条件下与一个扩增子特异性杂交的杂交序列；
(c)通过用一种或多种核苷酸延伸与所述扩增子杂交的寡核苷酸产生包括捕获剂的延伸的寡核苷酸，其中所述一种或多种核苷酸中的一种是终止核苷酸并且一种或多种被加至所述寡核苷酸的核苷酸包括所述捕获剂；
(d)在所述捕获剂与所述固相互相作用的条件下将所述延伸的寡核苷酸与固相结合；
(e)通过竞争物的竞争释放已经与所述固相互相作用的所述延伸的寡核苷酸；以及
(f)通过质谱检测在(e)中释放的延伸的寡核苷酸；从而通过对应的延伸的寡核苷酸是否存在确定每种靶核酸是否存在。
A1.1.如实施方式A1的方法，其中(i)所述组中一个寡核苷酸物质的质量不同于另一个寡核苷酸物质的质量；以及(ii)每个寡核苷酸物质特异性地对应于特定扩增子，从而特异性对应于特定的靶核酸。
A1.2.一种测定组合物中是否存在多种靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)通过在扩增条件下扩增所述靶核酸或其部分制备所述靶核酸的扩增子；
(b)在杂交条件下将溶液中的所述扩增子与一组寡核苷酸接触，其中：
(i)在所述组中的每个寡核苷酸包括当一个扩增子在所述溶液中存在时能够在所述杂交条件下与所述扩增子特异性杂交的杂交序列，
(ii)在所述组中每个寡核苷酸包括位于所述杂交序列的5′端的质量可区分标签，
(iii)所述组中一个寡核苷酸的质量可区分标签的质量可检测地区分于另一个寡核苷酸的质量可区分标签的质量；并且
(iv)每个质量可区分标签特异性地对应于特定扩增子，从而特异性地对应于特定靶核酸；
(c)通过用一种或多种核苷酸延伸与所述扩增子杂交的寡核苷酸产生包括捕获剂的延伸的寡核苷酸，其中所述一种或多种核苷酸中的一种是终止核苷酸并且一种或多种被加至所述寡核苷酸的核苷酸包括捕获剂；
(d)在所述捕获剂与所述固相互相作用的条件下将所述延伸的寡核苷酸与固相结合；
(e)通过竞争物的竞争从所述固相中释放已与所述固相互相作用的延伸的寡核苷酸关联的所述质量可检测标签；并且
(f)通过质谱检测在(e)中释放的质量可检测标签；从而通过对应的质量可检测标签是否存在确定每种靶核酸是否存在。
A2.如实施方式A1-A1.2中任一项的方法，其中，用竞争物的竞争包括将所述固相与竞争物接触。
A3.如实施方式A1-A2中任一项的方法，其中，所述竞争物由游离的捕获剂或其竞争片段或多聚体组成。
A3.1.如实施方式A3的方法，其中所述竞争物由游离的捕获剂组成。
A4.如实施方式A1-A3.1中任一项的方法，其中包括所述捕获剂的核苷酸是捕获剂偶联于核苷酸三磷酸。
A5.如实施方式A4的方法，其中，所述核苷酸三磷酸是双脱氧核苷酸三磷酸。
A6.如实施方式A1-A5中任一项的方法，其中所述捕获剂包括结合对的一个元件。
A7.如实施方式A1-A6中任一项的方法，其中，所述捕获剂包括生物素。
A8.如实施方式A7的方法，其中所述固相包括亲和素或链霉亲和素。
A9.如实施方式A1-A6中任一项的方法，其中，所述捕获剂包括亲和素或链霉亲和素。
A10.如实施方式A9的方法，其中所述固相包括生物素。
A11如实施方式A1-A10中任一项的方法，其中在升高温度的条件下进行通过用游离的捕获剂竞争释放所述质量可区分标签。
A12.如实施方式11的方法，其中所述升高温度的条件包括在约90摄氏度下处理约5分钟。
A13.如实施方式A1-A12中任一项的方法，其中在一个容器中进行(c)并且所述方法还包括在(e)和(f)之间将释放的质量可区分标签转移至另一个容器。
A14.如实施方式A1-A13中任一项的方法，其中用从未引入扩增子的任意核苷酸中去除末端磷酸酯的试剂处理含有(a)中产生的扩增子的溶液。
A15.如实施方式A1-A14中任一项的方法，其中通过将所述溶液与磷酸酶接触去除所述末端磷酸酯。
A16.如实施方式A15的方法，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶。
A17.如实施方式A16的方法，其中所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。
A18.如实施方式A1-A17中任一项的方法，其中在所述延伸的寡核苷酸中的末端核苷酸包括所述捕获剂。
A19.如实施方式A1-A18中任一项的方法，其中在所述延伸的寡核苷酸中的一种或多种非末端寡核苷酸包括所述捕获剂。
A20.如实施方式A1-A19中任一项的方法，其中所述杂交序列长度为约5-约200个核苷酸。
A21.如实施方式A1-A20中任一项的方法，其中所述固相选自平坦表面、珠、硅芯片或前述的组合。
A22.如实施方式A1-A21中任一项的方法，其中所述固相是顺磁性的。
A23.如实施方式A1-A22中任一项的方法，其中所述质谱是基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。
A24.如实施方式A1-A23中任一项的方法，其中所述质谱是电喷雾(ES)质谱。
A25.如实施方式A1-A24中任一项的方法，其中检测约1-约50种或更多靶核酸是否存在。
A26.如实施方式A1-A25中任一项的方法，其中所述质量可区分标签由核苷酸组成。
A27.如实施方式A1-A26中任一项的方法，其中所述质量可区分标签是核苷酸复合体。
A28.如实施方式A27的方法，其中所述核苷酸复合体长度为约5-约150个核苷酸。
A29.如实施方式A1-A28中任一项的方法，其中所述靶核酸是基因组DNA。
A30.如实施方式A29的方法，其中所述基因组DNA是人基因组DNA。
A31.如实施方式A1-A30中任一项的方法，其中在(f)中的检测包括大于不包括其中用竞争物的竞争释放的方法的信噪比的信噪比。
B1.一种检测组合物中多种遗传变异体的是否存在或量的方法，所述方法包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中每种靶核酸物质包括第一变异体和第二变异体；
(b)将所述扩增子与寡核苷酸物质杂交，其中每个寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的扩增子杂交，从而产生杂交的寡核苷酸物质；以及
(c)在延伸条件下，将所述杂交的寡核苷酸物质与包括一种或多种终止核苷酸的延伸组合物接触；其中：
(i)所述一种或多种终止核苷酸中的至少一种包括捕获剂，并且
(ii)与第一变异体杂交的杂交的寡核苷酸物质通过终止核苷酸延伸并且与第二变异体杂交的杂交的寡核苷酸物质没有由终止核苷酸延伸，从而产生延伸的寡核苷酸物质；
(d)将所述延伸的寡核苷酸物质捕获至捕获所述捕获剂的固相；
(e)从所述固相中释放在(d)中结合到所述固相上的延伸的寡核苷酸；以及
(f)通过质谱检测在(e)中从所述固相上释放的每个延伸的寡核苷酸的质量；从而检测所述遗传变异的是否存在或量。
B2.如实施方式1的方法，其中每个寡核苷酸物质包括位于所述杂交序列的5′端的质量可区分标签。
B3.如实施方式1或2的方法，其中所述第一变异体是较低丰度变异而所述第二变异体是较高丰度变异。
B4.如实施方式1-3中任一项的方法，其中所述遗传变异体是单核甘酸多态性(SNP)变异体，所述第一变异体是较低丰度的等位基因而所述第二变异体是较高丰度的等位基因。
B5.如实施方式1-4中任一项的方法，其中所述一种或多种终止核苷酸由1种终止核苷酸组成。
B6.如实施方式1-4中任一项的方法，其中所述一种或多种终止核苷酸由2种终止核苷酸组成。
B7.如实施方式1-4中任一项的方法，其中所述一种或多种终止核苷酸由3种终止核苷酸组成。
B8.如实施方式1-4中任一项的方法，其中所述一种或多种终止核苷酸独立选自ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
B9.如实施方式1-4中任一项的方法，其中所述延伸组合物包括非终止核苷酸。
B10.如实施方式9的方法，其中所述延伸组合物包括一种或多种延伸核苷酸，其中延伸核苷酸不含捕获剂。
B11.如实施方式1-10中任一项的方法，其中释放所述延伸的寡核苷酸物质包括将所述固相与释放剂接触。
B12.如实施方式11的方法，其中所述捕获剂包括生物素或生物素类似物，所述固相包括链霉亲和素并且所述释放剂包括游离的生物素或生物素类似物。
B13.如实施方式11或12的方法，其中对于固相，所述释放剂相比所述捕获剂具有较高的亲和力。
B14.如实施方式11-13中任一项的方法，其中在(e)中释放延伸的寡核苷酸物质包括加热至约30℃到约100℃。
B15.如实施方式14的方法，所述方法包括加热至约60℃到约100℃。
B16.如实施方式14的方法，所述方法包括加热至约89℃到约100℃。
B17.如实施方式14的方法，所述方法包括加热至约90℃。
B18.如实施方式1-17中任一项的方法，其中靶核酸物质的数量是20种或更多种靶核酸物质。
B19.如实施方式1-18中任一项的方法，其中靶核酸物质的数量是200种或更多种靶核酸物质。
B20.如实施方式1-19中任一项的方法，其中靶核酸物质的数量是200-300种靶核酸物质。
B21.如实施方式1-20中任一项的方法，其中在(c)中的所述延伸条件包括循环20-300次。
B22.如实施方式1-19中任一项的方法，其中在(c)中的所述延伸条件包括循环200-300次。
B23.如实施方式1-22中任一项的方法，其中所述延伸反应包括竞争物寡核苷酸。
B24.如实施方式1-23中任一项的方法，所述方法包括在捕获所述延伸的寡核苷酸物质之后洗涤所述固相。
B25.如实施方式B24，其中所述洗涤去除在质谱分析中产生干扰性加合物的盐。
B26.如实施方式B25，其中延伸的寡核苷酸不与离子交换树脂接触。
B27.如实施方式B1-B26中任一项的方法，其中在(f)中的检测得到的信噪比大于在没有竞争物的竞争的释放之后检测的信噪比。
B28.如实施方式B1-B27中任一项的方法，其中仅延伸突变型等位基因的信噪比大于延伸野生型和突变型等位基因的信噪比。
B29.如实施方式B1-B28中任一项的方法，其中对于仅延伸突变型等位基因，在(f)中检测突变型等位基因的灵敏度大于延伸野生型等位基因和突变型等位基因。
