EA027558B1 - Способ обнаружения мультиплексных нуклеиновых кислот - Google Patents

Способ обнаружения мультиплексных нуклеиновых кислот Download PDF

Info

Publication number
EA027558B1
EA027558B1 EA201391723A EA201391723A EA027558B1 EA 027558 B1 EA027558 B1 EA 027558B1 EA 201391723 A EA201391723 A EA 201391723A EA 201391723 A EA201391723 A EA 201391723A EA 027558 B1 EA027558 B1 EA 027558B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotides
nucleic acid
oligonucleotide
nucleotides
target nucleic
Prior art date
Application number
EA201391723A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391723A1 (ru
Inventor
Кристиане Хониш
Дирк Йоханнес Ван Ден Бом
Майкл Моско
Андерс Нюгрен
Original Assignee
Эйджена Байосайенс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эйджена Байосайенс, Инк. filed Critical Эйджена Байосайенс, Инк.
Publication of EA201391723A1 publication Critical patent/EA201391723A1/ru
Publication of EA027558B1 publication Critical patent/EA027558B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

В изобретении обеспечен способ обнаружения присутствия или отсутствия множественных нуклеиновых кислот-мишеней. Способ включает амплификацию нуклеиновых кислот-мишеней или их части; удлинение олигонуклеотидов, которые специфически гибридизируются с этими ампликонами, где эти удлиненные олигонуклеотиды включают захватывающий агент; захватывание удлиненных олигонуклеотидов к твердой фазе через этот захватывающий агент; высвобождение удлиненных олигонуклеотидов конкуренцией с конкурирующим агентом; детектирование этого удлиненного олигонуклеотида и определение посредством этого присутствия или отсутствия каждой нуклеиновой кислоты-мишени по присутствию или отсутствию этих удлиненных олигонуклеотидов.

Description

Эта технология относится частично к процедурам идентификации нуклеиновых кислот, в которых многочисленные нуклеиновые кислоты-мишени могут детектироваться в одной процедуре. Эта технология также относится частично к идентификации модификаций нуклеиновых кислот.
Уровень техники
Детектирование конкретных нуклеиновых кислот является важным инструментом для диагностической медицины и исследования молекулярной биологии. В настоящее время анализы нуклеиновых кислот играют роль в идентификации инфекционных организмов, таких как бактерии и вирусы, в зондировании экспрессии нормальных генов и идентификации мутантных генов, таких как онкогены, в типировании ткани на совместимость предшествующей трансплантации ткани, в перекрестном типировании проб ткани или крови для судебной медицины и для исследования гомологии, например, среди генов из разных видов.
Сущность изобретения
В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ для определения присутствия или отсутствия множества нуклеиновых кислот-мишеней в композиции, который включает (а) получение ампликонов нуклеиновых кислот-мишеней амплификацией этих нуклеиновых кислот-мишеней или их частей, в условиях амплификации; (Ь) контактирование этих ампликонов в растворе с набором олигонуклеотидов в условиях гибридизации, где каждый олигонуклеотид в этом наборе включает гибридизационную последовательность, способную специфически гибридизоваться с одним ампликоном в условиях гибридизации, когда этот ампликон присутствует в этом растворе; (с) генерирование удлиненных олигонуклеотидов, которые включают захватывающий агент, удлинением олигонуклеотидов, гибридизуемых с этими ампликонами, одним или несколькими нуклеотидами, где один из этих одного или нескольких нуклеотидов является терминирующим нуклеотидом, и один или несколько из этих добавляемых к этим олигонуклеотидам нуклеотидов включает этот захватывающий агент; (б) контактирование этих удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой в условиях, в которых этот захватывающий агент взаимодействует с этой твердой фазой; (е) высвобождение этих удлиненных олигонуклеотидов, которые взаимодействовали с этой твердой фазой, конкуренцией с конкурирующим агентом (конкурентом); и (ί) детектирование удлиненных олигонуклеотидов, высвобожденных в (е); посредством чего присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяют по присутствию или отсутствию соответствующего удлиненного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления (ί) масса одного вида олигонуклеотида детектируемо отличается от масс других видов олигонуклеотидов в этом наборе и (й) каждый вид олигонуклеотида специфически соответствует специфическому ампликону и тем самым специфически соответствует специфической молекуле нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых вариантах осуществления (ί) каждый олигонуклеотид в этом наборе включает распознаваемую по массе метку (тэг), расположенную 5' (слева) от гибридизационной последовательности, (ίί) эта масса распознаваемой по массе метки (тэга) одного олигонуклеотида детектируемо отличается от распознаваемых по массе меток (тэгов) других олигонуклеотидов в этом наборе и (ίίί) каждая из распознаваемых по массе меток (тэгов) специфически соответствует специфическому ампликону и тем самым специфически соответствует специфической нуклеиновой кислоте-мишени, массу этой распознаваемой по массе метки (тэг) детектируют масс-спектрометрией, и присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяют по присутствию или отсутствию соответствующей распознаваемой по массе метки (тэга). В некоторых вариантах осуществления детектирования распознаваемой по массе
- 1 027558 метки (тэга) детектирует удлиненный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления удлиненные олигонуклеотиды, высвобождаемые в (е), или распознаваемые по массе метки (тэги), ассоциированные или отщепленные от высвобождаемых удлиненных олигонуклеотидов, детектируют массспектрометрией.
В некоторых вариантах осуществления обеспечен также способ для определения присутствия или отсутствия множества нуклеиновых кислот-мишеней в композиции, который предусматривает (а) получение ампликонов нуклеиновых кислот-мишеней амплификацией этих нуклеиновых кислот-мишеней, или их частей, в условиях амплификации; (Ь) контактирование этих ампликонов в растворе с набором олигонуклеотидов в условиях гибридизации, где (ί) каждый олигонуклеотид в этом наборе включает гибридизационную последовательность, способную специфически гибридизоваться с одним ампликоном в условиях гибридизации, когда этот ампликон присутствует в этом растворе, (ίί) каждый олигонуклеотид в этом наборе включает распознаваемую по массе метку (тэг), расположенную 5' (слева) от этой гибридизационной последовательности, (ίίί) эта масса распознаваемой по массе метки одного олигонуклеотида детектируемо отличается от масс распознаваемых по метке других олигонуклеотидов в этом наборе и (ίν) каждая распознаваемая по массе метка соответствует специфическоиу ампликону и тем самым специфически соответствует специфической нуклеиновой кислоте-мишени; (с) генерирование удлиненных олигонуклеотидов, которые включают захватывающий агент, удлинением олигонуклеотидов, гибридизованных с ампликонами, одним или несколькими нуклеотидами, где один их этих одного или нескольких нуклеотидов является терминирующим нуклеотидом и один или несколько из нуклеотидов, добавленных к этим олигонуклеотидам, включают захватывающий агент; (й) контактирование этих удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой в условиях, в которых этот захватывающий агент взаимодействует с этой твердой фазой; (е) высвобождение этих удлиненных олигонуклеотидов, которые взаимодействовали с этой твердой фазой посредством конкуренции с конкурирующим агентом (конкурентом); и (£) детектирование распознаваемых по массе меток, высвобожденных в (е); посредством чего присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяют по присутствию или отсутствию соответствующей распознаваемой по массе метки.
В некоторых вариантах осуществления эти удлиненные олигонуклеотиды, высвобожденные в (е), или распознаваемые по массе метки, ассоциированные или отщепленные от высвобожденных удлиненных олигонуклеотидов, детектируют масс-спектрометрией.
В некоторых вариантах осуществления распознаваемую по массе метку не отщепляют и не высвобождают из удлиненных олигонуклеотидов, а в некоторых вариантах осуществления эту распознаваемую по массе метку отщепляют и высвобождают из удлиненных олигонуклеотидов.
В некоторых вариантах осуществления эта распознаваемая по массе метка является удлиненным олигонуклеотидом.
В некоторых вариантах осуществления удлинение в (с) выполняют один раз с получением одного удлиненного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления удлинение в (с) выполняют много раз (например, в условиях амплификации) с получением множественных копий этого удлиненного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления раствор, содержащий ампликоны (например, ампликоны, полученные в (а)), обрабатывают агентом, который удаляет концевые фосфаты из любых нуклеотидов, не включенных в эти ампликоны. Этот концевой фосфат иногда удаляют контактированием ампликонов с фосфатазой, и в некоторых вариантах осуществления, эта фосфатаза является щелочной фосфатазой (например, щелочной фосфатазой креветок).
В некоторых вариантах осуществления обеспечен также способ для определения присутствия или отсутствия множества нуклеиновых кислот-мишеней в композиции, который предусматривает (а) контактирование нуклеиновых кислот-мишеней в растворе с набором олигонуклеотидов в условиях гибридизации, где (ί) каждый олигонуклеотид в этом наборе содержит гибридизационную последовательность, способную специфически гибридизоваться с одним видом нуклеиновой кислоты-мишени в условиях гибридизации, когда эта нуклеиновая кислота-мишень присутствует в этом растворе; (Ь) генерирование удлиненных олигонуклеотидов, которые содержат захватывающий агент, удлинением олигонуклеотидов, гибридизованных с ампликонами, одним или несколькими нуклеотидами в условиях амплификации, где один из этих одного или нескольких нуклеотидов является терминирующим нуклеотидом и один или несколько нуклеотидов, добавленных к этим олигонуклеотидам, содержат захватывающий агент; (с) контактирование этих удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой в условиях, в которых этот захватывающий агент взаимодействует с этой твердой фазой; (й) высвобождение удлиненных олигонуклеотидов, которые взаимодействовали с этой твердой фазой, конкуренцией с конкурирующим агентом (конкурентом) и (е) детектирование удлиненных олигонуклеотидов, высвобожденных в (й); посредством чего присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяют по присутствию или отсутствию соответствующего удлиненного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления (ί) масса одного вида олигонуклеотида детектируемо отличается от масс других видов олигонуклеотидов в этом наборе; и (ίί) каждый вид олигонуклеотида специфически соответствует специфическому ампликону и посредством этого специфически соответствует
- 2 027558 специфической нуклеиновой кислоте-мишени. В некоторых вариантах осуществления (ί) каждый олигонуклеотид в этом наборе включает распознаваемую по массе метку, расположенную 5' (слева) от гибридизационной последовательности, (ίί) эта масса распознаваемой по массе метки одного олигонуклеотида детектируемо отличается от масс распознаваемых по массе меток других олигонуклеотидов в этом наборе и (ίίί) каждая распознаваемая по массе метка специфически соответствует специфическому ампликону и посредством этого специфически соответствует специфической нуклеиновой кислоте-мишени, эту массу распознаваемой по массе метки детектируют масс-спектрометрией, и присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяют по присутствию или отсутствию соответствующей распознаваемой по массе метки. В некоторых вариантах осуществления детектирование распознаваемой по массе метки детектирует удлиненный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления детектирование распознаваемой по массе метки детектирует удлиненный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления эти удлиненные олигонуклеотиды, высвобожденные в (ά), или распознаваемые по массе метки, ассоциированные или отщепленные от этих высвобожденных удлиненных олигонуклеотидов, детектируют масс-спектрометрией.
Любая подходящая процедура амплификации может быть использована в описанных здесь анализах мультиплексного детектирования, и иногда в некоторых вариантах осуществления используют процедуру, которая предусматривает (а) контактирование нуклеиновых кислот-мишеней с набором первых полинуклеотидов, где каждый первый полинуклеотид содержит (1) первую комплементарную последовательность, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, и (2) первую метку, расположенную 5' (слева) от этой комплементарной последовательности; (Ь) получение удлиненных первых полинуклеотидов удлинением первого полинуклеотида; (с) присоединение второго полинуклеотида к З'-концу удлиненных первых полинуклеотидов, где этот второй полинуклеотид содержит вторую метку; (ά) контактирование продукта (с) с праймером и удлинение этого праймера, где этот праймер гибридизуется с первой меткой или второй меткой; и (е) амплификацию продукта (с) с набором праймеров в условиях амплификации, где один праймер в этом наборе гибридизуется с одной из этих меток и другой праймер в этом наборе гибридизуется с комплементом другой метки. В некоторых вариантах осуществления линейную амплификацию выполняют с одним набором праймеров. В некоторых вариантах осуществления второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью. Эти нуклеотидная последовательность первой метки и нуклеотидная последовательность второй метки являются разными в некоторых вариантах осуществления и являются идентичными или комплементарными друг другу в других вариантах осуществления.
В некоторых вариантах осуществления эта первая метка и эта вторая метка включены в каждом из продуктов амплификации, продуцированных в (е). Такой способ амплификации может дополнительно предусматривать (Г) контактирование ампликонов в растворе с набором олигонуклеотидов в условиях гибридизации, где каждый олигонуклеотид в этом наборе содержит гибридизационную последовательность, способную специфически гибридизоваться с одним ампликоном в условиях гибридизации, когда этот ампликон присутствует в этом растворе; (д) генерирование удлиненных олигонуклеотидов, которые содержат захватывающий агент, удлинением олигонуклеотидов, гибридизованных с ампликонами одного или нескольких нуклеотидов, где один из этих одного или нескольких нуклеотидов является терминирующим нуклеотидом и один или несколько из нуклеотидов, добавленных к этим олигонуклеотидам, содержат захватывающий агент; (Ь) контактирование удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой в условиях, в которых этот захватывающий агент взаимодействует с этой твердой фазой; (ί) высвобождение удлиненных олигонуклеотидов, которые взаимодействовали с этой твердой фазой, посредством конкуренции с конкурирующим агентом; и (]) детектирование высвобожденных удлиненных олигонуклеотидов в (ί); посредством этого присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяют по присутствию или отсутствию удлиненного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления удлинение в (д) выполняют один раз с получением удлиненного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления удлинение в (д) выполняют много раз (например, в условиях амплификации) с получением множественных копий удлиненного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления (ί) масса одного вида олигонуклеотида детектируемо отличается от масс других видов олигонуклеотидов в этом наборе; и (ίί) каждый вид олигонуклеотида специфически соответствует специфическому ампликону и тем самым специфически соответствует специфической нуклеиновой кислоте-мишени. В некоторых вариантах осуществления (ί) каждый олигонуклеотид в этом наборе включает распознаваемую по массе метку (тэг), расположенную 5' (слева) от гибридизационной последовательности, (ίί) масса распознаваемой по массе метки одного олигонуклеотида детектируемо отличается от масс распознаваемых по массе меток других олигонуклеотидов в этом наборе и (ίίί) каждая распознаваемая по массе метка специфически соответствует специфическому ампликону и посредством этого специфически соответствует специфической нуклеиновой кислоте-мишени, массу распознаваемой по массе нуклеиновой кислоты-мишени детектируют масс-спектрометрией, а присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяют по присутствию или отсутствию соответствующей распознаваемой по массе метки.
- З 027558
В некоторых вариантах осуществления детектирование распознаваемой по массе метки детектирует удлиненный олигонуклеотид.
В некоторых вариантах осуществления детектирование распознаваемой по массе метки детектирует удлиненный олигонуклеотид.
В некоторых вариантах осуществления конкуренция с конкурирующим агентом (конкурентом) включает контактирование твердой фазы с конкурирующим агентом.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотид, который включает захватывающий агент, является захватывающим агентом, конъюгированным с нуклеотидтрифосфатом.
В некоторых вариантах осуществления этот нуклеотидтрифосфат является дидезоксинуклеотидтрифосфатом.
В некоторых вариантах осуществления захватывающий агент включает член пары связывания.
В некоторых вариантах осуществления этот захватывающий агент включает биотин или аналог биотина, и в некоторых вариантах осуществления эта твердая фаза включает авидин или стрептавидин.
В некоторых вариантах осуществления этот захватывающий агент включает авидин или стрептавидин, и в некоторых вариантах осуществления эта твердая фаза включает биотин.
В некоторых вариантах осуществления высвобождение распознаваемых по массе меток посредством конкуренции с конкурирующим агентом проводят в условиях повышенной температуры.
В некоторых вариантах осуществления условия повышенной температуры включают обработку в течение от приблизительно 1 до приблизительно 10 мин (например, приблизительно 1 мин, от приблизительно 2 до приблизительно 3 мин, приблизительно 4 мин, приблизительно 5 мин, приблизительно 6 мин, приблизительно 7 мин, приблизительно 8 мин, приблизительно 9 мин или приблизительно 10 мин) при температуре от приблизительно 80 до приблизительно 100 °С (например, приблизительно 80°С, приблизительно 81°С, приблизительно 82°С, приблизительно 83°С, приблизительно 84°С, приблизительно 85°С, приблизительно 86°С, приблизительно 87°С, приблизительно 88°С, приблизительно 89°С, приблизительно 90°С, приблизительно 91°С, приблизительно 92°С, приблизительно 93°С, приблизительно 94°С, приблизительно 95°С, приблизительно 96°С, приблизительно 97°С, приблизительно 98°С, приблизительно 99°С или приблизительно 100°С).
В некоторых вариантах осуществления условия повышенной температуры включает в себя обработку в течение, например, приблизительно 5 мин приблизительно при 90°С.
В некоторых вариантах осуществления, например, (с) генерирование удлиненных олигонуклеотидов, которые включают захватывающий агент, удлинением олигонуклеотидов, гибридизованных с ампликонами, одним или несколькими нуклеотидами, где один из этих одного или нескольких нуклеотидов является терминирующим нуклеотидом и один или несколько из нуклеотидов, добавленных к этим олигонуклеотидам, включает захватывающий агент, проводят в одном контейнере, и этот способ дополнительно предусматривает перенос высвобожденных распознаваемых по массе меток в другой контейнер между (е) и (ί).
В некоторых вариантах осуществления раствор, содержащий ампликоны, полученные в (а), обрабатывают агентом, который удаляет терминальные фосфаты из любых нуклеотидов, не включенных в эти ампликоны.
В некоторых вариантах осуществления терминальный фосфат удаляют контактированием этого раствора с фосфатазой.
В некоторых вариантах осуществления эта фосфатаза является щелочной фосфатазой, и в некоторых вариантах осуществления эта щелочная фосфатаза является щелочной фосфатазой креветок.
В некоторых вариантах осуществления эти терминальные нуклеотиды в удлиненных олигонуклеотидах содержат захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления один или несколько нетерминальных нуклеотидов в удлиненных олигонуклеотидах содержат захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления гибридизационная последовательность имеет длину от приблизительно 5 до приблизительно 200 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления эта гибридизационная последовательность в каждом олигонуклеотиде имеет длину от приблизительно 5 до приблизительно 50 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления терминальные нуклеотиды в удлиненных олигонуклеотидах содержат захватывающий агент, и иногда один или несколько нетерминальных нуклеотидов в удлиненных олигонуклеотидах содержат этот захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления захватывающий агент содержит биотин или, альтернативно, авидин или стрептовидин, и в этом случае твердая фаза содержит авидин или стрептавидин, или биотин соответственно.
Распознаваемая метка различается в некоторых вариантах осуществления частично по массе (т.е. распознаваемая по массе метка, где признаком распознаваемости является масса). Эта распознаваемая метка в некоторых вариантах осуществления состоит из нуклеотидов, и иногда эта метка имеет длину от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 50 нуклеотидов. Эта распознаваемая метка в некоторых вариантах осуществления является нуклеотидным компомером, который иногда имеет длину от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 35 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления эта распознаваемая метка является пептидом, который иногда имеет длину от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 100 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления эта распозна- 4 027558 ваемая метка является конкатемером единиц органических молекул. В некоторых вариантах осуществления эта метка является молекулярным конкатемером тритила.
В некоторых вариантах осуществления твердая фаза выбрана из плоской поверхности, кремниевого кристалла (чипа), бусины, сферы или комбинации предыдущих компонентов. Твердая фаза иногда является парамагнитной. В некоторых вариантах осуществления твердая фаза является парамагнитной бусиной, и в некоторых вариантах осуществления эта твердая фаза включает захватывающий агент.
В некоторых вариантах осуществления присутствие или отсутствие приблизительно 50 или более видов нуклеиновых кислот-мишеней детектируют описанным здесь способом. В некоторых вариантах осуществления детектируют приблизительно 100 или более, 150 или более, 200 или более, 250 или более, 300 или более, 325 или более, 350 или более, 375 или более, 400 или более, 425 или более, 450 или более, 475 или более или 500 или более нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления присутствие, отсутствие или количество приблизительно 2-500 видов нуклеиновых кислот-мишеней детектируют описанным здесь способом (например, приблизительно 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 видов нуклеиновых кислот). Эти нуклеиновые кислоты-мишени в некоторых вариантах осуществления являются геномной ДНК (например, геномной ДНК человека, микробной, вирусной, грибковой или растительной ДНК; любой эукариотической или прокариотической нуклеиновой кислотой (РНК и ДНК)). В некоторых вариантах осуществления этими олигонуклеотидами являются РНК или ДНК.
В некоторых вариантах осуществления масс-спектрометрией является выполняемая на основе матрикса лазерная десорбционная/ионизационная-времяпролетная масс-спектрометрия (ΜΑΕΌΙ-ΤΘΡ-Μδ). В некоторых вариантах осуществления эта масс-спектрометрия является электрораспылительной массспектрометрией (Εδ-Μδ). В некоторых вариантах осуществления детектируют присутствие или отсутствие от приблизительно 1 до приблизительно 50 или более нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления распознаваемая по массе метка состоит из нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления распознаваемой по массе меткой является нуклеотидный компомер. В некоторых вариантах осуществления этот нуклеотидный компомер имеет длину от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 150 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты-мишени являются геномной ДНК, и в некоторых вариантах осуществления эта геномная ДНК является геномной ДНК человека.
В некоторых вариантах осуществления детектирование включает увеличенное соотношение сигнал/шум, когда высвобождение включает конкуренцию с конкурирующим агентом, в сравнении с высвобождением, которое не включает конкуренции с конкурирующим агентом. В некоторых вариантах осуществления это детектирование имеет соотношение сигнал/шум, большее, чем соотношение сигнал/шум для детектирования после высвобождения без конкуренции с конкурирующим агентом. В некоторых вариантах осуществления соотношение сигнал/шум для удлинения только мутанта является более высоким, чем соотношение сигнал/шум для удлинения аллеля дикого типа и мутантного аллеля. В некоторых вариантах осуществления чувствительность детектирования мутантного аллеля является более высокой для удлинения только мутантного аллеля, чем для удлинения аллеля дикого типа и мутантного аллеля. В некоторых вариантах осуществления детектирование имеет соотношение сигнал/шум более высокое, чем соотношение сигнал/шум для способа, в котором высвобождение не предусматривает конкуренции с конкурирующим агентом.
В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ для детектирования присутствия, отсутствия или количества множественных генетических вариантов в композиции, предусматривающий (а) получение множества ампликонов, произведенных из множества видов нуклеиновых кислотмишеней, или их частей, где каждый вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит первый вариант и второй вариант; (Ь) гибридизацию этих ампликонов с видами олигонуклеотидов, где каждый вид олигонуклеотида гибридизируется с ампликоном, произведенным из вида нуклеиновой кислоты-мишени, с генерированием посредством этого гибридизированных видов олигонуклеотидов; и (с) контактирование этих гибридизированных видов олигонуклеотидов с удлиненной композицией, содержащей один или несколько терминирующих нуклеотидов, в условиях удлинения; где (ί) по меньшей мере один из этих одного или нескольких терминирующих нуклеотидов содержит захватывающий агент и (ίί) эти гибридизированные виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются с первым вариантом, удлиняются терминирующим нуклеотидом и гибридизированными видами олигонуклеотидов, и гибридизированные виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются со вторым вариантом, не удлиняются терминирующим нуклеотидом, с генерированием посредством этого удлиненных видов олигонуклеотидов; (ά) захват удлиненных видов олигонуклеотидов твердой фазой, которая захватывает этот захватывающий агент; (е) высвобождение удлиненных видов олигонуклеотидов, связанных с этой твердой фазой в (ά), из этой твердой фазы; и (Г) детектирование массы каждого вида удлиненного олигонуклеотида, высвобожденного из этой твердой фазы в (е), масс-спектрометрией; посредством чего детектируют присутствие, отсутствие или количество этих генетических вариантов. В некоторых вариантах осуществления удлиненные виды олигонуклеотидов второго варианта не детектируются. В некоторых вариантах осуществления каждый вид олигонуклеотида содержит распознаваемую по массе метку, расположенную 5' (слева) от гиб- 5 027558 ридизационной последовательности. В некоторых вариантах осуществления способ содержит первый вариант и второй вариант, где этот первый вариант является вариацией менее высокой встречаемости, а второй вариант является вариацией более высокой встречаемости. В некоторых вариантах осуществления эти генетические варианты являются вариантами однонуклеотидного полиморфизма (8ΝΡ), первый вариант является аллелем менее высокой встречаемости, а второй вариант является аллелем более высокой встречаемости. В некоторых вариантах осуществления эти один или несколько терминирующих нуклеотидов состоят из одного терминирующего нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления эти один или несколько терминирующих нуклеотидов состоят из двух терминирующих нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или несколько терминирующих нуклеотидов состоят из трех терминирующих нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления эти один или несколько терминирующих нуклеотидов независимо выбраны из άάΛΤΡ, άάΟΤΡ, ббСТР. άάΤΤΡ и άάυΤΡ. В некоторых вариантах осуществления эта удлиненная композиция содержит нетерминирующий нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления эта удлиненная композиция содержит один или несколько удлиняющих нуклеотидов, которые не содержат захватывающего агента. В некоторых вариантах высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов включает контактирование твердой фазы с высвобождающим агентом. В некоторых вариантах осуществления захватывающий агент содержит биотин или аналог биотина, эта твердая фаза содержит стрептавидин, и высвобождающий агент содержит свободный биотин или аналог биотина. В некоторых вариантах осуществления свободный биотин или аналог биотина является высвобождающим агентом. В некоторых вариантах осуществления свободный биотин или аналог биотина добавляют в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 100 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления свободный биотин или аналог биотина добавляют в концентрации приблизительно 25 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления этот захватывающий агент имеет более высокую аффинность в отношении твердой фазы, чем этот захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов включает нагревание от приблизительно 30 до приблизительно 100°С. В некоторых вариантах осуществления высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов включает нагревание от приблизительно 60°до приблизительно 100°С. В некоторых вариантах осуществления высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов включает нагревание от приблизительно 89 до приблизительно 100°С. В некоторых вариантах осуществления высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов включает нагревание до приблизительно 90°С. В некоторых вариантах осуществления эту твердую фазу промывают после захвата удлиненного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления это промывание удаляет соли, которые продуцируют мешающие аддукты в анализе с использованием масс-спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления удлиненный олигонуклеотид не контактируют со смолой (например, ионообменной смолой).
В некоторых вариантах осуществления множество видов нуклеиновых кислот-мишеней равно 20 или более видов нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления множество видов нуклеиновых кислот-мишеней равно 200 или более видов нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления множество видов нуклеиновых кислот-мишеней равно 200-300 видов нуклеиновых кислот-мишеней.
В некоторых вариантах осуществления условия удлинения включают повторение циклов 20-300 раз. В некоторых вариантах осуществления условия удлинения включают в себя повторение циклов 200300 раз.
В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая множество генетических вариантов, содержит синтетическую матрицу. В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая множество генетических вариантов, содержит синтетическую матрицу, и определяют количество и/или процент первого варианта в этой композиции, где эта синтетическая матрица содержит вариант, другой, чем в первом варианте и втором варианте, и гибридизуется с тем же самым видом олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления множество ампликонов содержат синтетическую матрицу, и определяют количество и/или процент первого варианта в этой композиции, где эта синтетическая матрица содержит вариант, другой, чем в первом варианте и втором варианте, и гибридизуется с тем же самым видом олигонуклеотида.
Некоторые варианты описаны далее в следующем описании, формуле изобретения и фигурах.
- 6 027558
Краткое описание фигур
Эти фигуры иллюстрируют некоторые неограничивающие варианты этой технологии и необязательно являются масштабированными.
Фиг. 1 показывает амплификацию представляющего интерес гена, использующую удлинение геноспецифического праймера универсальной ПЦР-меткой и последующее лигирование одной цепи со второй универсальной меткой с последующей эндонуклеазной очисткой и амплификацией с использованием метки 1 и метки 2 (Концепт 1).
Фиг. 2 показывает амплификацию представляющего интерес гена, использующую геноспецифический биотинилированный праймер с универсальной меткой 3, которая удлиняется на матрице и затем лигируется справа с геноспецифической фосфорилированной олигонуклеотидной меткой 4 на той же самой цепи. Этот продукт затем амплифицируют с использованием метки 3 и метки 4 (Концепт 2).
Фиг. 3 показывает универсальные ПЦР-продукты из процедур как Концепта 1, так и Концепта 2 из фиг. 1 и 2, которые могут быть идентифицированы с использованием пост-ПЦР-реакции (1РЬЕХ Оо1б, 8едиеиот).
Фиг. 4 показывает спектры ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ Μδ для генотипирования однонуклеотидного полиморфизма (6ϋδΝΡ # Т810063237) с использованием протокола Концепта 1.
Фиг. 5А показывает спектры ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ Μδ для генотипирования г§1015731 с использованием протокола Концепта 2.
Фиг. 5В показывает спектры ΜΑΕΌΙ-ΤΟΡ Μδ для генотипирования 12 мишеней (например, 12плексную реакцию) с использованием протокола Концепта 2.
Фиг. 5С показывает спектры ΜΑΕΌΙ-ΤΟΡ Μδ для генотипирования 19-плексной реакции с использованием протокола Концепта 2.
Фиг. 5Ό показывает спектры ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ Μδ для генотипирования 35-плексной реакции с использованием протокола Концепта 2.
Фиг. 5Е показывает генотипы, полученные из спектров ΜΑΕΌΙ-ΤΟΡ Μδ из Фиг. 5С (19-плексный) и Фиг. 5Ό (35-плексный).
Фиг. 6 показывает ПЦР-амплификацию и пост-ПЦР-праймерное удлинение аллельспецифическими праймерами удлинения, содержащими аллель-специфические метки массы.
Фиг. 7 показывает спектры ΜΑΕΌΙ-ΤΟΡ Μδ для 35-плексного генотипирования с использованием пост-ПЦР-праймерного удлинения аллель-специфическими праймерами удлинения, содержащими аллель-специфические метки массы в виде считывания.
Фиг. 8 показывает спектры ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ Μδ для генотипирования г§1000586 и г§10131894.
Фиг. 9 показывает метки массы олигонуклеотидов, соответствующие 70-плексному анализу. Все олигонуклеотиды разводили до конечной общей концентрации 10 пмоль и наносили в виде пятен на 384луночный чип. Величины для площади, высоты пиков и соотношения сигнал/шум собирали из Τуρе^ 3.4 ^ециеиот).
Фиг. 10 показывает площади пиков для меток массы олигонуклеотидов, соответствующие 70плексному анализу, сортированному посредством нуклеотидной композиции. Все олигонуклеотиды разводили до конечной общей концентрации 10 пмоль и наносили в виде пятен на 384-луночный чип. Величины площадей собирали из Τуρе^ 3.4 ^есцгепот).
Фиг. 11А показывает спектр (масштабированные виды) олигонуклеотидных меток, соответствующий 100-плексному анализу.
Фиг. 11В показывает соотношения сигнал/шум олигонуклеотидных меток, соответствующие 100-плексному анализу. Все олигонуклеотиды разводили до конечной общей концентрации 10, 5, 2,5 или 1 пмоль, с 8 повторностями, нанесенными на 384-луночный чип. Величины для соотношения сигнал/шум собирали из Τуρе^ 3.4 ^есцгепот).
Фиг. 11С показывает спектр ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ Μδ (масштабированные виды) 100-плексного анализа после ПЦР-амплификации и пост-ПЦР-удлинения праймеров аллель-специфическими праймерами удлинения, содержащими аллель-специфические метки массы.
Фиг. 12 показывает степени удлинения для 5-плексной реакции. Сравнение удлиненных олигонуклеотидов с дезоксиинозином или без дезоксиинозина и либо стандартными 66ΝΤΡ, либо нуклеотидами, содержащими биотиновую часть. Степени удлинения рассчитывали делением площади удлиненного продукта на общую площадь этого пика (удлиненного продукта и неудлиненного олигонуклеотида) в Τуρе^ 3.4 ^есщепот). Все эксперименты сравнивают шесть ДНК.
Фиг. 13 показывает степени удлинения для 7-плексных и 5-плексных реакций на протяжении двух ДНК. Результаты сравнивают удлинение единственным 66ΝΤΡ или биотинилированным 6ΝΤΡ и терминированным немодифицированным 66ΝΤΡ, и конечные количества биотинилированного 6ΝΤΡ или 66ΝΤΡ 210 или 420 пмоль добавляют к этой реакции. Степени удлинения рассчитывали делением площади удлиненного продукта на общую площадь этого пика (удлиненного продукта и неудлиненного олигонуклеотида) в Τуρе^ 3.4. Все эксперименты включают в себя две повторности ДНК СеШге бе'Ешбе би Ρо1уто^ρЬ^8те Ниташ (СЕРН), ΝΑ07019 и ΝΑ11036.
- 7 027558
Фиг. 14 показывает сравнение концентраций фермента 1РЬЕХ Οοΐά в реакции удлинения с использованием 70-плексного анализа. Все анализы выполняли по одному и тому же протоколу, за исключением количества фермента 1РЬЕХ Οοΐά. Все эксперименты включают в себя четыре повторности двух СЕРН ДНК ΝΑ06991 и ΝΑ07019. Эти результаты сравнивают соотношения сигнал/шум удлиненных продуктов из Турег 3.4 (Зесцкпот).
Фиг. 15 показывает сравнение концентрации буфера 1РЬЕХСо1Д в реакциях удлинения с использованием 70-плексного анализа. Все анализы выполняли по одному и тому же протоколу, за исключением используемого количества буфера до1ДРЬЕХ. Все эксперименты включают в себя четыре повторности СЕРН двух ДНК ΝΑ06991 и ΝΑ07019. Эти результаты сравнивают соотношения сигнал/шум удлиненных продуктов из Турег 3.4 (Зесщепош).
Фиг. 16-19 показывают сравнение концентрации удлиненного олигонуклеотида в реакциях удлинения с использованием 70-плексного анализа. Все анализы выполняли по одному и тому же протоколу, за исключением используемого количества удлиненного олигонуклеотида. Все эксперименты включают в себя четыре повторности двух СЕРН ДНК ΝΑ06991 и ΝΑ07019. Эти результаты сравнивают соотношения сигнал/шум удлиненных продуктов из Турег 3.4 (Зесщепош).
Фиг. 20 и 21 показывают сравнение концентрации биотинилированного ДДКГР в реакциях удлинения с использованием 70-плексного анализа. Все анализы выполняли по одному и тому же протоколу, за исключением используемого количества биотинилированного ДДКГР (величина показывает конечное количество каждого биотинилированного нуклеотида). Все эксперименты включают в себя четыре повторности двух СЕРН ДНК ΝΑ06991 и ΝΑ07019. Эти результаты сравнивают соотношения сигнал/шум удлиненных продуктов из Турег 3.4 (Зециепот).
Фиг. 22 показывает сравнение магнитных стрептавидиновых бусин §о1ийпк и ЭупаЬеа05 МуОпе С1 для захвата удлиненных продуктов. Общее количество 10 пмоль каждого олигонуклеотида, соответствующее двум возможным аллелям, связывали с этими магнитными стрептавидиновыми бусинами, в присутствии либо воды, либо варьирующихся количеств биотинилированных άΝΊΤ (в целом 10, 100 или 500 пмоль). Затем метки массы отщепляли из этого связанного олигонуклеотида 10 Е эндонуклеазы V. Эти результаты сравнивают площадь пиков метки массы из Турег 3.4 (Зесщепош) и перечисляют в сравнении с 10 пмоль олигонуклеотида, который имеет сходную массу.
Фиг. 23 показывает анализ способности эндонуклеазы V расщеплять удлиненный продукт, содержащий нуклеотид дезоксиинозин в различных положениях. Эти олигонуклеотиды были идентичными за исключением наличия дезоксиинозина в 10, 15, 20 или 25 основаниях от 3'-конца этого олигонуклеотида. После связывания этого олигонуклеотида с магнитными стрептавидиновыми бусинами, этот супернатант собирали, очищали при помощи набора для удаления нуклеотидов (Ц1адеп) и затем очищали обработкой эндонуклеазой V (названный несвязанным олигонуклеотидом). Эти бусины промывали и расщепляли эндонуклеазой V, как описано в разделе Протоколы (названный захваченным/расщепленным). Эти результаты сравнивают площадь пиков из Турег 3.4 (Зециепот) и перечислены в виде процента олигонуклеотида, расщепленного эндонуклеазой V, без связывания с магнитными стрептавидиновыми бусинами.
Фиг. 24 показывает сравнение магнитных стрептавидиновых бусин и концентрации эндонуклеазы V с использованием 70-плексного анализа. Все анализы проводили с использованием одних и тех же условий, за исключением количества магнитных стрептавидиновых бусин и эндонуклеазы V. Все эксперименты включают в себя четыре повторности СЕРН ДНК ΝΑ07019. Эти результаты сравнивают соотношение сигнал/шум из Турег 3.4.
Фиг. 25 и 26 показывают сравнение магнитных стрептавидиновых бусин и концентрации эндонуклеазы V с использованием 70-плексного анализа. Все анализы проводили с использованием одного и того же протокола, за исключением количества магнитных стрептавидиновых бусин и эндонуклеазы V. Все эксперименты включают в себя четыре повторности двух СЕРН ДНК ΝΑ06991 и ΝΑ07019. Эти результаты сравнивают соотношение сигнал/шум из Турег 3.4.
Фиг. 27Α-27Ο показывают схематическое представление способа конкуренции с биотином для высвобождения представляющего интерес биотинилированного продукта амплификации из покрытой стрептавидином магнитной или парамагнитной бусины. В панели А представляющий интерес район является ПЦР-амплифицированным (например, с использованием униплексных или мультиплексных способов) с последующим дефосфориливанием амплифицированных продуктов щелочной фосфатазой креветки (не показанным в диаграмме). Панель В иллюстрирует удлинение единственным основанием биотинилированных дидезоксинуклеотидов через представляющий интерес остаток в продукт, амплифицированный в панели А. Панель С иллюстрирует захват этих биотинилированных удлиненных продуктов покрытыми стрептавидином магнитными бусинами. Панель Ό иллюстрирует стадию промывания для удаления неиспользованных компонентов реакции с последующей стадией захвата для захвата покрытых стрептавидином магнитных бусин, с которыми связываются биотинилированные удлиненные продукты. Панель Е иллюстрирует высвобождение биотинилированных удлиненных продуктов из этих покрытых стрептавидином магнитных бусин конкуренцией со свободным биотином. Панель Р иллюстрирует очищенные биотинилированные удлиненные продукты, которые могут быть дополнительно анализированы с использованием различных способов, включающих выполняемую на основе матрикса лазерную де- 8 027558 сорбционную/времяпролетную (ΜΆΕΌΙ-ΤΘΡ) масс-спектрометрию (МЗ). Для применения в массспектрометрии МАЕЭ1-ТОЕ эти выделенные удлиненные продукты могут быть распределены, например, на Зрес1тоСН1Р® (Зециепот). Панель С иллюстрирует репрезентативный масс-спектр из анализа МАЕЭ1-ТОЕ МЗ биотинилированного удлиненного продукта, генерированного, как описано здесь. См. Пример 12 в отношении деталей и результатов.
Фиг. 28 является репрезентативным масс-спектром различия масс различных аллельных вариантов (например, полиморфизма), измеренного анализом МАБЭ1-ТОЕ МЗ удлиненных единственным основанием продуктов, генерированных с использованием биотинилированных дидезоксинуклеотидных терминаторов и высвобожденных из твердой поверхности конкуренцией с биотином, как описано здесь и иллюстрировано в Фиг. 27А-С в отношении экспериментальных деталей и результатов.
Фиг. 29А-С иллюстрируют блок-схему, показывающую механизм стадии высвобождения конкуренцией биотина.
Фиг. 30А иллюстрирует блок-схему, показывающую механизм стадии высвобождения расщеплением инозина. Стадии являются теми же самыми, что и для способа захвата биотина через стадию промывания, за исключением того, что удлиненные олигонуклеотиды имеют 5'-метку массы, разделенную остатком инозина. Эти метки массы отщепляются из захваченных продуктов через расщепление эндонуклеазой V, специфической в отношении остатков инозина.
Фиг. 30В иллюстрирует детектирование отщепленных меток массы на МАБ-ЭЕ Эта масса представляет генетический вариант.
Фиг. 31 показывает сравнительные результаты конкуренции биотина через расщепление инозина с использованием различных концентраций З'-биотинилированных олигонуклеотидов и различных захватывающих бусин.
Фиг. 32 показывает сравнительные результаты конкуренции биотина через расщепление инозина с использованием бусин Эупа1 С1. Пик масс-спектра, представляющий детектированный захватывающий олигонуклеотид и детектированный количественно олигонуклеотид, показан направленными вниз стрелками.
Фиг. 32А показывает результаты конкуренции биотина с использованием стрептавидиновых бусин Эупа1 С1 для захвата и свободного биотина для конкуренции. Концентрация тестированных биотинилированного олигонуклеотида и ссылочного олигонуклеотида (т.е. количественно охарактеризованного олигонуклеотида) была равна 0,031 мкМ.
Фиг. 32В показывает результаты высвобождения расщеплением инозина с использованием стрептавидиновых бусин Эупа1 С1 для захвата и эндонуклеазы V для высвобождения. Концентрация тестируемого биотинилированного олигонуклеотида и ссылочного олигонуклеотида (т.е. количественно охарактеризованного олигонуклеотида) была равна 0,031 мкМ.
Фиг. 33 показывает оценивание различных захватывающих бусин с использованием конкурирующей матрицы.
Фиг. 34 показывает результаты масс-спектрометрии из анализа, использующего очень низкую конкурирующую матрицу (приблизительно 30 молекул) для каждого тестируемого типа бусин. Пик массспектра, представляющий детектированный захватывающий олигонуклеотид и детектированный количественно охарактеризованный олигонуклеотид, показан направленными вниз стрелками.
Фиг. 34А показывает результаты с использованием бусин Эуиа1 С1. Фиг. 34В показывает результаты с использованием бусин Зо1и11пк.
Фиг. 34С показывает результаты с использованием бусин Эупа1 М270.
Фиг. 35 показывает детектирование мутаций ВКАР-2 и ВКАР-15 с использованием различных удлиненных композиций и демонстрирует увеличение соотношения сигнал/шум, когда άάΝΤΡ, соответствующие дикому виду (например, более часто встречающемуся варианту), исключены из удлиненной композиции.
Фиг. 36 показывает результаты конкурентного анализа с 1% редким аллелем.
Фиг. 37 иллюстрирует плазмидную модель, которая может быть расщеплена расщеплением рестриктазой ЕсоК1 для разделения этих районов и более адекватного отражения геномного контекста.
- 9 027558
Подробное описание
Способы для определения присутствия или отсутствия множества нуклеиновых кислот-мишеней в композиции, описанной здесь, находят множественные применения лицами с обычной квалификацией в данной области (далее называемыми здесь лицами с обычной квалификацией в данной области). Такие способы могут быть использованы, например, для (а) быстрого определения, присутствует ли конкретная последовательность-мишень (например, последовательность-мишень, содержащая генетическую вариацию) в пробе; (Ь) выполнения анализа смеси, например, идентификации смеси и/или ее композиции или определения частоты последовательности-мишени в смеси (например, смешанных сообществ, квазивидов); (с) детектирования вариаций последовательностей (например, мутаций, однонуклеотидных полиморфизмов) в пробе; (ά) выполнения гаплотипических определений; (е) выполнения типирования микроорганизмов (например, патогена); (ί) детектирования присутствия или отсутствия последовательности микроорганизма-мишени в пробе; (д) идентификации маркеров заболевания; (к) детектирования микросателлитов; (ί) идентификации коротких тандемных повторов; (]) идентификации организма или организмов; (к) детектирования аллельных вариаций; (1) определения аллельной частоты; (т) определения картин метилирования; (п) выполнения эпигенетических определений; (о) ресеквенирования района биомолекулы; (р) выполнения анализов в клинических исследованиях человека и медицине (например, детектирования раковых маркеров, детектирования вариацией последовательностей, детектирования сигнатур последовательностей, благоприятных или неблагоприятных для конкретного введения лекарственных средств), (с|) выполнения типирования НЬА; (г) выполнения анализов судебной медицины; (8) выполнения контрольных анализов качества вакцин; (ΐ) мониторинга терапий; (и) выполнения анализов идентичности векторов; (ν) выполнения контроля качества вакцин или качества продукционного штамма и (те) тестирования идентичности штамма (х) растений. Такие способы могут быть также использованы, например, в различных областях, в том числе, без ограничений, в коммерческой, воспитательной, медицинской, сельскохозяйственной, относящейся к окружающей среде, относящейся к мониторингу, военной защите и судебной медицине областях.
Нуклеиновые кислоты-мишени.
В данном контексте термин нуклеиновая кислота относится к олигонуклеотиду или полинуклеотиду, включающему, без ограничений ими, природные нуклеиновые кислоты (например, дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК)), синтетические нуклеиновые кислоты, неприродные нуклеиновые кислоты (например, пептидонуклеиновую кислоту (ПНК)), немодифицированные нуклеиновые кислоты, модифицированные нуклеиновые кислоты (например, метилированную ДНК или РНК, меченую ДНК или РНК, ДНК или РНК, имеющие один или несколько модифицированных нуклеотидов). Ссылка на нуклеиновую кислоту как полинуклеотид относится к двум или более нуклеотидам или аналогам нуклеотидов, связанных ковалентной связью. Нуклеиновые кислоты могут быть нуклеиновыми кислотами любого типа, подходящего для применения в описанных здесь способах. Нуклеиновой кислотой в некоторых вариантах осуществления может быть ДНК (например, комплементарная ДНК (кДНК), геномная ДНК (гДНК), плазмиды и векторные ДНК и т.п.), РНК (например, вирусная РНК, мессенджер-РНК (мРНК), короткая ингибиторная РНК (δίΡΝΑ), рибосомная РНК (рРНК), тРНК и т.п.), и/или аналоги ДНК или РНК (например, содержащие основание аналоги, сахарные аналоги и/или ненативные скелеты и т.п.). Нуклеиновая кислота может быть в любой форме, применимой для проведения описанных здесь способов (например, линейной, кольцевой, суперспиральной, одноцепочечной, двухцепочечной и т.п.). Нуклеиновая кислота может быть, или может быть произведена из, плазмидой, фагом, автономно реплицирующейся последовательностью (АКБ), центромером, искусственной хромосомой, хромосомой, клеткой, ядром или протоплазмой клетки в некоторых вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота получена из единственной хромосомы (например, проба нуклеиновой кислоты может быть получена из одной хромосомы пробы, полученной из диплоидного организма). В случае фетальной нуклеиновой кислоты, эта нуклеиновая кислота может быть из отцовского аллеля, материнского аллеля или материнского и отцовского аллеля.
Термин вид, используемый здесь со ссылкой на нуклеиновую кислоту-мишень, ампликон, праймер, метку последовательности, полинуклеотид или олигонуклеотид, относится к одной нуклеиновой кислоте, имеющей нуклеотидную последовательность, которая отличается одним или несколькими нуклеотидами из нуклеотидной последовательности другой нуклеиновой кислоты, при сопоставлении этих нуклеотидных последовательностей. Таким образом, первый вид нуклеиновой кислоты отличается от второго вида нуклеиновой кислоты, когда эти последовательности двух видов, при сопоставлении, отличаются одним или несколькими нуклеотидами (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более чем 100 нуклеотидными различиями). В некоторых вариантах осуществления количество видов нуклеиновых кислот, таких как виды нуклеиновых кислот-мишеней, виды ампликонов или виды удлиненных олигонуклеотидов, включают в себя, но не ограничиваются ими, от приблизительно 2 до приблизительно 10000 видов нуклеиновых кислот, от приблизительно 2 до приблизительно 1000 видов нуклеиновых кислот, от приблизительно 2 до приблизительно 500 видов нуклеиновых кислот или иногда приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225,
- 10 027558
250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или 10000 видов нуклеиновых кислот.
В некоторых вариантах осуществления один вид олигонуклеотида гибридизируется с матрицей нуклеиновой кислоты (например, ампликоном), с образованием тем самым двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и этот вид олигонуклеотида, который гибридизируется с этой матрицей, называют здесь гибридизированным видом олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления гибридизированный вид олигонуклеотида может содержать один или несколько нуклеотидов, которые не гибридизируются с матрицей. Например, гибридизированный вид олигонуклеотида может содержать один или несколько ошибочно спаренных нуклеотидов (например, некомплементарных нуклеотидов) и иногда 5'- и/или 3'-район нуклеотидов, которые не гибридизируются. В некоторых вариантах осуществления гибридизированный вид олигонуклеотида содержит метку (например, распознаваемую по массе метку, последовательность-метку, испускающую свет метку или радиоактивную метку). В некоторых вариантах осуществления гибридизированный вид олигонуклеотида содержит захватывающий агент (например, биотин или любой член пары связывания). В некоторых вариантах осуществления гибридизированный вид олигонуклеотида содержит терминирующий нуклеотид.
В данном контексте термин нуклеотиды относится к природным и неприродным нуклеотидам. Нуклеотиды включают, но не ограничиваются ими, природно-встречающиеся нуклеозид-моно-, ди-и трифосфаты: дезоксиаденозин-моно-, ди- и трифосфат; дезоксигуанозин-моно-, ди- и трифосфат; дезокситимидин-моно-, ди- и трифосфат; дезоксицитидин-моно-, ди- и трифосфат; дезоксиуридин-моно-, ди- и трифосфат и дезоксиинозин-моно-, ди- и трифосфат (называемые здесь как 6А, 60, 6Т, 6С, 6И и 61 или А, С, Т, С, и и I соответственно). Нуклеотиды включают также, но не ограничиваются ими, модифицированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Модифицированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов включают, без ограничения ими, деазапуриновые нуклеотиды, например, 7-деаза-дезоксигуанозин (7-деаза-60) и 7-деаза-дезоксиаденозин (7-деаза-6А) моно-, ди- и трифосфаты, дейтеродезокситимитидин (дейтеро-6Т) моно-, ди- и трифосфаты, метилированные нуклеотиды, например 5-метилдезоксицитидин-трифосфат, 13С/15И-меченые нуклеотиды и дезоксиинозин-моно-, ди-и трифосфат. Модифицированные нуклеотиды, изотопно обогащенные нуклеотиды, истощенные нуклеотиды, содержащие тэг или метку нуклеотиды и нуклеотидные аналоги могут быть получены с использованием различных комбинаций функциональности и положений присоединения.
Термин композиция, используемый здесь со ссылкой на нуклеиновые кислоты, относится к реальному препарату, который включает в себя одну или несколько нуклеиновых кислот. Композиция иногда является пробой, экстрагированной из какого-либо источника, но также является композицией всех проб в этом источнике, и иногда является источником одной или нескольких нуклеиновых кислот. Композиция может содержать нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать геномную ДНК. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать материнскую ДНК, фетальную ДНК или смесь материнской и фетальной ДНК. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать фрагменты геномной ДНК. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать нуклеиновые кислоты, полученные из вируса, бактерий, дрожжей, грибка, млекопитающего или их смесь.
Проба нуклеиновой кислоты может быть собрана из одного или нескольких источников. Проба может быть собрана, например, из организма, минерального или геологического участка (например, почвы, горной породы, минерального месторождения, ископаемого) или судебного участка (например, места происшествия, контрабанды или предполагаемой контрабанды). Таким образом, источник может быть связан, например, с окружающей средой, такой как геологическая, сельскохозяйственная среда, театр военных действий или представляющий почву источник. Источником может быть также любой тип организма, такой как любые растение, грибки, протисты, топегап, вирус или животное, в том числе, но не только, человек, не человек, млекопитающее, пресмыкающееся, крупный рогатый скот, кошка, собака, коза, свинья, поросенок, обезьяна, макаки, горилла, буйвол, корова, медведь, лошадь, овца, домашняя птица, мышь, крыса, рыба, дельфин, кит и акула, или любое животное или любой организм, которые могут иметь детектируемые нуклеиновые кислоты. Источниками могут также называться различные части организма, такие как внутренние части, наружные части, живые или неживые клетки, ткань, жидкость и т.п. Таким образом, проба может быть биологической пробой, которая относится к любому материалу, полученному из живого источника или ранее живущего источника, например, животному, такому как человек или другие млекопитающие, растению, бактерии, грибу, протисту или вирусу. Источник может быть в любой форме, включающей, без ограничения, твердый материал, такой как ткань, клетки, осадок клеток, клеточный экстракт или биопсия, или биологическую жидкость, такую как моча, кровь, слюна, амниотическая жидкость, экссудат из района инфекции или воспаления, или зубной эликсир, содержащий буккальные клетки, волосы, цереброспинальная жидкость и синовиальная жидкость, и органы. Проба может быть также выделена в другой временной точке в сравнении с другой пробой, где каждая из этих проб является пробой из того же самого или другого источника. Нуклеиновая кислота может быть из библиотеки нуклеиновых кислот, такой как, например, библиотека кДНК или библиотека РНК. Нуклеиновая кислота может быть результатом очистки или выделения нуклеиновой кислоты и/или ампли- 11 027558 фикации молекул нуклеиновых кислот из этой пробы. Нуклеиновая кислота, обеспечиваемая для описанных здесь способов анализа последовательности, может содержать нуклеиновую кислоту из одной пробы или из двух или более проб (например, из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 или более проб).
Нуклеиновые кислоты могут быть обработаны различными способами. Например, нуклеиновая кислота может быть уменьшена по размеру (например, обработана с использованием срезающих сил, расщеплена нуклеазой или рестриктазой, дефосфорилирована деметилирована), увеличена по размеру (например, фосфорилирована, обработана специфическим для метилирования реагентом, присоединена к детектируемой метке), обработана ингибиторами расщепления нуклеиновых кислот и т.п.
Нуклеиновые кислоты могут быть в некоторых вариантах осуществления обеспечены для проведения способов, описанных здесь, без обработки. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота обеспечена для проведения описанных здесь способов после обработки. Например, нуклеиновая кислота может быть экстрагирована, выделена, очищена или амплифицирована из пробы. Термин выделена относится в данном контексте к нуклеиновой кислоте, удаленной из ее исходной среды (например, природного окружения, если она является природно-встречающейся, или клетки-хозяина, если она экспрессируется экзогенно), и, следовательно, изменена рукой человека из ее исходного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота обычно обеспечена с меньшим количеством компонентов, не являющихся нуклеиновой кислотой, (например, белка, липида), чем количество компонентов, присутствующее в источнике пробы. Может быть обеспечена композиция, содержащая, по существу, выделенную нуклеиновую кислоту (например, на приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более чем 99% свободную от не являющихся нуклеиновой кислотой компонентов). Термин очищенная относится в данном контексте к обеспеченной здесь нуклеиновой кислоте, которая содержит меньше видов нуклеиновых кислот, чем в источнике пробы, из которого получена эта нуклеиновая кислота. Композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, может быть, по существу, очищенной (например, приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более чем 99% свободной от других видов нуклеиновых кислот).
Нуклеиновые кислоты могут быть обработаны способом, который генерирует фрагменты нуклеиновой кислоты, в некоторых вариантах осуществления перед обеспечением нуклеиновой кислоты для описанного здесь способа. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, подвергаемая фрагментации или расщеплению, может иметь номинальную или среднюю длину от приблизительно 5 до приблизительно 10000 пар оснований, отт приблизительно 100 до приблизительно 100 пар оснований, от приблизительно 100 до приблизительно 500 пар оснований или приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или 10000 пар оснований. Фрагменты могут быть генерированы любым подходящим способом, известным в данной области, и это среднее значение, средняя или номинальная длина фрагментов нуклеиновых кислот может контролироваться выбором генерирующей подходящий фрагмент процедуры. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота относительно короткой длины может быть использована для анализа последовательностей, которые содержат меньшую вариацию последовательностей и/или содержат информацию об относительно больших количествах известной нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота относительно большей длины может быть использована для анализа последовательностей, которые содержат большую вариацию последовательностей и/или содержат информацию об относительно малых количествах неизвестной нуклеотидной последовательности.
В данном контексте термин нуклеиновая кислота-мишень или вид нуклеиновой кислотымишени относится к любому представляющему интерес виду нуклеиновой кислоты в пробе. Нуклеиновая кислота-мишень включает, без ограничения ими, (ί) один конкретный аллель среди двух или более возможных аллелей и (ίί) нуклеиновую кислоту, имеющую или не имеющую конкретную мутацию, нуклеотидную замену, вариацию последовательности, повторяющуюся последовательность, маркер или распознаваемую последовательность.
В данном контексте термин отличающиеся нуклеиновые кислоты-мишени относится к видам нуклеиновых кислот, которые отличаются одним или несколькими признаками.
В этом контексте термин генетическая вариация относится к видам нуклеиновых кислот, которые отличаются одним или несколькими признаками.
В данном контексте термин вариант относится к видам нуклеиновых кислот, которые отличаются одним или несколькими признаками. Признаки включают в себя, без ограничения, одну или несколько метилированных групп или состояние метилирования, один или несколько фосфатов, одну или несколько ацетильных групп и одну или несколько делеций, добавлений или замен одного или нескольких нуклеотидов. Примеры одной или нескольких делеций, добавлений или замен одного или нескольких нуклеотидов включают в себя, без ограничения, присутствие или отсутствие конкретной мутации, присутствие или отсутствие нуклеотидной замены (например, однонуклеотидного полиморфизма (8ΝΡ)), присутствие или отсутствие повторяющейся последовательности (например, ди-, три-, тетра-, пентануклеотидного повтора), присутствие или отсутствие маркера (например, микросателлита) и присутствие или отсутствие распознающей последовательности (например, последовательности, которая отличает
- 12 027558 один организм от другого (например, последовательности, которая отличает один вирусный штамм от другого вирусного штамма)). Различные нуклеиновые кислоты-мишени могут распознаваться любым известным способом, например, по массе, связыванию, распознаваемым меткам (тэгам) и т.п., как описано здесь.
В данном контексте термин множество нуклеиновых кислот-мишеней или множество видов нуклеиновых кислот-мишеней относится более чем к одному виду нуклеиновой кислоты-мишени. Множество нуклеиновых кислот-мишеней может быть от приблизительно 2 до приблизительно 10000 видов нуклеиновых кислот, от приблизительно 2 до приблизительно 1000 видов нуклеиновых кислот, от приблизительно 2 до приблизительно 500 видов нуклеиновых кислот или иногда приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или 10000 видов нуклеиновых кислот, в некоторых вариантах осуществления. Детектирование или идентификация нуклеиновых кислот приводит к детектированию этой мишени и может указывать на присутствие или отсутствие конкретной мутации, вариации последовательности (мутации или полиморфизма) или генетической вариации (например, вариации последовательности, различия или полиморфизма последовательности). В этом множестве нуклеиновых кислотмишеней могут детектироваться одинаковые или различные нуклеиновые кислоты-мишени. Это множество нуклеиновых кислот-мишеней может быть также идентифицировано количественно, а также качественно в виде идентификации. Можно также сослаться на мультиплексирование ниже.
Амплификация и удлинение.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота (например, нуклеиновая кислотамишень) может быть амплифицирована. В этом контексте термин амплификация и его грамматические варианты относятся к процессу генерирования копий нуклеиновой кислоты-матрицы. Например, нуклеиновая кислота-матрица может быть подвергнута процессу, который линейно или экспоненциально генерирует два или более ампликонов (копий) нуклеиновых кислот, имеющих ту же самую или по существу ту же самую нуклеотидную последовательность, что и нуклеотидная последовательность этой матрицы или части этой матрицы. Амплификация нуклеиновой кислоты часто является специфической (например, ампликоны имеют одну и ту же или по существу одну и ту же последовательность) и может быть неспецифической (например, ампликоны имеют различные последовательности) в некоторых вариантах осуществления. Амплификация нуклеиновых кислот иногда является благоприятной, когда количество присутствующей в пробе последовательности-мишени является низким. Посредством амплификации последовательностей-мишеней и детектирования синтезированного ампликона, чувствительность этого анализа может быть улучшена, поскольку требуются меньше последовательностей-мишеней в начале этого анализа для детектирования нуклеиновой кислоты-мишени. Иногда, в некоторых вариантах осуществления, нуклеиновую кислоту-мишень не амплифицируют перед гибридизацией удлиненных олигонуклеотидов.
Условия амплификации известны и могут быть выбраны для конкретной нуклеиновой кислоты, которая будет амплифицирована. Условия амплификации включают в себя определенные реагенты, некоторые из которых могут включать, без ограничения ими, нуклеотиды (например, нуклеотидтрифосфаты), модифицированные нуклеотиды, олигонуклеотиды (например, праймерные олигонуклеотиды для амплификации на основе полимеразы и элементарные звенья олигонуклеотидов для амплификации на основе лигазы), одну или несколько солей (например, содержащую магний соль), один или несколько буферов, один или несколько агентов полимеризации (например, фермент лигазу, фермент полимеразу), один или несколько ферментов никинга (например, фермент, который разрывает одну цепь двухцепочечной нуклеиновой кислоты) и одну или несколько нуклеаз (например, экзонуклеазу, эндонуклеазу, РНКазу). Для амплификации может быть использована любая полимераза, такая как полимераза с экзонуклеазной активностью или без экзонуклеазной активности, могут быть использованы ДНК-полимераза и РНК-полимераза, например, мутантные формы этих ферментов. Любая лигаза, подходящая для соединения 5'-конца одного олигонуклеотида с 3'-концом другого олигонуклеотида, может быть использована. Условия амплификации могут также включать в себя некоторые условия реакции, такие как изотермальные условия и условия температурного цикла. Способы проведения циклов температуры в процессе амплификации известны, например, использующие термоциклическое устройство.
Термин повторение циклов относится к амплификации (например, реакции амплификации или реакции удлинения), использующей единственный праймер или множественные праймеры, где используется температурная циклизация. Условия амплификации могут в некоторых вариантах включать в себя эмульсионный агент (например, масло), который может быть использован для образования множественных реакционных компартментов, в которых могут быть амплифицированы отдельные виды молекул нуклеиновых кислот. Иногда амплификация является экспоненциальным генерирующим продукт процессом, а иногда она является линейным генерирующим продукт процессом.
Цепь одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени может быть амплифицирована, и одна или две цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени могут быть амплифицированы. Амплифицированный продукт (ампликон) в некоторых вариантах осуществления имеет длину от приблизительно 10 нук- 13 027558 леотидов до приблизительно 10000 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 1000 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 500 нуклеотидов, от 10 до приблизительно 100 нуклеотидов и иногда имеет длину приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нуклеотидов.
Любой подходящий способ амплификации и условия амплификации могут быть выбраны для амплификации конкретной нуклеиновой кислоты. Известные способы амплификации включают, без ограничения ими, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), удлинение и лигирование, амплификацию лигирования (или лигазную цепную реакцию (ЬСК)) и способы амплификации на основе применения О-бетарепликазы или зависимой от матрицы полимеразы (см. публикацию патента США И820050287592). Применимы также амплификация со смещением цепи (8ΌΑ), термофильная 8ΌΑ, амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты (3§К или ΝΑδΒΑ) и ассоциированная с транскрипцией амплификация (ТАА). Реагенты, устройство и аппаратное оборудование для проведения процессов амплификации являются коммерчески доступными, и условия амплификации известны и могут быть выбраны с легкостью для нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых вариантах осуществления амплификация на основе полимеразы может выполняться с использованием универсальных праймеров. В таких процессах районы гибридизации, которые гибридизируются с одним или несколькими универсальными праймерами, включены в матричную нуклеиновую кислоту. Такие районы гибридизации могут быть включены в (ί) праймер, который гибридизируется с матричной нуклеиновой кислотой и удлиняется, и/или в (ίί) олигонуклеотид, который соединяется (например, лигируется с использованием лигазного фермента) с нуклеиновой кислотой-мишенью или продуктом (ί), например. Процессы амплификации, которые включают в себя универсальные праймеры, могут, например, обеспечивать преимущество амплификации множества нуклеиновых кислот-мишеней с использованием только одного или двух праймеров амплификации.