B30.如实施方式B1-B29中任一项的方法，其中未检测到所述第二变异体的延伸的寡核苷酸物质。
B31.如实施方式B12-B30中任一项的方法，其中所述游离的生物素或生物素类似物以约10-约100ug/ml的浓度加入。
B32.如实施方式B31，其中以约25ug/ml的浓度加入游离的生物素或生物素类似物。
B33.如实施方式B1-B32中任一项的方法，其中所述组合物包括合成模板并且测定在组合物中第一变异的量和/或百分比，其中所述合成模板包括与第一变异体和第二变异体不同的变异体并且与相同的寡核苷酸物质杂交。
***
本文中引用的各专利、专利申请、出版物和文献的全部内容均通过引用纳入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的现有技术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。
可对上述内容进行改变而不背离本技术的基本方面。尽管参考一个或多个具体实施方式充分详细描述了本技术，但是本领域普通技术人员应认识到可对本申请中具体公开的实施方式进行改良，只要这些改良和改进在本技术的范围和精神内。
本文中适当描述的技术可在没有任何本文未具体公开的元素的情况下实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包含”、“基本由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可用其它两个中的任一个代替。已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，此类术语和表达的使用并不排除对所显示和所描述的特征或其部分的任何等价物，以及在要求权利的本技术范围内可进行各种改良。术语“一个”或“一种”表示一种或多种其修饰的元素(例如“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文清楚表示所描述的是元素之一或是一种以上的元素。本文所使用的术语“约”表示在基础参数的10％范围内的数值(即±10％)，在一列数值的开头处使用术语“约”表示修饰该列数值中的每个数值(即，“约1、2和3”是约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量能包含90克-110克的重量。因此，应理解，尽管通过代表性实施方式和任选的特征具体公开了本技术，但是本领域技术人员能对本文所公开内容进行改良和变化，应认为此类改良和变化落在本技术的范围内。
在所附权利要求书中陈述了本技术的实施方式。
序列表
<110> 基纳生物技术有限公司（AGENA BIOSCIENCE, INC.）
<120> 用于多重核酸鉴定的产品和方法
<130> U2254 PCT
<140> PCT/US2012/038710
<141> 2012-05-18
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ctatactctt gctcgtggag ttaatctcag agggctctga aggcggtgta tgacatgg 58
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<210> 59
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 59
cgatgtgatc ctgtgtcaaa taatgacggg ctctgaaggc ggtgtatgac atgg 54
<210> 60
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 60
ctgaagggaa tggctggttt ttaatttgta gtggctctga aggcggtgta tgacatgg 58
<210> 61
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 61
gaaggtggga ttacgcctaa ctttagggct ctgaaggcgg tgtatgacat gg 52
<210> 62
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 62
gacttcatgg ctggcagaaa gctctgaagg cggtgtatga catgg 45
<210> 63
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 63
ctgcatttct actggtaaca tgcgccgctc tgaaggcggt gtatgacatg g 51
<210> 64
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 64
ctattcaggt gtcactttta ttatgattat ctaaggtcag tggctctgaa ggcggtgtat 60
gacatgg 67
<210> 65
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 65
caggtccagt tcttgagttt catcctttcg ctctgaaggc ggtgtatgac atgg 54
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 66
cctctctgtt ttgttgagaa atccactctt ggtcgctctg aaggcggtgt atgacatgg 59
<210> 67
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 67
gcaaaatggg tatggtttag ccagaaacat ggctctgaag gcggtgtatg acatgg 56
<210> 68
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 68
ggtgatggac ccactgcctg gctctgaagg cggtgtatga catgg 45
<210> 69
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 69
gtgacctgac actggtggga tggctctgaa ggcggtgtat gacatgg 47
<210> 70
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 70
gctttgtgtg caaatcacct attttcctgg ctctgaaggc ggtgtatgac atgg 54
<210> 71
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 71
ggtgagagaa tatgaaagca aaacagcaac cgctctgaag gcggtgtatg acatgg 56
<210> 72
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 72
gggctatgta gacacttcaa aggtgttcgc tctgaaggcg gtgtatgaca tgg 53
<210> 73
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 73
gtttgctcta gctcaatggc ctcttaaggc tctgaaggcg gtgtatgaca tgg 53
<210> 74
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 74
ccaacacagt catctgatcc catctccgct ctgaaggcgg tgtatgacat gg 52
<210> 75
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 75
gtaggcaagg ctgttctttt ttgtgttggc tctgaaggcg gtgtatgaca tgg 53
<210> 76
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 76
ccatatgcag tttttgtttt cccagtgcgc tctgaaggcg gtgtatgaca tgg 53
<210> 77
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 77
caccataata gtttatctgc ttctactaaa attattattg gcgctctgaa ggcggtgtat 60
gacatgg 67
<210> 78
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 78
cctcagaatg aaatcatgct tttctgctaa tttgtaggct ctgaaggcgg tgtatgacat 60
gg 62
<210> 79
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 79
ccttcagaca taccttggga aaatgtcagg ctctgaaggc ggtgtatgac atgg 54
<210> 80
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 80
ccttcttcat ccccc 15
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 81
gcccataagc caaca 15
<210> 82
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 82