Фиг. 1 показывает некоторые варианты процессов амплификации. В некоторых вариантах для амплификации используют только один праймер (например, фиг. 1А). В некоторых вариантах используют два праймера. В условиях амплификации по меньшей мере один праймер имеет комплементарную распознаваемую метку. Геноспецифический удлиняющий праймер имеет 5'-универсальный РСКТадШ (например, фиг. 1А). Он может удлиняться на любой нуклеиновой кислоте, например на геномной ДНК. Эта ДНК или этот геноспецифический удлиняющий праймер РСКТадШ могут быть биотинилированы для облегчения очистки из реакции. Затем эту удлиненную цепь лигируют одноцепочечной лигазой с универсальным фосфорилированным олигонуклеотидом, который имеет последовательность, которая является обратным комплементом Тад2Р (универсального ПЦР-праймера; фиг. 1В). Для облегчения очистки на следующей стадии этот фосфорилированный олигонуклеотид может включать резистентные к экзонуклеазе нуклеотиды на его 3'-конце. Во время экзонуклеазной обработки все нелигированные удлиненные цепи деградируются, тогда как лигированные продукты являются защищенными и остаются в этой реакции (например, фиг. 1С). Затем выполняют универсальную ПЦР с использованием праймеров Тад1К и Тад2Р для амплификации множественных мишеней (например, фиг. 1Ό).
Фиг. 2 также показывает некоторые варианты процессов амплификации. В некоторых вариантах осуществления способ, включающий удлинение праймером и лигирование, имеет место в одной и той же реакции (например, фиг. 2А). Биотинилированный геноспецифический праймер РСКТад3К является удлиняющим праймером. Фосфорилированный олигонуклеотид имеет геноспецифическую последовательность и связывает приблизительно 40 оснований (например, 4-100 или более) из сайта удлиняющего праймера с той же самой цепью ДНК. Таким образом, ДНК-полимераза, такая как полимераза Штоффеля, удлиняет эту цепь, пока она не достигает фосфорилированного олигонуклеотида. Фермент лигаза лигирует геноспецифическую последовательность фосфорилированного олигонуклеотида с этой удлиненной цепью. 3'-конец фосфорилированного олигонуклеотида имеет РСКТад4(КС)Р в качестве универсальной метки. Затем эти биотинилированные удлиненные цепи связываются со стрептавидиновыми бусинами. Этот подход облегчает очистку из этой реакции (например, фиг. 2В). ДНК, такая как геномная ДНК, и геноспецифические фосфорилированные олигонуклеотиды вымываются. Затем выполняют универсальную ПЦР с использованием Тад3К и Тад4Р в качестве праймеров для амплификации различных представляющих интерес генов (например, фиг. 2С).
Некоторые нуклеиновые кислоты могут быть удлинены в некоторых вариантах осуществления. Термин удлинение и его грамматические варианты относятся в данном контексте к удлинению одной цепи нуклеиновой кислоты. Например, олигонуклеотид, который гибридизируется с нуклеиновой кислотой-мишенью, или ампликон, генерируемый из нуклеиновой кислоты-мишени, может быть удлинен в некоторых вариантах осуществления. Реакцию удлинения проводят в условиях удлинения, и различные такие условия являются известными и выбираются для конкретного применения. Условия удлинения включают в себя определенные реагенты, включающие без ограничения один или несколько олигонуклеотидов, удлиняющие нуклеотиды (например, нуклеотидтрифосфаты (άΝΓΡ)), терминирующие нуклеотиды (например, один или несколько дидезоксинуклеотидтрифосфатов (άάΝΓΡ)), одну или несколько солей (например, магнийсодержащую соль), один или несколько буферов (например, с бета-ΝΑΌ, Три- 14 027558 тоном Х-100) и один или несколько полимеризующих агентов (например, ДНК-полимеразу, РНКполимеразу). В некоторых вариантах осуществления удлинение может проводиться в изотермальных условиях или в неизотермальных условиях (например, в термоциклических условиях). Один или несколько видов нуклеиновых кислот могут быть удлинены в реакции удлинения, и одна или несколько молекул каждого вида нуклеиновых кислот могут быть удлинены. Нуклеиновая кислота может быть удлинена одним или несколькими нуклеотидами, или в некоторых вариантах осуществления продукт удлинения имеет длину от приблизительно 10 нуклеотидов до приблизительно 10000 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 1000 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 500 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 100 нуклеотидов, и иногда приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нуклеотидов. Включение терминирующего нуклеотида (например, ййЫТР), местоположение гибридизации или другие факторы могут определять длину, до которой удлиняется этот олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления процессы амплификации и удлинения проводят в одной и той же процедуре детектирования.
В некоторых вариантах осуществления реакция удлинения включает в себя множественные температурные циклы, повторяемые для амплификации количества продукта удлинения в этой реакции. В некоторых вариантах осуществления реакцию удлинения повторяют 2 или более раз. В некоторых вариантах осуществления реакцию в виде циклов повторяют 10, 15, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 600 или более раз. В некоторых вариантах осуществления реакцию удлинения повторяют в виде циклов 20-50 раз. В некоторых вариантах осуществления реакцию удлинения повторяют в виде циклов 20-100 раз. В некоторых вариантах осуществления реакцию удлинения повторяют в виде циклов 20-300 раз. В некоторых вариантах осуществления реакцию удлинения повторяют в виде циклов 200-300 раз.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту-мишень (например, вид нуклеиновой кислоты-мишени, вид олигонуклеотида, гибридизированный вид олигонуклеотида или ампликон) удлиняют в присутствии удлиняющей композиции, где эту нуклеиновую кислоту-мишень удлиняют одним нуклеотидом. Удлиняющая композиция может содержать один или несколько буферов, солей, ферментов (например, полимеразы, фрагмент Кленова и т.д.), воду, матрицы (например, ДНК, РНК, ампликоны и т.д.), праймеры (например, олигонуклеотиды), нуклеотидтрифосфаты, глицерин, макромолекулярные исключающие молекулы и любые другие добавки, используемые в данной области. Композиция удлинения может содержать терминирующие нуклеотиды (например, дидезоксинуклеотиды (например, ййЫТР)), нетерминирующие или удлиняющие нуклеотиды (например, йЫТР) или смесь терминирующих и нетерминирующих нуклеотидов. Композиция удлинения, состоящая, по существу, из конкретного терминирующего нуклеотида или терминирующих нуклеотидов, может содержать любой другой компонент композиции удлинения (например, буферы, соли, матрицы, праймеры и т.д.), но не содержит любого другого терминирующего нуклеотида или нуклеотидтрифосфата (например, йЫТР), за исключением этих указанных компонентов. Например, композиция удлинения, состоящая, по существу, из ййТТР и ййСТР, не содержит ййАТР, ййОТР или любого другого йЫТР. В некоторых вариантах осуществления нуклеотиды в композиции удлинения являются единственными терминирующими нуклеотидами, и эта нуклеиновая кислота-мишень удлиняется одним нуклеотидом (т.е. иногда в этой композиции удлинения нет удлиняющих нуклеотидов). В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения состоит, по существу, из терминирующих нуклеотидов (например, ййКГР). В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид содержит один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более) захватывающих агентов. В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид содержит один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более) различных захватывающих агентов. В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид содержит (например, является связанным с ними) одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или более) молекул захватывающего агента. В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид содержит одну молекулу захватывающего агента. В некоторых вариантах осуществления первый терминирующий нуклеотид содержит захватывающий агент, и второй терминирующий агент содержит другой захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения содержит один или несколько терминирующих нуклеотидов, где каждый терминирующий нуклеотид содержит отличающийся захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения содержит один или несколько терминирующих нуклеотидов, где каждый терминирующий нуклеотид содержит захватывающий агент, и этот захватывающий агент является одним и тем же. В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения содержит терминирующий нуклеотид и удлиняющий нуклеотид, и один или несколько из этих нуклеотидов (например, терминирующих нуклеотидов и/или удлиняющих нуклеотидов) включают захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид содержит захватывающий агент, и этот захватывающий агент является биотином или аналогом биотина. В некоторых вариантах осуществления эта композиция удлинения состоит, по существу, из терминирующих нуклеотидов, которые связаны с одним или несколькими захватывающими агентами. В некоторых вариантах осуществления этот захватывающий
- 15 027558 агент является биотином или аналогом биотина. Аналог биотина может быть любым модифицированным биотином, который влияет на связывающие свойства биотина с авидином или стрептавидином (например, 9-метилбиотином, метиловым эфиром биотина (ΜΕΒίο), дезтиобиотином (ΌΕΒίο), 2'-иминобиотином (ΙΜΒίο), е-И-биотинил-Г-лизином, диаминобиотином (ΌΑΒίο), включающим все аналоги биотина, описанные в Εαί-Οίαηβ е1.а1. (Ταί-Οίαηβ Ушд аий Ггисе Ρ. ΒΓαηοΗαυά, СЬешюа1
2011, 47, 8593-8595)). В некоторых вариантах осуществления этот захватывающий агент является авидином или стрептавидином или модифицированной формой авидина или стрептавидина (например, нитроавидином, нитрострептавидином, НейтрАвидином, КаптАвидином и их производными).
Любая подходящая реакция удлинения может быть выбрана и использована. Может быть использована реакция удлинения, например, для дискриминации аллелей 8ΝΡ включением дезоксинуклеотидов и/или дидезоксинуклеотидов в удлиняющий олигонуклеотид, который гибридизируется с районом, смежным с сайтом 8ΝΡ в нуклеиновой кислоте-мишени. Этот праймер часто удлинен полимеразой. В некоторых вариантах осуществления этот олигонуклеотид удлинен только одним дезоксинуклеотидом или дидезоксинуклеотидом, комплементарным сайту 8ΝΡ. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид может быть удлинен включением άΝΤΡ и терминирован άάΝΤΡ, или терминирован включением άάΝΤΡ без удлинения άΝΤΡ. В некоторых вариантах осуществления один или несколько άΝΤΡ и/или άάΝΤΡ, используемых во время реакции удлинения, метят частицей, позволяющей иммобилизацию на твердой подложке, такой как биотин. Удлинение может проводиться с использованием немодифицированных удлиняющих (инсерционных) олигонуклеотидов и немодифицированных дидезоксинуклеотидов, немодифицированных удлиняющих олигонуклеотидов и биотинилированных дидезоксинуклеотидов, удлиняющих олигонуклеотидов, содержащих дезоксиинозин и немодифицированные дидезоксинуклеотиды, удлиняющих олигонуклеотидов, содержащих дезоксиинозин и биотинилированные дидезоксинуклеотиды, удлинением биотинилированными дидезоксинуклеотидами или удлинением биотинилированным дезоксинуклеотидом и/или немодифицированными дидезоксинуклеотидами в некоторых вариантах осуществления.
В некоторых вариантах осуществления виды олигонуклеотидов могут гибридизоваться, в условиях гибридизации, с матрицей (например, видом нуклеиновой кислоты-мишени) смежно с генетической вариацией или вариантом (например, 3'-конец этого вида олигонуклеотида может быть локализован 5' (слева) от сайта генетической вариации и может находиться в 0-10 нуклеотидах от 5'-конца этого сайта генетической вариации). Несколько вариантов могут существовать в сайте генетической вариации в нуклеиновой кислоте-мишени. Генетический вариант является иногда однонуклеотидным полиморфизмом (8ΝΡ) или однонуклеотидным вариантом. Несколько однонуклеотидных вариантов могут существовать в положении единственного основания на матрице-мишени, расположенной 3' (справа) от гибридизовавшегося олигонуклеотида. Несколько однонуклеотидных вариантов могут различаться одним основанием, расположенным в положении на матрице-мишени, которое находится 3' (справа) от вида гибридизовавшегося олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления вид олигонуклеотида удлиняют одним нуклеотидом в положении этого варианта. В некоторых вариантах осуществления этот олигонуклеотид может быть удлинен любым из пяти терминирующих нуклеотидов (например, άάΑΤΡ, άάυΤΡ, άάΤΤΡ, άάΟΤΡ, άάΟΤΡ), в зависимости от количества присутствующих вариантов. Вид нуклеиновой кислотымишени и его варианты или соответствующий ампликон могут действовать в качестве матрицы и могут, частично, определять, какой терминирующий нуклеотид добавляется к этому олигонуклеотиду в реакции удлинения. Виды нуклеиновых кислот-мишеней могут иметь два или более вариантов. В некоторых вариантах осуществления вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит два варианта. В некоторых вариантах осуществления вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит три варианта. В некоторых вариантах осуществления вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит четыре варианта. В некоторых вариантах осуществления вид нуклеиновой кислоты-мишени не содержит вариантов.
В некоторых вариантах осуществления количество молекул мутантного варианта-мишени (например, не часто встречающегося варианта), присутствующего в анализе, где не генерируется продукт удлинения дикого типа (например, часто встречающегося вида), определяют с использованием синтетической матрицы, включенной в эту реакцию удлинения. В некоторых вариантах осуществления количество (например, копийность, концентрацию, процент) мутантного варианта-мишени (т.е. продуктов удлинения мутанта) и/или процент мутантного варианта-мишени в пробе определяют количественно включением известного количества синтетической матрицы в этой реакции удлинения. В некоторых вариантах осуществления эта синтетическая матрица может гибридизоваться с видом олигонуклеотида и содержать замену основания в положении мутанта, расположенном непосредственно 3' относительно подлежащего удлинению вида олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления эта замена основания отличается от замены основания дикого типа или мутантного варианта-мишени (например, первого варианта, не часто встречающегося варианта, 8ΝΡ). В некоторых вариантах осуществления замена основания, присутствующая в этой матрице, не присутствует в этой пробе перед введением этой матрицы. В некоторых вариантах осуществления άάΝΤΡ (например, биотин-άάΝΤΡ), который является комплементарным замене основания в этой синтетической матрице, также вводят в эту реакцию. В некоторых вариантах осуще- 16 027558 ствления виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются с мутантным вариантом-мишенью, коамплифицируются (например, совместно удлиняются) с видами олигонуклеотидов, которые гибридизируются с синтетической матрицей. В некоторых вариантах осуществления многочисленные реакции, которые включают в себя серийные разведения синтетической матрицы, выполняют для определения количества и/или процента мутантного варианта-мишени. В некоторых вариантах осуществления количество и/или процент мутантного варианта-мишени определяют по количеству синтетической матрицы, которая дает такой же продукт удлинения, что и мутантный вариант-мишень.
В некоторых вариантах осуществления один вариант может быть в большем количестве, чем другие варианты. В некоторых вариантах осуществления вариант в наибольшем количестве называют вариантом дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит первый и второй варианты, где этот второй вариант представлен в большем количестве (т.е. присутствует больше матрицы). В некоторых вариантах осуществления вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит первый, второй и третий варианты, где этот второй вариант представлен в большем количестве в сравнении с первым и третьим вариантами. В некоторых вариантах осуществления вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит первый, второй, третий и четвертый варианты, где этот второй вариант представлен в большем количестве в сравнении с первым, третьим и четвертым вариантом. Вариант, который представлен в большем количестве, обычно присутствует в более высокой концентрации или представлен большим числом молекул (например, копий) в сравнении с другим вариантом. Более высокая концентрация может быть 2-кратной или большей. В некоторых вариантах осуществления более высокая концентрация является 10-кратной или большей. В некоторых вариантах осуществления более высокая концентрация является 100-, 1000- или 10000-кратной. В некоторых вариантах осуществления второй вариант представляет последовательность дикого типа и присутствует при 100-кратной или более высокой концентрации, чем первый вариант. В некоторых вариантах осуществления первый вариант представлен при значимо более низкой концентрации, чем второй вариант (например, дикого типа), где этот первый вариант представляет менее вида нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления первый вариант представляет менее 30, 20, 15, 10, 8, 5, 4, 3, 2, 1, 0,8, 0,75, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01% или менее этого вида нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления первый вариант представляет от приблизительно 5 до приблизительно 0,75% вида нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления первый вариант представляет менее 30, 20, 15, 10, 8, 5, 4, 3, 2, 1, 0,8, 0,75, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01% или менее общей нуклеиновой кислоты в композиции.
В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид, который присутствует (или, в некоторых вариантах осуществления, отсутствует) в композиции удлинения, определяет, какой терминирующий нуклеотид добавлен к олигонуклеотиду. В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения содержит один или несколько терминирующих нуклеотидов (например, άάΝΤΡ). В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения содержит один или несколько терминирующих нуклеотидов и один или несколько нетерминирующих нуклеотидов (например, άΝΤΡ). В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения содержит только терминирующие нуклеотиды, которые соответствуют конкретному варианту (например, первому варианту или менее изобилующему варианту). и, следовательно, позволяют удлинять только этот конкретный вариант. В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид, который мог бы позволять удлинение второго варианта (например, дикого типа или более изобилующего варианта), может быть исключен из композиции удлинения, с предотвращением посредством этого удлинения второго варианта. В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения содержит только терминирующие нуклеотиды, которые содержат первый и третий варианты и, следовательно, позволяют удлинять только эти конкретные варианты. В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения содержит только терминирующие нуклеотиды, которые соответствуют первому, третьему и четвертому вариантам, и, следовательно, позволяют удлинять только первый, третий и четвертый варианты. В некоторых вариантах осуществления композиция удлинения состоит, по существу, из терминирующих нуклеотидов, которые соответствуют первому варианту. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает контактирование гибридизированных видов олигонуклеотидов с композицией удлинения, содержащей один или несколько терминирующих нуклеотидов, в условиях удлинения, где (ί) по меньшей мере один из этих одного или нескольких терминирующих нуклеотидов содержит захватывающий агент, и (ίί) виды гибридизированных олигонуклеотидов, которые гибридизируются с первым вариантом (например, менее изобилующим вариантом (например, менее изобилующим вариантом 8ΝΡ)), удлиняются терминирующим нуклеотидом, и эти виды гибридизированных олигонуклеотидов, которые гибридизируются со вторым вариантом (например, диким видом или более изобилующим вариантом), не удлиняются терминирующим нуклеотидом, с генерированием посредством этого удлиненных видов олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления удлиненные виды олигонуклеотидов второго варианта не детектируются.
Термин соотношение сигнал/шум относится в этом контексте к количественному измерению качества сигнала количественным определением соотношения интенсивности сигнала относительно шума при применении процесса детектирования (например, масс-спектрометрии). В некоторых вариантах осуществления интенсивный пик на одном спектре имеет более высокое соотношение сигнал/шум, чем
- 17 027558 пик низкой интенсивности, генерируемой тем же самым аналитом (например, удлиненным видом олигонуклеотида) на другом спектре. В некоторых вариантах осуществления шум генерируется видом удлиненного олигонуклеотида, полученного из изобилующих вариантов (например, аллелей дикого типа, вторых вариантов, вариантов дикого типа). В некоторых вариантах осуществления сигнал, генерированный из вида удлиненного олигонуклеотида, полученного из менее изобилующего варианта (например, первого варианта, третьего варианта, четвертого варианта, мутантного варианта, мутантного аллеля, 8ΝΡ), становится неясным вследствие шума, генерируемого более изобилующим видом удлиненного олигонуклеотида (например, второго варианта, варианта дикого типа, аллеля дикого типа), при применении масс-спектрометрии. Термин сигнал, используемый во фразе соотношение сигнал/шум, относится здесь к интенсивности пика сигнала вида удлиненного олигонуклеотида. Термин сигнал, используемый во фразе соотношение сигнал/шум, относится здесь к интенсивности пика сигнала вида удлиненного олигонуклеотида, полученной из менее изобилующего варианта (например, первого варианта, мутантного варианта, мутантного аллеля, 8ΝΡ). В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид, который мог бы позволить удлинение второго варианта (например, дикого типа или более изобилующего варианта), исключают из композиции удлинения, с предотвращением посредством этого удлинения второго варианта и увеличения соотношения сигнал/шум для менее изобилующего варианта (например, первого варианта, мутантного варианта, мутантного аллеля, 8ΝΡ). В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает контактирование гибридизированного вида олигонуклеотида с композицией удлинения, содержащей один или несколько терминирующих нуклеотидов, в условиях удлинения, где (ί) по меньшей мере один из этих одного или нескольких терминирующих нуклеотидов содержит захватывающий агент и (ίί) гибридизированные виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются с первым вариантом (например, менее изобилующим вариантом, (например, менее изобилующим вариантом 8ΝΡ)), удлиняются терминирующим нуклеотидом, и гибридизированные виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются со вторым вариантом (например, диким видом или более изобилующим вариантом), не удлиняются терминирующим нуклеотидом, с генерированием посредством этого удлиненного вида олигонуклеотида и увеличения соотношения сигнал/шум в сравнении с условием, когда удлиняются как первый, так и второй варианты. В некоторых вариантах осуществления детектирование в (£) имеет соотношение сигнал/шум, более высокое, чем соотношение сигнал/шум, для детектирования после высвобождения без конкуренции с конкурирующим агентом. В некоторых вариантах осуществления детектирование в (ί) предусматривает увеличение соотношения сигнал/шум, когда стадия высвобождения (е) предусматривает конкуренцию с конкурирующим агентом, в сравнении со стадией высвобождения, которая не предусматривает конкуренции с конкурирующим агентом. В некоторых вариантах осуществления соотношение сигнал/шум для удлинения только мутантного аллеля является большим, чем соотношение сигнал/шум для удлинения аллеля дикого типа и мутантного аллеля.
Термин чувствительность относится в этом контексте к количеству аналита, которое может быть детектировано при конкретном соотношении сигнал/шум, при использовании процесса детектирования (например, масс-спектрометрии). В некоторых вариантах осуществления чувствительность может быть улучшена уменьшением уровня фона или шума. В некоторых вариантах осуществления шум генерируется удлиненными видами олигонуклеотидов, произведенными из изобилующих вариантов (например, аллелей дикого типа, вторых вариантов, вариантов дикого типа). В некоторых вариантах осуществления чувствительность увеличивается, когда сигнал, генерированный из удлиненного вида олигонуклеотида, произведенного из более изобилующего удлиненного вида олигонуклеотида (например, второго варианта, варианта дикого типа, аллеля дикого типа), уменьшается или элиминируется. В некоторых вариантах осуществления терминирующий нуклеотид, который мог бы позволить удлинение второго варианта (например, дикого типа или более изобилующего варианта), исключают из композиции удлинения, предотвращая посредством этого удлинение второго варианта и увеличивая чувствительность для детектирования менее изобилующего варианта (например, первого варианта, мутантного варианта, мутантного аллеля, 8ΝΡ). В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает контактирование вида гибридизированного олигонуклеотида с композицией удлинения, содержащей один или несколько терминирующих нуклеотидов, в условиях удлинения, где (ί) по меньшей мере один из этих одного или нескольких терминирующих нуклеотидов содержит захватывающий агент и (ίί) гибридизированные виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются с первым вариантом (например, менее изобилующим вариантом (например, менее изобилующим вариантом 8ΝΡ)), удлиняются терминирующим нуклеотидом, и гибридизированные виды олигонуклеотида, которые гибридизируются со вторым вариантом (например, диким видом или более изобилующим вариантом), не удлиняются терминирующим нуклеотидом, с генерированием посредством этого удлиненного вида олигонуклеотида и увеличения чувствительности для детектирования первого варианта в сравнении с условием, когда как первый, так и второй варианты является удлиненными. В некоторых вариантах осуществления чувствительность детектирования мутантного аллеля (ί) является более высокой для удлинения только мутантного аллеля, чем для удлинения дикого типа и мутантного аллеля.
Любой подходящий тип нуклеотидов может быть включен в продукт амплификации удлиненный продукт или продукт удлинения. Нуклеотиды могут быть, в некоторых вариантах осуществления, при- 18 027558 родно-встречающимися нуклеотидами, терминирующими нуклеотидами или не встречающимися в природе нуклеотидами (например, аналогом или производным нуклеотида). Некоторые нуклеотиды могут содержать, в некоторых вариантах осуществления, детектируемую метку и/или член пары связывания (например, другой член пары связывания может быть связан с твердой фазой).
Раствор, содержащий ампликоны, продуцированные процессом амплификации, или раствор, содержащий продукты удлинения, продуцированные процессом удлинения, могут быть подвергнуты дополнительной обработке. Например, раствор может контактировать с агентом, который удаляет фосфатные части молекул из свободных нуклеотидов, которые не были включены в ампликон или продукт удлинения. Примером такого агента является фосфатаза (например, щелочная фосфатаза). Ампликоны и продукты удлинения могут быть также ассоциированы с твердой фазой, могут быть промыты, могут контактировать с агентом, который удаляет терминальный фосфат (например, подверганием действию фосфатазы), могут контактировать с агентом, который удаляет терминальный нуклеотид (например, экзонуклеазой), могут контактировать с агентом, который расщепляет (например, эндонуклеазой, рибонуклеазой) и т.п.
Термин олигонуклеотид относится в этом контексте к двум или более нуклеотидам или аналогам нуклеотидов, связанным ковалентной связью. Олигонуклеотид имеет любую удобную длину и в некоторых вариантах осуществления имеет длину от приблизительно 5 до приблизительно 200 нуклеотидов, от приблизительно 5 до приблизительно 150 нуклеотидов, от приблизительно 5 до приблизительно 100 нуклеотидов, от приблизительно 5 до приблизительно 75 нуклеотидов или от приблизительно 5 до приблизительно 50 нуклеотидов и иногда приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175 или 200 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут включать дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК), природно-встречающиеся и/или не встречающиеся в природе нуклеотиды или их комбинации и их любую химическую или ферментативную модификацию (например, метилированную ДНК, ДНК из модифицированных нуклеотидов). Длина олигонуклеотида является иногда более короткой, чем длина ампликона или нуклеиновой кислоты-мишени, но необязательно более короткой, чем праймер или полинуклеотид, используемые для амплификации. Олигонуклеотид часто содержит нуклеотидную субпоследовательность или гибридизационную последовательность, которая является комплементарной или по существу комплементарной ампликону, нуклеиновой кислоте-мишени или их комплементу (например, приблизительно на 95, 96, 97, 98, 99 или более чем на 99% идентичную ампликону или комплементу нуклеиновой кислоты-мишени при сопоставлении). Олигонуклеотид может содержать нуклеотидную субпоследовательность, не комплементарную или по существу не комплементарную ампликону, нуклеиновой кислоте-мишени или их комплементу (например, на 3'- или 5'-конце этой нуклеотидной субпоследовательности в праймере, комплементарном или по существу комплементарном этому ампликону). Олигонуклеотид в некоторых вариантах осуществления может содержать детектируемую молекулу (например, тэг (метку), флуорофор, радиоизотоп, колориметрический агент, частицу, фермент и т.п.) и/или член пары связывания, в некоторых вариантах осуществления (например, биотин/авидин, биотин/стептавидин).
Термин в растворе относится в данном контексте к жидкости, такой как жидкость, содержащая, например, одну или несколько нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты и другие компоненты в растворе могут быть диспергированы во всем объеме, и раствор часто содержит воду (например, водный раствор). Раствор может содержать любое подходящее количество видов олигонуклеотидов и часто в нем имеется, по меньшей мере, то же самое количество видов олигонуклеотидов, какое находится в видах ампликонов или видах нуклеиновых кислот-мишеней, подлежащих детектированию.
Термин гибридизационная последовательность относится в данном контексте к нуклеотидной последовательности в олигонуклеотиде, способной специфически гибридизироваться с ампликоном, нуклеиновой кислотой-мишенью или их комплементом. Гибридизационную последовательность можно легко сконструировать и выбрать, и она может иметь длину, подходящую для гибридизации с ампликоном, последовательностью-мишенью или их комплементом в растворе, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления гибридизационная последовательность в каждом олигонуклеотиде имеет длину от приблизительно 5 до приблизительно 200 нуклеотидов (например, приблизительно 5-10, приблизительно 10-15, приблизительно 15-20, приблизительно 20-25, приблизительно 25-30, приблизительно 30-35, приблизительно 35-40, приблизительно 40-45 или приблизительно 45-50, приблизительно 50-70, приблизительно 80-90, приблизительно 90-110, приблизительно 100-120, приблизительно 110-130, приблизительно 120-140, приблизительно 130-150, приблизительно 140-160, приблизительно 150-170, приблизительно 160-180, приблизительно 170-190, приблизительно 180-200 нуклеотидов в длину).
Термин условия гибридизации относится в данном контексте к условиям, в которых две нуклеиновые кислоты, имеющие комплементарные нуклеотидные последовательности, могут взаимодействовать одна с другой. Условия гибридизации могут быть условиями высокой (жесткой) строгости, средней строгости или низкой строгости, и условия для этих степеней строгости известны. Условия гибридизации часто выбирают таким образом, что они позволяют проводить амплификацию и/или удлинение в зависимости от представляющего интерес применения.
- 19 027558
Термин специфически гибридизирующиеся с одним ампликоном или нуклеиновой кислотоймишенью относится в данном контексте к гибридизации, по существу, с одним видом ампликона или видом нуклеиновой кислоты-мишени и, по существу, отсутствию гибридизации в другим видом ампликона и другим видом нуклеиновой кислоты-мишени в растворе. Специфическая гибридизация исключает ошибочные спаривания, так что, например, может быть сконструирован олигонуклеотид для гибридизации специфически с определенным аллелем и только с этим аллелем. Олигонуклеотид, который является гомогенно совместимым или комплементарным аллелю, будет специфически гибридизоваться с этим аллелем, тогда как если имеется одно или несколько ошибочных спариваний оснований, гибридизация может не возникнуть.
Термин местоположение гибридизации относится здесь к специфическому местоположению на ампликоне или нуклеиновой кислоте-мишени, с которым гибридизуется другая нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления конец олигонуклеотида является смежным или по существу смежным с сайтом на виде ампликона или виде нуклеиновой кислоты-мишени, который имеет другую последовательность, чем другой вид ампликона или вид нуклеиновой кислоты-мишени. Этот конец олигонуклеотида является смежным с сайтом, когда нет нуклеотидов между этим сайтом и концом этого олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления этот конец олигонуклеотида является по существу смежным с сайтом, когда имеются 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов между этим сайтом и концом олигонуклеотида.
Захватывающие агенты и твердые фазы.
Один или несколько захватывающих агентов могут быть использованы для описанных здесь способов. Имеется несколько различных типов захватывающих агентов, доступных для описанных здесь способов, включающих, без ограничения ими, например, члены пары связывания. Примеры пар связывания, включают в себя, без ограничения, (а) пары нековалентного связывания (например, антитело/антиген, антитело/антитело, антитело/фрагмент антитела, антитело/рецептор антитела, антитело/белок А или белок О, гаптен/антигаптен, биотин/авидин, биотин/стрептавидин, фолиевая кислота/фолатсвязывающий белок, рецептор/лиганд или его связывающая часть и витамин В12/внутренний фактор) и (Ь) пары ковалентного присоединения (например, сульфгидрил/малеимид, производное сульфгидрил/галоацетила, амин/изотиоцианат, амин/сукцинимидиловый эфир и амин/сульфонил галиды) и т.п. В некоторых вариантах осуществления один член пары связывания находится в ассоциации с удлиненным олигонуклеотидом или амплифицированным продуктом, а другой член в ассоциации с твердой фазой. Термин в ассоциации с относится в данном контексте к взаимодействию по меньшей мере между двумя единицами, где эти две единицы, например, связаны или соединены друг с другом.
Термин конкурент относится в данном контексте к любой молекуле, которая конкурирует с захватывающим агентом для взаимодействия с твердой фазой (например, связывается). Неограничивающие примеры конкурентов включают в себя свободный захватывающий агент (например, один или другой член пары связывания, свободный биотин, свободный авидин/стрептавидин), конкурирующий фрагмент захватывающего агента (например, конкурирующий фрагмент биотина или авидин/стрептавидина) конкурирующий мультимер захватывающего агента (например, мультимер биотина), другая конкурирующая молекула или ее фрагмент или мультимер, молекула, которая конкурирует специфически за связывание с твердой фазой, повышенные солевые условия, повышенные температурные условия или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления мультимер захватывающего агента содержит от приблизительно 2 до приблизительно 50 мономеров. В некоторых вариантах осуществления мультимер захватывающего агента содержит от приблизительно 2 до приблизительно 10 мономеров. В некоторых вариантах осуществления мультимер захватывающего агента содержит приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мономеров. В некоторых вариантах осуществления захватывающий агент, содержащий мультимер захватывающих агентов, содержит мономеры, которые ковалентно связаны друг с другом. В некоторых вариантах осуществления захватывающий агент, содержащий мультимер захватывающих агентов, содержит мономеры, которые не связаны ковалентно друг с другом. Термин свободный захватывающий агент относится в данном контексте к захватывающему агенту, который не находится в ассоциации с твердой фазой или удлиненным олигонуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент может быть биотином или его конкурирующей частью или фрагментом. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент может быть авидином, стрептавидином или их конкурирующей частью или фрагментом. Термин конкурирующая часть или фрагмент относится в данном контексте к захватывающему агенту, который имеет меньший чем полный размер, все еще сохраняет функциональность интактного захватывающего агента (например, ту же самую, меньшую или большую активность взамодействия этого захватывающего агента с твердой подложкой) в отношении взаимодействия с другим членом пары связывания (например, фрагмент или часть биотина, которые все еще могут связываться с авидином или стрептавидином, фрагмент или часть авидина или стрептавидина, которые все еще могут связываться с биотином). В некоторых вариантах осуществления фрагмент свободного захватывающего агента (например, фрагмент биотина) является агентом любого размера, который все еще сохраняет функциональность интактного захватывающего агента. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент
- 20 027558 (например, фрагмент биотина) является агентом любого размера, который все еще сохраняет некоторую функциональность интактного захватывающего агента. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент (например, фрагмент биотина) является агентом с размером, который сохраняет от приблизительно 30 до приблизительно 100% функциональности интактного захватывающего агента. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент (например, фрагмент биотина) является агентом с размером, который сохраняет приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% функциональности интактного захватывающего агента.
В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент (например, свободный биотин) добавляют в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 5000 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент (например, свободный биотин) добавляют в концентрации приблизительно 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 400, 800, 1000, 2000, 4000, 5000 мкг/мл или более. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент (например, свободный биотин) добавляют в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 100 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент (например, свободный биотин) добавляют в концентрации приблизительно 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления свободный захватывающий агент (например, свободный биотин) добавляют в композицию, содержащую удлиненные виды олигонуклеотидов в концентрации приблизительно 25 мкг/мл.
Термин твердая подложка или твердая фаза относится к нерастворимому материалу, с которым может быть ассоциирована нуклеиновая кислота. Примеры твердых подложек для применения с описанными здесь процессами включают в себя, без ограничения, эрреи, бусины (например, парамагнитные бусины, магнитные бусины, микробусины, нанобусины) и частицы (например, микрочастицы, наночастицы). Частицы или бусины, имеющие номинальный, усредненный или средний диаметр от приблизительно 1 нм до приблизительно 500 мкм, могут быть использованы, например, частицы или бусины, имеющие номинальный, усредненный и средний диаметр, например, приблизительно от 10 нм до приблизительно 100 мкм; приблизительно от 100 нм до приблизительно 100 мкм; приблизительно от 1 до приблизительно 100 мкм; приблизительно от 10 до приблизительно 50 мкм; приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или 900 нм или приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500 мкм.
Термин парамагнитный относится в данном контексте к магнетизму, который обычно встречается только в присутствии наружно приложенного магнитного поля. Таким образом, парамагнитная бусина может притягиваться (аттрагироваться) к наружно приложенному магнитному источнику, но обычно не проявляет ее собственного магнитного поля в отсутствие наружно приложенного магнитного поля. Магнитные бусины, содержащие кор (сердцевину) из двухвалентного железа, обычно проявляют их собственное магнитное поле.
Твердая подложка может содержать фактически любой нерастворимый или твердый материал и часто выбирается композиция твердой подложки, которая является нерастворимой в воде. Например, твердая подложка может содержать (или по существу состоять из них) силикагель, стекло (например, стекло с контролируемыми порами (СРО)), нейлон, ЗерЬабех®, ЗерЬагове®, целлюлозу, металлическую поверхность (например, сталь, золото, серебро, алюминий, кремний и медь), магнитный материал, пластиковый материал (например, полиэтилен, полипропилен, полиамид, полиэфир, поливинилидендифторид (РУЭР)) и т.п. Бусины или частицы могут быть набухаемыми (например, полимерные бусины, такие как смола Ванга) или ненабухаемыми (например, СРО). Коммерчески доступные примеры бусин включают в себя, без ограничения, смолу Ванга, смолу Меррифилда и ЭупаЬеаЪ® и Зо1иПик. Твердая фаза (например, бусина) может содержать член пары связывания (например, авидин, стрептавидин или их производное). В некоторых вариантах осуществления эта твердая фаза является, по существу, гидрофильной. В некоторых вариантах осуществления твердая фаза (например, бусина) является, по существу, гидрофобной. В некоторых вариантах осуществления, твердая фаза содержит член пары связывания (например, авидин, стрептавидин или их производное) и является, по существу, гидрофобной или по существу гидрофильной. В некоторых вариантах осуществления твердая фаза содержит член пары связывания (например, авидин, стрептавидин или их производное) и имеет связывающую способность, более высокую чем 1350 пмоль свободного захватывающего агента (например, свободного биотина) на 1 мг твердой подложки. В некоторых вариантах осуществления связывающая способность твердой фазы, содержащей член пары связывания, является большей, чем 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1800, 2000 пмоль свободного захватывающего агента на мг твердой подложки.
Твердая подложка может быть обеспечена в коллекции твердых подложек. Коллекция твердых подложек содержит два или более различных видов твердых подложек. Термин вид твердой подложки относится в данном контексте к твердой подложке в ассоциации с одним конкретным видом нуклеиновой кислоты твердой фазы или конкретной комбинации различных видов нуклеиновых кислот твердой фазы. В некоторых вариантах осуществления коллекция твердых подложек содержит 2-10000 видов
- 21 027558 твердых подложек, 10-1000 видов твердых подложек или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или 10000 уникальных видов твердых подложек. Твердые подложки (например, бусины) в коллекции твердых подложек могут быть гомогенными (например, все являются бусинами смолы Ванга) или гетерогенными (например, некоторые являются бусинами смолы Ванга и некоторые являются магнитными бусинами). В некоторых вариантах осуществления каждый вид твердой подложки в коллекции твердых подложек помечен специфическим идентификационным тэгом. Идентификационный тэг для конкретного вида твердой подложки является нуклеиновой кислотой (например, нуклеиновой кислотой твердой фазы), имеющей уникальную последовательность. Идентификационный тэг может быть любой молекулой, которая является детектируемой и распознаваемой среди идентификационных тэгов на других видах твердой среды.
Нуклеиновая кислота твердой фазы часто является одноцепочечной и является нуклеиновой кислотой любого типа, подходящего для гибридизации нуклеиновых кислот (например, ДНК, РНК, их аналогами (например, пептидонуклеиновой кислотой (ПНК)), их химерами (например, одна цепь содержит основания РНК и основания ДНК) и т.п.. Нуклеиновая кислота твердой фазы ассоциирована с твердой подложкой любым способом, известным лицу с обычной квалификацией в данной области и подходящим для гибридизации нуклеиновой кислоты твердой фазы с нуклеиновой кислотой. Нуклеиновая кислота твердой фазы может находиться в ассоциации с твердой подложкой посредством ковалентной связи или нековалентного взаимодействия. Неограничивающие примеры нековалентных взаимодействий включают в себя гидрофобные взаимодействия (например, С18-покрытая твердая подложка и тритилированная нуклеиновая кислота), полярные взаимодействия и т.п. Нуклеиновая кислота твердой фазы может быть ассоциирована с твердой подложкой различной методологией, известной лицу с обычной квалификацией в данной области, которая включает, без ограничения, (ί) синтез последовательности нуклеиновой кислоты непосредственно на твердой подложке и (ίί) синтез нуклеиновой кислоты, обеспечение этой нуклеиновой кислоты в твердой фазе и связывание этой нуклеиновой кислоты на твердой подложке. Нуклеиновая кислота твердой фазы может быть связана ковалентно в различных сайтах в нуклеиновой кислоте твердой подложки, например, (ί) в положении 1', 2', 3', 4' или 5' сахарной части или (ίί) в части пиримидиновых или пуриновых оснований терминального или нетерминального нуклеотида этой нуклеиновой кислоты. 5'-терминальный нуклеотид нуклеиновой кислоты твердой фазы, в некоторых вариантах осуществления, связан с твердой подложкой.
После ассоциации удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой (т.е. после захвата) неудлиненные олигонуклеотиды и/или нежелательные компоненты реакции, которые не связываются часто, вымываются и деградируются. В некоторых вариантах осуществления твердую фазу промывают после захвата видов удлиненных олигонуклеотидов и перед высвобождением этих видов олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления промывание твердой фазы удаляет соли. В некоторых вариантах осуществления промывание твердой фазы удаляет соли, которые продуцируют мешающие аддукты в массспектрометрии. В некоторых вариантах осуществления удлиненные виды олигонуклеотидов контактируют с анионообменной смолой после промывания твердой фазы. В некоторых вариантах осуществления удлиненные виды олигонуклеотидов не контактируют с анионообменной смолой после промывания твердой фазы. В некоторых вариантах осуществления удлиненные виды олигонуклеотидов захватываются на твердой фазе, промываются один или несколько раз, высвобождаются из этой твердой фазы и не контактируются с анионообменной смолой. Удлиненные олигонуклеотиды могут быть обработаны одной или несколькими процедурами перед детектированием. Например, удлиненные олигонуклеотиды могут быть кондиционированы перед детектированием (например, гомогенизацией типа катиона и/или аниона, ассоциированных с захваченной нуклеиновой кислотой с использованием ионообмена). Удлиненные олигонуклеотиды могут быть в некоторых вариантах осуществления высвобождены из твердой среды перед детектированием. В некоторых вариантах осуществления удлиненный олигонуклеотид (например, вид удлиненного олигонуклеотида) находится в ассоциации с захватывающим агентом, содержащим один член пары связывания (например, биотин или авидин/стрептавидин). В некоторых вариантах осуществления выделенный олигонуклеотид, содержащий захватывающий агент, захватывается контактированием члена пары связывания с твердой фазой, содержащей другой член пары связывания (например, авидин/стрептавидин или биотин). В некоторых вариантах осуществления удлиненный олигонуклеотид является биотинилированным, и биотиновая часть с продуктом удлиненного олигонуклеотида захватывается контактированием биотиновой части покрытой авидином или стрептавидином твердой фазы. В некоторых вариантах осуществления удлиненный олигонуклеотид содержит распознаваемую по массе метку (тэг), и в некоторых вариантах осуществления детектирование распознаваемой по массе метки включает детектирование присутствия или отсутствия удлиненного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления этот удлиненный олигонуклеотид удлинен одним, двумя, тремя или большим количеством нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления удлиненный олигонуклеотид, связанный с твердой фазой, высвобождают из этой твердой фазы конкуренцией с конкурирующим агентом, и удлиненный олигонуклеотид детектируют. В некоторых вариантах осуществления удлиненный олигонуклеотид, связанный с твердой фазой, высвобождают из этой твердой фазы конкуренцией с кон- 22 027558 курирующим агентом и детектируют распознаваемую метку в удлиненном олигонуклеотиде или метку, ассоциированную с ним. В некоторых вариантах осуществления удлиненный олигонуклеотид, связанный с твердой фазой, высвобождают из этой твердой фазы конкуренцией с конкурентом, распознаваемую метку высвобождают из этого удлиненного олигонуклеотида, и высвободившуюся распознаваемую метку детектируют.
Распознаваемые метки и высвобождение.
В этом контексте термины распознаваемые метки и распознаваемые тэги относятся к типам меток и тэгов, которые могут быть отличены друг от друга и использованы для идентификации нуклеиновой кислоты, к которой присоединен этот тэг. Различные типы меток и тэгов могут быть выбраны и использованы для обеспеченных здесь мультиплексных способов. Например, олигонуклеотиды, аминокислоты, малые органические молекулы, светоизлучающие молекулы, светопоглощающие молекулы, светорассеивающие молекулы, люминесцентные молекулы, изотопы, ферменты и т.п. могут быть использованы в качестве распознаваемых меток и тэгов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды, аминокислоты и/или малые органические молекулы с варьирующими длинами, варьирующими соотношениями масса-заряд, варьирующейся электрофоретической подвижностью (например, подвижностью в капиллярном электрофорезе) и/или варьирующейся массой могут быть также использованы в качестве распознаваемых меток или тэгов. Таким образом, флуорофор, радиоизотоп, колориметрический агент, светоизлучающий агент, хемилюминесцентный агент, светорассеивающий агент и т.п. могут быть использованы в качестве метки. Выбор метки может зависеть от требуемой чувствительности, легкости конъюгации с нуклеиновой кислотой, требований стабильности и доступного инструментария. Термин распознаваемый признак, используемый здесь в отношении распознаваемых меток и тэгов, относится к любому признаку одной метки или тэга, который может распознаваться от других метки или тэга (например, массе и другим признакам, описанных здесь). В некоторых вариантах осуществления композиция меток из распознаваемых меток и тэгов может быть выбрана и/или создана для получения оптимального поведения пролета в масс-спектрометре и позволения распознаваемости меток и тэгов при высоких уровнях мультиплексирования.
Для используемых здесь способов конкретный вид нуклеиновой кислоты-мишени, вид ампликона и/или вид удлиненного олигонуклеотида спаривают с распознаваемым детектируемым видом метки, так что детектирование конкретных метки или тэга непосредственно идентифицирует присутствие конкретного вида нуклеиновой кислоты-мишени, вида ампликона и/или вида удлиненного олигонуклеотида в конкретной композиции. Таким образом, один распознаваемый признак вида метки может быть использован, например, для идентификации одного вида нуклеиновой кислоты-мишени в композиции, так как этот конкретный распознаваемый признак соответствует этой конкретной нуклеиновой кислоте-мишени. Метки и тэги могут быть также присоединены к нуклеиновой кислоте (например, олигонуклеотиду) любыми известными способами и в любом местоположении (например, на 5'-конце олигонуклеотида). Таким образом, ссылка на каждый конкретный вид метки как специфически соответствующей каждому виду нуклеиновой кислоты-мишени, как это делается здесь, относится к одному виду метки, являющемуся спаренным с одним видом-мишенью. В некоторых вариантах осуществления, когда присутствие вида метки детектируется, тогда посредством этого детектируется присутствие этого вида нуклеиновой кислоты-мишени, ассоциированной с этим видом метки.
Термин вид, используемый здесь со ссылкой на распознаваемые тэг или метку (вместе метку), относится здесь к одной метке, которая является детектируемо отличаемой от другой метки. В некоторых вариантах осуществления количество видов меток включает в себя, но не ограничивается ими, от приблизительно 2 до приблизительно 10000 видов меток, от приблизительно 2 до приблизительно 500000 видов меток, от приблизительно 2 до приблизительно 100000, от приблизительно 2 до приблизительно 50000, от приблизительно 2 до приблизительно 10000 и от приблизительно 2 до приблизительно 500 видов меток или иногда приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000,30000, 40000,50000,60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000 или 500000 видов меток.
Термин распознаваемая по массе метка относится в данном контексте к метке, которая распознается по массе в качестве признака. Различные распознаваемые по массе метки могут быть выбраны и использованы, такие как, например, компомер, аминокислота и/или конкатемер. Различные длины и/или композиции нуклеотидных нитей (например, нуклеиновых кислот; компомеров), аминокислотных нитей (например, пептидов; полипептидов; компомеров) и/или конкатемеров могут быть распознаны по массе и быть использованы в качестве меток. Любое количество единиц может быть использовано в распознаваемой по массе метке, и верхняя и нижняя границы таких единиц зависят от окна массы и разрешения системы, используемой для детектирования и распознавания таких меток. Таким образом, длина и композиция распознаваемых по массе меток могут быть выбраны отчасти на основе окна массы и разрешения детектора, используемого для детектирования и распознавания этих меток.
- 23 027558
Термин компомер относится в данном контексте к композиции набора мономерных единиц и не к конкретной последовательности этих мономерных единиц. Для нуклеиновой кислоты термин компомер относится к композиции оснований нуклеиновой кислоты с мономерными единицами, являющимися основаниями. Количество каждого типа основания может обозначаться как Вп (т.е. АаСс0дТ|. с А0С0С0Т0, представляющим пустой компомер или компомер, не содержащий оснований). Природный компомер является компомером, для которого все мономерные единицы-компоненты (например, основания для нуклеиновых кислот и аминокислоты для полипептидов) являются большими чем 0 или равными 0. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из а, с, д или ΐ равен 1 или более (например, А0С0С1Т0, А1С0С1Т0, А2С1С1Т2, А3С2С1Т5). Для цели сравнения последовательностей для определения вариаций последовательностей, в обеспеченных здесь способах, могут быть генерированы неприродные компомеры, содержащие отрицательные количества мономерных единиц с использованием алгоритма, используемого для обработки данных. Для полипептидов компомером называют состав аминокислот полипептидного фрагмента, с обозначенным количеством аминокислот каждого типа. Вид компомера может соответствовать множественным последовательностям. Например, компомер А203 соответствует последовательностям АССА0, СС0АА, ААСС0, ССА0А и другим. Обычно имеется уникальный компомер, соответствующий последовательности, но более чем одна последовательность может соответствовать одному и тому же компомеру. В некоторых вариантах осуществления один вид компомера спарен (например, соответствует) с одним видом нуклеиновой кислоты-мишени, видом ампликона и/или видом олигонуклеотида. Различные виды компомера имеют различные композиции оснований, и распознаваемые массы в экспериментах здесь (например, А0С005Т0 и А0С500Т0) являются различными и распознаваемыми по массе видами компомеров. В некоторых вариантах осуществления виды компомеров набора различаются по композиции оснований и имеют одну и ту же длину. В некоторых вариантах осуществления виды компомера набора различаются по композиции оснований и длине.
Нуклеотидный компомер, используемый в качестве распознаваемой метки, может иметь любую длину, для которой все виды компомера могут быть детектируемо распознаваемыми, например приблизительно 1-15, 5-20, 1-30, 5-35, 10-30, 15-30, 20-35, 25-35, 30-40, 35-45, 40-50 или 25-50 или иногда приблизительно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 85 или 100 нуклеотидов в длину. Пептидный или полипептидный компомер, используемый в качестве распознаваемой метки, может иметь любую длину, для которой все виды компомера могут быть детектируемо распознаваемыми, например 1-20, 10-30, 20-40, 30-50, 4060, 50-70, 60-80, 70-90 или 80-100 аминокислот. Как отмечалось выше, предел единиц в компомере часто ограничивается окном массы и разрешением способа детектирования для распознавания вида компомера.
Термины конкатемер и компамер используются здесь синонимически (вместе конкатемер) и относятся к молекуле, которая содержит две или более единицы, связанные друг с другом (например, часто связанных последовательно; иногда разветвленных в некоторых вариантах). Конкатемер иногда является нуклеиновой кислотой и/или искусственным полимером в некоторых вариантах осуществления. Конкатемер может включать один и тот же тип единиц (например, гомоконкатемер) в некоторых вариантах, и иногда конкатемер может содержать различные типы единиц (например, гетероконкатемер). Конкатемер может содержать любой тип единицы (единиц), в том числе нуклеотидные единицы, аминокислотные единицы, единицы в виде малой органической молекулы (например, тритил), единицы конкретной нуклеотидной последовательности, единицы конкретной аминокислотной последовательности и т.п. В одном варианте осуществления гомоконкатемером из трех единиц конкретной последовательности АВС является АВСАВСАВС. Конкатемер может содержать любое количество единиц, пока каждый вид конкатемера может детектируемо распознаваться от других видов. Например, вид тритильного конкатемера может содержать приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 тритильных единиц в некоторых вариантах осуществления.
Распознаваемая метка может быть, в некоторых вариантах осуществления, высвобождена (выделена) из продукта нуклеиновой кислоты (например, удлиненного олигонуклеотида). Связь между распознаваемой меткой и нуклеиновой кислотой может быть любого типа, который может транскрибироваться и расщепляться, расщепляться и позволять детектирование высвобожденной метки или меток (например, публикация заявки на патент США № И820050287533А1, озаглавленной Тагде1-8ресШс Сотротегк апб МеШобк оГ Ике, паттд ЕНпсН е1 а1.). Такие связи и способы для расщепления связей (условия расщепления) известны. В некоторых вариантах осуществления метка может быть отделена от другой части молекулы, к которой она присоединена. В некоторых вариантах осуществления метку (например, компомер) отщепляют из большей нити нуклеотидов (например, удлиненных олигонуклеотидов). Неограничивающие примеры связей включают связи, которые могут быть расщеплены нуклеазой (например, рибонуклеазой, эндонуклеазой); связи, которые могут быть расщеплены химически; связи, которые могут быть расщеплены физической обработкой; и фоторасщепляемые линкеры, которые могут быть расщеплены светом (например, о-нитробензильная, 6-нитровератрилоксикарбонильная, 2-нитробензильная группы).
- 24 027558
Фоторасщепляемые линкеры обеспечивают преимущество, когда используется система детектирования, которая излучает свет (например, выполняемая на основе матрикса лазерная десорбционная/ионизационная (МЛЬО1) масс-спектрометрия включает в себя лазерную эмиссию света), когда расщепление и детектирование объединены и осуществляются в единой стадии.
В некоторых вариантах осуществления метка может быть частью большей единицы и может быть отделена от этой единицы перед детектированием. Например, в некоторых вариантах осуществления, метка является набором смежных нуклеотидов в большей нуклеотидной последовательности, и эту метку отщепляют от большей нуклеотидной последовательности. В таких вариантах осуществления эта метка часто локализована на одном конце нуклеотидной последовательности или нуклеиновой кислоты, в которой она находится. В некоторых вариантах осуществления эта метка и/или ее предшественник находится в транскрипционной кассете, которая включает промоторную последовательность, функционально связанную с последовательностью-предшественником, которая кодирует эту метку. В более поздних вариантах осуществления этот промотор иногда является рекрутирующим РНК-полимеразу промотором, который генерирует РНК, которая включает метку или состоит из метки. РНК, которая включает метку, может быть расщеплена для высвобождения метки перед детектированием (например, РНКазой).
В некоторых вариантах осуществления распознаваемая метка или распознаваемый тэг не отщепляют от удлиненного олигонуклеотида, и в некоторых вариантах эта распознаваемая метка или тэг содержит захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления детектирование распознаваемого признака включает детектирование присутствия или отсутствия удлиненного олигонуклеотида, и в некоторых вариантах осуществления удлиненный олигонуклеотид включает захватывающий агент. В некоторых вариантах осуществления этот удлиненный олигонуклеотид высвобождается из твердой фазы конкуренцией с конкурирующим агентом, и в некоторых вариантах осуществления конкуренция с конкурирующим агентом предусматривает контактирование твердой фазы с конкурирующим агентом. В некоторых вариантах осуществления высвобождение удлиненного олигонуклеотида из твердой фазы проводят в условиях повышенной температуры. В некоторых вариантах осуществления условия повышенной температуры находятся между приблизительно 80 и приблизительно 100°С. В некоторых вариантах осуществления высвобождение удлиненных олигонуклеотидов из захватывающего агента осуществляется в условиях повышенной температуры в течение периода времени между приблизительно 1 и приблизительно 10 мин. В некоторых вариантах осуществления высвобождение удлиненных олигонуклеотидов из твердой фазы включает обработку конкурирующим агентом (например, свободным захватывающим агентом, конкурирующим фрагментом свободного захватывающего агента, мультимером свободного захватывающего агента, любой молекулой, которая специфически конкурирует за связывание с твердой фазой, подобными агентами и их комбинациями) в течение приблизительно 5 мин приблизительно при 90°С. В некоторых вариантах осуществления конкурирующим агентом является биотин и твердая фаза содержит авидин/стрептавидин, и в некоторых вариантах осуществления конкурирующим агентом является авидин/стрептавидин и твердая фаза содержит биотин.
В некоторых вариантах осуществления мультиплексный анализ включает несколько олигонуклеотидов, которые являются удлиненными, и несколько олигонуклеотидов, которые не являются удлиненными после удлинения. В таких вариантах олигонуклеотиды, которые не являются удлиненными, часто не связываются с твердой фазой, и в некоторых вариантах олигонуклеотиды, которые не являются удлиненными, могут взаимодействовать с твердой фазой.
В некоторых вариантах осуществления отношение конкурирующего агента к захватывающему агенту, присоединенному к нуклеотиду или нуклеиновой кислоте (например, удлиненному олигонуклеотиду с включенным захватывающим агентом (например, биотином)) может быть равно 1:1. В некоторых вариантах осуществления конкурирующий агент может быть использован в избытке захватывающего агента, ассоциированного с олигонуклеотидом, и в некоторых вариантах осуществления захватывающий агент, ассоциированный с олигонуклеотидом, может быть в избытке конкурирующего агента. В таких вариантах этот избыток иногда является приблизительно 5-кратным избытком до приблизительно 50000кратным избытком (например, приблизительно 10-, приблизительно 100-, приблизительно 1000- или приблизительно 10000-кратным избытком).
Детектирование и степень мультиплексирования.
Термин детектирование (детекция) метки относится в данном контексте к идентификации вида метки. Любое подходящее устройство детектирования может быть использовано для распознавания вида метки в пробе. Устройства детектирования, подходящие для детектирования распознаваемых по массе меток, включают, без ограничения ими, определенные масс-спектрометры и устройства для гельэлектрофореза. Примеры форматов масс-спектрометрии включают в себя, без ограничения, выполняемую на основе матрикса лазерную десорбционную/ионизационную времяпролетную (МАЬО1-ТОР) массспектрометрию (М§), ΜΑΣΌΙ ортогональная ТОР М§ (ОТОР М§; двухмерную), лазерную десорбционную масс-спектрометрию (ЬОМ§), электрораспылительную (Е§) М§, использующую ионноциклотронный резонанс (1СК) масс-спектрометрию (М§) и масс-спектрометрию, использующую резонанс с Фурье-преобразованием. Описанные здесь способы являются легко применимыми для форматов масс-спектрометрии, в которых аналит испаряется и ионизируется (ионизационная М§, например,
- 25 027558
ΜΑΡΌΙ-ΤΟΡ Μδ, ΌΌΜδ, ΕδΜδ, линейная ΤΟΡ, ΟΤΟΡ). Ортогональная ион-экстракционная ΜΑΌΌΙ-ΤΟΡ и аксиальная ΜΑΡΌΙ-ΤΟΡ могут давать повышение до относительно высокого разрешения и, посредством этого, относительно высокие уровни мультиплексирования. Устройства для детектирования, подходящие для детектирования светоизлучающих, светопоглощающих и/или светорассеивающих меток, включают в себя, без ограничения, некоторые фотоэлементы и фотодетекторы (например, для флуоресцентных, хемилюминесцентных, поглощающих и/или рассеивающих свет меток). Способы, обеспеченные здесь, позволяют высокопроизводительное детектирование или обнаружение видов нуклеиновых кислот-мишеней во множестве нуклеиновых кислот-мишеней. Мультиплексированием называют одновременное детектирование более чем одного вида нуклеиновой кислоты-мишени. Обычные способы для выполнения мультиплексных реакций вместе с масс-спектрометрией известны (см., например, патенты США № 6043031, 5547835 и международную РСТ заявку Ж.) 97/37041). Мультиплексирование обеспечивает преимущество, состоящее в том, что множество видов нуклеиновых кислот-мишеней (например, некоторых имеющих различные последовательности вариаций) могут быть идентифицированы всего лишь в единственном масс-спектре, в сравнении с выполнением отдельного анализа масс-спектрометрии для каждого единственного масс-спектра для каждого индивидуального вида нуклеиновой кислотымишени. Способы, обеспеченные здесь, пригодны для высокопроизводительных, высокоавтоматизированных процессов для анализа вариаций последовательностей с высокой скоростью и точностью, в некоторых вариантах. В некоторых вариантах осуществления приведенные здесь способы могут быть мультиплексированы при высоких уровнях в единственной реакции. Мультиплексирование применяется, когда генотип в полиморфном локусе неизвестен и, в некоторых вариантах осуществления, когда этот генотип в локусе известен.
В некоторых вариантах осуществления количества мультиплексируемых видов нуклеиновых кислот-мишеней включают в себя, без ограничения, приблизительно 2-1000 видов и иногда приблизительно
1-3, 3 -5, 5- 7, : 7-9, 9-11, 11-13, 13-15, 15-17,
17-19, 19-21, 21- -23, 23-25 , 25-27, 27-29, 29- -31, 31-33, 33-35
35-37, 37 -39, 39- -41, 41-43, , 43-45, 45-47, 47- 49, 49-51 , 51-53,
53-55, 55 -57, 57- -59, 59-61, , 61-63, 63-65, 65- 67, 67-69 , 69-71,
35-37, 37 -39, 39- -41, 41-43, , 43-45, 45-47, 47- 49, 49-51 , 51-53,
53-55, 55 -57, 57- -59, 59-61, , 61-63, 63-65, 65- 67, 67-69 , 69-71,
71-73, 73 -75, 75- -77, 77-79, , 79-81, 81-83, 83- 85, 85-87 , 87-89,
89-91, 91 -93, 93- -95, 95-97, , 97-101, . 101-103, 103-105, 105-107,
107-109, 109-111, 111-113, 113-115, 115-117, 117-119, 121-123,
123-125, 125-127, 127-129, 129-131, 131-133, 133-135, 135-137,
137-139, 139-141, 141-143, 143-145, 145-147, 147-149, 149-151,
151-153, 153-155, 155-157, 157-159, 159-161, 161-163, 163-165,
165-167, 167-169, 169-171, 171-173, 173-175, 175-177, 177-179,
179-181, 181-183, 183-185, 185-187, 187-189, 189-191, 191-193,
193-195, 195-197, 197-199, 199-201, 201-203, 203-205, 205-207,
207-209, 209-211, 211-213, 213-215, 215-217, 217-219, 219-221,
221-223, 223-225, 225-227, 227-229, 229-231, 231-233, 233-235,
235-237, 237-239, 239-241, 241-243, 243-245, 245-247, 247-249,
249-251, 251-253, 253-255, 255-257, 257-259, 259-261, 261-263,
263-265, 265-267, 267-269, 269-271, 271-273, 273-275, 275-277,
277-279, 279-281, 281-283, 283-285, 285-287, 287-289, 289-291,
291-293, 293-295, 295-297, 297-299, 299-301, 301-303, 303-305,
305-307, 307-309, 309-311, 311-313, 313-315, 315-317, 317-319,
319-321, 321-323, 323-325, 325-327, 327-329, 329-331, 331-333,
333-335, 335-337, 337-339, 339-341, 341-343, 343-345, 345-347,
347-349, 349-351, 351-353, 353-355, 355-357, 357-359, 359-361,
361-363, 363-365, 365-367, 367-369, 369-371, 371-373, 373-375,
375-377, 377-379, 379-381, 381-383, 383-385, 385-387, 387-389,
389-391, 391-393, 393-395, 395-397, 397-401, 401-403, 403-405,
405-407, 407-409, 409-411, 411-413, 413-415, 415-417, 417-419,
419-421, 421-423, 423-425, 425-427, 427-429, 429-431, 431-433,
433-435, 435-437, 437-439, 439-441, 441-443, 443-445, 445-447,
447-449, 449-451, 451-453, 453-455, 455-457, 457-459, 459-461,
461-463, 463-465, 465-467, 467-469, 469-471, 471-473, 473-475,
475-477, 477-479, 479-481, 481-483, 483-485, 485-487, 487-489,
489-491, 491-493, 493-495, 495-497, 497-501
- 26 027558 видов или более.
Способы конструирования для достижения разрешенных масс-спектров с мультиплексными анализами могут включать способы конструирования праймеров и олигонуклеотидов и способы конструирования реакции. Для конструирования праймеров и олигонуклеотидов в мультиплексных анализах те же самые руководящие принципы для конструирования праймеров применяются для униплексных реакций, такие как избежание ошибочного праймирования и димеров праймеров, только для мультиплексных реакций включают больше праймеров. Кроме того, пики аналита в масс-спектрах для одного анализа являются достаточно разрешаемыми из продукта любого анализа, с которым этот анализ мультиплексируется, в том числе пики полимеразной паузы (транзиторной остановки транскрипции в одном из двух типов генов) (паузинга) и любые другие побочные пики. Пики аналита также оптимально попадают в указанное пользователем окно массы, например, в пределах диапазона 5000-8500 Да. Удлиненные олигонуклеотиды могут быть сконструированы, в некоторых вариантах, относительно последовательностей-мишеней конкретной цепи 8ΝΡ. В таких вариантах осуществления эта длина часто находится между границами, которые могут быть границами, например, указанными пользователем (например, 17-24 основания или 17-26 оснований), и часто не содержат оснований, которые являются неопределенными в этой последовательности-мишени. Сила гибридизации иногда измеряется температурой последовательностьзависимого плавления (или гибридизации/диссоциации), Тм. Выбор конкретного праймера может быть не позволен или выбракован относительно других выборов праймеров вследствие его шпилечного потенциала, потенциала ложного праймирования, потенциала праймера-димера, районов низкой комплексности и проблематичных субпоследовательностей, таких как ОООО. Способы и программное обеспечение для конструирования удлиненных олигонуклеотидов (например, в соответствии с этими критериями) известны и включают, например, δρβοΐΓοΌΕδΙΟΝΕΚ (Ъссщспош).
В данном контексте термин коэффициент запросов или коэффициент вызовов относится к количеству вызовов (например, определяемых генотипов), полученных относительно количества вызовов, которое пытались получить. Другими словами, для 12-плексной реакции, если 10 генотипов определяют в конечном счете из проводимых способов, обеспеченных здесь, то 10 вызовов были получены с коэффициентом вызовов 10/12. Различные события могут приводить к неудаче конкретного пробного анализа и приводить к коэффициенту вызовов менее 100%. Изредка, в случае смеси άΝΤΡ и άάΝΤΡ для терминации, могут возникать неподходящие удлиненные продукты вследствие полимеразной паузы (паузинга) после включения одного нетерминирующего нуклеотида (т.е. άΝΤΡ), приводящего, например, к преждевременно терминированному праймеру удлинения. Различие масс между реакцией удлинения массы ложно терминированным и правильно терминированным праймером в полиморфном сайте является иногда слишком малым для совместимого разрешения и может приводить к ошибочным вызовам, если используется смесь с неподходящей терминацией. Различия масс между правильной терминацией и ошибочной терминацией (т.е. терминацией, вызванной полимеразной паузой), а также между правильной терминацией и аддуктами соли, а также правильной терминацией и неспецифическим включением часто максимизируется для уменьшения числа ошибочных вызовов.
Точность мультиплексного анализа может быть определена оцениванием количества полученных вызовов (например, правильно или точно оцененных) и/или количества ложноположительных и/или ложноотрицательных событий в одном или нескольких анализах. Точность может быть также оценена сравнением с точностью соответствующих униплексных анализов для каждой из мишеней, оцениваемых в мультиплексном анализе. В некоторых вариантах осуществления один или несколько способов могут быть использованы для определения коэффициента вызовов. Например, может быть использован ручной способ вместе с автоматизированным или компьютерным способом для образования вызовов, и в некоторых вариантах осуществления эти коэффициенты для каждого способа могут быть суммированы для расчета общего коэффициента вызовов. В некоторых вариантах осуществления точность коэффициентов вызовов при мультиплексировании двух или более нуклеиновых кислот-мишеней (например, пятидесяти или более нуклеиновых кислот-мишеней) может быть равна приблизительно 99 или более, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78 или 77, 76%, например. В некоторых вариантах осуществления коэффициент вызовов для каждого вида-мишени в мультиплексном анализе, который включает приблизительно 2-200 видов-мишеней, является большим чем или равным 80% или более (например, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более).
В некоторых вариантах осуществления коэффициент ошибок может быть определен на основе коэффициента вызовов или коэффициента точности. Например, коэффициент ошибок может быть числом вызовов, сделанных ошибочно. В некоторых вариантах осуществления, например, коэффициент ошибок может быть на 100% меньшим, чем коэффициент вызовов или коэффициент точности. Этот коэффициент ошибок может также называться неудачным коэффициентом. Идентификация ложных положительных и/или ложных отрицательных результатов может изменять коэффициенты как вызовов, так и ошибок. В некоторых вариантах осуществления коэффициенты вызовов, при мультиплексировании двух или более нуклеиновых кислот-мишеней (например, пятидесяти или более нуклеиновых кислотмишеней) могут быть, например, приблизительно 1 или менее, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25%.
- 27 027558
Применения
Далее следуют примеры неограничивающих применений описанной здесь мультиплексной технологии.
1. Детектирование вариаций последовательностей (например, генетических вариантов).
Обеспечены улучшенные способы для идентификации геномной основы заболевания и их маркеры. Кандидаты вариации последовательности (например, генетического варианта), которые могут быть идентифицированы способами, обеспеченными здесь, включают последовательности, содержащие вариации последовательности, которые являются полиморфизмами.
Полиморфизмы включают как природно-встречающиеся, соматические вариации последовательности, так и последовательности, возникающие из мутации. Полиморфизмы включают, но не ограничиваются ими, микроварианты последовательности, где один или несколько нуклеотидов в локализованном районе варьируются от индивидуума к индивидууму, инсерции и делеции, которые могут варьироваться в размере от одного нуклеотида до миллиона оснований, и микросателлиты или нуклеотидные повторы, которые варьируются по количеству повторов. Нуклеотидные повторы включают гомогенные повторы, такие как динуклеотид, тринуклеотид, тетрануклеотид или большие повторы, где одна и та же последовательность повторяется много раз, а также гетеронуклеотидные повторы, где мотивы последовательности повторяются, как было обнаружено. Для конкретного локуса количество нуклеотидных повторов может варьироваться в зависимости от индивидуума.
Полиморфный маркер или сайт является локусом, в котором осуществляется дивергенция. Такой сайт может быть таким малым, как одна пара оснований (8ΝΚ). Полиморфные маркеры включают в себя, но не ограничиваются ими, полиформизм длин рестрикционных фрагментов (КРЬР), вариабельное число тандемных повторов (У^ТК), гипервариабельные районы, мини-сателлиты, динуклеотидные повторы, тринуклеотидные повторы, тетрануклеотидные повторы и другие повторяющиеся структуры, простые повторы последовательности и инсерционные элементы, такие как А1и. Полиформные формы обнаруживаются также в виде отличающихся от Менделевских аллелей для гена. Полиморфизмы могут наблюдаться по различиям в белках, модификациям белков, модификациям экспрессии ДНК, метилированию ДНК и РНК, регуляторным факторам, которые изменяют экспрессию генов и репликацию ДНК, и по любому другому проявлению изменений в геномной нуклеиновой кислоте или нуклеиновых кислотах органелл.
Кроме того, многие гены имеют полиморфные районы. Поскольку индивидуумы имеют любой из нескольких аллельных вариантов полиморфного района, индивидуумы могут быть идентифицированы на основе типа аллельных вариантов полиморфных районов генов. Это может быть использовано, например, для судебных целей. В других ситуациях важно знать идентичность аллельных вариантов, которые имеет индивидуум. Например, аллельные различия в некоторых генах, например, генах главного комплекса гистосовместимости (МНС), участвуют в отторжении трансплантата или болезни трансплантат против хозяина в транспортировке костного мозга. Таким образом, крайне желательным является развитие быстрых, чувствительных и точных способов для определения идентичности аллельных вариантов полиморфных районов генов или генетических повреждений. Способ или набор, обеспеченный здесь, может быть использован для генотипирования субъекта определением идентичности одного или нескольких аллельных вариантов одного или нескольких полиморфных районов в одном или нескольких генах или хромосомах субъекта. Генотипирование субъекта с использованием способа, обеспеченного здесь, может быть использовано в судебных или тестирующих идентичность целях и полиморфные районы могут присутствовать в микрохондриальных генах или могут быть короткими тандемными повторами.
Однонуклеотидные полиморфизмы (δΝΈ) являются обычно биаллельными системами, т.е. имеются два аллеля, которые индивидуум может иметь для каждого конкретного маркера. Это означает, что содержание информации в расчете на δΝΓ-маркер является относительно низким при сравнении с микросателлитными маркерами, которые могут иметь больше 10 аллелей. δΝΈ также имеют тенденцию быть очень специфическими в отношении популяции; маркер, который является полиморфным в одной популяции может не быть очень полиморфным в другой популяции. δΝΈ, обнаруживающие без исключения приблизительно тысячу нуклеотидов (т.н.) (см. \Уапд е1 а1. (1998), §аепсе,. 280:1077-1082), предоставляют потенциал для генерирования генетических карт очень высокой плотности, которые будут чрезвычайно применимыми для развития систем гаплотипирования для генов или представляющих интерес районов, и, вследствие этой природы δΝΈ, они могут фактически быть полиморфизмами, ассоциированными с исследуемыми фенотипами заболеваний. Низкий коэффициент мутации δΝΈ также делает их превосходными маркерами для исследования комплексных генетических признаков.
Значительная часть фокусирования геномики была нацелена на идентификацию 8ΝΓ, которые являются важными в силу различных причин. Они позволяют непрямое тестирование (ассоциацию гаплотипов) и прямое тестирование (функциональных вариантов). Они являются наиболее изобилующими и стабильными генетическими маркерами. Обычные заболевания являются наилучшим образом объясненными генетическими изменениями, и природная вариация в популяции человека способствует пониманию заболевания, терапии и взаимодействий окружающей среды.
- 28 027558
Чувствительное детектирование соматических мутаций является особенно ценным для сообщества исследования рака, интересом которого является идентификация генетических детерминант для инициации и пролиферации опухолей. Эта информация, полученная из чувствительного подхода, может быть также использована для анализа мутаций для предсказания результата лечения пациента и информации о релевантной возможности лечения. В некоторых вариантах осуществления чувствительный способ детектирования, который может детектировать генетический вариант, который представляет менее 5 или 5% его копии последовательности дикого типа, если это необходимо. В некоторых вариантах осуществления выполняется способ детектирования, который может детектировать менее чем 1 или 1% дикого типа. В некоторых вариантах осуществления выполняется способ детектирования, который может детектировать менее или равное 5, 4, 3, 2, 1, 0,8, 0,75, 0,5, 0,1, 0,05 или 0,01% дикого типа. Дополнительно, в пренатальной диагностике, этот тип способа мог бы объяснить произведенные по отцу мутации ίη Шсго.
В некоторых вариантах осуществления аллельный анализ может быть выполнен генерированием удлиненных олигонуклеотидов из нуклеиновых кислот-мишеней, несущих представляющие интерес соматические мутации (например, δΝΚ, маркеры заболевания или т.п. и их комбинации). Детектирование присутствия или отсутствия высвобожденного, удлиненного олигонуклеотида, представляющего аллель, несущий соматическую мутацию, может быть использовано в качестве быстрого способа скрининга на присутствие или отсутствие конкретной мутации в популяции-мишени, в некоторых вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления, включающих в себя генерирование удлиненного олигонуклеотида из мутантного аллеля, этот удлиненный олигонуклеотид может быть детектирован, когда подходящий мутантный аллель вызывает образование продукта удлиненного олигонуклеотида.
2. Идентифицирующие заболевание маркеры.
Здесь обеспечены способы для быстрой и точной идентификации вариаций последовательностей, которые являются генетическими маркерами заболевания, которые могут быть использованы для диагностики или определения прогноза заболевания. Заболевания, характеризуемые генетическими маркерами, могут включать в себя, но не ограничиваются ими, атеросклероз, ожирение, диабет, аутоиммунные нарушения и рак. Заболевания во всех организмах имеют генетический компонент, наследуемый или происходящий из реакции организма на стрессы окружающей среды, такие как вирусы и токсины. Конечной задачей проводимого геномного исследования является использование этой информации для развития новых путей для идентификации, лечения и потенциально излечивания этих заболеваний. Первой стадией был скрининг ткани заболевания и идентификация геномных изменений на уровне индивидуальных проб. Эта идентификация этих маркеров заболевания зависит от способности детектирования изменений в геномных маркерах для идентификации блуждающих генов или вариантов последовательностей. Геномные маркеры (все генетические локусы, включающие однонуклеотидные полиморфизмы (δΝΈ), микросателлиты и другие некодирующие геномные районы, тандемные повторы, интроны и экзоны) могут быть использованы для идентификации всех организмов, в том числе человека. Эти маркеры не только обеспечивают путь для идентификации популяций, но также делают возможной стратификацию популяций в соответствии с их реакцией на заболевание, устойчивостью к агентам окружающей среды и другим факторам. Маркер заболевания является иногда мутацией и может быть относительно редким аллелем, таким как, например, соматическая мутация против фона аллеля дикого типа (например, раковой ткани против нормальной ткани, мутантного вирусного типа против нормального вирусного типа (например, Ηΐν)), в некоторых вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления редкий аллель или мутация представляет менее 5, 4, 3, 2, 1, 0,8, 0,75, 0,5, 0,1, 0,05 или 0,01% дикого типа. В некоторых вариантах этот редкий аллель или мутация могут представлять менее 1% дикого типа.
3. Микробная идентификация.
Здесь обеспечен процесс или способ идентификации родов, видов, штаммов, клонов или подтипов микроорганизмов и вирусов. Этот микроорганизм (эти микроорганизмы) и вирусы выбирают из разнообразия организмов, включающих бактерии, грибки, простейшие, реснитчатые и вирусы. Эти микроорганизмы не ограничиваются конкретным родом, видом, штаммом, подтипом или серотипом или любой другой классификацией. Эти микроорганизмы и вирусы могут быть идентифицированы определением вариаций последовательности в последовательности-мишени микроорганизма относительно одной или нескольких ссылочных последовательностей или проб. Эта ссылочная последовательность (эти ссылочные последовательности) могут быть получены, например, из другого микроорганизма из того же самого или отличающегося гена, вида, штамма или серотипа или любой другой классификации, или из прокариотического или эукариотического организма-хозяина или любой смешанной популяции.
Идентификация и типирование патогенов (например, бактериальных или вирусных) является критическим в клиническом лечении инфекционных заболеваний. Точная идентичность микроба не только используется для дифференцировки состояния заболевания от здорового состояния, но является также фундаментальной для определения источника этой инфекции и его распространения и определения, какие антибиотики или другие противомикробные терапии являются наиболее подходящими для лечения. Кроме того, лечение может быть подвергнуто мониторингу. Традиционные способы типирования патогена использовали разнообразные фенотипические признаки, включающие в себя характеристики роста, цвет, морфологию клеток или колоний, чувствительность к антибиотикам, окрашивание, запах, сероти- 29 027558 пирование, биохимическое типирование и реактивность со специфическими антителами для идентификации микробов (например, бактерий). Все из этих способов требуют культивирования предполагаемого патогена, которое страдает от ряда серьезных недостатков, включающих в себя высокие стоимости материала и труда, опасность воздействия на медицинский персонал, ложные положительные результаты вследствие неправильного обращения и ложные отрицательные результаты вследствие низких количеств жизнеспособных клеток или вследствие изощренных требований культивирования многих патогенов. Кроме того, способы культивирования требуют относительно продолжительного времени для достижения диагноза, и, вследствие потенциально угрожающей жизни природы таких инфекций, противомикробную терапию часто начинают прежде, чем эти результаты могут быть получены. Некоторые организмы не могут сохраняться в культуре или проявляют чрезмерно медленные скорости роста (например, до 6-8 недель для МусоЬас!епит !иЬегси1о818).
Во многих случаях эти патогены присутствуют в минорных количествах и/или являются очень сходными с организмами, которые составляют нормальную флору, и могут быть не отличаемыми от безвредных штаммов при помощи цитированных выше способов. В этих случаях определение присутствия патогенного штамма может требовать более высокого разрешения, предоставляемого способами молекулярного типирования, обеспеченными здесь.
4. Детектирование присутствия вирусных или бактериальных последовательностей нуклеиновых кислот, указывающих на инфекцию.
Обеспеченные здесь способы могут быть использованы для определения вирусных или бактериальных последовательностей нуклеиновых кислот, указывающих на инфекцию, идентификацией вариаций последовательностей, которые присутствуют в вирусных или бактериальных последовательностях нуклеиновых кислот, относительно одной или нескольких ссылочных последовательностей. Эти ссылочные последовательности могут включать, но не ограничиваются ими, последовательности, полученные из инфекционного организма, родственного неинфекционного организма или последовательности из организмов-хозяев.
Вирусы, бактерии, грибки и другие инфекционные организмы содержат отличающиеся последовательности нуклеиновых кислот, включающие варианты последовательностей, которые отличаются от последовательностей, содержащихся в клетке-хозяине. ДНК-последовательность-мишень может быть частью чужеродной генетической последовательности, такой как геном вторгающегося микроорганизма, в том числе, например, бактерий и их фагов, вирусов, грибков, простейших и т.п. Обеспеченные здесь процессы являются частично применимыми для различения между различными вариантами или штаммами микроорганизма (например, патогенного, менее патогенного, резистентного от нерезистентного и т.п.), например для выбора подходящего терапевтически вмешательства. Примеры вызывающих заболевание вирусов, которые инфицируют людей и животных и которые могут быть детектированы описанным процессом, включают в себя, но не ограничиваются ими, Ке!гоутйае (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как Н1У-1 (также называемые НТЬУ-Ш, ΕΑν или НТГУ-ШТЛУ (Ка!иег е! а1., Уинге. 313:227-284 (1985); Ааш НоЬзои е! а1., Се11, 40:9-17 (1985)), Н1У-2 (Оиуайег е! а1., Уинге. 328:662669 (1987); Еигореап Ра!еи! РиЫюаПои №. 0269520; СЬакгаЬаШ е! а1., №!иге, 328:543-547 (1987); заявка на Европейский патент № 0655501), и другие изоляты, такие как Н1У-ЬР (международная публикация АО 94/00562); Рюогиаушйае (например, полиовирусы, вирус гепатита Α (Оиз! е! а1., 1и!егу1го1оду, 20:1-7 (1983)); энтеровирусы, вирусы коксаки человека, риновирусы, ЕСНО-вирусы; Са1с1У1гйае (например, штаммы, которые вызывают гастроэнтериты); Тодаутйае (например, вирусы лошадиного энцефалита, вирусы краснухи); Иаутйае (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Согоиаутйае (например, коронавирусы); КЬаЬйоутйае (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); РПоушйае (например, вирусы Эбола); Рагатухоушйае (например, вирусы парагриппа, вирус паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Ойкотухоушйае (например, вирусы гриппа); Виидаушйае (например, вирусы Хантаана, бунгавирусы, флебовирусы и Найровирусы); Α^еиаν^^^άае (вирусы геморрагической лихорадки); Кеоушйае (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Вппаутйае; Нерайиаушйае (вирус гепатита В); Рагуоушйае (парвовирусы); Рагуоутйае (большинство аденовирусов); Рароуаушйае (папилломавирусы, полиомавирусы); Αάеиоν^^^άае (большинство аденовирусов); Негрекутйае (вирус простого герпеса типа 1 (Н8У-1) и Н8У-2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, герпесвирусы); Рохушйае (вирусы натуральной оспы, вирусы осповакцины, поксвирусы); Ыйоутйае (например, вирус африканской свиной лихорадки)) и неклассифицированные вирусы (например, этиологические агенты Зроидйогт еисерЬа1ора!Ые8, агент дельта-гепатита (предположительно являющийся дефектным сателлитом вируса В гепатита), агенты ни А ни В гепатита (класс 1=интернально переносимые; класс 2=парентерально переносимые, т.е. гепатит С)); вирусы Норволк и родственные вирусы и астровирусы.
- 30 027558
Примеры инфекционных бактерий включают в себя, но не ограничиваются ими,
НеЕЕсоЬасЕег руЕогЕз, ВогеЕЕа ЪигдсЕогЕЕегЕ ,
ВедЕопеЕЕа рпеишорЕЕЕЕа г МусоЬасЕегЕа зр. (например, М.
ЕиЪегсиЕозЕз, М. ауЕит, М. ЕпЕгасеЕЕиЕаге, М. капзаЕЕ, М. догСопае), ЗаЕтопеЕЕа, ЗЕаркуЕососсиз аигеизг ЫеЕззегЕа допоггкеае, ИеЕззегЕа тепЕпдЕЕЕСЕз, ВЕзЕегЕа топосуЕодепез,
ЗЕгерЕососсиз руодепез (Сгоир А ЗЕгерЕососсиз) г ЗЕгерЕососсиз адаЕасЕЕае (Сгоир В ЗЕгерЕососсиз), ЗЕгерЕососсиз зр. (группы νίΓίάβηΞ) , ЗЕгерЕососсиз каесаНз, ЗЕгерЕососсиз Βονί5,
ЗЕгерЕососсиз зр. (анаэробные виды), ЗЕгерЕососсиз рпеитопЕае, патогенные СатруЕоЬасЕег зр. г ЕпЕегососсиз зр. г НаеторкНиз 1пВ1иепгае г ВасШиз апЕкгасЕз г СогупеЬасЕегЕит СЕркЕкегЕае ,
СогупеЬасЕегЕит зр. г ЕгузЕреЕоЕкгЕх гкизЕораЕкЕае, СЕозЕгЕЬЕит регкгЕпдепзг СЕозЕгЕЬЕит ЕеЕапЕ , ЕзскегЕскЕа соЕЕ г ЕпЕегоЬасЕег аегодепез, КЕеЬзЕеЕЕа рпеитопЕае, РазЕигеЕЕа тиЕЕосЕЬа г ВасЕегоЕЬез зр. г РизоЬасЕегЕит писЕеаЕит, ЗЕгерЕоЬасЕЕЕиз топЕЕЕЕЕогтЕз г Тгеропета раЕЕЕсИит, Тгеропеша регЕепие ,
ЕерЕозрЕга и АсЕЕпотусез ЕзгаеЕЕЕ и любые варианты, в том числе варианты с устойчивостью к антибиотикам.
Примеры инфекционных грибков включают в себя, но не ограничиваются ими, Сгур1ососси8 пео£огшап8г Н181ор1а8ша сарзиЫит, Сосс1ЙЮ1Йе5 1шшЙ15, В1а81отусе8 0егшаййЙ15, СЫашу&а Дасйотайз, СапШба а1Ысап8. Другие инфекционные организмы включают в себя простейших, таких как Ркзтойшт £а1с1рагиш и Тохор1азта допйй.
5. Антибиотический анализ.
Обеспеченные здесь способы могут улучшать скорость и точность детектирования изменений нуклеотидов, участвующих в устойчивости (резистентности) к лекарственным средствам, в том числе устойчивости к антибиотикам. Были идентифицированы генетические локусы, участвующие в устойчивости к изониазиду, рифампину, стрептомицину, фторхинолонам и этионамиду [Неут е! а1., Ьапсе! 344:293 (1994) и Могпз е! а1., I. 1п£ес1. ϋίδ. 171:954 (1995)]. Комбинацию изониазида (тЬ) и рифамицина (ίίί) вместе с пиразинамидом и этамбутолом или стрептомицином рутинным образом используют в первой линии атаки против подтвержденных случаев М. 1иЬегси1о818 [Вапецее е! а1., 5с1епсе, 263:227 (1994)]. Увеличивающаяся частота таких резистентных штаммов делает необходимым развитие быстрых анализов для их детектирования и уменьшения посредством этого расходов и опасности для здоровья сообществ в результате проведения неэффективного и, возможно, вредного лечения. Идентификация некоторых из генетических локусов, участвующих в резистентности к лекарственному средству, облегчило принятие технологий детектирования мутаций для быстрого скрининга нуклеотидных изменений, которые приводят к устойчивости к лекарственным средствам. Кроме того, эта технология облегчает мониторинг лечения и прослеживание (запись) структур микробной популяции, а также мониторинг наблюдения во время лечения. Кроме того, могут выполняться корреляции и мониторинг наблюдения смешанных популяций.
6. Гаплотипирование.
Способы, обеспеченные здесь, могут быть использованы для детектирования гаплотипов. В любой диплоидной клетке имеются два гаплотипа в любом гене или другом хромосомном сегменте, который содержит по меньшей мере одну отличающуюся дисперсию. Во многих хорошо исследованных генетических системах, гаплотипы являются более сильно коррелирующими с фенотипами, чем однонуклеотидные вариации. Таким образом, определение гаплотипов является ценным для понимания генетической основы разнообразия фенотипов, включающих в себя предрасположение к заболеванию или восприимчивость, реакцию на терапевтические вмешательства и другие представляющие интерес фенотипы в медицине, животноводстве и сельском хозяйстве.
Процедуры гаплотипирования, обеспеченные здесь, делают возможным выбор части последовательности из одной из двух гомологичных хромосом индивидуума и генотипирование связанных 5ΝΡ на этой части последовательности. Прямое разрешение гаплотипов может давать увеличенное содержание информации, улучшение диагностики любых связанных с заболеванием генов или идентификацию связей, ассоциированных с этими заболеваниями.
7. Микросателлиты.
Способы, обеспеченные здесь, делают возможным быстрое недвусмысленное детектирование вариаций микросателлитных последовательностей. Микросателлиты (иногда называемые вариабельным числом тандемных повторов или νΝΤΚ) являются короткими тандемно повторяемыми нуклеотидными единицами из 1-7 или более оснований, наиболее известными среди которых являются ди-, три- и тетра- 31 027558 нуклеотидные повторы. Микросателлиты присутствуют через каждые 100000 п.н. в геномной ДНК (РЬ. ХУеЬег αηά Ρ.Ε. Сап, Ат. 1. Нит. Оепе!. 44, 388 (1989); 1. ХУеГкепЬаск е! а1., №!иге, 359, 794 (1992)). СА-динуклеотидные повторы, например, составляют приблизительно 0,5% экстра-митохондриального генома человека; повторы СТ и АО вместе составляют 0,2%. Повторы СО являются редкими, наиболее вероятно, вследствие регуляторной функции СрО-островков.
Микросателлиты являются высокополиморфными относительно длины и широко распределенными на протяжении всего генома с основным изобилием в некодирующих последовательностях, и их функция в геноме неизвестна. Микросателлиты могут быть важными в судебных применениях, пока популяция будет сохранять разнообразие микросателлитов, характерных для этой популяции, и отличаться от других популяций, которые не подвергались интербридингу.
Многие изменения в микросателлитах могут быть молчащими, но некоторые могут приводить к значимым изменениям в генных продуктах или уровнях экспрессии. Например, тринуклеотидные повторы, обнаруженные в кодирующих районах генов, испытывали воздействие в некоторых опухолях (С.Т. Саккеу е! а1., 8с1епсе, 256, 784 (1992), и изменение микросателлитов может приводить к генетической нестабильности, которая приводит к предрасположенности к раку (Ρ.Ρ МсКтппеп, Нит. Оепе!. 175, 197 (1987); 1. Оегтап е! а1., СЬп. Оепе!. 35, 57 (1989)).
8. Короткие тандемные повторы.
Способы, обеспеченные здесь, могут быть использованы для идентификации районов коротких тандемных повторов (8РК) в некоторых последовательностях-мишенях генома человека, родственных, например, ссылочным последовательностям в геноме человека, которые не содержат 8РК-районов.
являются полиморфными районами, которые не относятся к какому-либо заболеванию или состоянию. Многие локусы в геноме человека содержат полиморфный район коротких тандемных нуклеотидов (8РК). содержат элементы коротких повторяющихся последовательностей с длиной 3-7 оснований. Определено, что имеются 200000 ожидаемых тримерных и тетрамерных 8РК, которые присутствуют так часто, как один раз каждые 15 т.п.н. в геноме человека (см., например, международную РСТ-заявку νθ 9213969 А1, ΕάλΥητάδ е! а1., №с1. ΑΟάδ Кек. 19:4791 (1991); Βесктаηη е! а1. (1992), Оеют^я, 12:627-631). Почти половина этих локусов 8ΤΚ являются полиморфными, обеспечивающими богатый источник генетических маркеров. Вариация в числе повторяемых единиц в конкретном локусе является ответственной за наблюдаемые вариации последовательностей, напоминающие локусы вариабельного нуклеотидного тандемного повтора (νΝΤΚ) (Шкапина е! а1. (1987), 8с1еисе, 235:1616-1622); и локусы мини-сателлитов НеГГгеук е! а1. (1985), Ш!ите, 314:67-73), которые содержат длинные повторяющиеся единицы, и локусы микросателлитов или динуклеотидных повторов (Ьи!у е! а1. (1991), №.1с1ею ΑΟάκ Кек. 19:4308; Ы!! е! а1. (1990), Шис1е1с Ααάκ Кек. 18:4301; Ы!! е! а1. (1990), Шис1е1с Ααάκ Кек. 18:5921; Ьи1у е! а1. (1990), Αт. 1. Нит. Оепе!. 46:776-783; Τ;ιιΙζ (1989), Νϋθ1. ΑΟάκ Кек. 17:6463-6471; ХУеЬег е! а1. (1989), Αт. 1. Нит. Оепе!. 44:388-396; Βесктапи е! а1. (1992), Ое^т^к,
12:627-631).
VNΤК-τиπирование является хорошо установленным инструментом в микробном типировании, например, М.!иЬе^си1οκ^κ (М1Ки-типировании).
Примеры 8РК-локусов включают в себя, но не ограничиваются ими, пентануклеотидные повторы в СИ4-локусе человека (Γάλλ^ά е! а1., №с1. Л^к Кек. 19:4791 (1991)); тетрануклеотидные повторы в гене ароматазы-цитохрома Р450 человека (ΟΥΡ19; Ρο1уте^οрοи1οκ е! а1., Иис1. Αс^άκ Кек. 19:195 (1991)); тетрануклеотидные повторы в гене субъединицы А фактора коагуляции XIII человека (Ρ13Α1; Ρο1уте^οрοи1οκ е! а1., №с1. Αс^άκ Кек. 19:4306 (1991)); тетрануклеотидные повторы в ΡΠΒ-локусе (ΝίкЫтита е! а1., Иис1. Αс^άκ Кек. 20:1 167 (1992)); тетрануклеотидные повторы в с-1ек/Грк человека, протоонкогене (ΡΕ8; Ρο1уте^οрοи1οκ е! а1., Νϋθ1. Αс^άκ Кек. 19:4018 (1991)); тетрануклеотидные повторы в гене ЬРЬ (2иЪат е! а1., №с1. Αс^άκ Кек. 18:4958 (1990)); тринуклеотидные вариации повторяемых последовательностей в А-2-гене панкреатической фосфолипазы человека (ΡΡΑ2; Ρο1уте^οрοи1οκ е! а1., Νϋθ1. Αс^άκ Кек. 18:7468 (1990)); тетрануклеотидные вариации повторяемых последовательностей в гене ννΡ ^^к е! а1., Νϋθ1. Αс^άκ Кек. 18:4957 (1990)); и тетрануклеотидные повторы в локусе пероксидазы тиреоида человека (ΙιΤΡΟ) (ΑπΙ^γ е! а1., Нит. Μο1. Оепе!. 1:137 (1992)).
9. Идентификация организмов.
Полиморфные 8РК-локусы и другие полиморфные районы генов являются вариациями последовательностей, которые являются чрезвычайно полезными маркерами для идентификации человека, тестирования отцовства и материнства, генетического картирования, иммиграции и споров из-за наследования, тестирования зиготности в близнецах, тестов на инбридинг (инцухт) в людях, контроля качества культивируемых клеток человека, идентификации остатков человека и тестирования проб спермы, пятен крови, микробов и другого материала в судебной медицине. Такие локусы являются также полезными маркерами в коммерческом животноводстве и в анализе родословной (педигри) и в коммерческом растениеводстве. Признаки экономической важности в посевах растений и животных могут быть идентифицированы анализом связывания с использованием полиморфных ДНК-маркеров. Эффективные и точные способы для определения идентичности таких локусов обеспечены здесь.
- 32 027558
10. Детектирование аллельной вариации.
Способы, обеспеченные здесь, делают возможными высокую производительность, быстрое и точное детектирование аллельных вариантов. Исследования аллельной вариации включают в себя не только детектирование специфической последовательности в комплексном фоне, но также дискриминацию между последовательностями с небольшим числом нуклеотидных различий или с единственным нуклеотидным различием. Один способ для детектирования аллель-специфических вариантов при помощи ПЦР основан на том факте, что Тац-полимеразе трудно синтезировать ДНК-цепь, когда имеется ошибочное спаривание между матричной цепью и 3'-концом этого праймера. Аллель-специфический вариант может быть детектирован с использованием праймера, который точно совмещается только с одним из возможных аллелей; это ошибочное спаривание с другим аллелем действует для предотвращения удлинения этого праймера, предотвращая посредством этого амплификацию этой последовательности. Приведенные здесь способы применимы также для ассоциированных исследований, вариаций копийности, детектирования маркера заболевания и 8МР-наборов для типирования и т.п.
11. Определение частоты аллелей.
Способы, описанные здесь, являются ценными для идентификации одного или нескольких генетических маркеров, изменения частоты которых в популяции изменяются как функция возраста, этнической группы, пола или некоторых других критериев. Например, в данной области известно зависимое от возраста распределение генотипов АроЕ (см., например, 8сНесН1ег е1 а1. (1994), №1иге СепеЕск, 6:29-32). Частоты вариаций последовательностей, о которых известно, что они являются ассоциированными на одном и том же уровне с заболеванием, могут быть также использованы для детектирования или мониторинга прогрессирования состояния заболевания. Например, полиморфизм Ν2 918 (Ν2 918) гена липопротеинлипазы, который приводит к замене серином аспарагина в аминокислотном кодоне 291, приводит к уменьшенным уровням липопротеин-холестерина высокой плотности (НОЬ-С), который ассоциирован с увеличенным риском мужчин в отношении артериосклероза и, в частности, инфаркта миокарда (см. Кеутет е1 а1. (1995), №-11иге СепеЕск, 10:28-34). Кроме того, определение изменений в частоте аллелей может позволить идентифицировать ранее неизвестные вариации последовательностей и в конечном счете ген или путь, участвующий в возникновении и прогрессировании заболевания.
12. Эпигенетика.
Способы, обеспеченные здесь, могут быть использованы для исследования вариаций в нуклеиновой кислоте-мишени или белке относительно ссылочной нуклеиновой кислоты или белка, которые не основаны на последовательности, например, идентичности оснований или аминокислот, которые являются природно-встречающимися мономерными единицами нуклеиновой кислоты или белка. Например, способы, обеспеченные здесь, могут быть использованы для распознавания различий в последовательностьнезависимых признаках, таких как картины метилирования, присутствие модифицированных оснований или аминокислот или различий в структуре более высокого порядка между молекулой-мишенью и ссылочной молекулой для генерирования фрагментов, которые отщепляются в независимых от последовательности сайтах. Эпигенетика является исследованием наследования информации на основе различий в экспрессии гена, а не различий в последовательности генов. Эпигенетическими изменениями называют митотически и/или мейотически наследуемые изменения в функции генов или изменения в структуре нуклеиновых кислот более высокого порядка, которые не могут быть объяснены изменениями в последовательности нуклеиновых кислот. Примеры признаков, которые являются предметом эпигенетической вариации или изменения, включают в себя, но не ограничиваются ими, картины метилирования ДНК в животных, модификацию гистонов и белковые комплексы группы Ро1усотЪ-КЕЕогах (Рс-С/ίχ) (см., например, Βίτά, А., Сепек Иеу., 16:6-21 (2002)).
Эпигенетические изменения обычно, хотя и необязательно, приводят к изменениям в экспрессии генов, которые являются обычно, хотя и необязательно, наследуемыми. Например, как обсуждается дополнительно далее, изменения в картинах метилирования являются ранним событием в случае развития и прогрессирования рака и другого заболевания. Во многих типах рака некоторые гены неподходящим образом выключаются или включаются вследствие аберрантного метилирования. Способность картин метилирования подавлять или активировать транскрипцию может быть наследуемой. Белковые комплексы Рс-С/ίτχ, подобно метилированию, могут подавлять транскрипцию наследуемым образом. Ансамбль мультибелка Рс-С/ΐτχ нацелен на специфические районы генома, где он эффективно замораживает статус экспрессии эмбрионального гена, независимо от того, является ли этот ген активным или неактивным, и размножает это состояние стабильно на протяжении развития. Способность белков группы Рс-С/ΐτχ нацеливаться и связываться с геномом, поражает только уровень экспрессии генов, содержащихся в геноме, а не свойства этих генных продуктов. Способы, обеспеченные здесь, могут быть использованы со специфическими реагентами расщепления или специфическими реакциями удлинения, которые идентифицируют вариации в последовательности-мишени относительно ссылочной последовательности, которые основаны на независимых от последовательности изменениях, таких как эпигенетические изменения.
- 33 027558
13. Картины метилирования.
Способы, обеспеченные здесь, могут быть использованы для детектирования вариаций последовательности, которые являются эпигенетическими изменениями последовательности-мишени, такими как изменение картин метилирования в последовательности-мишени. Анализ клеточного метилирования является возникающей дисциплиной исследования. Ковалентное добавление метильных групп к цитозину первично презентируется при СрС динуклеотидах (микромателлитах). Хотя функция СрС-островков, не локализованная в районах промотора, остается не исследованной, СрС-островки в районах промотора представляют интерес, так как их статус метилирования регулирует транскрипцию и экспрессию ассоциированного гена. Метилирование районов промотора приводит к сайленсингу экспрессии гена. Этот сайленсинг является перманентным и продолжается на протяжении процесса митоза. Вследствие его существенной роли в экспрессии генов, метилирование ДНК оказывает действие на процессы развития, импринтинг и инактивацию Х-хромосомы, а также генез (возникновение) опухоли, старение, а также супрессию паразитических ДНК. Считается, что метилирование включено в канцерогенезе многих широко распространенных опухолей, таких как рак легкого, молочной железы и ободочной кишки, и в лейкозе. Имеется также соотношение между метилированием и белковыми дисфункциями (синдромом удлинения рт (ЭКГ)) или метаболическими заболеваниями (транзиторным неонатальным диабетом, диабетом типа 2).
Бисульфитное лечение геномной ДНК может быть использовано для анализа положений остатков метилированного цитозина в этой ДНК. Обработка нуклеиновых кислот бисульфитом деаминирует остатки цитозина в остатки урацила, тогда как метилированный цитозин остается немодифицированным. Таким образом, посредством сравнения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, которая не обработана бисульфитом, с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая обработана бисульфитом, в обеспеченных здесь способах, могут быть расшифрованы степень метилирования в нуклеиновой кислоте, а также положения, в которых цитозин является метилированным.
Анализ метилирования посредством реакции рестрикционной эндонуклеазы был сделан возможным с использованием рестрикционных ферментов, которые имеют специфические для метилирования сайты узнавания, такие как Нра11 и ΜδΡΙ. Основным принципом является то, что некоторые ферменты блокируются метилированным цитозином в этой последовательности узнавания.
После этой дифференцировки, последующий анализ полученных фрагментов может выполняться с использованием обеспеченных здесь способов.
Эти способы могут быть использованы вместе с комбинированным бисульфитным рестрикционным анализом (СОВКА). Обработка бисульфитом вызывает потерю сайта рестрикции Βδΐυΐ в амплифицированном продукте ПЦР, что вызывает появление нового детектируемого фрагмента в анализе в сравнении с необработанной пробой. Обеспеченные здесь способы могут быть использованы вместе со специфическим расщеплением сайтов метилирования для обеспечения быстрой, надежной информации на картинах метилирования в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
14. Повторное секвенирование.
Разительно увеличивающееся количество доступной информации геномной последовательности из различных организмов увеличивает необходимость технологий, делающих возможным крупномасштабный сравнительный анализ для коррелирования информации последовательности с функцией, фенотипом или идентичностью. Применение таких технологий для сравнительного анализа последовательностей может быть широко распространенным, включающим в себя обнаружение δΝΡ и зависимую от последовательности идентификацию патогенов. Таким образом, технологии повторного секвенирования и крупномасштабного скрининга мутаций являются критическими для идентификации лежащих в основе заболевания мутаций, а также генетической вариабельности, лежащей в основе дифференциальной реакции лекарственных средств.
Было разработано несколько подходов для удовлетворения этих потребностей. Существующая технология для высокопроизводительного секвенирования ДНК включает в себя ДНК-секвенаторы, использующие электрофорез и детектирование индуцируемой лазером флуоресценции. Способы секвенирования на основе электрофореза имеют присущие им недостатки в отношении детектирования гетерозигот и ухудшаются ОС-компрессиями. Таким образом, платформа секвенирования ДНК, которая производит цифровые данные без использования электрофореза, может преодолеть эти проблемы. Выполняемая на основе матрикса лазерная десорбционная/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (МАЬИ1-ТОР Μδ) измеряет фрагменты нуклеиновых кислот с получением цифровых данных. Обеспеченные здесь способы делают возможными высокую производительность, высокую скорость и высокую точность в детектировании идентичности последовательностей относительно ссылочной последовательности. Этот подход делает возможным рутинное использование секвенирования МАЬИ1-ТОР Μδ для точного детектирования мутаций, например, скринингом на обнаруживаемые мутации в ВКСА1 и ВКСА2, которые связаны с развитием рака молочной железы.
- 34 027558
15. Мониторинг появлений эндемий.
Во времена глобальной транспортировки и путешествий вспышки патогенных эндемий требуют тщательного мониторинга для предотвращения их распространения по всему свету и создания возможности их контроля. Типирование на основе ДНК с использованием высокопроизводительных технологий делает возможной быструю пропускную способность проб в сравнительно короткое время, требуемое в ситуации вспышки (например, мониторинг в условиях больницы, ранние системы предупреждения). Мониторинг зависит от используемого района микробного маркера, но может облегчать мониторинг на специфическом для гена, вида, штамма или подтипа уровне. Такие подходы могут быть применимы в биозащите, в клиническом и фармацевтическом мониторинге и применениях метагеномики (например, анализе хорошей флоры). Такой мониторинг прогрессирования или неблагоприятного исхода описан в патентах США № 7255992, 7217510, 7226739 и 7108974, которые включены здесь посредством ссылки.
16. Контроль качества вакцины и контроль качества продукционного клона.
Обеспеченные здесь способы могут быть использованы для контроля идентичности рекомбинантных продукционных клонов (не ограничиваемых вакцинами), которые могут быть вакцинами или, например, инсулином или любым другим продукционным клоном или биологическим или медицинским продуктом.
17. Микробный мониторинг в фармакологии для продукционного контроля и качества.
Обеспеченные здесь способы могут быть использованы для контроля качества фармакологических продуктов, например, детектированием присутствия или отсутствия нуклеиновой кислоты-мишени микроорганизма в таких продуктах.
Наборы.
В некоторых вариантах осуществления обеспечены наборы для проведения описанных здесь способов. Наборы часто содержат один или несколько контейнеров, которые содержат описанные здесь компоненты. Набор содержит один или несколько компонентов в любом количестве отдельных контейнеров, пакетов, пробирок, флаконов, мультилуночных планшетов и т.п. или компоненты могут быть объединены в различных комбинациях в таких контейнерах. Например, один или несколько из следующих компонентов могут быть включены в набор: (ί) один или несколько нуклеотидов (например, терминирующих нуклеотидов и/или нетерминирующих нуклеотидов); (ίί) один или несколько нуклеотидов, содержащих захватывающий агент; (ίίί) один или несколько олигонуклеотидов (например, олигонуклеотидных праймеров, один или несколько олигонуклеотидов удлинения, олигонуклеотидов, содержащих тэг, олигонуклеотидов, содержащих захватывающий агент); (ίν) свободный захватывающий агент (например, свободный биотин); (ν) твердая фаза (например, бусина), содержащая член пары связывания (νΐ); (νίί) один или несколько ферментов (например, полимераза, эндонуклеаза, рестрикционный фермент и т.д.); (νίίί) компоненты-контроли (например, контрольная геномная ДНК, праймеры, синтетические матрицы, нуклеиновые кислоты-мишени и т.д.); (ίχ) один или несколько буферов и (х) напечатанный материал (например, инструкции, метки и т.д.).
Набор иногда используется вместе с процессом и может включать инструкции для выполнения одного или нескольких процессов и/или описание одной или нескольких композиций. Набор может быть использован для проведения процесса (например, использования твердой фазы), описанного здесь. Инструкции и/или описания могут быть в материальной форме (например, бумаги и т.п.) или электронной форме (например, считываемом компьютером файле на материальной среде (например, компактном диске) и т.п.) и могут быть включены во вкладыш набора. Набор может также включать письменное описание сайта (местоположения в Интернете), которое обеспечивает такие инструкции или описания.
Примеры
Примеры, представленные ниже, иллюстрируют и не ограничивают эту технологию.
Пример 1. Пре-ПСР-реакция.
Представленный процесс обеспечивает альтернативную биохимию регулярной ПЦР, которая обычно имеет два геноспецифических праймера, амплифицирующих одну и ту же мишень. Этот процесс является подходящим для амплификации районов-мишеней, например, содержащих δΝΡ.
Подход 1:
Этот способ использует только один праймер для удлинения, см. фиг. 1. Г еноспецифический удлиняющий праймер имеет 5'-универсальный РСКТад1К. Он удлиняется на этой геномной ДНК. Эта ДНК или РСКТад1К геноспецифический удлиняющий праймер может быть биотинилирован, для облегчения очистки из этой реакции. Затем эту удлиненную цепь лигируют с универсальным фосфорилированным олигонуклеотидом, который имеет последовательность, которая является обратным комплементом Тад2Р (универсального ПЦР-праймера). Для облегчения очистки в следующей стадии, этот фосфорилированный олигонуклеотид имеет устойчивые к экзонуклеазе нуклеотиды на его 3'-конце.
Во время обработки экзонуклеазой все нелигированные удлиняющие цепи расщепляются, тогда как лигированные продукты являются защищенными и остаются в этой реакции. Затем выполняют универсальную ПЦР с использованием праймеров Тад1К и Тад2Р для амплификации множественных мишеней. Обзор концепта-1 очерчен на фиг. 1.
- 35 027558
Подход 2:
В этом способе удлинение праймером и лигирование имеют место в одной и той же реакции. Фиг. 2 показывает использование биотинилированного геноспецифического праймера РСКТад3К в качестве удлиняющего праймера. Этот фосфорилированный олигонуклеотид имеет геноспецифическую последовательность и связывается на расстоянии 40 оснований от сайта праймерного удлинения с той же самой цепью ДНК. Таким образом, ДНК-полимераза Штоффеля удлиняет эту цепь, пока она не достигает фосфорилированного олигонуклеотида. Атр-лигаза (Ерюепйе) лигирует эту геноспецифическую последовательность фосфорилированного олигонуклеотида с этой удлиненной цепью. Этот 3'-конец фосфоолигонуклеотида имеет РСКТад4(КС)Р в виде его универсального тэга. Затем эти биотинилированные удлиненные цепи связывают со стрептавидиновыми бусинами. Это облегчает очистку из этой реакции. Г еномную ДНК и геноспецифические фосфорилированные олигонуклеотиды будут вымывать. Затем выполняют универсальную ПЦР с использованием Тад3К и Тад4Р в качестве праймеров для амплификации различных представляющих интерес генов. Обзор концепта-2 показан на фиг. 2.
Универсальные ПЦР-продукты как из Подхода 1, так и из Подхода 2 могут быть идентифицированы с использованием пост-ПЦР-реакции, как показано на фиг. 3. §АР использовали для очистки из этой ПЦР-реакции. Пост-ПЦР-реакции выполняли с использованием геноспецифических олигонуклеотидов, связывающихся непосредственно перед 8ΝΡ, и эти однонуклеотидные удлиненные продукты наносили в виде пятен на эррей чипа и анализировали масс-спектрометрией. Альтернативно, обеспеченные здесь способы могут быть использованы для считывания пост-ПЦР.
Пример 2. Материалы пре-ПЦР-реакции из примера 1.
Подход 1:
la) Удлинение: Реакцию 90 мкл выполняли с плазмидным инсертом 18 нг, IX Ц1адеп РСК-буфером с Мд, 2,82 мМ общего МдС12, 10 мМ Тпк, рН 9,5, 50 мкМ бЭТР, 0,5 мкМ геноспецифического удлиняющего праймера 5'-РСК!ад1К, 5,76 Е термосеквеназы. Используемыми условиями для проведения термоциклов были 2 мин при 94°С с последующими 45 циклами 10-секундной денатурации при 94°С; 10 с отжига при 56°С; 20 с удлинения при 72°С.
lb) Лигирование: 5 мкл удлиненного продукта лигировали с 500 пмоль фосфоолигонуклеотида (обратного комплемента праймера Тад2Р), который является устойчивым к экзонуклеазе, на его 3'-конце. Эти продукт удлинения и фосфоолигонуклеотид денатурировали при 65°С/10 мин, охлаждали перед доведением объема до 50 мкл 50 мМ Трис-НС1, рН 7,8, 10 мМ МдС12, 10 мМ ЭТТ, 1 мМ АТФ и 50 Е РНК-лигазы Т4. Инкубирование проводили при 37°С/4 ч, 65°С/20 мин.
lc) Обработка экзонуклеазой: 10 мкл этого лигированного продукта денатурировали при 95°С/5 мин, охлаждали и разводили 0,5Х буфером экзонуклеазы III, содержащим 20 Е экзонуклеазы I и 100 Е экзонуклеазы III в объеме 20 мкл. Эту реакцию инкубировали при 37°С/4 ч, 80°С/20 мин.
1б) Универсальная ПЦР: 2 мкл обработанного экзонуклеазой продукта амплифицировали с 0,4 мкМ каждого из прямого и обратного праймеров М13 в реакции 25 мкл, содержащей IX Ц1адеп буфер, содержащий 1,5 мМ МдС12, 200 мкМ бЭТР и 0,625 Е Но! к1аг ДНК-полимеразы. Используемыми термоциклическими условиями были 15 мин при 94°С, с последующими 45 циклами 30-секундной денатурации при 94°С; 30 с отжига при 55°С и одноминутным удлинением при 72°С.
Используемыми праймерами и последовательностями тэгов ПЦР были:
универсальная Тад1К (гк10063237) = 5' ООАААСАОСТАТОАССАТО - (ОТААТТОТАСТОТОАОТООС) геноспецифическая последовательность 3', универсальная Тад2 (КС)Р = 5Р-САТОТСОТТТТАСААСОТСО*Т*О*ббС 3' ( обозначает устойчивые к экзонуклеазе связи между нуклеотидами),
Тад1К (М13К) = 5' ООАААСАОСТАТОАССАТО 3',
Тад2Р (М13Р) = 5' САСОАСОТТОТААААСОАС 3', гк10063237_Е1 (для пост-ПЦР-реакции): 5'
ТСАААОААТТАТАТООСТААОО 3'.
Результаты из Подхода 1 можно видеть на фиг. 4.
Подход 2:
2а) Удлинение и лигирование: Реакцию 20 мкл проводили с 16-35 нг геномной ДНК, IX буфера Атр-лигазы (Ерюейте), 200 мкМ бОТР, 10 нМ биотинилированным удлиняющим праймером, 50 нМ геноспецифическим фосфоолигонуклеотидом, 1 Е фрагментом Штоффеля ДНК-полимеразы и 4 Е Атрлигазы (Ерюейте). Использованные термоциклические условия были: 5 мин при 94°С с последующими 19 циклами 30-секундной денатурации при 94°С; 150-секундного отжига при 58,5°С, с уменьшением температуры на 0,2°С в каждом цикле; 45-секундное удлинение при 72°С. Реакцию удлинения и лигирования обрабатывали 40 мкг протеиназы К при 60°С в течение 20 мин.
2Ь) Очистка бусин: 15 мкл стрептавидиновых бусин Иупа М-280 промывали три раза IX связывающим буфером (5 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 1 М №С1, 0,5 мМ ЭДТА). Во время всех промывок эти бусины связывались с магнитом и затем супернатант выбрасывали. Две реакции удлинения объединяли и разводили с получением концентрации связывающего буфера и затем смешивали с этими бусинами. Эти бусины инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин с осторожным перемешиванием.
- 36 027558
Затем эти бусины промывали 3 раза ΙΧ промывочным буфером (10 мМ Трис, рН 8 и 1 мМ ЭДТА) и 2 раза водой. Затем эти бусины обрабатывали 0,1н. ΝαΟΗ при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем эти бусины промывали 2 раза ΙΧ водным буфером и 2 раза водой. Эти бусины в конечном счете суспендировали в 15 мкл воды.
2с) Универсальная ПЦР: 2 мкл бусин добавляли к 25 мкл ПЦР-реакции, содержащей ΙΧ ΡСΚ Оо1б буфер (Αρρίΐβό Бюзуз1;етз), 250 мкМ 6ΝΤΡ, 2,5 мМ Μ«ί'12 и 0,4 мкМ каждого из праймеров Τα§4Ρ и Га§3К, 1,25 Е ДНК-полимеразы Αтρ1^Τа^ Оо1б и 0,05% Твин 20.
Используемые термоциклические условия были 12 мин при 94°С с последующими 60 циклами 30-секундной денатурации при 94°С; 30-секундного отжига при 68°С, 45-секундного удлинения при 72°С, с конечным удлинением при 72°С в течение 2 мин.
Используемыми праймерами и последовательностями тэгов были:
универсальная Га§3К = 5' ΘΑΘСΤΘСΤΘСΑССΑΤΑΤΤССΤΘΑΑС-геноспецифическая последовательность 3', универсальная Га§4 (Κ£)Ρ = 5'Р-геноспецифическая последовательность - ΘСΤСΤΘΑΑΘΘСΘΘΤΘΤΑΤΘΑСΑΤΘΘ 3', '1ац3К = 5' ΘΑΘСΤΘСΤΘСΑССΑΤΑΤΤССΤΘΑΑС 3',
Га^ = 5' ССΑΤΘΤСΑΤΑСΑССΘССΤΤСΑΘΑΘС 3',
Геноспецифические удлиняющие праймеры, фосфоолигонуклеотиды и удлиняющие пост-ПЦРреакцию праймеры Подхода 2 перечислены в табл. 1, 2 и 3 соответственно. Для табл. 1 район тэга ПЦР подчеркнут. В Подходе 25'-биотинилированный и специфический для ПЦР-меченого гена праймер удлиняется на геномной ДНК-полимеразой Штоффеля и одновременно лигируется с правым геноспецифическим ПЦР-меченым фосфоолигонуклеотидом, связанным на той же самой цепи, Αтρ-лигазой (Ер1сеп!ге). Результаты из Подхода 2 показаны на фиг. 5А.
Таблица 1
Удлиняющие праймеры, используемые для удлинения геномной ДНК в реакции удлинения-лигирования (не гибридизирующиеся районы подчеркнуты)
Название праймера Последовательность 5'-биотин-праймера
5'ΒίοίίηυΓ гз1000586 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСТСТСАААСТССАСАСТСССС
5’ΒίοίίηυΓ гз10012004 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСАССАСТССТТСАСАСАСТТТАС
5'ΒίοίίηυΒ гз10014076 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТССТСАТТТСТССТССАСАС
5’ΒίοίίηυΒ ГЗЮ027673 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССССТСТТССАТААААТСТТССАС
5’ΒίοίίηυΒ Г310028716 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССАТСААСАСАААТАСТТСТСАССТТТСС
5'ΒίοίίηΝθΜυΒ
ГЗЮ063237 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТСАТАСТААТТСТАСТСТСАСТССС
5'ΒίοίίηυΕ Г31007716 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТАААААСТТАТААТТТТААТАСАСССТССАТТСААС
5’ΒίοίίηυΒ ГЗЮ131894 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСАССТААССАСАСАТССССАС
5’ΒίοίίηυΒ ГЗЮ14337 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССАТТТСТАТССТСАААААССТТАТССС
5'ΒίοίίηυΒ ГЗЮ15731 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССАТСААТСАТСТТАСТСТТТАСТАТССТТСС
5’ΒίοίίηυΒ Г310164484 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСССТССССТТТАСАСАССААТС
5'ΒίοίίηυΒ Г310251765 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССАТСТСССТТСАТСТСССТТС
- 37 027558
5'ΒίοίίηυΓ гз10265857 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСССТТСАТССТСТТСТТССТСС
5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСССТАТТТТТАТААТАТТТАТТАТТТТ
5’ΒίοίίηυΓ гз103242б ΑΑΑΤΑΑΤ Τ СΑΑΑΑΤАСААААС Τ ААС АС
5'ΒίοίίηυΒ гз1049555б 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТАСАСАТТСССААТАСАТАССАСТС
5’ΒίοίίηυΒ гз1049922б 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСААСТТСТАСССАСАТССАСТС
5'ΒίοίίηυΒ гз10505007 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТТСТААСССТТСАСССАТСАС
5'ΒίοίίηυΒ ГЗЮ63087 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТАСТТСААААСААСССССС
5'ΒίοίίηυΒ гз1073234б 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССАТСТСТСТАССАССАТСАССС
5'ΒίοίίηΝθΜυΒ
ГЗЮ742993 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСАССАСТСАСТАСАТТСАСССАТС
5’ΒίοίίηυΒ ГЗЮ882763 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТСТСТСАССТСАААСТСАСТС
5'ΒίοίίηΝθΜυΒ
Г310911946 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТТСАССАТТАТАСТСССАСТТСС
5’ΒίοίηυΒ ГЗИ033260 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСССТТТСААТССТАТСАСССТСАС
5'ΒίοίίηυΒ Г311240574 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСАААСССАСТСАТСАСТСТСС
5'ΒίοίίηυΒ гз11599388 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССССАСССССААТСТТАААТСС
5'ΒίοίίηυΓ Г311634405 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСССААСАССАТТССАСТААССС
5’ΒίοίίηυΒ Г31222958 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССАТСТАТАТАСТТТСССТАССАСТСАААС
5'ΒίοίίηυΒ гз1233475б 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССААТССТАСТССТААССТСАТСТТС
5’ΒίοίίηυΒ гз1266886 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТТСАТСАССААССААСТАСАТТС
5'ΒίοίίηΝθΜυΒ
гз128255бб 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССССТССААААСТССТСАТСТС
5’ΒίοίίηυΒ13023380 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСТТТТТССАТСССТТТТСССС
5’ΒίοίίηυΒ гз1393257 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСТСТАСАСССАССТСТТАСАСАТС
5’ΒίοίίηυΒ Г31400130 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССТАСССААТТССТТСАСТССАС
5'ΒίοίίηΝθΜυΒ Г31490492 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААСАССССТТСТТТСАССТТСАС
5'ΒίοίίηυΒ гз1567603 5’Βίοίίη-САССТССТССАССАТАТТССТСААССААААСТТТТСТТТАССТСССТТСС
Таблица 2
Г еноспецифические фосфоолигонуклеотиды, используемые для лигирования удлиненной цепи в реакции удлинения-лигирования (не гибридизирующие районы подчеркнуты)
Название праймера Последовательность 5'-праймера
5’Ρ Г31000586 ССССАСТСТАССТТСТССТАСССАСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ Г310012004 САТ САСС ТАТАТ САТ ТАТ Т ТАС ТАААТТАТ ТТТТТСТТ САААС Т САС Т ТАССС Т С Т САА 66С66Т6ТАТ6АСАТ66
5’Ρ Г310014076 СССТТТТТТССТААААССССССАААСТТТТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ ГЗЮ027673 СТТТТСТСАССТСССТТТТССТСАТСТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ Г310028716 ССТАТТТСАСТТТТССТТТТТТСТТТТССТСТССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ гз100б32371опд САТТТАСАСАСАСТСТТАСТСТСТСАССАССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ Г31007716 СТАТАСТСТТССТССТССАСТТААТСТСАСАССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ ГЗЮ131894 СТСАСААСТСТССААСАССТССССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ ГЗЮ14337 СТТСССАСТТСАССТАСАСТТАСТТТСААСАТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ ГЗЮ15731 ССАТСТАСАТТАССТТАССАССССТССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ Г310164484 СТСТСТААТСТТССАСАСАААССССАССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Ρ Г310251765 ССТТТТСТТАТСТСТСТССССТСАТССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
- 38 027558
5’Р гз102б5857 ССАССССТССАТСАААСАСААСАСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз103242б СТТСАСАСТТСАТТТТСТААТСССТССАСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз1049555б ССАТСТСАТССТСТСТСАААТААТСАСССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз1049922б СТСААСССААТСССТССТТТТТААТТТСТАСТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз10505007 СААССТСССАТТАССССТААСТТТАССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р ГЗЮ63087 САСТТСАТСССТСССАСАААССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз1073234б СТССАТТТСТАСТССТААСАТСССССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5'ΡΝθμ гз10742993 СТАТТСАССТСТСАСТТТТАТТАТСАТТАТСТААССТСАСТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р ГЗЮ882763 САССТССАСТТСТТСАСТТТСАТССТТТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5'Р гз1091194б1опд ССТСТСТСТТТТСТТСАСАААТССАСТСТТССТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз110332б0 ССААААТСССТАТССТТТАСССАСАААСАТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз11240574 ССТСАТССАСССАСТСССТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз11599388 СТСАССТСАСАСТССТСССАТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз11б34405 ССТТТСТСТССАААТСАССТАТТТТССТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз1222958 ССТСАСАСААТАТСАААССААААСАССААССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз1233475б ССССТАТСТАСАСАСТТСАААССТСТТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз!2бб88б СТТТССТСТАССТСААТССССТСТТААСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5'ΡΝθμ гз12825566 ССААСАСАСТСАТСТСАТСССАТСТССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз13023380 СТАСССААСССТСТТСТТТТТТСТСТТСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз1393257 ССАТАТССАСТТТТТСТТТТСССАСТССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р гз1400130 САССАТААТАСТТТАТСТССТТСТАСТААААТТАТТАТТСССССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’ΡΝθμ гз1490492 ССТСАСААТСАААТСАТССТТТТСТССТААТТТСТАСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
5’Р Г315676ОЗ ССТТСАСАСАТАССТТСССААААТСТСАСССТСТСААСССССТСТАТСАСАТСС
Таблица 3
Стандартные пост-ПЦР-праймеры, используемые в пост-ПЦР-анализе для универсального считывания ПЦР
ТЕКИ 3ΝΡ Ю иер гак ИЕР МАЗЗ ИЕР 3Εζ) 5'—3' ЕХТ1 САЬЬ ЕХТ1 МАЗЗ ЕХТ2 САЬЬ ЕХТ2 МАЗЗ
Ы до13РЬЕХ гз10882763 Е 4374,9 ССТТСТТСАТССССС С 4662,1 Т 4701,9
Ь2 до13РЬЕХ гз1233475б к 4515 ССССАТААСССААСА С 4762,2 А 4842,1
ЬЗ до13РЬЕХ гз1014337 Е 4627 СТСССААСССАСАСС С 4914,2 Т 4954,1
Ь4 до13РЬЕХ гз10б3087 К 4875,2 ССТАААСССССТССАА С 5162,4 А 5202,3
Ь5 до13РЬЕХ гз100058б К 5027,3 СТССССАССТ6АСССТ6 С 5274,5 А 5354,4
Ьб до13РЬЕХ гз1400130 К 5118,3 ТТАТССТСТСТТТСССС Т 5389,5 С 5405,5
Ь7 до13РЬЕХ гз11б34405 К 5237,4 САААССАССТССАССАА С 5484,6 А 5564,5
Ь8 до13РЬЕХ гз128255бб к 5311,5 АСТТССТСССТТСТТАСТ С 5598,7 А 5638,6
Ь9 до13РЬЕХ Г310251765 Е 5448,5 сссттттсссттсстссс С 5735,7 Т 5775,6
Ь10 до13РЬЕХ ГЗИ033260 Е 5704,7 СССАТТТТСССССАТТТАТ А 5975,9 С 5991,9
Ь11 до13РЬЕХ гз1049555б Е 5827,8 ССАТ САСАТ С СТ СТ Т АСАС С 6075 Т 6154,9
- 39 027558
Ь12 доЮРЬЕХ гзЮ027б73 К 5867,8 ддЛАСАСССТТАТСАТССТ С 6115 А 6194,9
М1 доЮРЬЕХ гзЮ131894 Е 6037,9 сссЕТССАТССАТССССАСА С 6285,1 С 6325,1
М2 доЮРЬЕХ гз1393257 Е 6239,1 а дССААТАСАСССАСТАТ СА С 6486,3 Т 6566,2
М3 доЮРЬЕХ гзЮ1б4484 Е 6246,1 ааасЕТСТСССТСАСССТАСС А 6517,3 С 6533,3
М4 доЮРЬЕХ гзЮ49922б К 6373,2 САСАААТАСАТТТСССАСТАТ С 6620,4 С 6660,4
М5 доЮРЬЕХ гзЮ0771б К 6446,2 дсССТСТАТССТСАСАСАСТА С 6693,4 А 6773,3
Мб доЮРЬЕХ гзЮ73234б К 6731,4 СССАСААТССАТТТСТТТТТСС Т 7002,6 С 7018,6
М7 доЮРЬЕХ гзЮ01407б К 6831,5 ССАТАСТТСААСААТАСТАСАС С 7078,7 А 7158,6
М8 доЮРЬЕХ гз1266886 К 6840,4 сссасТСТАТТСССАССТСАССС Т 7111,7 С 7127,7
М9 доЮРЬЕХ гз11240574 Е 6954,5 ЕЕЕаТТТТТССАТСАСАССТАТС С 7201,7 Т 7281,6
МЮ доЮРЬЕХ гз11599388 К 7233,7 ЕЕЕсТЛААТССССАССССССССАС С 7480,9 А 7560,8
МП доЮРЬЕХ гз1222958 Е 7240,7 дСТСТСАССАТТААСТАТАСАССА А 7511,9 С 7527,9
М12 доЮРЬЕХ гзЮ742993 К 7327,8 д 5 5 дАСАСТ Т СТ С СААСТ С САСАТ Т 7599 С 7615
Н1 доЮРЬЕХ гзЮ505007 Е 7398,8 ддаЕЕАСАСАТСССТТСТТеееТА А 7670 С 7686
Н2 доЮРЬЕХ гзЮ063237 К 7722,1 СААТСАААСААТТАТАТСССТААСС С 7969,2 А 8049,2
НЗ доЮРЬЕХ гзЮ012004 Е 7902,1 сссютААСАСстАТАтеееттттте С 8149,3 Т 8229,2
Н4 доЮРЬЕХ гз13023380 Е 7909,2 дсадсАСАСССТТСССТАСААТСАСА А 8180,4 С 8196,4
Н5 доЮРЬЕХ гз1490492 Е 8098,3 дддСАТТСТСАССААААТААТСТАТС С 8345,5 Т 8425,4
Нб доЮРЬЕХ гзЮ2б5857 К 8106,3 ддасСАСАССТСТСАСАСТТТСТСАТ Т 8377,5 С 8393,5
Н7 доЮРЬЕХ гз1567603 Е 8265,4 а сАТААСТ СТ САСАТААТТАААСТТ СТ С 8512,6 Т 8592,5
Н8 доЮРЬЕХ гзЮ15731 К 8310,5 а 5 д 5 ТААСАСАААС САСААТАААААСА С 8557,7 А 8637,6
Н9 доЮРЬЕХ гзЮ91194б Е 8470,5 д д д а д САСАС СААС САТААСАТАТ ТАС С 8717,7 Т 8797,6
НЮ доЮРЬЕХ гзЮ02871б К 8477,5 ссЕддТТТТСТСТТСССТАТТТАСТСАТ т 8748,7 С 8764,7
Н11 доЮРЬЕХ гзЮ3242б Е 8672,7 ддасААААСТТСТСААТТАТТТССТТТС А 8943,9 С 8959,9
Пример 3. Пост-ПЦР-реакция после примеров 1 и 2.
8ЛР/Пост-ПЦР-реакция: 5 мкл универсальной ПЦР (Ишу РСК) распределяли в 384-луночном планшете и добавляли 2 мкл реакции 8ЛР, содержащей 0,6 Е 8ЛР (щелочной фосфатазы креветок), с инкубированием при 37°С в течение 40 мин и, наконец, инактивировали этот фермент при 85°С в течение 5 мин. Удлиняющие реагенты добавляли в количествах 2 мкл, содержащих 0,9 мМ ациклических терминаторов и 1353 Е пост-ПЦР-фермента. Смесь удлиняющих олигонуклеотидов, отличающихся по концентрации в соответствии с их массой: 0,5 мкМ низкой массы: 4000-5870 Да, 1,0 мкМ средней массы: 60007360 Да и 1,5 мкМ высокой массы: 7400-8700 Да, добавляли в конечный объем 9 мкл. Условия проведения циклов, используемые для пост-ПЦР-реакции, были 94°С/30 с и 40 циклов 11-температурного цикла (94°С/5 с и 5 внутренних циклов (52°С/5 с и 80°С/5 с) ) и конечное удлинение при 72°С/3 мин.
ΜΑΕΌΙ-ТОР М8: Реакцию удлинения разбавляли 16 мкл воды и добавляли 6 мг ίΊ,ΗΑΝ Кезт (8едиепош) для обессоливания этой реакции. Она чередовалась в течение 2 ч при комнатной температуре. 15 нл этой пост-ПЦР-реакции распределяли автоматизированно (с применением робота) на кремниевые чипы, предварительно загруженные матриксом (8рес!гоСН1Р®, 8едиепош). Масс-спектры получали с использованием Мазз ΑΚΚΑΥ Сошрас! Апа1у/ег (ΜΑΕΌΙ-ТОР масс-спектрометра, 8едиепош).
Пример 4. Пост-ПЦР-реакция для увеличения мультиплексирования и гибкости (универсальности применения) в 8№-генотипировании.
Представленный процесс обеспечивает концепт для альтернативного пост-ПЦР формата с удлинением доЫРБЕХ-праймером для увеличения мультиплексирования и гибкости 8ХР-генотипирования. Он использует аллель-специфические праймеры удлинения, с двумя праймерами удлинения на 8ΝΓ, сконструированные для гибридизации на сайте 8ΝΙ\ Каждый праймер содержит ген и аллель-специфический 3'-нуклеотид для специфической гибридизации с представляющим интерес 8ХР-сайтом и различно определенную 5-нуклеотидную последовательность, которая соответствует тэгу по массе. Специфичность этого анализа определяют спариванием 3'-конца этого праймера с этой матрицей, которая будет удлиняться ДНК-полимеразой только при соответствии со специфическим 8ΝΙ\ Беглый обзор этого процесса очерчен на фиг. 6.
Эти праймеры удлинения удлиняются включением сШТР и терминируются скШТР или альтернативно терминируются включением скШТР без удлинения сШТР. Один или несколько сШТР и/или ббХТР, используемые во время реакции удлинения, помечены частью молекулы, позволяющей иммобилизацию на твердой подложке, такой как биотин.
Этот продукт удлинения вспоследствии иммобилизуется на твердой подложке, такой как покрытые стрептавидином бусины, где будут связываться только удлиненные/терминированные продукты. Неудлиненные праймеры и нежелательные компоненты реакции не связываются и вымываются.
Эту 5-нуклеотидную последовательность или альтернативную группу, которая соответствует тэгу по массе, отщепляют от продукта удлинения, оставляя 3'-секцию этого продукта удлинения, связанной с этой твердой подложкой. Отщепление может достигаться различными способами, включающими ферментативные, химические и физические обработки. Эта возможность, очерченная в этом примере, использует эндонуклеазу V для расщепления дезоксиинозина в этом праймере. Эта реакция расщепляет вторые фосфодиэфирные связи 3'(справа) с дезоксиинозином, выделяя олигонуклеотидный тэг по массе.
- 40 027558
Затем эту 5'-нуклеотидную последовательность (тэг по массе) переносят в эррей чипа и анализируют масс-спектрометрией (например, МАЬО1-ТОР М8). Присутствие сигнала массы, соответствующего массе тэга, указывает на то, что аллель-специфический праймер был удлинен, и, следовательно, на присутствие этого специфического аллеля.