gtcccaaggg agagc 15
<210> 83
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 83
ggtaaagccc ctcgaa 16
<210> 84
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 84
ctccccacct gaccctg 17
<210> 85
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 85
ttatggtgtc tttcccc 17
<210> 86
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 86
caaagcaggt gcacgaa 17
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 87
acttcctccc ttcttact 18
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 88
cccttttggc ttcctggg 18
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 89
cccattttgc gccatttat 19
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 90
ggatcacatc gtgttagac 19
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 91
ggaagacgct tatcatggt 19
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 92
cccttgcatg catgcgcaca 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 93
aggcaataga gggagtatca 20
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 94
aaacttctcc ctcagcctac c 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 95
cagaaataca tttgccacta t 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 96
gcgctgtatc ctcagagagt a 21
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 97
gggagaatgc atttcttttt cc 22
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 98
ggatacttca agaatagtag ag 22
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 99
cccactctat tcccacgtca gcc 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 100
tttatttttc catcacacgt atg 23
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 101
tttctaaatc cccacccggc gcag 24
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 102
gctctcacca ttaactatac agca 24
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 103
gttgacagtt ctccaagtcc agat 24
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 104
ggattacaga tgccttcttg ggta 24
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 105
caatcaaaga attatatggc taagg 25
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 106
ccctttaaca cctatatggg tttttg 26
<210> 107
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 107
gcagcacagc cttgcctaca atgaca 26
<210> 108
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 108
gggcattctg aggaaaataa tgtatg 26
<210> 109
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 109
ggacgagagg tctgagagtt tctgat 26
<210> 110
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 110
acataactct cagataatta aagttgt 27
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 111
atgttaacag aaagcacaat aaaaaca 27
<210> 112
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 112
gggaggagag gaaccataag atattag 27
<210> 113
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 113
cctggttttg tcttccctat ttactgat 28
<210> 114
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 114
ggacaaaagt tctgaattat ttggtttg 28
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 115
acgttggatg aaaggctgat ccaggtcatc 30
<210> 116
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 116
acgttggatg ttgagacacg gcacagcgg 29
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 117
acgttggatg aaggtaggcc tttaggagag 30
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 118
acgttggatg atgcacaatc gtcctactcc 30
<210> 119
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 119
acgttggatg tgagccaggg atatcctaac 30
<210> 120
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 120
acgttggatg taatagaggg tgcattgaag 30
<210> 121
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 121
acgttggatg aaagagagag agatccctg 29
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 122
acgttggatg cactaataaa ggcagcctgt 30
<210> 123
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 123
acgttggatg ggctctgatc ccttttttta g 31
<210> 124
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 124
acgttggatg gcttttcctc ttctttggta g 31
<210> 125
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 125
acgttggatg tctcagttcc aactcatgcc 30
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 126
acgttggatg agaatgtgcc aaagagcag 29
<210> 127
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 127
acgttggatg ccttattgga ttctatgtcc c 31
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 128
acgttggatg acttggcgag tccccatttc 30
<210> 129
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 129
acgttggatg tcttgtctct tacctctcag 30