Пример 5. Расщепление эндонуклеазой V дезоксиинозина.
Перед реакцией удлинения 35-плексную ПЦР проводили в объеме реакции 5 мкл с использованием следующих реагентов: 5 нг ДНК, IX ПЦР-буфер, 500 мкМ каждого сШТР. 100 нМ каждого праймера ПЦР (как перечислено в табл. 4), 3 мМ МдС12 и 0,15 Е Тац (8ециепот). Термоциклирование проводили с использованием следующих условий: 7 мин при 95°С; с последующими 45 циклами 20 с при 95°С, 30 с при 56°С и 1 мин при 72°С и завершали 3 мин при 72°С.
Эту реакцию ПЦР обрабатывали 8АР (щелочной фосфатазой креветок) для дефосфорилирования невключенных сШТ'Р. 2 мкл смеси, содержащей 0,6 Е 8АР, добавляли к продукту ПЦР и затем подвергали 40 мин при 37°С и 5 мин при 85°С.
Реагенты реакции удлинения объединяли в объеме 3 мкл, который добавляли к обработанному 8АР продукту ПЦР. Эта общая реакция удлинения содержала следующие реагенты: 1Х доЫРЬЕХ-буфер, 17 мкМ каждого из биотип-скШТ'Р. 0,8 мкМ каждого праймера удлинения (перечисленных в табл. 5) и 1Х розБдоЫРБЕХ фермент.
Термоциклирование проводили с использованием программы из 200 циклов, состоящей из 2 мин при 94°С; с последующими 40 циклами 5 с при 94°С, с последующими 5 циклами 5 секунд при 52°С и 5 с при 72°С; и завершением 3 мин при 72°С. Последовательности удлинения праймера, содержащие тэги по массе, и полученные массы расщепленных продуктов, соответствующих специфическим аллелям, перечислены в табл. 5.
Магнитные стрептавидиновые бусины 8о1и1тк кондиционировали промыванием три раза 50 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 1 М №С1, 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,5. Затем эту реакцию удлинения объединяли с 300 мкг кондиционированных бусин. Бусины инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин с осторожным перемешиванием и затем осаждали с использованием магнитного штатива. Супернатант удаляли. Затем эти бусины промывали 3 раза 50 мМ Трис-НС1, 1 М №С1, 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,5 и 3 раза водой. Для каждой стадии промывки бусины осаждали и супернатант удаляли. Тэги по массе расщепляли из продукта удлинения добавлением раствора, содержащего 30 Е эндонуклеазы V и 0,4 х буфер 4^ЕБ), и инкубированием при 37°С в течение 1 ч. После инкубирования эти магнитные бусины осаждали с использованием магнитного штатива и супернатант, содержащий продукты тэга по массе, удаляли.
Обессоливание достигалось добавлением 6 мг С^ЕΑN Кезт (8ециепот). 15 нл реакций расщепления распределяли автоматизированно (с использованием робота) на кремниевые чипы, загруженные матриксом (8рес1гоСН1Р®, 8ециепот). Масс-спектры получали с использованием Мазз АККАУ Сотрас! Апа1у/ег (МАБЭБТОР масс-спектрометра, 8ециепот). Фиг. 7 показывает спектры МаЫБТоГ М8 для 35плексного генотипирования с использованием пост-ПЦР-считывания, представленного здесь.
Таблица 4
ПЦР-праймеры, используемые в этом исследовании
5ΝΡ Ю Прямой праймер Обратный праймер
гз11155591 АССТТССАТСАААСССТСАТССАССТСАТС АССТТССАТСТТСТСТТСАААССТСССАТС
гз12554258 АССТТССАТСТТСАСАСАССССАСАСССС АС6ТТ66АТ6ТТТТССТСТТССТАССССТС
гз121б2441 АССТТССАТСААССТАССССТТТАССАСАС АССТТССАТСТСС СААСАСАССАС Т СТАС Т
Г311658800 АССТТССАТСАТССАСААТССТССТАСТСС АССТТССАТСТССТТСССАССТСАСТАТТС
гз13194159 АССТТССАТСТСАСССАСССАТАТССТААС АССТТССАТСТССАТСАСТССАССАСТАСС
гз1007716 АССТТССАТСТААТАСАСССТССАТТСААС АССТТССАТССТС САС САС СААСАС ТАТАС
гз11б37827 АС 6 Т Т 6 САТ САААСАСАСАСАСАТ С С С Т С АС6ТТ6САТСАТСССАТАС66ССААСААСА
гз13188128 АССТТССАТССАСТААТАААСССАСССТСТ АССТТССАТСАТСАСТААСССТТССТССТС
гз1545444 АССТТССАТССССТСТСАТСССТТТТТТТАС АССТТССАТСТССТАСССТСААСААТССТС
гз1544928 АССТТССАТСССТТТТССТСТТСТТТССТАС АС С Т Т С САТ С 6ААТСТОТААААСАААССАС
Г311190684 АССТТССАТСТСТСАСТТССААСТСАТССС АС 6 Т Т 6 САТ 6 Т САС С С АТ С Т АСАСАС Т САС
гз1214728б АССТТССАТСАСААТСТСССАААСАССАС АССТТССАТСТСТССАТСССТТАССТТСАС
Г311256200 АССТТССАТСССТТАТТССАТТСТАТСТССС АССТТССАТСАССААССАСТСТАСТТТТС
гз1124181 АССТТССАТСАСТТССССАСТССССАТТТС АС 6Т Т 6САТ 6Т ТААТАТАСТ ССССАСССАС
гз1392592 АССТТССАТСТСТТСТСТСТТАССТСТСАС АССТТССАТССТСТССТСАСТСАСТАСАТС
гз1507157 АССТТССАТСТСАССАТТАААССАТСТССС АССТТССАТСАТСТТТСААСССТССТСТСС
гз1569907 АС6ТТССАТССАСССТССТСТАСАСАААА6 АССТТССАТСССАТСТСССТАТСАСАТСАС
гз1339007 АССТТССАТСТТССТСТААССТССАТССТС АС 6 Т Т 6 САТ 6 Т Т АС 6САС С С СААС Т Т Т САС
- 41 027558
гз1175500 АССТТССАТССТТТАСААССТСТСССАСАС АС С Т Т 6 САТ С Т С ТАС САТ С ТСАСССАТ САС
гз11797485 АССТТССАТССАААСТСАСССАТСААССАС АССТТССАТССТАСТТССТТСТССТТАССС
гз1475270 АССТТССАТССТАТССССААСТСААТААСТС АССТТССАТССАССААТТСАТТТСТСТСС
гз12631412 АССТТССАТССАААСТАТТСАСТССТСАТСС АССТТССАТСТТТТСТТСТТТССССАТТСС
гз1456076 АССТТССАТСССАСАССТТТСАСААААСАС АССТТССАТССТТСССАТССАСТААТССАС
гз12958106 АССТТССАТССТАТАТСССТСТАТСТССТС АССТТССАТСССААСАСТТТТТСТТТААССС
гз1436633 АССТТССАТССАСССАААСАССТССТТСТА АССТТССАТСАСААССТСССАСААААССТС
гз1587543 АССТТССАТССАСААСССТТТССАСААТТТС АССТТССАТСТАТАСССАТТАСТССССТТС
гз10027б73 АССТТССАТССААААСССАССТСАСААААС АССТТССАТССССТСТТССАТААААТСТТСС
гз12750459 АССТТССАТСТТТТСССССССТССАТАТТС АССТТССАТССТССАТССААСССТСТССС
гз13144228 АССТТССАТСТССАТАТССТСААТТТСАСС АССТТССАТСССТТАТСААССАСТТТСТСС
Г311131052 АССТТССАТССТТТТСТССАТСТТТСССАС АССТТССАТССАССТТАТСТТАТТСТААССС
гз1495805 АССТТССАТСАССАСАСТТСТССТСАСАТС АССТТССАТСАСАСТСТССТТТСССАССАТ
гз1664131 АССТТССАТССТСАСССТСССТААСТТАТС АССТТССАТСТСАТСАСААССАСАТССТСС
гз1527448 АССТТССАТСССССТТСССАСАТАСТАСТС АССТТССАТСССАТАССТТСААССАТТССС
Г311062992 АССТТССАТСТТССТТАТАСАСССТСССТС АССТТССАТСАССТСТССААСТСТСАСААС
гз12518099 АССТТССАТСАССССТТАСТССААТААСТС АССТТССАТССТАТАТСАТСТССАСТСААС
Таблица 5
Праймеры удлинения и тэги по массе, высвобождаемые после расщепления*
3ΝΡ Ю последовательность праймера удлинения последовательность тэга по метке масса
гз11155591 а ССАСССССТСС1ССТСССАТСТССАСССТСТА ССАСС6ССТСС1С 3802,49
гз11155591_д ССАСССССТАС1ССТСССАТСТССАСССТСТС ССАСС6ССТАС1С 3826,52
гз12554258 с ССАСАСССТАС1СТТССТАССССТССАССССС ССАСА6ССТАС1С 3850,54
гз12554258_С ССАСАССАТАС1СТТССТАССССТССАССССТ ССАСА6САТАС1С 3874,57
Г312162441 с СААСАССАСАА1ТТССТАТССС САСААТТАСС СААСА6САСААIТ 3922,62
гз12162441_С СААСАСААС АА1ТТССТАТССС САСААТТАС Т СААСА6ААСАА1Т 3946,64
гз11658800_с СААААСААСΑΑIТ САААС Т ССАСАС Т С Т Т ССС СААААСААСАА1Т 3970,67
гз11658800_С СААААСААААА1Т САААС Т ССАСАС Т С Т Т СС Т САААА6ААААА1Т 3994,69
гз13194159 с ААТААСААСАА1С6ТСТСАТТСССТТТАСТТС ААТАА6АА6АА1С 4010,69
гз13194159_С ΟΑΤΑΑΟΑΑΟΑΑΙС6ТСТСАТТСССТТТАСТТТ ΟΑΤΑΑΟΑΑΟΑΑΙ С 4026,69
Г31007716 с ААТАС ССАСАА1ССТСТАТССТ САСАСАСТАС ААТАСССАСАА1С 4042,69
гз1007716_С ААТАС ССАСАС1ССТСТАТССТ САСАСАСТАТ ААТАСССАСАС1С 4058,69
гз11б37827 а ССАССССС6ССС1ТТСТСССАСА6ТАААСТТССА ССАССССС6ССС1Т 4091,68
гз11637827_д ССАССАСС6ССС1ТТСТСССАСА6ТАААСТТСС6 ССАССАСС6ССС1Т 4115,70
гз13188128 с ССАСС6САСТАС1СТСТТСТ6СТТСАТАТТТСАС ССАСС6САСТАС1С 4139,73
гз13188128_д ССАСАССАС ТАС1СТСТТСТССТТ САТАТ Т Т САС С САСАС САС ТАСЮ 4163,75
гз!545444_а СААСА6САССАС ТТТ САТ ТАТ Т Т САС Т САА6ССА СААСА6САССАС1Т 4187,78
- 42 027558
гз1545444 д СААСАССААСАСIТ Т САТ ТАТ Т Т САС Т СААСССС СААСАССААСАСΙΤ 4211,80
гз1544928 а СААСАСС ТАСАА1АААСАААССАСАААСТ САСТА СААСАССТАСАА1А 4235,83
гз1544928 д СААСАСАТАСΑΑIАААСАААС САСАААС Т САС Т С СААСАОАТАСАА1А 4259,85
гз11190684 с СААААСАТАСАА1АТСТАСАСАС Т САСТ С Т С Т Т С СААААСАТАСАА1А 4283,88
гз11190684_д СААААСАТАСААIАТ С ТАСАСАС Т САС Т С Т С Т Т С СААААСАТАСАА1А 4323,90
гз12147286 с СААААСАСАСАА1ТССАААТТАСАТТТСТСАССС СААААСАСАСАА1Т 4339,90
гз12147286 ί САСААСАСАСАА1Т ССАААТ ТАСАТ Т Т СТ САССТ САСААОАСАСАА1Т 4355,90
гз11256200 а САСААСАСАСАС1ТАТСТСТТАТТСТТСТТ САССА САСААСАСАСАСIТ 4371,90
гз11256200 д САС САСАСАСАС1ТАТСТСТТАТТСТТСТТ САССС САССАСАСАСАС1Т 4387,90
гз1124181_с С САС С САС С С С С СIТАСТ ССССАСССАС ТАТААААС ССАСССАСССССС1Т 4404,89
гз1124181_д ССАСССССССССС1ТАСТССССАСССАСТАТААААС ССАСССССССССС1Т 4420,89
гз1392592_с ССАССССССССТС1ТТСССАААСТТСАСССАСТТАС ССАССССССССТС1Т 4435,90
гз1392592_5 ССАСТССССССТС1ТТСССАААСТТСАСССАСТТАТ ССАСТССССССТС1Т 4450,91
гз1507157_с ССАСССССССТАС1ААСССТССТСТСССССАСААСС ССАСССССССТАС1А 4468,94
гз1507157 ί СААСССССАСТАС1ААСССТССТСТСССССАСААСТ СААСССССАСТАСΙΑ 4516,99
гз1569907 а СААСААССАСТАСIСССТТТТСТТСТСССАСТАСАА СААСААССАСТАСIС 4541,01
гз1569907 д СААСААССААТАСIСССТ Т Т ТСТ ТСТСССАСТАСАС СААСААССААТАСIС 4565,04
гз1339007 с СААСААСАААТАА1С Т СССААТ ТААТ САТ СААС Т С Т С СААСААСАААТАА1С 4613,09
гз1339007 ί АААСААСАААТАА1С Т СССААТ ТААТ САТ СААС Т С Т Т АААСААСАААТАА1С 4637,11
гз1175500 а СААСААСАСАТАА1АТ СТ САСССАТ САССС Т С Т САСА СААСААСАСАТАА1А 4653,11
гз1175500_д СААСААСАСАТАСIАТ СТ САСССАТ САССС Т С Т САСС СААСААСАСАТАС ТА 4669,11
гз11797485_с СААСАС САС С ТАСIСС Т С Т ТАТАТ С Т САТАТСААСАС СААСАССАССТАСIС 4717,11
гз11797485_д САС САС САС С ТАСIСС Т С Т ТАТАТ С Т САТАТСААСАС САССАССАССТАСIС 4733,11
гз1475270_с ССАСССТССТСТАС1АСТТТТСАТееТТАТТСТСАСТС ССАСССТССТСТАС1А 4748,12
гз1475270 С ССССССТССТСТАС1АСТТТТСАТССТТАТТСТСАСТТ ССССССТССТСТАС1А 4764,12
гз12631412 с ССАСССССАССААС1ТСТТТТСТТТСТТТТСТТТТТТС ССАСССССАССААСIТ 4782,15
гз12631412_С ССАССССССССААС1ТСТТТТСТТТСТТТТСТТТТТТТ ССАССССССССААСIТ 4798,15
гз1456076_с С САС С С САС Т СААСIССАТ С САСТААТ ССАС ТАСАСТ С ССАССССАСТСААСIС 4822,17
гз1456076_д С САС САСАС Т СААСIССАТ С САСТААТ ССАС ТАСАСТ С С САС САСАС Т СААСIС 4846,20
гз12958106_а ССАССАСАСТСААС1АСТТТТТСТТТААССССАСТАОА ССАССАСАСТСААСIА 4870,22
гз12958106_д СААССАСАСТАААС1АСТТТТТСТТТААССССАСТАСС СААССАСАСТАААСIА 4918,27
гз1436633_с САААСАСААТАААСIССАСАААСАТ САСТСССТАТАТС САААСАСААТАААСIС 4942,30
гз1436633_Т САААСАеААТАААА1ееАСАААеАТеАетесеТАТАТТ САААСАСААТΑΑΑΑΙС 4966,32
гз1587543 а САААСАСААТАСАА1СССТТССССТССССАТТАААСССА САААСАСААТАСААIС 4982,32
гз1587543 д САСАСАСААТАСАА1СССТТССССТССССАТТАААСССС САСАСАСААТАСАА1С 4998,32
гз10027673 с ААСАСС САСАСАСА1ТАС ТАААСАССС Т ТАТ САТ ССТ С ААСАСССАСАСАСА1Т 5014,32
гз10027673 С АССАСССАСАСАСА1ТАСТАААСАСССТТАТСАТССТТ АССАСССАСАСАСАIТ 5030,32
гз12750459 с СССАСАСАСАСОАС1ТССААСССТСТСССТССАСААСАС СССАСАСАСАССАСIТ 5046,32
гз12750459 С СССАСАСССАСОАС1ТССААСССТСТСССТССАСААСАТ СССАСАСССАССАСIТ 5062,31
гз13144228 с СССССТСССССАСТС1АТТСТАТАТТАСААСААСТСТСТТС СССССТСССССАСТС1А 5078,31
гз13144228 С С САС С С С С С С САС Т СIАТ Т С ТАТАТТАСААСААС Т С Т С Т Т Т ССАССССССССАСТС1А 5127,35
Г311131052 с ССАССС СССАСАСАСIТААС ССАТАТ ССАСАТ ССАСАСАТ С ССАССССССАСАСАСIТ 5151,38
гз11131052_5 С С АС С С САСАС АСАС I ТААС С С АТ АТ С С АС АТ С С АС АС АТТ ССАССССАСАСАСАСIТ 5175,40
гз1495805 с СААС С С САСАС АСАС1ТСТССТТТСССАССАТ СС Т САААСС СААССССАСАСАСАСIТ 5199,43
гз1495805_С СААС С С САСАСАСАА1ТСТССТТТСС САССАТ СС Т САААС Т СААССССАСАСАСААIТ 5223,45
гз1664131 д СААССАСАСАСАСΤΑΙАССАСАТССТССССССАТССТТСАС СААССАСАСАСАСΤΑΙА 5247,48
гз1664131_5 СААССАСАСАААСТА1АССАСАТССТССССССАТССТТСАТ СААССАСАСАААСТА1А 5271,50
гз1527448_с СААССАСАСАААСΑΑΙТААТАСТАСААСАСС ТАТ СААТ ТАС СААССАСАСАААСΑΑΙТ 5311,53
гз1527448 5 СААССАСАСАСАСАА1ТААТАСТАСААСАССТАТСААТТАТ СААССАСАСАСАСΑΑΙТ 5327,53
гз11062992_а СААС САСАСАСАСАСIТ СТ ССААСТСТ САСААСАТ СААСАА СААССАСАСАСАСАСIТ 5343,53
гз11062992 д С САС САСАСАСАСАСIТ СТ ССААСТСТ САСААСАТ СААСАС ССАССАСАСАСАСАСIТ 5359,53
гз12518099_с С САС СТАС САС САС Т СIСААСАААТААСАААСАТ Т САСАСАС С САС СТАС САС САС Т СIС 5375,52
гз12518099_5 С САСАТАС САС САС ТСТ СААСАААТААСАААСАТ Т САСАСАТ С САСАТАС САС САС Т СIС 5399,55
* 8NΡ-специфические нуклеотиды являются подчеркнутыми, тэги по массе являются подчеркнутыми и I относится к дезоксиинозину.
- 43 027558
Пример 6. Расщепление рибонуклеотидов РНКазой.
А. Материалы и способы.
Перед реакцией удлинения проводили 2-плексную ПЦР в 5 мкл объема реакции с использованием следующих реагентов; 2 нг ДНК, 1,25Х Но1Б1аг Тац-буфер, 500 мкМ каждого йNТР, 100 нМ каждого ПЦР-праймера (как перечислено в табл. 1), 3,5 мМ МдС12 и 0,15 Е ΗοΐδΐαΓ Тац (О1адеп). Термоциклирование проводили с использованием следующих условий: 15 мин при 95°С; с последующими 45 циклами 20 с при 95°С, 30 с при 56°С и 1 мин при 72°С; и завершением 3 мин при 72°С.
Эту ПЦР-реакцию обрабатывали δАР (щелочной фосфатазой креветок) для дефосфорилирования невключенных йNТР. 2 мкл смеси, содержащей 0,3 Е δАР, добавляли к ПЦР-продукту и затем подвергали 40 мин при 37°С и 5 мин при 85°С.
Таблица 6
Используемые ПЦР-праймеры
5ΝΡ Ю прямой праймер обратный праймер
гз1000586 АС СТ Т ССАТ СТАС САСААС СТАСАСТ С С С С АССТТССАТСТСТСАААСТССАСАСТСССС
гз10131894 АССТТССАТСАССТААССАСАСАТССССАС АССТТССАТСАССТСТТССАСАСТТСТСАС
Реагенты реакции удлинения объединяли в объеме 2 мкл и добавляли к обработаннуму δАР ПЦР-продукту. Эта реакция удлинения содержала следующие реагенты: 21 мкМ каждого из биотин ййNТР, 1 мкМ каждого из праймеров удлинения с включением рибонуклеотида для последующего расщепления РНКазой (перечисленные в табл. 7) и 1,25 Е термосеквеназы. Термоциклирование проводили с использованием следующих условий проведения циклов: 2 мин при 94°С; с последующими 100 циклами 5 секунд при 94°С, 5 с при 52°С и 5 с при 72°С; с завершением 3 мин при 72°С. Удаление несвязанных нуклеотидов проводили с использованием набора Р1Ацшск для удаления нуклеотидов (О1адеп) в соответствии с рекомендацией изготовителя.
Затем эту элюированную реакцию удлинения объединяли с 30 мкг приготовленных стрептавидиновых бусин ИупаЬеайз М-280 (Иупа1) (промытых три раза 5 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 1 М №С1, 0,5 мМ ЭДТА). Бусины инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин с осторожным перемешиванием и затем осаждали с использованием магнитного штатива. Супернатант удаляли. Затем эти бусины промывали 6 раз 5 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 1 М №С1, 0,5 мМ ЭДТА. Для каждой стадии промывки эти бусины осаждали и супернатант удаляли.
Эти тэги по массе отщепляли от продукта удлинения добавлением РНКазы А и инкубированием при 37°С в течение 1 ч. После инкубирования эти магнитные бусины осаждали с использованием магнитного штатива и супернатант, содержащий продукты тэга по массе, удаляли. Обессоливание достигалось добавлением 6 мг С^ΕΑN Ке§т ^ециепош).
нл реакций удлинения распределяли автоматизированно (с использованием робота) на кремниевые чипы, предварительно загруженные матриксом (Арес1гоС1 ПР®, δе^иеηοт). Масс-спектры получали с использованием М১ АК.КАУ Сотрас1 Апа1у/ег (ΜΑΕΌΙ-ТОЕ масс-спектрометра, δе^иеηοт).
Последовательности удлинения праймеров, содержащие эти тэги по массе, и полученные массы отщепленных продуктов, соответствующих специфическим аллелям, перечислены на фиг. 8. Для каждого из двух δΝΤ показана как гомозиготная, так и гетерозиготная проба, и можно видеть явное различие соответствующих тэгов по массе.
Таблица 7
Праймеры удлинения и тэги по массе, высвобождающиеся после расщепления
Название анализа Последовательность праймера удлинения Последова- тельность тэга по массе масса
гз1000586_С ТТТСТССССАССТСАСССТСС ТТТСТСССС 2697,73
гз1000586_Т ТТТТСТССССАССТСАСССТСТ ТТТТСТСССС 3001,93
гз10131894_С ТТАТТСССАССиССАТССАТССССАСАС ТТАТТСССАССи 3694,37
гз10131894_С Т Т АТ Т Т С ССАССЦССАТ СС АТ СС СС АС АС ТТАТТТСССАССи 3998,57
В табл. 7 рибонуклеотиды выделены жирным шрифтом, δNР-специфические нуклеотиды подчеркнуты, и тэги по массе подчеркнуты. На фиг. 8 показаны МА1.1)1-ТОП Μδ-спектры для генотипирования г§1000586 и Г810131894.
Пример 7. Конструирование тэгов по массе.
Тэги по массе конструировали таким образом, чтобы они находились на расстоянии по меньшей мере 16 Да друг от друга во избежание любого перекрывания с потенциальными солевыми аддуктами, а также таким образом, чтобы двойной заряд любого сигнала массы не мешал сигналу тэга по массе. Расчет тэгов по массе должен учитывать дезоксиинозин и нуклеотид 3' относительно дезоксиинозина.
Нуклеотидные тэги по массе: поведение пролета МА1.1)1-ТОН исследовали для олигонуклеотидов, которые соответствуют тэгам по массе, используемым в 70-плексном (фиг. 9 и 10) и 100-плексном анали- 44 027558 зах (фиг. 11А и В).
Все олигонуклеотиды, соответствующие 70-плексному анализу, вызывались стандартной программой δе^иеηот Турег 3.4 5оП\\агс. использующей три параметра: площадь, высота пика и соотношение сигнал/шум при сравнимом уровне (фиг. 9). С использованием олигонуклеотидов, представляющих 70плексный анализ, величина площади каждого пика коррелирует с составом последовательности этого олигонуклеотида. Более высокий процент нуклеотидов гуанидина и цитозина приводит к большим величинам площади; тогда как процент аденозина соответствует более низким величинам площади (фиг. 10). С использованием олигонуклеотидов, представляющих 100-плексный анализ, авторы изобретения испытывали действия концентрации олигонуклеотидов (конечной концентрации 10, 5, 2,5 и 1 пмоль на один олигонуклеотид) на соотношение сигнал/шум (фиг. 11В). Более низкие концентрации олигонуклеотидов 2,5 и 1 пмоль давали согласующиеся более высокие величины соотношения сигнал/шум, чем концентрации олигонуклеотидов 10 и 5 пмоль. Это наблюдение было подтверждено ручным наблюдением пиков, обнаруживаемых в Турег 3.4. Однако эти четыре концентрации олигонуклеотидов давали сравнимые величины площади (данные не показаны).
Пример 8. Конструирование праймеров удлинения и включения άΝΤΡ/άάΝΤΡ.
Праймер удлинения конструировали с использованием программного обеспечения δе^иеηот'8 А88ау Ос51дп 8оП\\аге с использованием следующих параметров δΒΕ Ма88 Εxΐеηά/до1άΡ^ΕX-удлинения, длины праймеров между 20 и 35 оснований (и соответствующего окна массы), и минимального разделения пиков 10 Да для аналитов (минимально возможного) и 0 Да для праймеров удлинения по массе.
Роль олигонуклеотидов удлинения и άάΝΤΡ в реакции удлинения: Для исследования эффектов олигонуклеотида удлинения (с нуклеотидом дезоксиинозином или без нуклеотида дезоксиинозина) и композиции άάΝΤΡ (с биотиновой частью или без биотиновой части молекулы) после удлинения праймером, авторы изобретения исследовали коэффициенты удлинения 5-плекса (фиг. 12). Анализы обычно показывают наилучшие коэффициенты удлинения олигонуклеотидов с использованием олигонуклеотидов удлинения и άάΝΤΡ. Олигонуклеотиды удлинения, содержащие дезоксиинозин, не показывали значимого уменьшения в коэффициенте удлинения. Однако при использовании включения άάΝΤΡ, включающего в себя биотиновую часть, уменьшение коэффициента удлинения наблюдали во всех анализах при использовании любого типа олигонуклеотида удлинения.
Удлинение биотинилированным άΝΤΡ/άάΝΤΡ: Для сравнения эффектов удлинения отдельным биотинилированным άάΝΤΡ или биотинилированным άΝΤΡ и терминированным немодифицированным άάΝΤΡ, авторы сравнивали коэффициенты удлинения в 7-плексе и 5-плексе. 7-плекс удлиняли биотинилированным άάСΤΡ или биотинилированным άί','ΤΡ и άάАΤΡ, άάυΤΡ или άάΟΤΡ. 5-плекс удлиняли биотинилированным άάυΤΡ или биотинилированным άυΤΡ и άάАΤΡ, άάί','ΤΡ или άάΟΤΡ. Этот эксперимент также сравнивал две концентрации биотинилированных άΝΤΡ или άάΝΤΡ, либо 210, либо 420 пмоль.
В обоих плексах и во всех индивидуальных анализах коэффициенты удлинения, при удлинении биотинилированным άΝΤΡ и терминировании немодифицированными άάΝΤΡ, были значимо уменьшенными в сравнении с удлинением одними биотинилированными άάΝΤΡ (фиг. 13).
Эти результаты показывают, что удлинение только биотинилированными άάΝΤΡ дает более высокую эффективность удлинения.
ПЦР-амплификация.
Перед реакцией удлинения ПЦР проводили в объеме реакции 5 мкл с использованием следующих реагентов: 5 нг ДНК, 1Х ПЦР-буфер, 500 мкМ каждого άΝΤΡ, 100 нМ каждого ПЦР-праймера, 3 мМ МдС12 и 0,15 Е Τας (Ъесщепот).
Термоциклирование проводили с использованием следующих условий: 7 мин при 95°С; с последующими 45 циклами 20 с при 95°С, 30 с при 56°С и 1 мин при 72°С; с завершением 3 мин при 72°С.
δАΡ-обработка.
ПЦР-реакцию обрабатывали δАΡ (щелочной фосфатазой креветок) для дефосфорилирования невключенных άΝΤΡ. Смесь 2 мкл, содержащую 0,6 Е δΛΡ, добавляли к ПЦР-продукту и затем подвергали 40 мин при 37°С и 5 мин при 85°С в термоциклере.
Реакция удлинения.
Реагенты реакции удлинения объединяли в объеме 3 мкл, который добавляли к обработанному δΛΡ ПЦР-продукту. Общая реакция удлинения содержала следующие реагенты: 1Х до№ЬЕХ-буфер, 0,2 мкл 250 мкМ исходного раствора каждого биотинилированного άάΝΤΡ (конечная концентрация 50 пмоль, 0,8 мкл 2,5 мкМ раствора каждого праймера удлинения (конечная концентрация 2 пмоль) (ΙΌΤ) и 0,05 мкл до№ЬЕХ-фермента (Ъесщепот).
Термоциклирование проводили с использованием программы с 300 циклами, состоящей из: 2 мин при 94°С; с последующими 60 циклами: 5 с при 94°С; с последующими 5 циклами 5 с при 52°С и 5 с при 80°С; и завершением 3 мин при 72°С.
Захват.
Для кондиционирования магнитные стептавидиновые бусины промывали два раза с 100 мкл 60 мМ Трис-НС1, 1М №С1, 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,5. Эту реакцию удлинения объединяли с 50 мкг (5 мкл) кондиционированных бусин. Бусины инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с осторожным
- 45 027558 перемешиванием и затем осаждали центрифугированием с использованием магнитного штатива. Супернатант удаляли. Затем эти бусины промывали 3 раза 100 мкл 50 мМ Трис-НС1, 1 М №С1, 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,5 и 3 раза 100 мкл воды. Для каждой стадии бусины осаждали центрифугированием и супернатант удаляли.
ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ.
Обессоливание достигали добавлением 6 мг ί'ΡΕΑΝ Реет (§ециепот). 15 нл реакций расщепления распределяли автоматизированно (с использованием робота) на кремниевые чипы, предварительно загруженные матриксом (8рес1гоСН1Р®, §ециепот). Масс-спектры получали с использованием ΜаδδΑΚΚΑ.Υ Сотрас! Апа1увег (ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ масс-спектометра).
Пример 9. Титрование фермента, буфера, олигонуклеотида и биотина-άάΝΤΡ.
Титрование фермента: Испытывали количество пост-ПЦР-фермента, используемого в реакции удлинения. Использовали стандартные условия ПЦР, удлинения и иммобилизации/расщепления (как описано в протоколе в примере 8), за исключением этого фермента. Количество используемого фермента ни в ручных вызовах, ни в величинах соотношения сигнал/шум не приводило к различию для отдельных анализов (фиг. 14).
Титрование буфера.
Испытывали количество доИРЬЕХ-буфера, используемого в реакции удлинения. Использовали стандартные условия ПЦР, удлинения и иммобилизации/расщепления (как описано в протоколе в примере 8), за исключением корректировки количества буфера. Количество используемого буфера ни в ручных вызовах, ни в величинах соотношения сигнал/шум не приводило к различию для отдельных анализов (фиг. 15).
Титрование олигонуклеотидов.
Испытывали количество олигонуклеотидов, используемых в реакции удлинения. Использовали стандартные условия ПЦР, удлинения и иммобилизации/расщепления (как описано в разделе Протоколы), за исключением корректировки количества олигонуклеотида.
В первоначальном эксперименте (фиг. 16) испытывали конечные количества 15 пмоль, 10 пмоль и 5 пмоль каждого олигонуклеотида. Количества 10 и 15 пмоль давали сходные результаты, но 5 пмоль давали значимо больше ручных вызовов и вызовов с использованием программы генотипа. Это можно видеть наблюдением величин соотношения сигнал/шум (фиг. 9), где слабо выполняемые анализы показывают увеличенное соотношение сигнал/шум при применении более низких количеств олигонуклеотида.
В экспериментах с последующим наблюдением испытывали конечные количества 5, 2,5 и 1 пмоль (фиг. 17). Результаты для всех трех количеств давали сходные результаты при оценивании по соотношению сигнал/шум и ручным вызовам генотипа. Однако три отдельных анализа, для которых ясно наблюдались пики при концентрациях 2,5 или 1 пмоль, были трудными для вызова вследствие низкой интенсивности при применении конечной концентрации 5 пмоль. При применении двух 70-плексных анализов, сравнивающих конечные количества 2, 1 и 0,5 пмоль каждого олигонуклеотида, наблюдали одно и то же количество ручных вызовов для всех концентраций. Однако наблюдали большие соотношения сигнал/шум при применении больших количеств олигонуклеотида (фиг. 18 и 19).
Эти результаты показывают, что оптимальным количеством каждого олигонуклеотида является 2 пмоль при использовании 70-плексного анализа. Однако сходные результаты наблюдали с конечными количествами каждого олигонуклеотида в диапазоне 0,5-5 пмоль.
Концентрация биотинилированного άάNΤΡ.
Испытывали количество биотинилированного άά^ΙΤ в реакции удлинения. Использовали стандартные условия ПЦР, удлинения и иммобилизации/расщепления (как описано в протоколе в примере 8), за исключением корректировки количества биотинилированного άάNΤΡ.
В первоначальном варианте тестировали количества 100, 200, 300 и 400 пмоль каждого биотинилированного άά^ΙΤ в каждой реакции удлинения. Ручные вызовы и соотношение сигнал/шум (фиг. 20) показывают сходные результаты, наблюдаемые со всеми тестируемыми количествами биотинилированного ббЭТР.
Для дополнительного исследования количества биотинилированного άάNΤΡ, требуемого в каждой реакции удлинения, один эксперимент сравнивал 50 и 100 пмоль каждого биотинилированного άάNΤΡ в другом 70-плексном анализе. Эти анализы опять не обнаруживают различия в ручных вызовах или соотношении сигнал/шум (фиг. 21). Это указывает на то, что количество 50 пмоль каждого биотинилированного άά^ΙΤ является достаточным для получения оптимальной реакции удлинения с использованием 70-плексного анализа.
Пример 10. Оптимизация захвата и отщепления.
Иммобилизация и отщепление олигонуклеотидов.
Связывающая способность магнитных стрептавидиновых бусин. Сравнение магнитных стрептавидиновых бусин §о1и1шк и ИупаЬеабв ΜуΟηе С1 с захватывающим биотинилированным олигонуклеотидом в соответствии с протоколом захвата, описанным в примере 8. Этот эксперимент использует два олигонуклеотида, которые соответствуют продуктам удлинения для двух возможных аллелей, сконст- 46 027558 руированных для 8МР гк1000586. Эти олигонуклеотиды содержат нуклеотид дезоксиинозин и 3'-биотинилированный нуклеотид. Эти олигонуклеотиды связываются с магнитным стрептавидином в присутствии либо воды, либо варьирующихся количеств биотинилированных 0КГР и отщепляются обработкой эндонуклеазой V.
Магнитные стрептавидиновые бусины ЭупаЬеайк МуОпе С1 не обнаруживают уменьшения в площади в присутствии 10 или 100 пмоль биотинилированного ййКГР. Однако наблюдали большое уменьшение в сигнале с добавлением 500 пмоль биотинилированного ййКГР.
Магнитные бусины 8о1иНпк не обнаруживают уменьшения сигнала в присутствии количества до 500 пмоль и в случае 500 пмоль биотинилированного ЙКГР. Это показывает, что невключенный биотинилированный 00КГР из реакции удлинения мог бы вызывать уменьшение в конечном сигнале, если бы он не был абсолютно большим чем 500.
Эти результаты в комбинации с экспериментами, не описанными в этом сообщении, показывают, что бусины 8о1иНпк являются толерантными к биотинилированным малым молекулам, ингибирующим связывание биотинилированного продукта удлинения. Возможно, это обусловлено большей связывающей способностью этих бусин, которая, как сообщается, равна 2500 νκ. 500 пмоль биотиновых олигонуклеотидов на 1 мг (фиг. 22).
Отщепление.
Тэги по массе отщепляются от продукта удлинения добавлением раствора, содержащего 12 Е эндонуклеазы V (ΝΕΒ) и 10 мМ ацетата магния (81дта) и инкубированием при 37°С в течение 4 ч в Термомиксере К (Ерреийой) со встряхиванием при 1500 об/мин. После инкубирования магнитные бусины осаждают центрифугированием с использованием магнитного штатива и супернатант удаляют.
Действие положения дезоксиинозина на свойства отщепления: Этот эксперимент планировали для анализа способности эндонуклеазы V расщеплять продукт удлинения, содержащий нуклеотид дезоксиинозин в разных положениях. Четыре олигонуклеотида конструировали для стимуляции продукта удлинения (содержащего 3'-биотин и нуклеотид дезоксиинозин), которые отличаются только положением нуклеотида дезоксиинозина. Этот дезоксиинозин помещали на расстоянии 10, 15, 20 и 25 пар оснований от 3'-нуклеотида, содержащего эту биотиновую часть молекулы.
Сигнал тэга по массе, наблюдаемый после отщепления супернатанта из стадии связывания (несвязанного олигонуклеотида), показывает, что сходное количество олигонуклеотида было связано на магнитных стрептавидиных бусинах для всех олигонуклеотидов. Однако после отщепления олигонуклеотидов, связанных с магнитными стрептавидиновыми бусинами, наблюдается ясная картина. Чем больше расстояние дезоксиинозина относительно 3'-конца этого олигонуклеотида, тем больше этот сигнал и предположительно отщепление. Эти результаты приводят к построению всех олигонуклеотидов удлинения таким образом, что дезоксиинозин находится на расстоянии по меньшей мере 20 нуклеотидов от предположительного 3'-конца продукта удлинения (фиг. 23).
Титрование бусин и эндонуклеазы V.
Количество магнитных стрептавидиновых бусин 8о1иНпк для эффективного захвата биотинилированных продуктов удлинения и эндонуклеазы V для отщепления захваченного продукта для высвобождения тэгов по массе оценивали в серии экспериментов с использованием 70-плексных анализов.
Первоначальный эксперимент сравнивал 10, 20 и 30 мкл магнитных стрептавидиновых бусин 8о1иПпк и 10, 20 и 30 единиц эндонуклеазы V. Соотношения сигнал/шум показывают сходные результаты со всеми тестированными комбинациями, за исключением случая, когда используют 20 и 30 мкл магнитных бусин в комбинации с 10 единицами эндонуклеазы V (фиг. 24). Идентичные результаты наблюдали при ручном вызове генотипов, сравнением 30 мкл бусин и 30 Е эндонуклеазы V с 10 мкл бусин и 10 Е эндонуклеазы V.
Для последующего наблюдения этих результатов один эксперимент сравнивал следующие условия: 10 мкл бусин/10 Е эндонуклеазы V; 5 мкл бусин/10 Е эндонуклеазы V; 10 мкл бусин/5 Е эндонуклеазы V и 5 мкл бусин/5 Е эндонуклеазы V. При исследовании либо ручных вызовов генотипа, либо соотношения сигнал/шум наблюдали сходные результаты при использовании либо 10, либо 5 мкл магнитных бусин (фиг. 25). Однако при использовании 5 Е эндонуклеазы V имелось значимое уменьшение как в ручных вызовах, так и в соотношении сигнал/шум в сравнении с 10 Е эндонуклеазы V.
Для подтверждения этих результатов дополнительный эксперимент сравнивал следующие условия: 10 мкл бусин/12 Е эндонуклеазы V; 5 мкл бусин/6 Е эндонуклеазы V; 5 мкл бусин/12 Е эндонуклеазы V и 5 бусин/18 Е эндонуклеазы V. При сравнении как ручных вызовов генотипа, так и соотношений сигнал/шум наблюдали сходные результаты при сравнении 10 или 5 мкл магнитных бусин 8о1иНпк (фиг. 26). При сравнении различных количеств эндонуклеазы V наблюдали сходные результаты с 12 и 18 Е эндонуклеазы V. Однако при использовании 6 Е эндонуклеазы V наблюдали уменьшение сигнала (фиг. 26).
- 47 027558
Пример 11. Альтернативный механизм отщепления олигонуклеотида.
Рибонуклеотид.
Первоначальные эксперименты использовали олигонуклеотиды удлинения, которые включали рибонуклеотид. После удлинения и последующего захвата магнитных стрептавидиновых бусин тэги по массе высвобождали отщеплением этого рибонуклеотида РНКазой А. Этот способ описан в следующем разделе. Эти анализы были разработаны для З№ гк1000586 и гк10131894 в комбинации. Эта 2-плексная реакция работала хорошо, и эти генотипы ясно видны (фиг. 8). Одной проблемой, которая должна быть преодолена в будущем, является отщепление этих рибонуклеотидсодержащих олигонуклеотидов вследствие размораживания.
Фоторасщепляемые.
Для испытания альтернативы отщепления дезоксиинозина эндонуклеазой У тестировали олигонуклеотиды, содержащие фотоотщепляемый линкер (ГОТ). Этот линкер содержит 10-атомное спейсерное плечо, которое может быть расщеплено экспонированием УФ-света в спектральном диапазоне 300-350 нм.
Метилфосфонат.
В качестве дополнительной альтернативы для использования отщепления дезоксиинозина эндонуклеазой У испытывали олигонуклеотиды, содержащие метилфосфонатную модификацию. Эти олигонуклеотиды содержат модификацию фосфатного скелета в единственном положении, где кислород заменен метильной группой. Это приводит к нейтрально заряженному скелету, который может быть расщеплен гидроксидом натрия (№ОН) или гидроксидом калия (КОН) и нагреванием. Одна серия экспериментов показала, что эти олигонуклеотиды могут отщепляться добавлением всего лишь 50 мМ №ОН или 200 мМ КОН и нагреванием при 70°С в течение 1 ч.
дСпейсер (бЗрасег), фосфоротиоат/фосфорамидит.
Три альтернативных механизмов отщепления, которые не были испытаны детально, являются заменой нуклеотида 1',2'-дидезоксирибозой (дСпейсером) и модификацией скелета, создающей либо фосфоротиоат, либо фосфорамидит. Фосфоротиоатная модификация заменяет образующий мостиковую связь кислород серой. Это делает возможным расщепление скелета молекулы обработкой либо 30/50 мМ водным раствором нитрата серебра (с дитиотреитолом/без дитиотреитола), либо 50 мМ йодом в водном ацетоне. Фосфорамидитная модификация заменяет образующий мостиковую связь кислород амидной группой. Полученная связь Р-Ν может расщепляться обработкой 80% СН3СООН или во время процедуры МАБЭБТОЕ.
Пример 12. Выделение биотинилированных продуктов удлинения с использованием конкурентного способа выделения биотина.
Способ для очистки биотинилированных продуктов удлинения и высвобождения этих продуктов из покрытых стрептавидином магнитных бусин описан здесь и иллюстрирован на фиг. 27А-27О. В некоторых вариантах осуществления этот способ используется для очистки и выделения и анализа реакций удлинения одним основанием для идентификации полиморфизма.
Представляющий интерес геномный район (например, район, имеющий генетическую вариацию) может стать мишенью с использованием способов на основе ПЦР (см. фиг. 27А). После ПЦРамплификации представляющего интерес района, продукты этой реакции обрабатывают щелочной фосфатазой креветки (ЗАР) для дефосфорилирования невключенных нуклеотидтрифосфатов. Этот представляющий интерес район, включающий в себя представляющий интерес полиморфизм, может стать мишенью для нуклеотидных зондов с использованием реакций удлинения одним основанием (ЗВЕ), которые соответствуют представляющему интерес нуклеотидному остатку (например, полиморфизму; см. фиг. 27В). Эти реакции ЗВЕ используют меченные биотином дидезоксинуклеотид-трифосфатные терминаторы. Биотинилированные продукты удлинения затем захватывали (см. фиг. 27С), промывали и очищали от (см. фиг. 27Ό) неиспользованных компонентов реакции с использованием покрытых стрептавидином магнитных бусин и магнитного разделения.
Эти очищенные продукты удлинения затем элюируют из покрытых стрептавидином магнитных бусин конкуренцией со свободным биотином при повышенных температурных условиях (см. фиг. 27Е). Этот элюант, содержащий биотинилированные продукты удлинения из представляющего интерес района, распределяли (см. фиг. 27Р) на ЗресПоСШР® (Зецнепот) и анализировали с использованием МАБ-ОБТОЕ-масс-спектрометрии (см. фиг. 27О). Компоненты и условия реакции описаны здесь.
- 48 027558
Способы
Компоненты реакции, использованные в реакциях ПЦР-амплификации.
Реагент Не содержащая РНКазы άάΗ2Ο Конечная концентрация на реакцию Ν/Α
10Х буфер 1х
άΝΤΡ (25 мМ каждый) 200 мкМ
МдС12 (25 мМ) 1, 0 мМ
НобЗбаг Тач (5 Е/мкл) Ν/Α
Смесь праймеров (1 мкл М) 2 00 нМ
Матрица различные
Компоненты реакции, использованные в реакциях дефосфорилирования щелочной фосфатазой креветок.
Реагент Конечная концентрация на реакцию
Не содержащая РНКазы άάΗ2Ο Ν/Α
10Х ЗАР буфер 0,24Х
Фермент ЗАР (1,7 Е/мкл) 0,073 Е 10
Компоненты реакции, использованные в реакциях удлинения единственным основанием.
Реагент Конечная концентрация на реакцию
Н2О Ν/Α
10Х буфер 0,222Х
Смесь праймеров (9 мкМ) 1 мкМ
Биотинилированные άάΝΤΡ (250 мкл мкМ) 5,56 мкМ
Термосеквеназа (32 Е/мкл) 1,3 Е
Растворы для связывания и промывания, использованные для выделения и очистки биотинилированных продуктов удлинения.
Раствор Состав
2Х буфер связывания 2 М ЫаС1, 10 мМ Трис рН 7,5, 1,0 мМ ЭДТА
10Х буфер промывки 100 мМ Трис-НС1 рН 8,0
IX буфер промывки 10 мМ Трис рН 8,0
Компоненты и процедура для приготовления покрытых стрептавидином магнитных бусин.
Реагент Объем на одну реакцию [мкл]
Бусины 10
Поместите на магнит по меньшей мере на 3 мин для концентрирования бусин, удалите супернатант. Добавьте 2х буфер связывания в эту пробирку следующим образом:
Реагент Объем на одну реакцию [мкл]
2х буфер связывания 10
Смешайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин; удалите супернатант.
Добавьте 2х буфер связывания в эту пробирку для повторения в целом 2 промывок следующим образом:
Реагент Объем на одну реакцию [мкл]
2х буфер связывания 10
Смешайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин; удалите супернатант.
- 49 027558
Ресуспендируйте бусины в 2х буфере связывания следующим образом:
Реагент Объем на одну реакцию [мкл]
25
Компоненты и процедура для захвата биотинилированных продуктов удлинения с использованием покрытых стрептавидином магнитных бусин.
Добавьте равный объем 2х буфера связывания с бусинами в каждую лунку ПЦР-реакции:
мкл бусин в 2х буфере связывания, мкл продукта удлинения.
Вращайте планшет в течение 15-30 мин при комнатной температуре.
Поместите планшет на магнитный сепаратор, удалите супернатант.
Компоненты и процедура для очистки и промывания биотинилированных продуктов удлинения с использованием покрытых стрептавидином магнитных бусин.
Добавьте 1х промывочный буфер следующим образом:
Реагент Объем на реакцию [мкл]
1х промывочный буфер 50
Смешайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин; удалите супернатант.
Добавьте 1 х промывочный буфер в эту пробирку для повторения в целом 2 промывок следующим образом:
Реагент Объем на реакцию [мкл]
1х промывочный буфер 100
Смешайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин; удалите супернатант. Добавьте воду следующим образом:
Реагент Объем на реакцию [мкл]
Вода 100
Смешайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин; удалите супернатант. Добавьте воду следующим образом:
Реагент Объем на реакцию [мкл]
Вода 100
Смешайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин; удалите супернатант.
Элюция захваченных биотинилированных продуктов удлинения из покрытых стрептавидином магнитных бусин для последующего анализа.
Эти биотинилированные продукты удлинения элюировали из покрытых стрептавидином магнитных бусин с использованием конкуренции со свободным биотином при повышенных температурах. Условия реакции даны в таблице ниже.
Добавьте 15 мкл биотина (Кекш-обработанного, 25 нг/мкл).
Нагревайте до 90°С в течение 5 мин, затем охладите до 4°С.
Поместите на магнит на 2-3 мин для захвата бусин.
После захвата магнитных бусин, как описано в таблице, элюант удаляли из этих бусин и готовили для дальнейшего анализа. В некоторых вариантах осуществления приготовление для дальнейшего анализа включает в себя распределение или нанесение пятен на твердую подложку для применения в ΜΑΕΌΙ-ΤΘΡ-масс-спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления этой твердой подложкой является твердая подложка 8рес!^οСНIΡ® ^рие^т). Эти биотинилированные продукты удлинения анализируют ΜΑΕΌΙ-ΤΘΡ-масс-спектрометрией, которая использует различия в массе продуктов удлинения для выяснения генотипа этой пробы в представляющем интерес районе (например, в сайте полиморфизма). Репрезентативная трассировка спектра показана на фиг. 28.
Фиг. 28 иллюстрирует различия масс в продуктах реакции одного основания, анализируемых ΜΑΡΌΙ-ΤΘΡ-масс-спектрометрней. Неудлиненный праймер показан на этой трассировке спектра при массе приблизительно 5997 Да. Два продукта реакции удлинения также показаны на фиг. 28, продукт реакции άάυ, представляющий приблизительно 10% введенной матрицы и имеющий массу приблизительно 6665 Да, и продукт реакции άάΑ, представляющий приблизительно 90% введенной матрицы и имеющий массу приблизительно 6687 Да. Дополнительные точечные линии при массе 6510 и 657 9 являются ожидаемой массой для аллелей ΒΕΑΡ_2_νΤ и ΒΕΑΡ-2-К маркерных продуктов удлинения единственным основанием.
- 50 027558
Пример 13. Удлинение и высвобождение удлиненных олигонуклеотидов из твердой фазы.
Типичный мультиплекс (т.е. 1РЬЕХ) прослеживали до стадии удлинения (например, в примере 8).
ПЦР-амплификацию представляющего интерес района выполняли с последующим дефосфорилированием невключенных нуклеотидов. Удлинение одним основанием использовало биотинилированные дидезоксинуклеотиды. Это удлинение выполняли либо включением только нуклеотидов, соответствующих минорным видам, либо всех четырех нуклеотидов. Биотинилированные олигонуклеотиды захватывались с использованием стрептавидиновых бусин от различных изготовителей. Для стадии высвобождения способ отщепления инозина сравнивали с использованием свободного биотина для конкуренции со связанными биотинилированными олигонуклеотидами. Другие компоненты этой реакции были сходными с анализами, описанными ранее (например, пример 8). Условия, используемые для ПЦР-амплификации, дефосфорилирования и удлинения 8АР, показаны в табл. 8.
Таблица 8
Установка ПЦР
Реагент Конечная концентрация на реакцию Объем для отдельной реакции [мкл]
Свободная от РНказы άάΗ2Ο Ν/Α 0,16
10Х буфер 1х 0, 50
άΝΤΡ>[25 мМ каждый] 200 мкМ 0, 04
МдС12 [25 мМ] 1,0 мМ 0,20
НобЗбаг Тад [5 Е/мкл] Ν/Α 0, 10
Смесь праймеров (1 мкМ) 2 00 нМ 1, 00
Конкурирующий агент Титрование 3, 00
Всего 5
Параметры ПЦР-амплификации
95°С 15 мин
95°С 20 сек
5б°С 20 сек 10 циклов
72°С 1 мин
72°С 3 мин
4°С =
8АР-установка
Реагент Конечная концентрация на реакцию Объем для отдельной реакции [мкл]
Свободная от азы сМН2О РНк- Ν/Α 1,53
10Х буфер ЗАР 0,24х 0, 17
ЗАР-фермент Е/мкл) (1,7 0,073 Е/мкл 0,3
Всего 2
Инкубирование 8АР
- 51 027558
Установка удлинения
Реагент Конечная концентрация на реакцию Объем для отдельной реакции [мл]
Н2О Ν/Α 0,56
10Х буфер 0,222х 0,2
Смесь праймеров [9 мкМ] 1 мкМ 1
Био тинилиро в анные άάΤ&Α [250 мкМ] 5,56 мкМ 0,2
Термосеквеназа [39 Е/мкл] 1,3 Е 0, 04
Всего 2
Параметры удлинения
94°С в течение 30 секунд
94°С в течение 5 секунд 40 циклов
52°С в течение 5 секунд 5 циклов
80°С в течение 5 секунд
72°С в течение 3 минут
4°С постоянно
После удлинения эту реакционную смесь вводили в покрытые стрептавидином магнитные бусины. Этим удлиненным продуктам позволяли производить захват в течение короткого периода времени. Последующие стадии промывания проводили для удаления компонентов реакции, за исключением захваченных продуктов удлинения (табл. 9). Эта процедура удаляла соли, которые продуцируют мешающие аддукты в ΜΑΕΠΙ-ΤΟΡ-масс-спектрометрии, что позволило теперь удалить процедуру с использованием анионообменной смолы, применяемую сейчас с существующей 1РЬЕХ-автоматизацией.
После промывания захваченные продукты элюировали из этих бусин введением высокомолярного раствора свободного биотина при 25 нг/мкл. После элюции продукты удлинения оставались в элюенте. Этот очищенный аналит был теперь готов для распределения на биоэррее чипа и был, по существу, свободен от неудлиненного праймера, солей и других загрязнителей, которые могут затмевать низкоизобилующие виды на спектрах, позволяя более чувствительное детектирование. Фиг. 29А-29О изображают блок-схему этой процедуры.
Таблица 9
Кондиционирование бусин
Перемешайте на вортексе ΜуΟηе ЗйерШ^Фп С1 бусины в полностью ресуспендированные бусины.
Перенесите бусины в пробирку следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
Бусины 10
Поместите на магнит по меньшей мере на 3 мин для концентрирования бусин, удалите супернатант. Добавьте 2х буфер связывания в эту пробирку следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
2х буфер связывания 10
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин.
Добавьте 2х буфер связывания в эту пробирку для повторения в целом 2 промывок следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
2х буфер связывания 10
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
- 52 027558
Захват
Ресуспендируйте в 2х буфере связывания следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
2х буфер связывания 25
Добавьте равный объем 2х буфера связывания с бусинами в каждую лунку ПЦР-реакции.
Вращайте планшет для смешивания в течение 15-3 0 мин при комнатной температуре. Поместите планшет на магнитный сепаратор, удалите супернатант.
Промывка бусин
Добавьте промывочный буфер следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
1х промывочный буфер 50
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Добавьте 1х промывочный буфер в эту пробирку для повторения в целом 2 промывок следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
Вода 100
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Добавьте воду следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
Вода 100
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Добавьте воду в эту пробирку для повторения в целом 2 промывок следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
Вода 100
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Элюция.
Добавьте 15 биотина (обработанного смолой, 25 нг/мкл).
Нагревайте до 90°С в течение 5 мин, затем охладите до 4°С.
Поместите на магнит на 2-3 мин для захвата бусин.
Удалите супернатант в чистый 96-луночный планшет и проведите определение на МАЬОГ
Отщепление инозина.
В качестве другого способа элюции выполняли отщепление инозина тэгов по массе от захваченных продуктов удлинения. Этот способ отклонялся от подхода для конкуренции биотина в отношении конструирования олигонуклеотида удлинения. Этот подход требовал нематричную последовательность на 5'конце праймера удлинения для соответствия продукту удлинения. Кроме того, этот олигонуклеотид был синтезирован с остатком инозина, который разделяет комплементарную последовательность мишени и идентификатор последовательности тэга по массе. Посредством этого остатка инозина, тэг по массе отщеплялся от захватывающего агента активностью эндонуклеазы V. Расщепляющая часть этого процесса иллюстрирована на фиг. 30А и 30В.
Выбор стрептавидиновых бусин и оценивание элюции (биотин ν8 отщепления инозина)
Для оценивания выбирали пять стрептавидиновых продуктов-бусин. Этот выбор был основан на характеристиках поверхности и связывающей способности свободного биотина. Эти характеристики перечислены в табл. 10.
- 53 027558
Таблица 10
Характеристики бусин
Бусины Поверхность Связывающая способность свободного биотина (пмоль/мг бусин)
Оупа1 М270 Гидрофильная 650-1350
Оупа1 М2 8 0 Гидрофобная 650-900
Оупа1 С1 Гидрофильная >2500
Оупа1 Т1 Гидрофобная >1300
Зо1и1Фпк Гидрофильная >1300
Производительность этих бусин оценивали с использованием олигонуклеотидов, синтезированных с 3'-биотином. Были сконструированы два олигонуклеотида с идентичным районом специфической последовательности; один не имел 5'-модификации, тогда как другой содержал 5'-тэг по массе с остатком инозина.
Для оценивания эффективности захвата и стратегии элюции использовали сравнительное измерение в каждом спектре. Были сконструированы дополнительные олигонуклеотиды таким образом, что их соответствующий размер находился в пределах приемлемого диапазона массы этих элюированных продуктов, для сравнения.
Процедура тестирования включала в себя захватывание 3'-биотинилированных олигонуклеотидов, выполнение ряда промывок и последующую элюцию (конкуренцию биотина νδ. отщепления инозина). Эта стратегия облегчает вариабельность, которая может быть введена во время ПЦР и стадий удлинения. Стратегии бусин и элюции оценивали посредством реакции на лимитирование захватываемых олигонуклеотидов. Это оценивание выполняли серийным разведением 3'-биотинилированного олигонуклеотида от 2 до 0,031 мкМ. Для каждой тестируемой реакции равное количество квантифицированных (в количественной форме) олигонуклеотидов добавляли к элюенту для измерения захвата бусин и эффективности элюции.
Отношение захваченных олигонуклеотидов к высоте квантифицированных олигонуклеотидов измеряли при каждой концентрации для каждой оцениваемой бусины. Этот исходный эксперимент показал, что способ конкуренции с биотином превосходит способ элюции. Оба способа элюции обнаруживали захваченный продукт при наименьшем исходном введении, но захват биотина явно показывал больше захваченного и элюированного продукта, как показывало это соотношение. Этот результат был очевидным независимо от используемых бусин, и конкуренция с биотином была выбрана в качестве стратегии элюции. Эти данные показали также более низкую производительность Пупа! М280 и Пупа! Т1. Данные, отражающие этот эксперимент, можно видеть на фиг. 31 и 32.
Оценивание бусин.
Следующим подходом был анализ захваченных бусин для дополнительного развития. Это экспериментирование использовало все стадии предложенной автоматизации ультрачувствительного детектирования для оценивания производительности бусин из удлиненного продукта без ПЦР-матрицы. Для контроля вводимого материала конкурирующие олигонуклеотиды использовали в качестве матричного материала. ПЦР, δΑР, удлинение и захват выполняли, как описано ранее. Комплемент матрицы, БиотинййИТР, был единственным нуклеотидом, используемым в реакции удлинения. Концентрацию конкурирующей олигонуклеотидной матрицы серийно разводили от приблизительно 60000 молекул до приблизительно 30 молекул. Каждое разведение повторяли шесть раз. Для всех реакций использовали 1 мкл 1 мкМ раствора удлиненных олигонуклеотидов. Оцениваемыми бусинами были Пупа! М270, Пупа! С1 и δο1и1^ηк. Для выяснения производительности связывания каждых бусин с использованием одной и той же стратегии, какая использовалась в предыдущем исследовании, 1 мкл 1 мкМ раствора квантифицированных олигонуклеотидов добавляли к элюенту после захвата биотина.
Результаты этого оценивания продемонстрировали, что Пупа! С1 превосходили как δο1и1^ηк, так и М270 при всех концентрациях матрицы. М270 не были способны захватывать никакой продукт. Для 1)упа1 С1 наблюдали постепенное снижение отношения продукта удлинения к квантифицированному (находящемуся в количественной форме) олигонуклеотиду с использованием либо высоты, либо площади в качестве меры относительно введенного количества. Такого соотношения не наблюдали с δο1и1^ηк, что предполагало лимитирование захвата. Результаты этого эксперименты можно видеть на фиг. 33 и 34.
Геномные варианты (т.е. модель геномной смеси).
С установленными основными компонентами и процедурами для этого процесса развитие продолжали до фактически существующих проб. Одна модельная система была разработана с использованием проб и анализов, хорошо охарактеризованных в прежней валидизации (валидизации Опсосаг1а). Используемый генетический материал является коммерчески доступным из АТСС, и известно, что он несет соматические мутации. Проба ΗΈΒ-26Ό (геномная ДНК клеточной линии, произведенной из аденокарци- 54 027558 номы молочной железы) несет мутацию в кодирующем серин/треонин-протеинкиназу районе В-КаР (ВКАР). Конкретно, эта проба ранее обнаруживала соматическую мутацию ВКАР-2 (в Диком типе - О; в Мутанте - Т).
Эта проба была охарактеризована как являющаяся 30%-ным мутантом. Проба НТВ-38Э (геномная ДНК клеточной линии, произведенной из колоректальной аденокарциномы) также несет мутацию в районе ВКАР. Ранее было показано, что эта проба имеет мутацию в ВКАР-15 (в Диком типе - Т; в Мутанте А). Эта проба была охарактеризована как 15%-ный мутант. НТВ-26Э является диким типом для ВКАР-15, и НТВ-38Э является диким типом для ВКАР-2.
Одним логическим обоснованием для выбора этих анализов и проб, кроме легкости получения геномного материала, были эти специфические генотипы. Биотин-ббСТР и биотин-ббТТР разделялись только 1 Да по массе. Хотя это различие по массе находится в пределах разрешения МАБШ-ТОР инструментов, оценивали большее различие по массе между продуктами. Затем было обнаружено, что различные продавцы предоставляли биотин-ббИТР с 16-углеродным линкером (против 11-углеродного линкера первоначального набора). Замена 11-углеродного линкера 16-углеродным линкером в этом анализе облегчала любые потенциальные проблемы конструирования.
Для оценивания чувствительности в этой модельной системе, эти две пробы смешивали для дополнительного разведения каждой соответствующей соматической мутации. Эти две пробы смешивали в различных соотношениях, титруя соматическую мутацию в ВКАР-2 для пробы 26Ό от 30 до 1,5% и титруя вариант ВКАР-15 от 15 до 0,75% для пробы 38Ό. Каждую точку титрования проверяли в двух последовательностях и рекомбинировали после ЗАР. Смешанный аналит перераспределяли на две различные реакции. Одна из этих реакций использовалась для всех четырех биотин-бб№ГР, тогда как другая использовала только биотин-ббИТР (для ВКАР-2) и биотин-ббАТР (для ВКАР-15). Захват и элюцию выполняли с бусинами Эупа1 С1 и конкурированием со свободным биотином. Фиг. 35 показывает результаты этих четырех сценариев.
Мутант ВКАР-2 обнаруживал слабый сигнал в ходе реакции с 4 биотин-бб№ГР (верхняя левая панель, фиг. 35). Обычно этот сорт сигнала не считался значимым выше базового шума. С использованием только биотин-ббИТР (для реакции ВКАР-2, нижняя левая панель, фиг. 35) наблюдали очень ясный и отчетливый сигнал для этого мутанта. То же самое наблюдение сохранялось для 0,75% мутанта в анализе ВКАР-15 для пробы 38Ό. Очень ясный и отчетливый сигнал наблюдали для мутанта ВКАР-15, когда только биотин-ббАТР (нижняя правая панель, фиг. 35) был включен в композицию удлинения. Эти данные продемонстрировали значимое увеличение в соотношении сигнал/шума (3ΝΡ.) исключением биотинбб№ГР, соответствующего более изобилующей последовательности дикого типа. В случае ВКАР-15 не было наблюдаемого сигнала для этого мутанта в реакции, когда все 4 биотин-ббNТΡ были включены в реакцию удлинения (верхняя правая панель, фиг. 35).
Детектирование и количественное определение низко изобилующего варианта.
В некоторых вариантах осуществления количество молекул мутантного варианта-мишени (например, низко изобилующего варианта), присутствующее в анализе, где продукт удлинения дикого типа (например, высоко изобилующего вида) не генерируется, определяют с использованием синтетической матрицы, включенной в реакцию удлинения. Первоначальной задачей этого оценивания было оценивание способности надежного детектирования минорного вклада (т.е. низко изобилующего мутанта) в смеси при чувствительных уровнях. Стратегия пост-ПЦР-обогащения, суммированная здесь, определяет, что эта способность является возможной эффективным удалением продукта удлинения дикого типа (например, высоко изобилующего вида). Можно определить количество (например, копийность, концентрацию, процент) присутствующих мутантных молекул-мишеней (т.е. мутантных продуктов удлинения) в анализе (например, реакции удлинения), если известно количество матрицы. Это количество мишени (например, копийности, концентрации, процента) мутантного варианта (т.е. мутантных продуктов удлинения) и/или процента мутантного варианта-мишени в этой пробе определяют количественно включением известного количества синтетической матрицы в этой реакции удлинения. Эта синтетическая матрица может гибридизоваться с видом олигонуклеотида и содержит замену основания в положении мутации, локализованной непосредственно 3' (справа) от вида олигонуклеотида, подлежащего удлинению. Эта замена основания является отличающейся от дикого типа или мутантного варианта-мишени (например, первого варианта, низко изобилующего варианта, З№). Эта замена основания, присутствующая в синтетической матрице, не присутствует в пробе перед введением этой синтетической матрице. бб№ГР, который является комплементарным этой замене основания в синтетической матрице, также вводят в эту реакцию. Виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются с мутантным вариантом-мишенью, коамплифицируются (например, ко-удлиняются) с видами олигонуклеотидов, которые гибридизируются с этой синтетической матрицей. Выполнением множественных реакций, которые включают в себя серийные разведения синтетической матрицы, количество и/или процент мутантного варианта-мишени могут быть определены. Количество и/или процент мутантного варианта-мишени определяются количеством синтетической матрицы, которая дает продукт удлинения, равный мутантному варианту-мишени.
Квантификацию (количественное определение) мутантов, описанных здесь, проводили на модели геномной смеси. С постоянными процентами мутантов 5, 1, 0,5 и 0,1, применяли титрования (количества)
- 55 027558 синтетической матрицы, нацеленные на теоретическое число молекул, дающее общее введение ДНК 20 нг. Этот результат показывал точное число мутантных молекул для 5- и 1%-ной проб. Этот процесс не был таким точным при более низких уровнях, предположительно вследствие смещения взятия проб ПЦР с ограниченной матрицей. Фиг. 36 показывает анализ титрования для 1%-ного мутанта.
Выводы.
Элиминация продукта удлинения дикого типа может увеличивать чувствительность мультиплексного анализа, описанного здесь. В некоторых вариантах осуществления, анализы одного и того же плекса (комплекса) имеют один и тот же генотип дикого типа или имеют один и тот же мутантный генотип. В некоторых вариантах осуществления могут быть использованы синтетические матрицы или конструкты плазмид со сконструированными мутациями против геномной ДНК здоровой популяции (т.е. пробы консорциума НАРМАР). Эта стратегия может облегчать проблемы конструирования и может иметь явное преимущество искусственно созданных различных процентов мутантов в различных анализах для одного и того же плекса (только конкурента). В некоторых вариантах осуществления синтетические матрицы (например, плазмиды или олигонуклеотидные матрицы) включены здесь в наборах.
В некоторых вариантах осуществления конструкции создают специально в отношении нуклеотида дикого типа (т.е. более изобилующего). Таким образом, все анализы в одном плексе имеют один и тот же общий нуклеотид для дикого типа, и используемая смесь удлинения опускает этот нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления конструкты могут быть созданы специально в отношении этого мутанта. В некоторых вариантах осуществления все анализы в плексе имеют одно и то же общее мутантное основание. В некоторых вариантах осуществления смесь удлинения содержит только это мутантное основание. В некоторых вариантах осуществления имеется риск неспецифического взаимодействия с переполняющей фоновой ДНК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления должен быть по меньшей мере один контрольный плекс, представляющий каждое удаленное основание дикого типа, или каждое опущенное мутантное основание, в зависимости от выбранного стиля конструирования.
Улучшения автоматизации процедур.
Эти процессы, описанные здесь, являются поддающимися автоматизации. Ключевыми стадиями, рассматриваемыми для автоматизации, могут быть кондиционирование бусин, добавление бусин, промывание бусин и аспирация элюированного продукта.
Пример 14. Детектирование генотипов дикого типа и мутантных генотипов с использованием анализов и наборов.
Дизайн (разработка) анализа.
Одним препятствием в отношении более чувствительного детектирования было присутствие масштабирования интенсивности пика дикого типа относительно точки, где мутанты низкого уровня уже не являются видимыми выше базовой линии (фона). Удаление пика дикого типа из детектирования улучшило чувствительность и соотношение сигнал/шум. Анализы, разработанные в одинарном плексе, имеют тот же самый пик дикого типа, общий с соответствующим основанием дикого типа, удаленным из реакции удлинения, или разработанные таким образом, чтобы иметь тот же самый мутантный пик, общий только со специфическим основанием, включенным в реакцию удлинения (табл. 11). В отношении стоимости материалов, в качестве модельной системы используется стратегия выбора плекса, направленного в отношении мутантного аллеля с только одним основанием, используемым в реакции удлинения.
Дизайны мультиплекса (т.е. плекса) разделены на три класса анализов. Эти три класса представляют каждый из других 3 нуклеотидов в виде дикого типа. Четыре анализа мультиплексов (т.е. плексов) разрабатывают с использованием логического обоснования с каждым плексом, нацеливающим на отличающееся мутантное основание. Эта стратегия разработки анализов позволяет исследовать все возможные комбинации дикого типа/мутанта.
Это конструирование включает в себя шесть районов из Ьиид Раие1. Каждый сконструированный мутант запрашивается в прямом и обратном направлениях для облегчения требования всех возможных комбинаций дикого типа/мутанта. Это конструирование избегает перекрывания из олигонуклеотида удлинения и ПЦР-праймера таким образом, чтобы избежать любых потенциальных сигналов, производимых экзонуклеазой. Мутация, встроенная в эту модель, представляет фактические соматические мутации, используемые в Ьиид Раие1. Это конструирование с мультиплексом представлено в табл.12. Эти четыре мультиплекса сконструированы таким образом, что они могут быть мультиплексированы вместе в одном плексе с использованием смеси ациклического удлинения. Это конструирование включает в себя сайт ЕсоЫ, разделяющий эти районы друг от друга (фиг. 37). Перед использованием этой модели эту плазмиду расщепляют посредством расщепления рестрикцией ЕсоЫ для разделения этих районов и более адекватного отражения геномного контекста.
- 56 027558
Таблица 11
Дизайн со всеми анализами, типа в плексе имеющими общий нуклеотид дикого
Смесь нуклеотидов удлинения
Плекс с диким типом - Т С, С, А
Плекс с диким типом - С т, с, А
Плекс с диким типом - С т, с, А
Плекс с диким типом - А т, с, С
Дизайн со всеми анализами, имеющими общий нуклеотид дикого
типа в плексе
Смесь нуклеотидов удлинения
Плекс с мутантом - Т Т
Плекс с мутантом - С С
Плекс с мутантом - 6 с
Плекс с мутантом - А А
Таблица 12
Мультиплекс Район Дикий тип/мутация Направление удлинения
Мультиплекс мутанта С ООК2_Ъ63У С/С К
ЕРНАЗ N37 9К А/С К
ЙАК2_У931С Т/С К
Альбумин СЕг1 С А/С К
Мультиплекс мутанта А ΝΟΤΟΗΙ Η2328Ν С/А К
ТР53_И249И Т/А Е
АЪК_С4493А С/А Е
Альбумин СЕг1 А С/А Е
Мультиплекс мутанта Т АЬК_С4493А С/Т И
ΝΟΤΟΗΙ И2328И С/Т Е
ТР53_Н249М А/Т К
Альбумин Сбг! Т С/Т К
Мультиплекс мутанта С ЕРНАЗ Ν379Κ т/е Е
ϋϋΚ2 Ь63У С/С Е
ДАК2 У931С А/С Е
Альбумин СДг! С Т/С Е
Контроли.
Элементы этого процесса приводят к контролям для анализа справа. Неуспех в захвате продукта может быть обусловлен ограниченной матрицей, неудавшимся ПЦР/удлинением или неудавшимися захватом и элюцией. Для оценивания проблем с этими специфическими переменными в каждый сконструированный плекс включают контрольный анализ. Этот сконструированный контроль нацелен на ген альбумина человека. Контроль предоставляется в каждой реакции, которая имеет достаточную матрицу с правильным функционированием ПЦР и удлинением. Для этого контроля предназначены четыре отдельных олигонуклеотида удлинения. Эти олигонуклеотиды удлинения нацелены на остаток, представляющий каждый из четырех нуклеотидов, и используются с подходящей смесью нуклеотидов удлинения.
После анализа удлинения 5'-биотинилированный олигонуклеотид с 3'-инвертированным 6ΤΤΡ включают во все анализы для контроля захвата и элюции. Отсутствие этого сигнала, совпадающее с отсутствием любого аналита, информирует пользователя о неудавшихся захвате и элюции. Молярность этого конкретного контроля не должна подавлять эту реакцию во избежание маскирования любого мутанта низкого уровня в детектировании.
- 57 027558
Оптимизация элюции.
Захваченные и промытые продукты элюируют в 15 мкл высокомолярного раствора биотина. Новое аппаратное оборудование, которое осаждает бусины при подходящей высоте для элюции 15 мкл, оптимизировано для этого процесса с использованием Ма!п\ Ρ1;·ιΕΜ;·ιΕ 2X2 и/или Ερίιηοίίοιτ 5075. Эксперимент титрования используется для оценивания производительности нового планшета. В качестве теста этого процесса это оценивание выполняется в трех повторностях для каждого разведения контроля захвата. Этот контроль захвата вводят в имитирующий ίΡΕΕΧ раствор. Этот тест-раствор подвергается типичному процессу пост-удлинения с использованием этого аппаратного оборудования.
Корректируемая автоматизация для Ρ1;·ιΕΜ;·ιΕ осуществляется перед экспериментированием с элюцией. Титрование включает в себя двенадцать стадий серийного разведения, с получением введения захватывающего олигонуклеотида от 2500 до приблизительно 1 молекулы. Этот способ с новым аппаратным оборудованием оптимизирован для способности сохранения осадка во время промывок без потери бусин. В конечном счете, производительность оценивается по чувствительности, демонстрируемой детектированием захватывающего олигонуклеотида.
Контроль качества.
Четыре мультиплекса сначала обрабатывают типичным ίΡΕΕΧ-процессом с использованием смеси ациклического удлинения только на одной плазмиде. Это выполняется в качестве измерения качества изготовления плазмиды. Продукт рестрикционного расщепления также оптимизируют и визуализируют в агарозном геле для гарантии полного расщепления в составляющие компоненты.
Оптимизация контроля качества.
Существует первоначальный эксперимент для определения, какая концентрация контроля захвата является подходящей для последующих экспериментов. Этот контроль применим для всех реакций, в которых нет мутанта и, следовательно, нет пика удлинения. В этой ситуации необходимо определить, является ли отсутствие пика результатом отсутствия достаточной матрицы для генерирования продукта удлинения, или неуспехом захвата или элюции. Титрование плазмиды выполняют в четырех повторностях. Для каждой повторности используют различную концентрацию захватывающего олигонуклеотида. Титрование плазмид отражает эксперимент чувствительности с восемью разведениями от 50- до 0,01%ного мутанта и реакцией без мутанта. Самую низкую используемую концентрацию контроля захвата определяют из эксперимента оптимизации элюции. Эту концентрацию используют в качестве ввода для одной повторности и двойных концентраций для остальных трех повторностей. Производительность контроля захвата оценивают по тому, как присутствие пика контроля захвата влияет на анализ детектирования мутанта. Этот пик не должен затенять мутант низкого уровня, будучи слишком преобладающим в этих спектрах. Однако пик контроля захвата должен ясно детектироваться при концентрациях низкого уровня мутанта. Открытия этого эксперимента являются основой для концентрации контроля захвата в последующих анализах чувствительности, специфичности и соответствия. 3'-инвертированный άΤ является необходимым для этих реакций, когда этот нуклеотид не включен в реакцию удлинения. Однако этот контроль разработан таким образом, чтобы обеспечить включение этого контроля непосредственно в реакцию удлинения.
Чувствительность и специфичность.
Установление порога чувствительности этого процесса включает в себя титрование плазмидной ДНК относительно ДНК человека. Пороги чувствительности определяются, когда мутантный аналит не является детектируемым, или, по существу, единственная копия этого варианта используется для меньшинства матрицы. Используются различные разведения этой смеси. Число мутантных молекул матрицы равно 15000, 3750, 938, 235, 59, 15, 4 и 0. Соответствующее число копий дикого типа равно 15000, 26250, 29062, 29765, 29941, 29985, 29996 и 30000. Объединенные, эти восемь смесей представляют 50, 12,5, 3,13, 0,78, 0,2, 0,05, 0,01 и 0% концентрацию мутанта, соответственно. Общая матрица равна 90 нг/г\п, или 30000 геномных копий. Каждое разведение каждого плекса используют с 48 повторностями. Дополнительные два планшета используются для 48 не имеющих матриц повторностей для каждого мультиплекса в качестве контроля для оценивания степени неспецифических взаимодействий.
Дополнительно, планшет золотого стандарта из 48 проб, функционирующий в двух повторностях с использованием 50- мутанта и 12,5%-ного мутанта, устанавливает правильные соотношения. В целом, исследование чувствительности и специфичности требует девятнадцать 96-луночных планшетов. ПЦР и 8ΑΡ осуществляются в соответствии с существующим ίΡΕΕΧ-протоколом. Пост-8ΑΡ-реакции подвергают реакции удлинения, содержащей биотин-άάΝΤΡ в качестве альтернативного терминирования нуклеотидного субстрата (за исключением золотого стандартного планшета). Все другие компоненты реакции остаются теми же самыми. Табл. 13 показывает установку разведения модельной системы в виде числа молекул и массы каждой составляющей ДНК. Табл. 14 и 15 описывают весь процесс от ПЦР до удлинения в концентрациях для каждого компонента на основе реакции.
Первоначальный анализ рассматривает, в какой точке не наблюдается сигнал, для установления порога значимой чувствительности. Этот анализ рассматривает полные данные, включающие в себя все мультиплексы, и также учитывает вариабельность, которая может встречаться при удлинении конкретного основания, а также какое действие, если оно имеется, оказывает фоновый генотип дикого типа на
- 58 027558 успешное удлинение. Этот анализ оценивает, как эта чувствительность действует на специфичность.
Таблица 13
Таблица смеси удлинения
Масса (нг) Молекулы Общая масса (нг) Молекулы Общие молекулы (нг) Общие молекулы %-ный мутант
45 15000 45 15000 90 30000 50
78,75 26250 11,25 3750 90 30000 12,5
87,19 29062 2,81 938 90 30000 3,13
89,3 29765 0,71 235 90 30000 0,78
89,82 29941 0,18 59 90 30000 0,2
89,96 29985 0,05 15 90 30000 0,05
89,99 29996 0,01 4 90 30000 0,01
90 30000 0 0 90 30000 0
Согласованность.
Анализ согласованности рассматривает данные, собранные из экспериментов по чувствительности и специфичности. Все повторности калиброваны (измерены) для согласования в каждом эксперименте, а также согласования среди экспериментов. Золотой стандартный генотип устанавливают выполнением самой модельной системы в контроле качества этой модельной системы.
Дополнительное измерение согласованности выполняют с пробами, обеспечиваемыми Ноп/оп Όΐадпо8йе5. Ноп/оп В1адпо51зс5 обеспечивает генетически определенные гДНК и ссылочные стандарты клеток ΤΤΡΕ. Оценивание рассматривает не более 23 проб, которые изготовлены ΤΤΡΕ. Восемьпятнадцать мутаций отобраны из перечня, изготовляемого Ноп/оп. Для исследования силы этой системы детектирования, мутанты выбирали и покупали с соответствующей версией дикого типа или смешивали у себя в лаборатории с пробами здоровой популяции. Пробы, обеспечиваемые Ноп/оп, находятся в 50%ном мутантном состоянии и требуется разведение для оценивания чувствительного детектирования в этом контексте. Серия разведений является такой же, что и используемая в оценивании чувствительности и специфичности. Кроме того, прогоняли не имеющий матрицы контроль для доведения общего числа проб до 24. Все пробы прогоняли в четырех повторностях с получением в целом 96-луночного планшета. Это экспериментальное конструирование будет включать в себя золотой стандарт ίΡΡΕΧ, использующий пробы Ног1/оп В1адпо51зе без разведения. Это оценивание не только дополнительно оценивает согласованность с традиционным ίΕΡΕΧ, но также дает информацию о производительности фактических проб ΤΤΡΕ.
Контрольные переменные.
Обработка пре-обогащения: Все реакции проводили в соответствии с ίΕΕΡΧ δΟΡ до стадии удлинения. Эти процессы детализированы в табл. 14 и 15. Все используемые реагенты контролируются таким образом, что они являются одной и той же партией реагентов, используемой во всех этих исследованиях.
Обработка бусин: Стадии кондиционирования, промывания и элюции были установлены из других исследований для получения надежной системы. После того как стратегии элюции были решены после фазы пре-тестирования, используют определенный протокол для всех последующих экспериментов.
ДНК пробы: ДНК, полученную из трех источников, используют для всех исследований. Первая является плазмидной ДНК, содержащей модельную систему. Вторая является пробами НарМар из резидентов ΡΤηΙι Европейского происхождения. Последняя является ДНК, обеспечиваемой Ноп/оп В1адпо51зс5.
Измерительная техника: Пре- и пост-ПЦР измерительная техника включают в себя или Ρ1аίеΜаίе 2X2, и/или НатШоп М1сго ЬаЬ 4000. Нанодиспергирование выполняют на δе^иеηот Nапоά^5реп5е^ Κδ1000 с детектированием аналита с использованием Ма55АККА¥ Апа1у/ег 4. Все порядковые номера находятся в каталоге.
- 59 027558
Установка ПЦР
Таблица 14
Реагент Конечная концентрация на реакцию Объем для отдельной реакции [мкл]
Свободная от РНказы άάΗ2Ο Ν/Α 1, 16
10Х буфер (м/20 мМ МдС12) 1х 0, 50
άΝΤΡ [25 мМ каждый] 200 мкМ 0, 04
МдС12 [25 мМ] 1,0 мМ 0,20
Еазбагб Тац [5 Е/мкл] 0,1 Е/гхп 0, 10
Смесь праймеров (1 мкМ) 2 00 нМ 1, 00
ДНК (5 нг/мкл) 10 нг/гхп 2, 00
Параметры ПЦР-амплификации
Всего 5,00
95°С 15 мин
95°С 20 сек
56°С 20 сек 45 циклов
72°С 1 мин
72°С 3 мин
4°С =
ЗАР-установка
Реагент Конечная концентрация на реакцию Объем для отдельной реакции [мкл]
Свободная от аан2о РНказы Ν/Α 1,53
10Х ЗАР буфер 0,24х 0, 17
5АР-фермент (1,7 Е/мкл) 0,073 Е/мкл 0,30
Всего 2
Инкубирование ЗАР
Реакция удлинения
Таблица 15
Реагент Конечная концентрация на реакцию Объем для отдельной реакции [мл]
Н20 Ν/Α 0, 56
10Х буфер 0,222х 0,20
Смесь праймеров [9 мкМ] 1 мкМ 1, 00
Биотинилировнные άάΝΤΡ [250 мкМ] 5,56 мкМ 0,20
Термосеквеназа [39 Е/мкл] 1,3 Е/гхп 0, 04
Всего 2
- 60 027558
Параметры удлинения
94°С 30 секунд
94°С 5 секунд
52°С 5 секунд 40 циклов
5 циклов
80°С 5 секунд
72°С 3 минут
4°С =
Параметры реакции.
Эксперименты, используемые в этом тест-плане, оцениваются несколькими параметрами. Контрольные параметры имеют потенциальное действие на несколько параметров. Оценивается способность этого процесса доставлять надежный и желаемый результат. Любое значение на параметре реакции, которое может быть надежно определено контрольными параметрами, учитывается.
Высота пика.
Балл достоверности пика.
Ожидаемые генотипы.
Таблица 16
Кондиционирование бусин
Перемешайте на вортексе МуОпе 31гер1ау1Йт С1 бусины в полностью ресуспендированные бусины. Перенесите бусины в пробирку следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
Бусины 10
Поместите на магнит по меньшей мере на 3 мин для концентрирования бусин, удалите супернатант. Добавьте 2х буфер связывания в эту пробирку следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
2х буфер связывания 10
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин.
Добавьте 2х буфер связывания в эту пробирку для повторения в целом 2 промывок следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
2х буфер связывания 10
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Захват
Ресуспендируйте в 2х буфере связывания следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
2х буфер связывания 25
Добавьте равный объем 2х буфера связывания с бусинами в каждую лунку ПЦР-реакции.
Вращайте планшет для смешивания в течение 15-3 0 мин при комнатной температуре. Поместите планшет на магнитный сепаратор, удалите супернатант.
Промывка бусин
Добавьте промывочный буфер следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
1х промывочный буфер 50
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Добавьте 1 х промывочный буфер в эту пробирку для повторения в целом 2 промывок следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
1х промывочный буфер 100
- 61 027558
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Добавьте воду следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
Вода 100
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Добавьте воду в эту пробирку для повторения в целом 2 промывок следующим образом:
Реагент Объем на реакцию
Вода 100
Смешивайте осторожно, затем поместите на 2-3 мин на магнит для захвата бусин, удалите супернатант.
Элюция.
Добавьте 15 биотина (обработанного смолой, 25 нг/мкл).
Нагревайте до 90°С в течение 5 мин, затем охладите до 4°С.
Поместите на магнит на 2-3 мин для захвата бусин.
Удалите супернатант в чистый 96-луночный планшет и проведите определение на МАЕО1.
Обработка бусинб
Бусины кондиционируют в 2х буфере связывания и конечный объем 25 мкл кондиционированных бусин добавляют к 9 мкл реакции удлинения. Добавляют воду до приведения общего объема до 50 мкл. Захват бусин производят в 96-луночном планшете для согласования этого объема. Захват продуктов удлинения выполняют на гематологическом ротаторе при комнатной температуре в течение 30 мин. После захвата эти бусины промывают от компонентов реакции в растворе 1х Трис-буфера. Это промывание повторяют в целом для двух промывок. Затем эти бусины промывают водой. Промывку водой также повторяют в целом для двух промывок. Каждая стадия промывок использует 100 мкл общего объема. 96-луночный планшет-магнит используют для осаждения бусин. Стадии промывок могут выполняться вручную или через применение автоматизации. Промытые бусины повторно суспендируют в 15 мкл концентрированного раствора свободного биотина (25 нг/мкл; обработанные смолой). Свободному биотину дают конкурировать с биотинилированными продуктами удлинения при 90°С в течение 5 мин. Из 15 мкл ресуспензии, 10 мкл аспирируются, тогда как бусины осаждаются под магнитом. Этот чистый элюент в количестве 10 мкл распределяют в 384-луночный планшет для дозирования. Кондиционирование бусин и параметры промывания показаны в табл. 16.
Параметры распределения требуют некоторых изменений относительно протоколов распределения при условии высоты объема и характеристик аналита. Смещение аспирации устанавливают на 8 мм, и скорость распределения изменяют приблизительно до 150 мм/с или другой более высокой скорости распределения для учета отличия вязкости в этом аналите от типичной 1РЬЕХ-биохимии.
Пример 15: Неограничивающие примеры вариантов.
Далее здесь обеспечены неограничивающие примеры некоторых вариантов этой технологии.
А1. Способ для определения присутствия или отсутствия множества нуклеиновых кислот-мишеней в композиции, который предусматривает:
(a) приготовление ампликонов нуклеиновых кислот-мишеней амплификацией этих нуклеиновых кислот-мишеней, или их частей, в условиях амплификации;
(b) контактирование этих ампликонов в растворе с набором олигонуклеотидов в условиях гибридизации, где каждый олигонуклеотид в этом наборе включает гибридизационную последовательность, способную специфически гибридизироваться с одним ампликоном в условиях гибридизации, когда этот ампликон присутствует в этом растворе;
(c) генерирование удлиненных олигонуклеотидов, которые включают захватывающий агент, удлинением олигонуклеотидов, гибридизированных с этими ампликонами, одним или несколькими нуклеотидами, где один из этих одного или нескольких нуклеотидов является терминирующим нуклеотидом и один или несколько из этих нуклеотидов, добавленных к этим олигонуклеотидам, включают захватывающий агент;
(ά) контактирование этих удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой в условиях, в которых этот захватывающий агент взаимодействует с этой твердой фазой;
(е) высвобождение этих удлиненных олигонуклеотидов, которые взаимодействовали с твердой фазой, конкуренцией с конкурирующим агентом;
(ί) детектирование этих удлиненных олигонуклеотидов, высвобожденных в (е), массспектрометрией; посредством чего присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяется по присутствию или отсутствию соответствующего удлиненного олигонуклеотида.
- 62 027558
А1.1. Способ варианта А1, где:
(ί) масса одного вида олигонуклеотида детектируемо отличается от масс других видов олигонуклеотидов в этом наборе и (ίί) каждый вид олигонуклеотида специфически соответствует специфическому ампликону и посредством этого специфически соответствует специфической нуклеиновой кислоте-мишени.
А1.2. Способ для определения присутствия или отсутствия множества нуклеиновых кислотмишеней в композиции, который предусматривает:
(a) приготовление ампликонов нуклеиновых кислот-мишеней амплификацией этих нуклеиновых кислот-мишеней, или их частей, в условиях амплификации;
(b) контактирование этих ампликонов в растворе с набором олигонуклеотидов в условиях гибридизации, где:
(ί) каждый олигонуклеотид в этом наборе содержит гибридизационную последовательность, способную специфически гибридизироваться с одним ампликоном в условиях гибридизации, когда этот ампликон присутствует в этом растворе, (ίί) каждый олигонуклеотид в этом наборе содержит распознаваемый по массе тэг, расположенный 5' (слева) от гибридизационной последовательности, (ίίί) масса этого распознаваемого по массе тэга одного олигонуклеотида детектируемо отличается от масс распознаваемых по массе тэгов других олигонуклеотидов в этом наборе, (ίν) каждый распознаваемый по массе тэг специфически соответствует специфическому ампликону и посредством этого специфически соответствует специфической нуклеиновой кислоте-мишени;
(c) генерирование удлиненных олигонуклеотидов, которые содержат захватывающий агент, удлинением олигонуклеотидов, гибридизовавшихся с этим ампликоном, одним или несколькими нуклеотидами, где один из этих одного или нескольких нуклеотидов является терминирующим нуклеотидом и один или несколько из этих нуклеотидов, добавленных к этим олигонуклеотидам, включают захватывающий агент;
(ά) контактирование этих удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой в условиях, в которых этот захватывающий агент взаимодействует с этой твердой фазой;
(е) высвобождение этих распознаваемых по массе тэгов в ассоциации с этими удлиненными олигонуклеотидами, которые взаимодействуют с твердой фазой, из этой фазы конкуренцией с конкурирующим агентом; и (ί) детектирование распознаваемых по массе тэгов, высвобожденных в (е), масс-спектрометрией; посредством чего присутствие или отсутствие каждой нуклеиновой кислоты-мишени определяется по присутствию или отсутствию соответствующего распознаваемого по массе тэга.
А2. Способ любого из вариантов А1-А1.2, где конкуренция с конкурирующим агентом предусматривает контактирование этой твердой фазы с конкурирующим агентом.
А3. Способ любого из вариантов А1-А2, где этот конкурирующий агент состоит из свободного захватывающего агента или его конкурирующего фрагмента или мультимера.
А3.1. Способ варианта А3, где этот конкурирующий агент состоит из свободного захватывающего агента.
А4. Способ любого из вариантов А1-А3.1, где этот нуклеотид, который содержит захватывающий агент, является захватывающим агентом, конъюгированным с нуклеотидтрифосфатом.
А5. Способ варианта А4, где этот нуклеотидтрифосфат является дидезоксинуклеотидтрифосфатом.
А6. Способ любого из вариантов А1-А5, где этот захватывающий агент содержит пару связывания.
А7. Способ любого из вариантов А1-А6, где этот захватывающий агент содержит биотин.
А8. Способ варианта А7, где эта твердая фаза содержит авидин или стрептавидин.
А9. Способ любого из вариантов А1-А6, где этот захватывающий агент содержит авидин или стрептавидин.
А10. Способ варианта А9, где эта твердая фаза содержит биотин.
А11. Способ любого из вариантов А1-А10, где высвобождение распознаваемых по массе тэгов посредством конкуренции со свободным захватывающим агентом проводят в условиях повышенной температуры.
А12. Способ варианта А11, где эти условия повышенной температуры предусматривают обработку в течение 5 мин приблизительно при 90°С.
А13. Способ любого из вариантов А1-А12, где (с) проводят в одном контейнере, и этот способ дополнительно предусматривает перенос распознаваемых по массе тэгов в другой контейнер между (е) и (ί).
А14. Способ любого из вариантов А1-А13, где этот раствор, содержащий ампликоны, полученные в (а), обрабатывают агентом, который удаляет терминальные фосфаты из любых нуклеотидов, не включенных в эти ампликоны.
А15. Способ любого из вариантов А1-А14, где этот терминальный фосфат удаляют контактированием этого раствора с фосфатазой.
А16. Способ варианта А15, где эта фосфатаза является щелочной фосфатазой.
- 63 027558
А17. Способ варианта А16, где эта щелочная фосфатаза является щелочной фосфатазой креветок.
А18. Способ любого из вариантов А1-А17, где эти терминальные нуклеотиды в удлиненных олигонуклеотидах содержат захватывающий агент.
А19. Способ любого из вариантов А1-А18, где один или несколько нетерминальных нуклеотидов в этих удлиненных олигонуклеотидах содержат этот захватывающий агент.
А20. Способ любого из вариантов А1-А19, где эта гибридизационная последовательность имеет длину от приблизительно 5 до приблизительно 200 нуклеотидов.
А21. Способ любого из вариантов А1-А20, где эта твердая фаза выбрана из плоской поверхности, бусины, кремниевого чипа или комбинаций предыдущего.
А22. Способ любого из вариантов А1-А21, где эта твердая фаза является парамагнитной.
А23. Способ любого из вариантов А1-А22, где этой масс-спектрометрией является выполняемая на основе матрикса лазерная десорбционная/ионизационная (ΜΑΣΌΙ) масс-спектрометрия.
А24. Способ любого из вариантов А1-А23, где этой масс-спектрометрией является электрораспылительная (Е8) масс-спектрометрия.
А25. Способ любого из вариантов А1-А24, где детектируется присутствие или отсутствие от приблизительно 1 до приблизительно 50 или более нуклеиновых кислот-мишеней.
А26. Способ любого из вариантов А1-А25, где этот распознаваемый по массе тэг состоит из нуклеотидов.
А27. Способ любого из вариантов А1-А26, где этот распознаваемый по массе тэг является нуклеотидным компомером.
А28. Способ варианта А27, где этот нуклеотидный компомер имеет длину от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 150 нуклеотидов.
А29. Способ любого из вариантов А1-А28, где этими нуклеиновыми кислотами-мишенями являются геномные ДНК.
А30. Способ варианта А29, где эта геномная ДНК является геномной ДНК человека.
А31. Способ любого из вариантов А1-А30, где детектирование в (ί) предусматривает соотношение сигнал/шум, большее, чем соотношение сигнал/шум для способа, в котором высвобождение не предусматривает конкуренцию с конкурирующим агентом.
В1. Способ для детектирования присутствия, отсутствия или количества множества генетических вариантов в композиции, предусматривающий:
(a) приготовление множества ампликонов, полученных из множества видов нуклеиновых кислотмишеней, или их частей, где каждый вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит первый вариант и второй вариант;
(b) гибридизацию ампликонов с видами олигонуклеотидов, где каждый вид олигонуклеотида гибридизируется с ампликоном, полученным из вида нуклеиновой кислоты-мишени, с генерированием посредством этого гибридизированных видов олигонуклеотидов; и (c) контактирование этих гибридизированных видов олигонуклеотидов с композицией удлинения, содержащей один или несколько терминирующих нуклеотидов, в условиях удлинения; где:
(ί) по меньшей мере один из этих одного или нескольких терминирующих нуклеотидов содержит захватывающий агент, и (ίί) эти гибридизированные виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются с первым вариантом, удлиняются терминирующим нуклеотидом, и гибридизированные виды олигонуклеотидов, которые гибридизируются со вторым вариантом, не удлиняются терминирующим нуклеотидом, с генерированием посредством этого видов удлиненных олигонуклеотидов;
(ά) захватывание видов удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой, которая захватывает агент захвата;
(е) высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов, связанных с твердой фазой в (ά), из этой твердой фазы; и (ί) детектирование массы каждого вида удлиненного олигонуклеотида, высвобожденного из твердой фазы в (е), масс-спектрометрией; посредством чего детектируется присутствие, отсутствие или количество этих генетических вариантов.
В2. Способ варианта 1, где каждый вид олигонуклеотида содержит распознаваемый по массе тэг, расположенный 5' (слева) от гибридизационной последовательности.
В3. Способ варианта 1 или 2, где этот первый вариант является менее изобилующей вариацией и этот второй вариант является более изобилующей вариацией.
В4. Способ любого из вариантов 1-3, где эти генетические варианты являются вариантами с однонуклеотидными полиморфизмами (8ЫР), первый вариант является менее изобилующим аллелем и второй вариант является более изобилующим аллелем.
В5. Способ любого из вариантов 1-4, где один или несколько терминирующих нуклеотидов состоят из одного терминирующего нуклеотида.
В6. Способ любого из вариантов 1-4, где один или несколько терминирующих нуклеотидов состоят из двух терминирующих нуклеотидов.
- 64 027558
Β7. Способ любого из вариантов 1-4, где один или несколько терминирующих нуклеотидов состоят из трех терминирующих нуклеотидов.
Β8. Способ любого из вариантов 1-4, где один или несколько терминирующих нуклеотидов независимо выбраны из άάΑТΡ, ййОТР, ййСТР, ййТТР и ййИТР.
Β9. Способ любого из вариантов 1-4, где композиция удлинения содержит нетерминирующий нуклеотид.
Β10. Способ варианта 9, где эта композиция удлинения содержит один или несколько нуклеотидов удлинения, причем нуклеотиды удлинения не содержат захватывающий агент.
Β11. Способ любого из вариантов 1-10, где высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов предусматривает контактирование твердой фазы с высвобождающим агентом.
Β12. Способ варианта 11, где этот захватывающий агент содержит биотин или аналог биотина, твердая фаза содержит стрептавидин и высвобождающий агент содержит свободный биотин или аналог биотина.
Β13. Способ вариантов 11 или 12, где этот высвобождающий агент имеет более высокую аффинность в отношении твердой фазы, чем захватывающий агент.
Β14. Способ любого из вариантов 11-13, где высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов в (е) предусматривает нагревание от приблизительно 30 до приблизительно 100°С.
Β15. Способ варианта 14, предусматривающий нагревание от приблизительно 60 до приблизительно 100°С.
Β16. Способ варианта 14, предусматривающий нагревание от приблизительно 89 до приблизительно 100°С.
Β17. Способ варианта 14, предусматривающий нагревание до приблизительно 90°С.
Β18. Способ любого из вариантов 1-17, где это множество видов нуклеиновых кислот-мишеней равно 20 или более видам нуклеиновых кислот-мишеней.
Β19. Способ любого из вариантов 1-18, где это множество видов нуклеиновых кислот-мишеней равно 200 или более видам нуклеиновых кислот-мишеней.
Β20. Способ любого из вариантов 1-19, где это множество видов нуклеиновых кислот-мишеней равно 200-300 видам нуклеиновых кислот-мишеней.
Β21. Способ любого из вариантов 1-20, где условия удлинения в (с) предусматривают проведение циклов 20-300 раз.
Β22. Способ любого из вариантов 1-19, где условия удлинения в (с) предусматривают проведение циклов 200-300 раз.
Β23. Способ любого из вариантов 1-22, где реакция удлинения включает конкурирующий олигонуклеотид.
Β24. Способ любого из вариантов 1-23, предусматривающий промывание твердой фазы после захвата вида удлиненного олигонуклеотида.
В25. Вариант В24, где это промывание удаляет соли, которые производят мешающие аддукты в анализе масс-спектрометрии.
Β26. Вариант В25, где удлиненные олигонуклеотиды не контактируют с ионообменной смолой.
Β27. Способ любого из вариантов В1-В26, где детектирование в (Г) является соотношением сигнал/шум, большим, чем соотношение сигнал/шум для детектирования после высвобождения без конкуренции с конкурирующим агентом.
Β28. Способ любого из вариантов В1-В27, где соотношение сигнал/шум для удлинения только мутантного аллеля является большим, чем соотношение сигнал/шум для удлинения аллеля дикого типа и мутантного аллеля.
Β29. Способ любого из вариантов В1-В28, где чувствительность детектирования мутантного аллеля в (Г) является большей для удлинения только мутантного аллеля, чем для удлинения дикого типа и мутантного аллеля.
Β30. Способ любого из вариантов В1-В29, где вид удлиненного олигонуклеотида второго варианта не детектируется.
Β31. Способ любого из вариантов В12-В30, где свободный биотин или аналог биотина добавляют в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 100 мкг/мл.
Β32. Вариант В31, где свободный биотин или аналог биотина добавляют в концентрации приблизительно 25 мкг/мл.
Β33. Способ любого из вариантов В1-В32, где эта композиция содержит синтетическую матрицу, и количество и/или процент первого варианта в этой композиции определяется, где эта синтетическая матрица содержит вариант, другой, чем первый вариант и второй вариант, и гибридизируется с одними и теми же видами олигонуклеотидов.
Полное содержание каждого патента, заявки на патент, публикации и документа, на которые делаются ссылки здесь, включены в настоящее описание в качестве ссылки. Цитирование вышеуказанных патентов, заявок на патенты, публикации и документы не является признанием того, что любая из предыдущих ссылок является относящейся к предшествующему уровню техники, и не учреждает какого- 65 027558 либо признания в отношении содержания или даты этих публикаций или документов.
Могут быть произведены модификации в отношении предыдущего описания без отклонения от основных аспектов этой технологии. Хотя эта технология была описана достаточно подробно со ссылкой на один или несколько конкретных вариантов, специалистам с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что могут быть произведены изменения в отношении вариантов, конкретно описанных в этой заявке, но эти модификации и улучшения находятся в пределах объема и идеи этой технологии.
Эта технология, иллюстративно описанная здесь, может быть удобным образом использована на практике в отсутствие каких-либо элементов, не описанных конкретно здесь. Так, например, в каждом случае здесь любой из терминов содержащий, состоящий по существу из и состоящий из может быть заменен любым из двух других терминов. Эти термины и выражения, которые были использованы в качестве терминов описания, а не ограничения, и применение таких терминов и выражений не исключает любых эквивалентов признаков, показанных и описанных, или их частей, и различные модификации являются возможными в пределах объема заявленной технологии. Термин в единственном числе может относиться к одному из множества элементов или к множеству элементов (например, реагент может обозначать один или более реагентов), если только в контексте не описывается ясно любой один из этих элементов или более чем один из этих элементов. Термин приблизительно в данном контексте относится к величине в пределах 10% лежащего в основе параметра (т.е. плюс или минус 10%), и применение термина приблизительно в начале ряда величин (т.е. приблизительно 1, 2 и 3 обозначает приблизительно 1, приблизительно 2 и приблизительно 3). Например, масса приблизительно 100 граммов может включать в себя массы между 90 и 110 г. Таким образом, должно быть понятно, что, хотя данная технология была конкретно раскрыта с использованием репрезентативных вариантов и необязательных признаков, модификация и вариация этих идей, описанных здесь, может быть пересортирована квалифицированными в данной области специалистами, и такие модификации и вариации считаются находящимися в пределах объема этой технологии.
Варианты этой технологии представлены в формуле изобретения, которая следует далее.
- 66 027558
Список последовательностей <110> 5Ε01ΙΕΝΟΜ, 1ЫС.
<120> ПРОДУКТЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ <130> 112254 РСТ <140> РСТ/1152012/038710 <141> 2012-05-18 <150> 115 61/488,082 <151> 2011-05-19 <160> 339 <170> Рагеппп уегзтоп 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 1 ддааасадсг асдассасдд саастдсасс дгдадгддс <210> 2 <211> 23 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 2 сасдссдт гасаасдгсд где <210> 3 <211> 19 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 3 ддааасадсг асдассагд
Синтетический
Синтетический <210> 4 <211> 19 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 67 027558 праймер <400> 4 сасдасдпд гаааасдас <210> 5 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 5 тсааадаатт агагддсгаа дд
Синтетический <210> 6 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 6 дадсгдсгдс ассататтсс гдаас
Синтетический <210> 7 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 7 дссссдаадд сддсдсасда сасдд
Синтетический <210> 8 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 8 дадсгдсгдс ассагаггсс гдаас
Синтетический <210> 9 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
- 68 027558 <221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 9 ссагдгсага сассдсспс ададс <210> 10 <211> 45 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 10 дадсгдсгдс ассагагтсс гдаасгсгса аасгссадад гддсс
Синтетический <210> 11 <211> 47 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 11 дадсгдсгдс ассагагтсс гдаасадсад тдсттсасас астад
Синтетический <210> 12 <211> 46 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 12 дадсгдсгдс ассагагтсс гдаасдгссг датттстсст ссадад
Синтетический <210> 13 <211> 48 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 13 дадсгдсгдс ассагапсс гдаассссгс ггдсагаааа гдггдсад
Синтетический <210> 14 <211> 53 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 69 027558 <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 14 дадсгдсгдс ассататтсс гдаассагда ададааагад ггсгдаддгг ссс 53 <210> 15 <211> 51 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 15 дадсгдсгдс ассататтсс гдаассгдаг адтааттдта сгдгдадгдд с 51 <210> 16 <211> 62 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 16 дадсгдсгдс ассататтсс гдаассгааа аасттатаат тттаатадад ддтдсаттда 60 ад 62 <210> 17 <211> 45 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 17 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасасдта адсасасагс сссад 45 <210> 18 <211> 52 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 18 дадсгдсгдс ассагапсс гдаасдагп сгагссгсаа ааадспагд дд 52
- 70 027558 <210> 19 <211> 56 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 19 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасдагда атсатсттас тстттадтат ддттдс 56 <210> 20 <211> 46 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 20 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасссгдс сстттадаса ддаагс <210> 21 <211> 46 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 21 дадсгдсгдс ассататтсс гдаассагсг дссттдатст сссттс
Синтетический <210> 22 <211> 46 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 22 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасссгтс атдстсттст гссгдс
Синтетический <210> 23 <211> 78 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 23 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасдсгаг ттттатаата гпапаш тааатааттс 60
- 71 027558 аааагасааа адгаасас 78 <210> 24 <211> 51 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 24 дадсгдсгдс ассататтсс гдаассгада саттдддаат асасаддадс д 51 <210> 25 <211> 46 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 25 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасаассг дгасссадаг дсадгс 46 <210> 26 <211> 47 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 26 дадсгдсгдс ассататтсс тдаассттст ааддсттсад ддагдас 47 <210> 27 <211> 45 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 27 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасдгасг гдаааадаад сссдд 45 <210> 28 <211> 47 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 72 027558 праймер <400> 28 дадсгдсгдс ассагапсс гдаасдагсг сгсгассасс ассаддд <210> 29 <211> 48 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 29 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасаддад тсастасатт садддагд
Синтетический <210> 30 <211> 47 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 30 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасдсдтс гсаддгдааа дгдасгс
Синтетический <210> 31 <211> 49 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 31 дадсгдсгдс ассататтсс тдаассттса ддаттатаст ддсадттдс
Синтетический <210> 32 <211> 48 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 32 дадсгдсгдс ассататтсс тдаасдсттт даагддгагс асссгсас
Синтетический <210> 33 <211> 45 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
- 73 027558 <221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 33 дадстдстдс ассатагтсс тдаасааасд садтсатсас тстсс <210> 34 <211> 46 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 34 дадстдстдс ассатагтсс тдаасдддад сдддаатстт ааатсс
Синтетический <210> 35 <211> 46 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 35 дадстдстдс ассатагтсс тдаасдсаас аддапсдас тааддс
Синтетический <210> 36 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <400> 36 дадстдстдс ассатагтсс тдаассатдт ататадтттд дстадсадтд ааад <210> 37 <211> 50 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 37 дадстдстдс ассатагтсс тдаасдаатс стастсстаа ддтдатдттд <210> 38 <211> 49 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 74 027558 <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 38 дадсгдсгдс ассататтсс тдаассттса ссадсаадса астасаттд <210> 39 <211> 46 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности праймер <400> 39 дадсгдсгдс ассататтсс сдаасдддтс саааасгдсг сагдгс
Синтетический <210> 40 <211> 45 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности праймер <400> 40 дадсгдсгдс ассататтсс тдаасттттт ссатддсттт гдддс
Синтетический <210> 41 <211> 48 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 41 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасгдгас аддсаддссс гададагд
Синтетический <210> 42 <211> 47 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 42 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасдгадс сааттссттс адтдсад
Синтетический <210> 43
- 75 027558 <211> 45 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 43 дадсгдсгдс ассататтсс гдаасадддс ттдтттсадс ттдад <210> 44 <211> 50 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 44 дадсгдсгдс ассататтсс гдаассаааа дшгдта ддтдссттсс
Синтетический <210> 45 <211> 50 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 45 ддддадгдга ддттстддта сссаддсгсг дааддсддгд гагдасагдд
Синтетический <210> 46 <211> 76 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <400> 46 сагсассгаг агсаггаггг астаааттат шггсггса аастдастта ддсгсгдаад 60 дсддсдсасд асасдд 76 <210> 47 <211> 56 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 47
- 76 027558 сссгггтс стаааадссс ссааасттп ддстстдаад дсддтдтатд асатдд 56 <210> 48 <211> 53 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 48 сттттдтдад стддсттд стсатстсдс тстдааддсд дтдтатдаса тдд 53 <210> 49 <211> 59 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 49 сстатттдад ттттдстттт ттдттттддт стсддстстд ааддсддтдт атдасатдд 59 <210> 50 <211> 56 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 50 датадаса дадтсттаст стдтсассад ддстстдаад дсддтдтатд асатдд 56 <210> 51 <211> 58 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 51 статастстт дстсдтддад ттаатстсад адддстстда аддсддтдта тдасатдд 58 <210> 52 <211> 49 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 77 027558 <400> 52 сксадаадкд кддаасадск дсссдскскд ааддсддкдк акдасакдд 49 <210> 53 <211> 58 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 53 сккдддаскк саддкадаск тадтттдаас аксдскскда аддсддкдка гдасакдд 58 <210> 54 <211> 52 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 54 ссакскасак кадсккасса дддскдсдск скдааддсдд кдкакдасак дд 52 <210> 55 <211> 53 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 55 скскскаакд ккссададаа ассссадддс кскдааддсд дкдкакдаса кдд 53 <210> 56 <211> 52 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 56 сдккккскка кдкдкскддс сксакссдск скдааддсдд кдкакдасак дд 52 <210> 57 <211> 49 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 78 027558 <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 57 ддадсдсгсс агдааасаса асаддссстд ааддсддгдс асдасасдд 49 <210> 58 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 58 дттдасадтт даттттдтаа гдссгссасд сгсгдааддс ддгдгасдас асдд 54 <210> 59 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 59 сда!д!да1с с1д!д!сааа саагдасддд с!с!дааддс ддсдса!дас а!дд 54 <210> 60 <211> 58 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 60 сгдаадддаа тддстддттт ттаатттдта дгддсгсгда аддсддсдга гдасагдд 58 <210> 61 <211> 52 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 61 дааддгддда ггасдссгаа стттадддст сгдааддсдд гдгагдасаг дд 52 <210> 62 <211> 45 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 79 027558 <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 62 даспсагдд сгддсадааа дсгсгдаадд сддгдгагда сагдд 45 <210> 63 <211> 51 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 63 сгдсагпсг асгддгааса сдсдссдсгс гдааддсддг дгагдасагд д 51 <210> 64 <211> 67 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 64 ссапсаддс дгсасгта ггагдаггаг ссааддссад гддсгсгдаа ддсддгдгаг 60 дасагдд 67 <210> 65 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 65 саддсссадс гсггдадггг сагсстсд сгсгдааддс ддгдгагдас асдд 54 <210> 66 <211> 59 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 66 ссгсгсгдп пдпдадаа асссасссп: ддгсдсгсгд ааддсддсдс асдасасдд 59 <210> 67
- 80 027558 <211> 56 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 67 дсаааагддд татддтттад ссадааасаг ддсгсгдаад дсддгдгагд асагдд 56
<210> 70 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 70 дстттдтдтд сааагсассг аттттсстдд сгсгдааддс ддгдгагдас асдд 54 <210> 71 <211> 56 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 71 ддгдададаа гагдааадса ааасадсаас сдсгсгдаад дсддгдгагд асагдд 56
- 81 027558 <210> 72 <211> 53 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 72 дддсгагдга дасасттсаа аддтдттсдс гсгдааддсд дгдгагдаса едд 53 <210> 73 <211> 53 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 73 дтттдстста дсгсаагддс стсттааддс гегдааддед дгдгагдаса едд 53 <210> 74 <211> 52 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 74 ссаасасадс сагсгдагсс сагсгссдсг егдааддедд гдгагдасаг дд 52 <210> 75 <211> 53 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 75 дгаддсаадд стдттстттт ттдтдттддс гегдааддед дгдгагдаса едд 53 <210> 76 <211> 53 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 76
- 82 027558 ссагагдсад гтгдпп: сссадгдсдс гсгдааддсд дгдгагдаса едд 53 <210> 77 <211> 67 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 77 сассагаага дтттатстдс ттстастааа аттаттаттд дсдсгсгдаа ддсддгдгаг 60 дасагдд 67 <210> 78 <211> 62 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 78 ссгсадаагд ааагсагдсг тттстдстаа тттдтаддст сгдааддсдд гдгагдасаг 60
62 <210> 79 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 79 ссттсадаса тассттддда ааагдгсадд сгсгдааддс ддгдгагдас асдд 54 <210> 80 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 80 ссггсггсаг ссссс 15 <210> 81 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 83 027558 <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 81 дсссагаадс сааса
Синтетический <210> 82 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 82 дгсссааддд ададс
Синтетический <210> 83 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 83 ддгааадссс сгсдаа
Синтетический <210> 84 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 84 сгссссассг дасссгд
Синтетический <210> 85 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 85 ттатддтдтс тттсссс
Синтетический <210> 86 <211> 17 <212> ДНК
- 84 027558 <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 86 сааадсаддс дсасдаа <210> 87 <211> 18 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 87 асттсстссс ггсггасг
Синтетический <210> 88 <211> 18 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 88 сссттттддс ттсстддд
Синтетический <210> 89 <211> 19 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 89 сссаттттдс дссатттат
Синтетический <210> 90 <211> 19 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 90 ддагсасагс дтдттадас
Синтетический <210> 91
- 85 027558 <211> 19 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 91 ддаадасдсг татсатддт <210> 92 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 92 сссттдсатд сагдсдсаса
Синтетический <210> 93 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 93 аддсаатада дддадтатса
Синтетический <210> 94 <211> 21 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 94 ааасттстсс стсадсстас с
Синтетический <210> 95 <211> 21 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 95 садааатаса тттдссаста ΐ 21
- 86 027558
<210> 96 <211> 21 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
<220> <221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер Синтетический
<400> 96 дсдстдтатс стсадададт а 21
<210> 97 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
<220> <221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер Синтетический
<400> 97 дддадаатдс атспш: сс 22
<210> 98 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
<220> <221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер Синтетический
<400> 98 ддатасттса адаатадтад ад 22
<210> 99 <211> 23 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
<220> <221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер Синтетический
<400> 99 сссасгссас ссссасдсса дсс 23
<210> 100 <211> 23 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
<220> <221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер Синтетический
<400> 100
- 87 027558 пгагшгс сагсасасдг агд <210> 101 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 101 тттстааатс сссасссддс дсад <210> 102 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 102 дсгсгсасса ттаастатас адса <210> 103 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 103 дттдасадтт сгссаадгсс адаг <210> 104 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 104 ддаттасада гдссггсггд ддса
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 105 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 88 027558 <400> 105 саатсааада аттататддс таадд 25 <210> 106 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 106 ссстттааса сстататддд тттттд 26 <210> 107 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 107 дсадсасадс сттдсстаса атдаса 26 <210> 108 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 108 дддсаттстд аддаааатаа тдтатд 26 <210> 109 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 109 ддасдададд тстдададтт тстдат 26 <210> 110 <211> 27 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 89 027558 <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 110 асагаасгсг садатаатта аадттдт <210> 111 <211> 27 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 111 атдттаасад ааадсасааг аааааса <210> 112 <211> 27 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 112 дддаддадад даассасаад ататтад <210> 113 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 113 сстддттттд тсттссстат ттастдат <210> 114 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 114 ддасаааадт тстдааттат ггддгггд
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 115 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 90 027558 <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 115 асдттддатд аааддсгдаг ссаддссатс <210> 116 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 116 асдттддатд ттдадасасд дсасадсдд <210> 117 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 117 асдттддатд ааддгаддсс тттаддадад <210> 118 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 118 асдттддатд асдсасаасс дгссгасгсс <210> 119 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 119 асдттддатд гдадссаддд агагссгаас
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 120 <211> 30 <212> ДНК
- 91 027558 <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 120 асдттддатд таатададдд тдсаттдаад <210> 121 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 121 асдттддатд ааадададад адатссстд <210> 122 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 122 асдттддатд састаатааа ддсадсстдт <210> 123 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 123 асдттддатд ддстстдатс ссттша д <210> 124 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 124 асдттддатд дсгтссгс ггстддга д
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 125
- 92 027558 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 125 асдккддакд ксксадкксс аасксакдсс <210> 126 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 126 асдккддакд адаакдкдсс ааададсад <210> 127 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 127 асдккддакд ссккаккдда ккскакдксс с <210> 128 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 128 асдккддакд асккддсдад кссссакккс
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 129 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 129 асдккддакд ксккдкскск кассксксад 30
- 93 027558 <210> 130 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 130 асдттддатд тдаддаттаа аддагсгддд <210> 131 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 131 асдттддатд даддсгссгс гасасаааад <210> 132 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 132 асдттддатд ттдстстаад дсддагдстд <210> 133 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 133 асдттддатд дтттасаасс гдгддсадас
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 134 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 134
- 94 027558 асдпддагд дааадгдасс сагсаадсад <210> 135 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 135 асдпддагд сгагддддаа сгдаагаадг д <210> 136 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 136 асдпддагд сааасгапд ассддссагд д <210> 137 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 137 асдпддагд дсададдт дадаааадад <210> 138 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 138 асдпддагд дгагагдссг дсасдсдд-сс
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 139 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по1е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 95 027558 <400> 139 асдттддатд дадддааада сстдсттста 30 <210> 140 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 140 асдттддатд дадааддстт тссадааттт д 31 <210> 141 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 141 асдттддатд саааадссад сгсасаааад 30 <210> 142 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 142 асдттддатд ттттдддссс стссататтс 30 <210> 143 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 143 асдттддатд сддагагдсг даатттдадд 30 <210> 144 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<221> источник
- 96 027558 <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 144 асдттддатд стттгдтсса тдтттддсад <210> 145 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 145 асдттддатд аддасадттд тсдтдадатд <210> 146 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 146 асдттддатд стдаддстдд дтаасттатс <210> 147 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 147 асдттддатд дсссгтддса сатадтассд <210> 148 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 148 асдттддатд ггддггагад адсдтссссд
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 149 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 97 027558 <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 149 асдттддатд ассссттаст ссаагаадтс <210> 150 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 150 асдттддатд ггсгсггсаа ассгсссатс <210> 151 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 151 асдттддатд гтсстсп: ссгасссстс <210> 152 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 152 асдттддатд гддсаасаса сдасгдгасг <210> 153 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 153 асдттддатд тдсттсссад дссасгассд
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 154 <211> 30 <212> ДНК
- 98 027558 <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 154 асдттддатд гссагдадгд саддасгасд <210> 155 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 155 асдттддатд сгссасдадс аададгагад <210> 156 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 156 асдттддатд агсссагасд дссаадаада <210> 157 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 157 асдттддатд асдадсаасд сссддсдстд <210> 158 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 158 асдттддатд гддгадссгс аадаасдстс
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 159
- 99 027558 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 159 асдттддатд даатдтдтаа аасааассад <210> 160 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 160 асдттддатд тдадссатдт ададастсад <210> 161 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 161 асдттддатд тстдсатссс ттаддттсас <210> 162 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 162 асдттддатд ассаадсаст дтасттттс
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 163 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 163 асдттддатд ттаататадт ссссадссас 30
- 100 027558 <210> 164 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 164 асдттддатд сгдгдсгдас сдадсадатд <210> 165 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 165 асдттддатд атстттдаад дсгссгсгдд <210> 166 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 166 асдттддатд дсатдтссс! атдадатсад <210> 167 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 167 асдттддатд ттаддсассс саадтттсад
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 168 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 168
- 101 027558 асдттддатд тдтадсатдт садссатсад <210> 169 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 169 асдттддатд дтадттдстт дтддттассд <210> 170 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 170 асдттддатд дадсааттса тттдтстсс <210> 171 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 171 асдттддатд ттттдттдтт тдддсаттдд <210> 172 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 172 асдттддатд дттсссатсс адтаатддад
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 173 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 102 027558 <400> 173 асдпддатд ссаасадтп пстаадд д 31 <210> 174 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 174 асдттддатд адаадстссд адааааддтд 30 <210> 175 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 175 асдттддатд татадссатт астдддсттд 30 <210> 176 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 176 асдттддатд ссстсттдса таааатдттд с 31 <210> 177 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 177 асдттддатд стссатдсаа ддстдтддс 29 <210> 178 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 103 027558 <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 178 асдттддатд сдттатсаад дастттдтдс <210> 179 <211> 31 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 179 асдттддатд даддттатст таттдтаасд с <210> 180 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 180 асдттддатд адассдсссс ттсссаддат <210> 181 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 181 асдттддатд ссассадаад садасдссдд <210> 182 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 182 асдттддатд ссатасдттс ааддаттддд
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 183 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 104 027558 <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 183 асдттддатд аддгдгдсаа дгдгсадаад <210> 184 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 184 асдттддатд дгагагсагд гссадгдаад
Синтетический <210> 185 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 185 ссассдссгс спссгсссаг сгссассстс га <210> 186 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 186 ссассдссга спссгсссаг сгссассстс гд <210> 187 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 105 027558 <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 187 ссасадсска спскксскас ссскссадсс дс <210> 188 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 188 ссасадсака спскксскас ссскссадсс дк <210> 189 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 189 саасадсаса апккдскакс сссасаакка сс <210> 190 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание
- 106 027558 <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 190 саасадааса аппдсгагс сссасаатта сс <210> 191 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 191 саааадааса аптдааастд садастсттс сс <210> 192 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 192 саааадаааа аптдааастд садастсттс ст <210> 193 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 193 аатаадаада апсдтстдат тддстттадт тс <210> 194
- 107 027558 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 194 дагаадаада апсдгсгдаг тддстттадт ΐΐ <210> 195 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 195 аагадсдада апдсгдгагс сгсадададг ас <210> 196 <211> 32 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 196 аагадсдада дпдсгдгагс сгсададад! а!
<210> 197 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 108 027558 <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 197 ссасссссдс ссппссссс асадгааасг гсса 34 <210> 198 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 198 ссассассдс сспттстссс асадгааасг гссд 34 <210> 199 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 199 ссассдсасг аспстсттст дсттсататт ссас 34 <210> 200 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 200
- 109 027558 ссасадсасг аспсгспсг дспсагап ссад 34 <210> 201 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 201 саасадсасс асппсапа тсасгсаа деда 34 <210> 202 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 202 саасадсаас асппсапа тсасгсаа дедд 34 <210> 203 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 203 саасадссас аапааасааа ссадааадгс асса 34 <210> 204 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 110 027558 <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 204 саасадатас аапааасааа ссадааадтс астд <210> 205 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 205 саааадатас аапатдтада дастсадтст спс <210> 206 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 206 саааадатад аапатдтада дастсадтст сттд <210> 207 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание
- 111 027558 <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 207 саааададад аапсдсааас садасссдсс аддс <210> 208 <211> 34 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 208 садаададад аапсдсааас садасссдсс аддс <210> 209 <211> 35 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поСе=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 209 садаададад адпсасдссс сасссссссс сасса <210> 210 <211> 35 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 210 саддададад адпсасдссс сасссссссс сассд <210> 211
- 112 027558
Синтетический <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 211 ссасссассд ссспгадгсс ссадссасса саааас <210> 212 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 212 ссасссдссд ссспсадссс ссадссасса саааад <210> 213 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 213 ссасссдссд ссспссссса аадссдаддд асссас <210> 214 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 113 027558 <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 214 ссасгсдссд сссппссса аадпдаддд аспас 36 <210> 215 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 215 ссасдсдссс таспааддст сстстддддс асаадс 36 <210> 216 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 216 саасдсдсас таспааддст сстстддддс асаадт 36 <210> 217 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 217
- 114 027558 саасаадсас саспдддгп тдттдтдсса дгадаа 36 <210> 218 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 218 саасаадсаа таспдддттт гдггдгдсса дгадад 36 <210> 219 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 219 саадаадааа гаапсгдсса аттаатсатс аасгсгс 37 <210> 220 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 220 ааадаадааа гаапссдсса апаагсатс ааскси 37 <210> 221 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 115 027558 <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 221 даадаадаса таапатдтса дссатсадсс тстсаса <210> 222 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 222 даадаадаса тадпатдтса дссатсадсс тстсасд <210> 223 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 223 даададдасд тадпдстстт ататстсата тдаасас <210> 224 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание
- 116 027558 <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 224 даддаддасд кадпдскскк акаксксака кдаасад <210> 225 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 225 ссасдсксск скаспасккк ксакддккак ксксадкс <210> 226 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 226 ссдсдсксск скаспасккк ксакддккак ксксадкк <210> 227 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 227 ссасдсдсас сааспкдккк кдкккдкккк дккккккс <210> 228
- 117 027558
Синтетический <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 228 ссасдсдсдс саасптдттт гдтдшг дтпп:
<210> 229 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 229 ссасдсдадс сааспссагс садгаагдда дгасадгс <210> 230 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 230 ссасдададс сааспссагс садгаагдда дгасадгд
Синтетический
Синтетический <210> 231 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 118 027558 <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 231 ссасдададс сааспадттт ггстаадд ддадгада 38 <210> 232 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по1е=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 232 саасдададс аааспадттт ггстаадд ддадгадд <210> 233 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 233 сааададааг аааспддаса аадасдадтд сдгагагс
Синтетический <210> 234 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 234
- 119 027558 сааададаат аааапддаса аадатдадтд сдтатап 38 <210> 235 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 235 сааададаат адаапддстт ддддтсссса пааадсда 39 <210> 236 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 236 садададаат адаапддстт ддддтсссса пааадсдд 39 <210> 237 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 237 аададсдада дадаптаста аадасдстта тсатддтс 38 <210> 238 <211> 38 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 120 027558 <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 238 аддадсдада дадаптаста аадасдссса тсатддтт <210> 239 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 239 сддададада ддадптдсаа ддстдтддст ддасаадас <210> 240 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 240 сддададдда ддадптдсаа ддстдтддст ддасаадат <210> 241 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: праймер
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание
- 121 027558 <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 241 сссдссссдс садтспаттс тататтадаа саастстстт с <210> 242 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 242 ссасдсдсдс садтспаттс тататтадаа саастстстт с <210> 243 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 243 ссасдсдсда садаспсаас дсагагдсас асдсасасас с
Синтетический <210> 244 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 244 ссасдсдада садаспсаас дсагагдсас агдсасасаг ΐ <210> 245
- 122 027558 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 245 саасдсдада садаспгдгс стттсссадд агдсгсааад с <210> 246 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 246 саасдсдада садаапгдгс стттсссадд агдсгсааад ΐ <210> 247 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 247 саасдадада садгападса дагдсгддсс ссагдсггса д
Синтетический
Синтетический <210> 248 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 123 027558 <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 248 саасдадада аадсападса дасдссддсс ссасдсссса ΐ 41 <210> 249 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 249 сааддадада аадаапсаас адсасаасад ссассаасса с <210> 250 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 250 сааддадада дадаапгааг адгасаасад статсаатта ΐ
Синтетический <210> 251 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 251
- 124 027558 сааддадада дададпгдгд саадгдгсад аадагдааса а 41 <210> 252 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 252 сдаддадада дададпгдгд саадсдссад аадагдааса д 41 <210> 253 <211> 42 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (17)..(17) <223> Дезоксиинозин <400> 253 ссассгасса ссадгспдаа дааагаадаа асаттдадас ас 42 <210> 254 <211> 42 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> модифицированное основание <222> (17)..(17) <223> Дезоксиинозин <400> 254 ссасагасса ссадгспдаа дааагаадаа асаттдадас ас 42 <210> 255 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 125 027558
Синтетический <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 255 ссассдссгс спс <210> 256 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 256 ссассдссга спс <210> 257 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 257 ссасадссга спс <210> 258 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание
- 126 027558 <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 258 ссасадсата спс <210> 259 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 259 саасадсаса апт <210> 260 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 260 саасадааса апт <210> 261 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 261 саааадааса апт <210> 262
- 127 027558 <211> 13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание Искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 262 саааадаааа апс <210> 263 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /по1е=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 263 аагаадаада апс <210> 264 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 264 дагаадаада апс <210> 265 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 128 027558 <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 265 аагадсдада апд 13 <210> 266 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (12)..(12) <223> Дезоксиинозин <400> 266 аагадсдада дпд <210> 267 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 267 ссасссссдс сспг
Синтетический <210> 268 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 268
- 129 027558 ссассассдс сспг 14 <210> 269 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 269 ссассдсасг аспс 14 <210> 270 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 270 ссасадсасг аспс 14 <210> 271 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 271 саасадсасс аспс 14 <210> 272 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 130 027558 <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 272 саасадсаас аспк <210> 273 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 273 саасадскас аапа <210> 274 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 274 саасадакас аапа <210> 275 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание
- 131 027558 <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 275 саааадагас аапа <210> 276 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 276 саааадагад аапа <210> 277 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 277 саааададад аапс <210> 278 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 278 садаададад аапс <210> 279
- 132 027558 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 279 садаададад адпт <210> 280 <211> 14 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (13)..(13) <223> Дезоксиинозин <400> 280 саддададад адпт <210> 281 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 281 ссасссассд ссспт <210> 282 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 133 027558 <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 282 ссасссдссд ссспс 15 <210> 283 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 283 ссасссдссд ссспс 15 <210> 284 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 284 ссасссдссд ссспс 15 <210> 285 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 285
- 134 027558 ссасдсдссс гаспа 15 <210> 286 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 286 саасдсдсас гаспа 15 <210> 287 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 287 саасаадсас гаспд 15 <210> 288 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 288 саасаадсаа гаспд 15 <210> 289 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 135 027558 <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 289 саадаадааа таапс <210> 290 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 290 ааадаадааа таапс <210> 291 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 291 даадаадаса таапа <210> 292 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание
- 136 027558 <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 292 даадаадаса гадпа <210> 293 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 293 даададдасд садпд <210> 294 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (14)..(14) <223> Дезоксиинозин <400> 294 даддаддасд садпд <210> 295 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 295 ссасдсгссг ссаспа <210> 296
- 137 027558 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 296 ссдсдсгссг ссаспа <210> 297 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 297 ссасдсдсас сааспс <210> 298 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 298 ссасдсдсдс сааспс <210> 299 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 138 027558 <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 299 ссасдсдадг сааспс 16 <210> 300 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 300 ссасдададс сааспс <210> 301 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 301 ссасдададс сааспа
Синтетический <210> 302 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 302
- 139 027558 саасдададт аааспа 16 <210> 303 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 303 сааададаат аааспд 16 <210> 304 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 304 сааададаат аааапд 16 <210> 305 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 305 сааададааг адаапд 16 <210> 306 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 140 027558
Синтетический <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 306 садададааг адаапд <210> 307 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 307 аададсдада дадапс <210> 308 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 308 аддадсдада дадапс <210> 309 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание
- 141 027558 <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 309 сддададада ддадпс <210> 310 <211> 16 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (15)..(15) <223> Дезоксиинозин <400> 310 сддададдда ддадпс <210> 311 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 311 сссдсгссдс садгспа <210> 312 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 312 ссасдсдсдс садгспа <210> 313
- 142 027558 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 313 ссасдсдсда садасп!
<210> 314 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 314 ссасдсдада садаспг <210> 315 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 315 саасдсдада садаспг <210> 316 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 143 027558 <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 316 саасдсдада садаапс 17 <210> 317 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 317 саасдадада садгапа <210> 318 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 318 саасдадада аадгапа <210> 319 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 319
- 144 027558 сааддадада аадаапг 17 <210> 320 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 320 сааддадада дадаапс 17 <210> 321 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 321 сааддадада дададпг 17 <210> 322 <211> 17 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (16)..(16) <223> Дезоксиинозин <400> 322 сдаддадада дададпг 17 <210> 323 <211> 18 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 145 027558 <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> модифицированное основание <222> (17)..(17) <223> дезоксиинозин <400> 323 ссасскасса ссадкспд <210> 324 <211> 18 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: олигонуклеотид
Синтетический <220>
<221> модифицированное основание <222> (17)..(17) <223> Дезоксиинозин <400> 324 ссасакасса ссадкспд <210> 325 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 325 асдккддакд кассадаасс касасксссс
Синтетический <210> 326 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поке=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 326 асдккддакд асдкаадсас асакссссад
Синтетический <210> 327 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 146 027558 <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 327 асдттддатд ссссааассс сададсддсс <210> 328 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 328 асдттддатд адстдттсса састтстдад <210> 329 <211> 21 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 329 тттстсссса ссгдасссгд с <210> 330 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поге=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 330 ттттстсссс ассгдасссг дг
Синтетический
Синтетический
Синтетический <210> 331 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> источник <223> /по!е=Описание комбинации молекул днк/рнк: Синтетический праймер <400> 331
- 147 027558 ссасссссад дидсасдсас дсдсасас 28 <210> 332 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <220>
<221> источник <223> /посе=Описание комбинации молекул днк/рнк: Синтетический праймер <400> 332 ггашхсса ддидсасдса сдсдсасад 29 <210> 333 <211> 9 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /посе=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 333
ТТТсТсссс 9 <210> 334 <211> 10 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 334
ГГГГСГСССС 10 <210> 335 <211> 12 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> источник <223> /поте=Описание комбинации молекул днк/рнк: Синтетический олигонуклеотид <400> 335
ТТаТТсссад ди 12
- 148 027558 <210> 336 <211> 13 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> источник <223> /поте=Описание комбинации молекул днк/рнк: Синтетический олигонуклеотид <400> 336 ттатттссса дди 13
<210> 339 <211> 21 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /поте=Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 339 асссастсса тсдадатттс а 21
- 149 027558