<210> 130
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 130
acgttggatg tgaggattaa aggatctggg 30
<210> 131
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 131
acgttggatg gaggctcctc tacacaaaag 30
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 132
acgttggatg ttgctctaag gtggatgctg 30
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 133
acgttggatg gtttacaacc tgtggcagac 30
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 134
acgttggatg gaaagtgacc catcaagcag 30
<210> 135
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 135
acgttggatg ctatggggaa ctgaataagt g 31
<210> 136
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 136
acgttggatg caaactattg actggtcatg g 31
<210> 137
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 137
acgttggatg gcagaggttt gagaaaagag 30
<210> 138
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 138
acgttggatg gtatatgcct gtatgtggtc 30
<210> 139
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 139
acgttggatg gagggaaaga cctgcttcta 30
<210> 140
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 140
acgttggatg gagaaggctt tccagaattt g 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 142
acgttggatg ttttgggccc ctccatattc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 143
acgttggatg tggatatgct gaatttgagg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 144
acgttggatg cttttgtcca tgtttggcag 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<212> DNA
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<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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acgttggatg tggcaacaca cgactgtact 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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acgttggatg tgcttcccag gtcactattg 30
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<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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acgttggatg tccatgagtg caggactacg 30
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<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 155
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 157
acgttggatg atgagtaacg cttggtgctg 30
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 159
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<211> 30
<212> DNA
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<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 162
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 163
acgttggatg ttaatatagt ccccagccac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 164
acgttggatg ctgtgctgac tgagtagatg 30
<210> 165
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 165
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<210> 166
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 166
acgttggatg gcatgtccct atgagatcag 30
<210> 167
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 167
acgttggatg ttaggcaccc caagtttcag 30
<210> 168
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 168
acgttggatg tgtagcatgt cagccatcag 30
<210> 169
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 169
acgttggatg gtagttgctt gtggttaccg 30
<210> 170
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 170
acgttggatg gagcaattca tttgtctcc 29
<210> 171
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 171
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 172
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<210> 173
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 173
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 174
acgttggatg agaagctccg agaaaaggtg 30
<210> 175
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 175
acgttggatg tatagccatt actgggcttg 30
<210> 176
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 176
acgttggatg ccctcttgca taaaatgttg c 31
<210> 177
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 177
acgttggatg ctccatgcaa ggctgtggc 29
<210> 178
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 178
acgttggatg cgttatcaag gactttgtgc 30
<210> 179
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 179
acgttggatg gaggttatct tattgtaacg c 31
<210> 180
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 180
acgttggatg agactgtcct ttcccaggat 30
<210> 181
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 181
acgttggatg tcatcagaag cagatgctgg 30
<210> 182
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 182
acgttggatg ccatacgttc aaggattggg 30
<210> 183
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 183
acgttggatg aggtgtgcaa gtgtcagaag 30
<210> 184
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 184
acgttggatg gtatatcatg tccagtgaag 30
<210> 185
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 185
ccaccgcctc cncctcccat ctccaccctc ta 32
<210> 186
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 186
ccaccgccta cncctcccat ctccaccctc tg 32
<210> 187
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 187
ccacagccta cncttcctac ccctccagcc gc 32
<210> 188
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 188
ccacagcata cncttcctac ccctccagcc gt 32
<210> 189
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 189
caacagcaca anttgctatc cccacaatta cc 32
<210> 190
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 190
caacagaaca anttgctatc cccacaatta ct 32
<210> 191
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 191
caaaagaaca antgaaactg cagactcttc cc 32
<210> 192
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 192
caaaagaaaa antgaaactg cagactcttc ct 32
<210> 193
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 193
aataagaaga ancgtctgat tggctttagt tc 32
<210> 194
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 194
gataagaaga ancgtctgat tggctttagt tt 32
<210> 195
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 195
aatagcgaga angctgtatc ctcagagagt ac 32
<210> 196
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 196
aatagcgaga gngctgtatc ctcagagagt at 32
<210> 197
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 197
ccacccccgc ccnttctccc acagtaaact tcca 34
<210> 198
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 198
ccaccaccgc ccnttctccc acagtaaact tccg 34
<210> 199
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 199
ccaccgcact acnctcttct gcttcatatt tcac 34
<210> 200
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 200
ccacagcact acnctcttct gcttcatatt tcag 34
<210> 201
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 201
caacagcacc acnttcatta tttcactcaa gcga 34
<210> 202
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 202
caacagcaac acnttcatta tttcactcaa gcgg 34
<210> 203
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 203
caacagctac aanaaacaaa ccagaaagtc acta 34
<210> 204
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 204
caacagatac aanaaacaaa ccagaaagtc actg 34
<210> 205
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 205
caaaagatac aanatgtaga gactcagtct cttc 34
<210> 206
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 206
caaaagatag aanatgtaga gactcagtct cttg 34
<210> 207
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 207
caaaagagag aantgcaaat tagatttgtc aggc 34
<210> 208
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 208
cagaagagag aantgcaaat tagatttgtc aggt 34
<210> 209
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 209
cagaagagag agntatgtct tattcttctt cacca 35
<210> 210
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
<400> 210
caggagagag agntatgtct tattcttctt caccg 35
<210> 211
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 211
ccacccaccg cccntagtcc ccagccacta taaaac 36
<210> 212
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 212
ccacccgccg cccntagtcc ccagccacta taaaag 36
<210> 213
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 213
ccacccgccg ctcnttccca aagttgaggg acttac 36
<210> 214
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 214
ccactcgccg ctcnttccca aagttgaggg acttat 36
<210> 215
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 215
ccacgcgccc tacnaaggct cctctggggc acaagc 36
<210> 216
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 216
caacgcgcac tacnaaggct cctctggggc acaagt 36
<210> 217
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 217
caacaagcac tacngggttt tgttgtgcca gtagaa 36
<210> 218
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 218
caacaagcaa tacngggttt tgttgtgcca gtagag 36
<210> 219
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 219
caagaagaaa taanctgcca attaatcatc aactctc 37
<210> 220
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 220
aaagaagaaa taanctgcca attaatcatc aactctt 37
<210> 221
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 221
gaagaagaca taanatgtca gccatcagcc tctcaca 37
<210> 222