Claims (10)

1. Способ детектирования присутствия, отсутствия или количества множества генетических вариантов в композиции, предусматривающий:
(a) приготовление множества ампликонов, произведенных из множества видов нуклеиновых кислот-мишеней или их частей, где каждый вид нуклеиновой кислоты-мишени содержит первый вариант и второй вариант, где первый вариант является менее изобилующей вариацией и второй вариант является более изобилующей вариацией;
(b) гибридизацию ампликонов с видами олигонуклеотидов, где каждый вид олигонуклеотида гибридизируется с ампликоном, произведенным из вида нуклеиновой кислоты-мишени, и генерирование посредством этого гибридизированных видов олигонуклеотидов;
(c) контактирование гибридизированных видов олигонуклеотидов с композицией удлинения, содержащей один или несколько терминирующих нуклеотидов, в условиях удлинения; где:
(ί) один или несколько терминирующих нуклеотидов включает захватывающий агент, содержащий авидин, стрептавидин или биотин, и (ίί) виды гибридизированных олигонуклеотидов, которые гибридизируются с первым вариантом, удлиняются терминирующим нуклеотидом и виды гибридизированных олигонуклеотидов, которые гибридизируются со вторым вариантом, не удлиняются терминирующим нуклеотидом с генерированием посредством этого видов удлиненных олигонуклеотидов;
(ά) захватывание видов удлиненных олигонуклеотидов с твердой фазой, содержащей связывающий партнер захватывающего агента в (с), где связывающий партнер выбран из группы, состоящей из авидина, стрептавидина и биотина;
(е) высвобождение видов удлиненных олигонуклеотидов, связанных с твердой фазой в (ά), из твердой фазы путем контактирования твердой фазы при повышенных температурных условиях с конкурирующим агентом, содержащим свободную форму захватывающего агента, который взаимодействует с твердой фазой в (ά); и (ί) детектирование каждого из видов удлиненного олигонуклеотида, высвобожденного из твердой фазы в (е), посредством чего детектируется присутствие, отсутствие или количество этих генетических вариантов.
2. Способ по п.1, где захватывающий агент содержит биотин, твердая фаза содержит стрептавидин и высвобождающий агент содержит свободный биотин.
3. Способ по п.1, где генетические варианты являются вариантами с однонуклеотидными полиморфизмами (8ΝΡ), первый вариант является менее изобилующим аллелем и второй вариант является более изобилующим аллелем.
4. Способ по п.1, где детектирование каждого из видов удлиненных олигонуклеотидов осуществляется путем определения массы каждого из видов удлиненных олигонуклеотидов с помощью массспектрометрии.
5. Способ по п.1, где каждый из видов олигонуклеотидов включает различаемую по массе метку, расположенную в 5' положении последовательности гибридизации.
6. Способ по п.1, где множество видов нуклеиновых кислот-мишеней составляет 20 или более видов нуклеиновых кислот-мишеней.
7. Способ по п.1, где соотношение сигнал/шум или чувствительность для удлинения только мутантного аллеля является большим, чем соотношение сигнал/шум и/или чувствительность для удлинения дикого типа и мутантного аллеля.
8. Способ по п.1, где повышенные температурные условия составляют от приблизительно 80 до приблизительно 100°С.
9. Способ по п.1, где композиция содержит синтетическую матрицу и количество и/или процент первого варианта в композиции определяется, где синтетическая матрица содержит вариант, отличный от первого варианта и второго варианта, и гибридизируется с одними и теми же видами олигонуклеотидов.
10. Способ по п.1, где один или несколько терминирующих нуклеотидов содержат один или несколько ациклических терминаторов.
EA201391723A 2011-05-19 2012-05-18 Способ обнаружения мультиплексных нуклеиновых кислот EA027558B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161488082P 2011-05-19 2011-05-19
PCT/US2012/038710 WO2012159089A1 (en) 2011-05-19 2012-05-18 Products and processes for multiplex nucleic acid identification