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 222
gaagaagaca tagnatgtca gccatcagcc tctcacg 37
<210> 223
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 223
gaagaggacg tagngctctt atatctcata tgaacac 37
<210> 224
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 224
gaggaggacg tagngctctt atatctcata tgaacag 37
<210> 225
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 225
ccacgctcct ctacnacttt tcatggttat tctcagtc 38
<210> 226
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 226
ccgcgctcct ctacnacttt tcatggttat tctcagtt 38
<210> 227
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 227
ccacgcgcac caacntgttt tgtttgtttt gttttttc 38
<210> 228
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 228
ccacgcgcgc caacntgttt tgtttgtttt gttttttt 38
<210> 229
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 229
ccacgcgagt caacnccatc cagtaatgga gtacagtc 38
<210> 230
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 230
ccacgagagt caacnccatc cagtaatgga gtacagtg 38
<210> 231
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 231
ccacgagagt caacnagttt ttctttaagg ggagtaga 38
<210> 232
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 232
caacgagagt aaacnagttt ttctttaagg ggagtagg 38
<210> 233
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 233
caaagagaat aaacnggaca aagatgagtg cgtatatc 38
<210> 234
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 234
caaagagaat aaaanggaca aagatgagtg cgtatatt 38
<210> 235
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 235
caaagagaat agaanggctt ggggtcccca ttaaagcga 39
<210> 236
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 236
cagagagaat agaanggctt ggggtcccca ttaaagcgg 39
<210> 237
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 237
aagagcgaga gagantacta aagacgctta tcatggtc 38
<210> 238
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 238
aggagcgaga gagantacta aagacgctta tcatggtt 38
<210> 239
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 239
cggagagaga ggagntgcaa ggctgtggct ggacaagac 39
<210> 240
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 240
cggagaggga ggagntgcaa ggctgtggct ggacaagat 39
<210> 241
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 241
cccgctccgc cagtcnattc tatattagaa caactctctt c 41
<210> 242
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 242
ccacgcgcgc cagtcnattc tatattagaa caactctctt t 41
<210> 243
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 243
ccacgcgcga cagacntaac gcatatgcac atgcacacat c 41
<210> 244
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 244
ccacgcgaga cagacntaac gcatatgcac atgcacacat t 41
<210> 245
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 245
caacgcgaga cagacntgtc ctttcccagg atgctcaaag c 41
<210> 246
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 246
caacgcgaga cagaantgtc ctttcccagg atgctcaaag t 41
<210> 247
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 247
caacgagaga cagtanagca gatgctggcc ccatgcttca g 41
<210> 248
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 248
caacgagaga aagtanagca gatgctggcc ccatgcttca t 41
<210> 249
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 249
caaggagaga aagaantaat agtacaacag ctatcaatta c 41
<210> 250
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 250
caaggagaga gagaantaat agtacaacag ctatcaatta t 41
<210> 251
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 251
caaggagaga gagagntgtg caagtgtcag aagatgaaca a 41
<210> 252
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 252
cgaggagaga gagagntgtg caagtgtcag aagatgaaca g 41
<210> 253
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 脱氧肌苷
<400> 253
ccacctacca ccagtcngaa gaaataagaa acattgagac ac 42
<210> 254
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 脱氧肌苷
<400> 254
ccacatacca ccagtcngaa gaaataagaa acattgagac at 42
<210> 255
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 255
ccaccgcctc cnc 13
<210> 256
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 256
ccaccgccta cnc 13
<210> 257
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 257
ccacagccta cnc 13
<210> 258
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 258
ccacagcata cnc 13
<210> 259
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 259
caacagcaca ant 13
<210> 260
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 260
caacagaaca ant 13
<210> 261
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 261
caaaagaaca ant 13
<210> 262
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 脱氧肌苷
<400> 262
caaaagaaaa ant 13
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
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<220>
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<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
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<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
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caacagcaac acnt 14
<210> 273
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
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<212> DNA
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<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
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<211> 14
<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
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<211> 14
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 脱氧肌苷
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<212> DNA
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<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
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<221> 修饰的碱基
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 282
ccacccgccg cccnt 15
<210> 283
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 284
ccactcgccg ctcnt 15
<210> 285
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
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<400> 285
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
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<400> 286
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<210> 287
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 287
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<210> 288
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 288
caacaagcaa tacng 15
<210> 289
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 289
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<210> 290
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 290
aaagaagaaa taanc 15
<210> 291
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
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gaagaagaca taana 15
<210> 292
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
<400> 292
gaagaagaca tagna 15
<210> 293
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
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<210> 294
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 脱氧肌苷
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gaggaggacg tagng 15
<210> 295
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
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<210> 297
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
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<210> 298
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
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ccacgcgcgc caacnt 16
<210> 299
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 300
ccacgagagt caacnc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
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<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 303
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<210> 304
<211> 16
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 304
caaagagaat aaaang 16
<210> 305
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 305
caaagagaat agaang 16
<210> 306
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 306
cagagagaat agaang 16
<210> 307
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 307
aagagcgaga gagant 16
<210> 308
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 308
aggagcgaga gagant 16
<210> 309
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 309
cggagagaga ggagnt 16
<210> 310
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 脱氧肌苷
<400> 310
cggagaggga ggagnt 16
<210> 311
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 311
cccgctccgc cagtcna 17
<210> 312
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 312
ccacgcgcgc cagtcna 17
<210> 313
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 313
ccacgcgcga cagacnt 17
<210> 314
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 314
ccacgcgaga cagacnt 17
<210> 315
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 315
caacgcgaga cagacnt 17
<210> 316
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 316
caacgcgaga cagaant 17
<210> 317
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 317
caacgagaga cagtana 17
<210> 318
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 318
caacgagaga aagtana 17
<210> 319
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 319
caaggagaga aagaant 17
<210> 320
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 320
caaggagaga gagaant 17
<210> 321
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 321
caaggagaga gagagnt 17
<210> 322
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 脱氧肌苷
<400> 322
cgaggagaga gagagnt 17
<210> 323
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 脱氧肌苷
<400> 323
ccacctacca ccagtcng 18
<210> 324
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 脱氧肌苷
<400> 324
ccacatacca ccagtcng 18
<210> 325
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 325
acgttggatg taccagaacc tacactcccc 30
<210> 326
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 326
acgttggatg acgtaagcac acatccccag 30
<210> 327
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 327
acgttggatg tctcaaactc cagagtggcc 30
<210> 328
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 328
acgttggatg agctgttcca cacttctgag 30
<210> 329
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 329
tttctcccca cctgaccctg c 21
<210> 330
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<400> 330
ttttctcccc acctgaccct gt 22
<210> 331
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 来源
<223> /注="组合的DNA/RNA分子的说明：合成引物"
<400> 331
ttattcccag gugcatgcat gcgcacac 28
<210> 332
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成引物"
<220>
<221> 来源
<223> /注="组合的DNA/RNA分子的说明：合成引物"
<400> 332
ttatttccca ggugcatgca tgcgcacag 29
<210> 333
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<400> 333
tttctcccc 9
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<400> 334
ttttctcccc 10
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<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /注="组合的DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸"
<400> 335
ttattcccag gu 12
<210> 336
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /注="组合的DNA/RNA分子的说明：合成寡核苷酸"
<400> 336
ttatttccca ggu 13
<210> 337
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<400> 337
acccactcca tcgagatttc 20
<210> 338
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<400> 338
acccactcca tcgagatttc t 21
<210> 339
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成寡核苷酸"
<400> 339
acccactcca tcgagatttc a 21

Claims (14)

1.一种使用多重分析检测组合物中多种基因变异体是否存在的方法，所述方法包括：
(a)制备衍生自多种靶核酸物质或其部分的多个扩增子，其中每种靶核酸物质包括第一变异体和第二变异体，其中所述第一变异体是较低丰度变异而所述第二变异体是较高丰度变异，并且所述较低丰度变异是靶核酸物质的1％或更低；
(b)将所述扩增子与寡核苷酸物质杂交，其中每个寡核苷酸物质与衍生自靶核酸物质的扩增子杂交，从而产生杂交的寡核苷酸物质；以及
(c)在延伸条件下，将所述杂交的寡核苷酸物质与包括一种或多种终止核苷酸的延伸组合物接触；其中：
(i)所述一种或多种终止核苷酸包括捕获剂，所述捕获剂包括生物素；并且
(ii)与第一变异体杂交的杂交的寡核苷酸物质由终止核苷酸延伸，从而产生延伸的寡核苷酸物质，并且与第二变异体杂交的杂交的寡核苷酸物质没有由终止核苷酸延伸；
(d)将所述延伸的寡核苷酸物质捕获至固相，所述固相包含(c)中捕获剂的结合伴侣，所述结合伴侣是亲和素或链霉亲和素；
(e)通过在85℃至95℃的升高的温度条件下使所述固相与竞争物接触从所述固相中释放在(d)中结合到所述固相上的延伸的寡核苷酸物质，其中所述竞争物包括浓度为25至50μg/ml的游离生物素；以及
(f)通过质谱检测在(e)中从所述固相释放的每个延伸的寡核苷酸的质量；从而检测所述遗传变异体是否存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每个寡核苷酸物质包括位于所述杂交序列的5′端的质量可区分标签。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述遗传变异体是单核甘酸多态性(SNP)变异体，所述第一变异体是较低丰度的等位基因而所述第二变异体是较高丰度的等位基因。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种终止核苷酸由1种终止核苷酸组成。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种终止核苷酸由2种终止核苷酸组成。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种终止核苷酸由3种终止核苷酸组成。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种终止核苷酸独立选自：ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddUTP。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述升高的温度条件是90℃下持续5分钟并且所述游离生物素浓度为25μg/ml。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述升高的温度条件是95℃下持续5分钟并且所述游离生物素浓度为50μg/ml。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述多种靶核酸物质的数量是2至20种靶核酸物质。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，在(c)中的所述延伸条件包括循环200至300次。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，所述方法包括在捕获所述延伸的寡核苷酸物质之后洗涤所述固相。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，仅延伸突变型等位基因的信噪比大于延伸野生型和突变型等位基因的信噪比。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，对于仅延伸突变型等位基因，在(f)中检测突变型等位基因的灵敏度大于延伸野生型等位基因和突变型等位基因。
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