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391723A1 EA201391723A1 (ru) 2014-06-30
EA027558B1 true EA027558B1 (ru) 2017-08-31

Family

ID=46147797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391723A EA027558B1 (ru) 2011-05-19 2012-05-18 Способ обнаружения мультиплексных нуклеиновых кислот

Country Status (8)

Country Link
US (4) US10604791B2 (ru)
EP (1) EP2710144B1 (ru)
JP (2) JP6040227B2 (ru)
CN (2) CN103717751A (ru)
AU (1) AU2012254985C1 (ru)
CA (1) CA2835942C (ru)
EA (1) EA027558B1 (ru)
WO (1) WO2012159089A1 (ru)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2545189B1 (en) 2010-03-08 2018-01-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Full cold-pcr enrichment with reference blocking sequence
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
DK2691541T3 (en) 2011-03-31 2018-01-22 Dana Farber Cancer Inst Inc PROCEDURE FOR ENRICHMENT OF SINGLE DRAWED MUTANTS SEQUENCES FROM A MIXTURE OF WILD TYPE AND MUTANTS
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
CA2835942C (en) 2011-05-19 2019-01-22 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification
EP2710172B1 (en) * 2011-05-20 2017-03-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
EP2909337B1 (en) 2012-10-17 2019-01-09 Spatial Transcriptomics AB Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
EP4067505A1 (en) 2013-03-15 2022-10-05 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for nucleic acid extraction
LT3013983T (lt) 2013-06-25 2023-05-10 Prognosys Biosciences, Inc. Erdviniai koduoti biologiniai tyrimai, naudojant mikrofluidinį įrenginį
WO2015138774A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP4321627A3 (en) 2015-04-10 2024-04-17 10x Genomics Sweden AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
CN107787371B (zh) * 2015-04-24 2022-02-01 基纳生物技术有限公司 检测和定量次要变体的并行式方法
CN114540470A (zh) 2015-04-24 2022-05-27 基纳生物技术有限公司 用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法
US11725230B2 (en) 2015-06-24 2023-08-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Selective degradation of wild-type DNA and enrichment of mutant alleles using nuclease
CA3006994A1 (en) 2015-12-16 2017-06-22 Fluidigm Corporation High-level multiplex amplification
WO2018025412A1 (ja) 2016-08-05 2018-02-08 堺ディスプレイプロダクト株式会社 駆動回路及び表示装置
EP3512947B1 (en) * 2016-09-15 2021-10-20 ArcherDX, LLC Methods of nucleic acid sample preparation
CA3042391A1 (en) * 2016-11-02 2018-05-11 ArcherDX, Inc. Methods of nucleic acid sample preparation for immune repertoire sequencing
CA3046953A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for molecular barcoding of dna molecules prior to mutation enrichment and/or mutation detection
EP3802867A1 (en) * 2018-06-01 2021-04-14 Agena Bioscience, Inc. Products and processes for nucleic acid detection and quantification
CN108913791A (zh) * 2018-06-26 2018-11-30 福建医科大学孟超肝胆医院 一种基于靶标基因MassARRAY耐药检测方法
WO2020031156A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Speedx Pty Ltd Multiplex detection of nucleic acids
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US20220064630A1 (en) 2018-12-10 2022-03-03 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays using deconvolution
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
CN110144399B (zh) * 2019-04-09 2021-12-03 中源维康(天津)医学检验所有限公司 检测人类循环肿瘤dna中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
ES2982420T3 (es) 2019-12-23 2024-10-16 10X Genomics Inc Métodos para el análisis espacial mediante el uso de la ligazón con plantilla de ARN
US20210190770A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
CN115916999A (zh) 2020-04-22 2023-04-04 10X基因组学有限公司 用于使用靶向rna耗竭进行空间分析的方法
EP4153775B1 (en) 2020-05-22 2024-07-24 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
AU2021275906A1 (en) 2020-05-22 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
EP4421186A3 (en) 2020-06-08 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4446430A2 (en) 2020-06-10 2024-10-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
AU2021344340A1 (en) * 2020-09-15 2023-03-23 10X Genomics, Inc. Methods of releasing an extended capture probe from a substrate and uses of the same
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4421491A2 (en) 2021-02-19 2024-08-28 10X Genomics, Inc. Method of using a modular assay support device
CN112941182B (zh) * 2021-03-11 2021-09-21 南京先声医学检验实验室有限公司 一种基于核酸质谱的风湿免疫疾病用药的基因检测方法及其应用
WO2022198068A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023125898A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 柏锘（上海）医疗科技有限公司 核酸检测方法与系统
CN117558380B (zh) * 2024-01-10 2024-04-09 中国科学院深圳先进技术研究院 基于人工智能算法的磁性微纳材料高通量制备方法及系统

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1176212A1 (en) * 2000-07-24 2002-01-30 Centre National de Genotype Method for haplotyping by mass spectrometry
US20060166201A1 (en) * 2002-09-01 2006-07-27 Philipp Schatz Method for the detection of nucleic acid sequences by means of crackable probe molecules
US20080167197A1 (en) * 2000-03-14 2008-07-10 Electrophoretics Limited Mass labels
WO2010056513A2 (en) * 2008-10-30 2010-05-20 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
DE3301833A1 (de) 1983-01-20 1984-07-26 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig Verfahren zur simultanen synthese mehrerer oligonocleotide an fester phase
US5059654A (en) 1983-02-14 1991-10-22 Cuno Inc. Affinity matrices of modified polysaccharide supports
US4515781A (en) 1983-02-23 1985-05-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services 2',5'-Riboadenylate-morpholinoadenylate nucleotides
US4582789A (en) 1984-03-21 1986-04-15 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
US4957858A (en) 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US5118605A (en) 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
AU592324B2 (en) * 1984-10-29 1990-01-11 Roche Diagnostics Corporation Mehods for protein binding enzyme complementation assays
US5064754A (en) 1984-12-14 1991-11-12 Mills Randell L Genomic sequencing method
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
EP0269520A3 (fr) 1986-11-21 1988-08-24 Institut Pasteur Rétrovirus du type HIV-2 susceptible de provoquer le sida, et ses constituants antigéniques et nucléiques
US5037882A (en) 1987-03-11 1991-08-06 Steel Samuel L Synthesis of oligonucleotide analogs
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
ATE141946T1 (de) 1988-06-14 1996-09-15 Qiagen Gmbh Hiv-2-virusvarianten
US5003059A (en) 1988-06-20 1991-03-26 Genomyx, Inc. Determining DNA sequences by mass spectrometry
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5489507A (en) 1988-11-30 1996-02-06 Perkin-Elmer Corporation DNA detection by color complementation
US5237016A (en) 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
ES2091225T3 (es) 1989-07-11 1996-11-01 Gen Probe Inc Metodos para la amplificacion de las secuencias de acidos nucleicos.
WO1991011533A1 (en) 1990-01-26 1991-08-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for isolating primer extension products from template-directed dna polymerase reactions
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
EP0566670A4 (en) 1990-12-17 1993-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
US5364759B2 (en) 1991-01-31 1999-07-20 Baylor College Medicine Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats
US5888819A (en) 1991-03-05 1999-03-30 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through primer extension
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
DE69322266T2 (de) 1992-04-03 1999-06-02 Perkin-Elmer Corp., Foster City, Calif. Proben zusammensetzung und verfahren
US5412083A (en) 1992-04-16 1995-05-02 Northeastern University Carbohydrate heterobifunctional cross-linking reagent
WO1994000562A1 (en) 1992-06-24 1994-01-06 The Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York A novel human immunodeficiency virus
US5710028A (en) 1992-07-02 1998-01-20 Eyal; Nurit Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor
US6194144B1 (en) 1993-01-07 2001-02-27 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
ATE267877T1 (de) 1993-01-07 2004-06-15 Sequenom Inc Dns - sequenzierung durch massenspektronomie
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US6074823A (en) 1993-03-19 2000-06-13 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
JPH08507926A (ja) 1993-03-19 1996-08-27 シーケノム・インコーポレーテツド エキソヌクレアーゼ分解を介した質量分析法によるｄｎａ配列決定
US5399857A (en) 1993-05-28 1995-03-21 The Johns Hopkins University Method and apparatus for trapping ions by increasing trapping voltage during ion introduction
JPH07159404A (ja) * 1993-12-06 1995-06-23 Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk スピンラベルしたビオチンを用いた物質の測定方法
US5976798A (en) 1994-03-30 1999-11-02 Mitokor Methods for detecting mitochondrial mutations diagnostic for Alzheimer's disease and methods for determining heteroplasmy of mitochondrial nucleic acid
GB9417211D0 (en) 1994-08-25 1994-10-12 Solicitor For The Affairs Of H Nucleotide sequencing method
JPH11501008A (ja) * 1995-02-09 1999-01-26 ユニバーシティ オブ ワシントン 改変−アフィニティーストレプトアビジン
US6428955B1 (en) 1995-03-17 2002-08-06 Sequenom, Inc. DNA diagnostics based on mass spectrometry
AU5296496A (en) 1995-03-24 1996-10-16 Mitokor Mutation detection by differential primer extension of mutant and wildtype target sequences
JPH11503611A (ja) 1995-04-11 1999-03-30 トラスティーズ・オブ・ボストン・ユニバーシティ 生体高分子の固相配列決定法
US5770272A (en) 1995-04-28 1998-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Matrix-bearing targets for maldi mass spectrometry and methods of production thereof
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5869242A (en) 1995-09-18 1999-02-09 Myriad Genetics, Inc. Mass spectrometry to assess DNA sequence polymorphisms
AU2217597A (en) 1996-03-18 1997-10-22 Sequenom, Inc. Dna sequencing by mass spectrometry
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5885775A (en) * 1996-10-04 1999-03-23 Perseptive Biosystems, Inc. Methods for determining sequences information in polynucleotides using mass spectrometry
US20030129589A1 (en) 1996-11-06 2003-07-10 Hubert Koster Dna diagnostics based on mass spectrometry
JP2001524808A (ja) 1996-12-10 2001-12-04 ジーントレイス・システムズ・インコーポレイテッド 放出可能な不揮発性の質量標識分子
US6613509B1 (en) 1999-03-22 2003-09-02 Regents Of The University Of California Determination of base (nucleotide) composition in DNA oligomers by mass spectrometry
US20050287592A1 (en) 2000-08-29 2005-12-29 Yeda Research And Development Co. Ltd. Template-dependent nucleic acid polymerization using oligonucleotide triphosphates building blocks
US20030027169A1 (en) 2000-10-27 2003-02-06 Sheng Zhang One-well assay for high throughput detection of single nucleotide polymorphisms
GB0102568D0 (en) * 2001-02-01 2001-03-21 Magnetic Biosolutions Sweden A Method
US20040121314A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in containers
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
DK1423400T4 (da) * 2001-03-19 2013-09-02 Harvard College Evolution af hidtil ukendt molekylfunktion
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US20030119004A1 (en) 2001-12-05 2003-06-26 Wenz H. Michael Methods for quantitating nucleic acids using coupled ligation and amplification
JP3752466B2 (ja) * 2002-04-24 2006-03-08 株式会社日立製作所 遺伝子検査方法
WO2003104420A2 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 The Regents Of The University Of California Electrochemical detection of single nucleotide polymorphisms (snps)
US7074597B2 (en) 2002-07-12 2006-07-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
US20040259105A1 (en) 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
ATE425265T1 (de) 2003-07-31 2009-03-15 Sequenom Inc Verfahren für multiplex- polymerasekettenreaktionen auf hohem niveau und homogenen massenverlängerungsreaktionen zur genotypisierung von polymorphismen
US7709262B2 (en) * 2004-02-18 2010-05-04 Trustees Of Boston University Method for detecting and quantifying rare mutations/polymorphisms
CN100400673C (zh) * 2004-03-18 2008-07-09 华晶基因技术有限公司 单核苷酸多态性（SNPs）及点突变的检测方法
WO2006073436A2 (en) 2004-04-29 2006-07-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mass tag pcr for multiplex diagnostics
EP1756307A1 (en) 2004-05-20 2007-02-28 Trillion Genomics Limited Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry
JP4735926B2 (ja) * 2004-05-27 2011-07-27 アイシン精機株式会社 核酸の高効率回収方法
US7785843B2 (en) 2004-06-23 2010-08-31 Sequenom, Inc. Target-specific compomers and methods of use
JP2008531052A (ja) * 2005-02-28 2008-08-14 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸ハイブリダイゼーションスイッチプローブを用いて被分析体を検出するための組成物及び方法
JP2006320271A (ja) * 2005-05-20 2006-11-30 Tokyo Institute Of Technology 低分子化合物とタンパク質の結合評価方法
EP1896608A1 (en) 2005-06-13 2008-03-12 F. Hoffmann-Roche AG Il10 snp associated with acute rejection
US8586708B2 (en) 2005-10-28 2013-11-19 Massachusetts Institute Of Technology Monovalent streptavidin compositions
US8133701B2 (en) * 2006-12-05 2012-03-13 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
US9249423B2 (en) 2007-02-02 2016-02-02 Yale University Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA
WO2009046507A1 (en) 2007-10-10 2009-04-16 Atanas Atanasov Wave power station
SI2540843T1 (sl) 2008-11-05 2014-10-30 Genentech, Inc. Genetski polimorfizmi in starostna degeneracija makule
EP2479268B1 (en) * 2009-09-17 2020-11-04 JSR Corporation Dissociation method and dissociation agent for avidin and biotinderivatives
CA2835942C (en) 2011-05-19 2019-01-22 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification
JP6392222B2 (ja) 2012-07-24 2018-09-19 ナテラ， インコーポレイテッド 高度多重ｐｃｒ法および組成物
CN103131787B (zh) 2013-03-11 2014-05-21 四川大学 基于y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN103602740A (zh) 2013-11-06 2014-02-26 毅新兴业（北京）科技有限公司 质谱仪鉴定血清中游离dna的方法、试剂盒及其应用
CN114540470A (zh) 2015-04-24 2022-05-27 基纳生物技术有限公司 用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法
CN107787371B (zh) 2015-04-24 2022-02-01 基纳生物技术有限公司 检测和定量次要变体的并行式方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080167197A1 (en) * 2000-03-14 2008-07-10 Electrophoretics Limited Mass labels
EP1176212A1 (en) * 2000-07-24 2002-01-30 Centre National de Genotype Method for haplotyping by mass spectrometry
US20060166201A1 (en) * 2002-09-01 2006-07-27 Philipp Schatz Method for the detection of nucleic acid sequences by means of crackable probe molecules
WO2010056513A2 (en) * 2008-10-30 2010-05-20 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEFMANN MICHAEL ET AL: "Novel mass spectrometry-based tool for genotypic identification of mycobacteria.", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 42, no. 1, 1 January 2004 (2004-01-01), US, pages 339 - 346, XP002457302, ISSN: 0095-1137, DOI: 10.1128/JCM.42.1.339-346.2004 *
STANSSENS PATRICK ET AL: "High-throughput MALDI-TOF discovery of genomic sequence polymorphisms.", GENOME RESEARCH, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, US, vol. 14, no. 1, 1 January 2004 (2004-01-01), US, pages 126 - 133, XP002510039, ISSN: 1088-9051, DOI: 10.1101/gr.1692304 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201391723A1 (ru) 2014-06-30
JP2016144474A (ja) 2016-08-12
US20130017960A1 (en) 2013-01-17
EP2710144B1 (en) 2020-10-07
AU2012254985B2 (en) 2016-11-10
CN110564819A (zh) 2019-12-13
US10604791B2 (en) 2020-03-31
US20230407375A1 (en) 2023-12-21
JP6040227B2 (ja) 2016-12-07
JP2014515264A (ja) 2014-06-30
CA2835942C (en) 2019-01-22
CA2835942A1 (en) 2012-11-22
CN103717751A (zh) 2014-04-09
AU2012254985A1 (en) 2014-01-09
US11667958B2 (en) 2023-06-06
EP2710144A1 (en) 2014-03-26
US20140011195A1 (en) 2014-01-09
US20200318169A1 (en) 2020-10-08
WO2012159089A1 (en) 2012-11-22
AU2012254985C1 (en) 2017-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11667958B2 (en) Products and processes for multiplex nucleic acid identification
CA2742272C (en) Products and processes for multiplex nucleic acid identification
US20170067097A1 (en) Systems and methods for clonal replication and amplification of nucleic acid molecules for genomic and therapeutic applications
US11680289B2 (en) Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms
US20190367970A1 (en) Products and processes for nucleic acid detection and quantification
AU2016250849A1 (en) Multiplex methods for detection and quantification of minor variants

Legal Events

Date Code Title Description
PC1A Registration of transfer to a eurasian application by force of assignment
HC1A Change in name of an applicant in a eurasian application
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU