CN110144399B - 检测人类循环肿瘤dna中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法 - Google Patents
检测人类循环肿瘤dna中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法，提供5个基因的49个用于评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因变异位点，利用MassARRAY核酸质谱技术对这些位点进行基因分析检测。本试剂盒单碱基延伸时只加入用于延伸突变型基因的ddNTPs，并且ddNTPs带有生物素标记，使用带有链霉亲和素标记的磁珠对延伸产物进行捕获，去除杂峰的信号干扰，大大增加延伸产物中突变型基因的信号值，提高试剂盒的灵敏度。应用本方法检测循环肿瘤DNA样本，20ng上样量其灵敏度可低至0.1％。此方法相较qPCR及二代测序平台，具有设计灵活、准确性高、成本低、操作简便等优势。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，尤其是涉及一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法，利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和核酸质谱技术，对肺癌相关的5个基因49个位点进行基因检测。
背景技术
肿瘤是多基因经历多步骤变化导致细胞周期紊乱，使细胞失控性生长而形成的新生长物。肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)占肺癌的85％左右，NSCLC中又以腺癌最常见。在肿瘤学、遗传学等多学科研究中发现，大多数NSCLC患者存在表皮生长因子受体(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)等原癌基因和抑癌基因的突变，它们在肿瘤的形成及其介导瘤细胞的生物行为中发挥着重要的作用，因此这些基因成为抗肿瘤靶向治疗药物的重要靶点之一。
癌症临床治疗的有效率目前仍然偏低，这与癌症复杂的发生机理和患者个体化差异密切相关。随着人类基因组学、药物基因组学及癌症分子生物学研究的不断深入和发展，研究表明人体中某些基因与癌症的靶向或化疗药物的疗效或毒性是密切相关的，对这些特定基因进行检测，简单的说就是取被检测者的组织细胞、血液或胸腔积液，经提取和纯化其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的特定基因作检测，分析基因的状态为癌症患者提供治疗方案参考更具科学性，有助于提高患者的生活质量和生存期，并节省患者的时间和金钱。
有研究表明，肿瘤患者的血液、胸腹腔积液、脑脊液等体液中可以检测到的游离DNA含量远大于正常人，并且游离DNA表现出与肿瘤组织相同的生物学特性。随着肿瘤分子生物学研究的进展，游离DNA的检测及其生物学指标的研究已为临床肿瘤早期诊断、预后判断及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特意、无创或微创的分子生物学检测手段。
核酸质谱检测技术联合PCR技术、单碱基延伸技术，通过PCR扩增技术放大检测样本模板量；利用具有“微测序”之称的单碱基延伸技术特异性延伸一个碱基，准确性极高；尤其是质谱检测目标为物质的分子量，无需荧光探针标记，识别单碱基之间的差异时分辨率高达9Da，使得该技术在基因检测领域具有非常旺盛的生命力。该技术自2002年荣获诺贝尔奖以来，受到各界广泛关注，在医学、农业等各大领域已有众多应用。
发明内容
本发明提供了一组检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因变异的引物组。
本发明的另一个目的是提供一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因变异试剂盒，该试剂盒可以同时检测多个突变位点，通量高。检测时间较短，单个位点的费用相对较低。
本发明的第三个目的是提供一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因变异的试剂盒的使用方法。分析灵敏度和分析特异性好，操作简便。
与普通核酸质谱检测产品不同的是，本试剂盒单碱基延伸时只加入用于延伸突变型基因的ddNTPs，并且ddNTPs带有生物素标记，使用带有链霉亲和素标记的磁珠对延伸产物进行捕获，去除杂峰的信号干扰，从而大大增加了延伸产物中突变型基因的信号值，提高了试剂盒的灵敏度。应用本方法检测循环肿瘤DNA样本，20ng上样量其灵敏度可低至0.1％。此方法相较qPCR及二代测序平台，具有设计灵活、准确性高、成本低、操作简便等优势。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组，引物组包括PCR扩增引物、单碱基延伸引物和过程质控引物，PCR扩增引物序列为SEQ ID No.1-22，单碱基延伸引物序列为：SEQ ID No.23-62，过程质控引物序列为：SEQ ID No.63-65。
所述单碱基延伸引物分为8组：
一种检测人类肺癌相关基因突变的试剂盒，包括：
1)用于PCR的反应试剂，包括SEQ ID No.1-22所述PCR扩增引物，SEQ ID No.63-64所述过程质控引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2，PCR反应缓冲液；
2)用于PCR产物纯化的试剂，包括虾碱性磷酸酶，虾碱性磷酸酶缓冲液；
3)用于单碱基延伸的试剂，包括SEQ ID No.23-62的单碱基延伸引物，SEQ IDNo.65的过程质控引物，耐高温的单碱基延伸酶，生物素标记ddNTPs，延伸反应缓冲液。
4)用于延伸产物捕获的试剂，包括链霉亲和素标记的磁珠，结合/洗涤缓冲液。
试剂盒还包括：阴性质控品，阳性质控品，捕获质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用的靶板。
用来评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点为：BRAF_p.D594G、BRAF_p.G469A、BRAF_p.G469V、BRAF_p.V600E、EGFR_p.C797S、EGFR_p.D770_N771insSVD、EGFR_p.D770_N771insG、EGFR_p.E709A、EGFR_p.E709G、EGFR_p.E709K、EGFR_p.E746_A750del、EGFR_p.E746_E749del、EGFR_p.E746_S752＞D、EGFR_p.E746_S752＞V、EGFR_p.E746_T751del、EGFR_p.G719A、EGFR_p.G719C、EGFR_p.G719S、EGFR_p.H773_V774insNPH、EGFR_p.H773_V774insH、EGFR_p.L747_A750＞P、EGFR_p.L747_E749del、EGFR_p.L747_P753＞S、EGFR_p.L858R、EGFR_p.L861Q、EGFR_p.L861R、EGFR_p.S768I、EGFR_p.T790M、EGFR_p.V769_D770insASV、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、ERBB2_p.G776＞VC、KRAS_p.G12A、KRAS_p.G12V、KRAS_p.G12D、KRAS_p.G12R、KRAS_p.G12C、KRAS_p.G12S、KRAS_p.G13C、KRAS_p.G13D、KRAS_p.Q61H、KRAS_p.Q61K、KRAS_p.Q61E、KRAS_p.Q61P、KRAS_p.Q61L、KRAS_p.Q61R、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545K、PIK3CA_p.H1047L、PIK3CA_p.H1047R。
上述检测人类肺癌相关基因突变的试剂盒的使用方法，包括如下步骤:
1)多重PCR反应：在一个反应体系内，以待测样本DNA为模板，使用特异性的针对包含所检测基因突变位点的PCR扩增引物，通过多重PCR同时扩增含有不同待检基因位点的序列，得到含扩增目标区域的PCR产物；
2)利用虾碱性磷酸化酶消化步骤1)反应体系中剩余的dNTPs；
3)利用单碱基延伸引物对步骤2)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
4)利用链霉亲和素标记的磁珠捕获单碱基延伸产物中突变型的延伸产物；
5)利用MassARRAY平台进行树脂纯化、芯片点样、质谱检测，结果使用TYPER4.0软件分析并输出结果，通过变异碱基处是否出峰来判断突变类型。
所述步骤1)的PCR反应条件为：95℃、2min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，45个循环；72℃、5min；4℃保持。
所述步骤2)的消化条件为：37℃、40min；85℃、5min；4℃保持。
所述步骤3)的延伸反应条件为：95℃、30s；95℃、5s，(52℃、5s，80℃、5min)5个循环，40个循环；72℃、3min；4℃保持。
本发明的有益效果是：
1)灵敏度高。本发明综合了多重PCR技术、单碱基延伸技术、质谱技术为一体，可通过多重PCR技术放大模板，又可通过质谱技术检测微量样本，提高了检测的灵敏度。相较普通核酸质谱技术而言，本试剂盒单碱基延伸时只加入用于延伸突变型基因的ddNTPs，并且ddNTPs带有生物素标记，使用带有链霉亲和素标记的磁珠对延伸产物进行捕获，去除杂峰的信号干扰，从而大大增加了延伸产物中突变型基因的信号值，提高了试剂盒的灵敏度。针对血浆游离DNA，20ng上样量可以检出低至0.1％的突变。
2)特异性好。单碱基延伸使用特异性延伸引物，在引物3’末端只延伸一个碱基，较测序技术延伸数百个碱基而言，出错概率更低，准确性高，特异性好。
3)本发明可以同时对多个样本的5个基因49个位点进行检测，相较qPCR技术而言通量更高。
4)快速、简便。本发明可在一天内完成检测，操作简单，自动化程度高，且无需复杂的生物信息学分析。
5)相对于其他检测方法，单个位点的成本较低。减轻了患者的就医负担。
6)样本投入量较少。样本较节省。
7)采用外周血样本，避免了患者因组织穿刺受到的巨大痛苦。
8)本发明的试剂盒可以指导患者的靶向用药，有助于提高患者的生活质量和生存期在临床上具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组，引物组包括PCR扩增引物、单碱基延伸引物和过程质控引物，PCR扩增引物序列为SEQ ID No.1-22，单碱基延伸引物序列为：SEQ ID No.23-62，过程质控引物序列为：SEQ ID No.63-65。
优选，所述单碱基延伸引物分为8组：
一种检测人类肺癌相关基因突变的试剂盒，包括：
1)用于PCR的反应试剂，包括SEQ ID No.1-22所述PCR扩增引物，SEQ ID No.63-64所述过程质控引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2，PCR反应缓冲液；
2)用于PCR产物纯化的试剂，包括虾碱性磷酸酶，虾碱性磷酸酶缓冲液；
3)用于单碱基延伸的试剂，包括SEQ ID No.23-62的单碱基延伸引物，SEQ IDNo.65的过程质控引物，耐高温的单碱基延伸酶，生物素标记ddNTPs，延伸反应缓冲液。
4)用于延伸产物捕获的试剂，包括链霉亲和素标记的磁珠，结合/洗涤缓冲液。
试剂盒还包括：阴性质控品，阳性质控品，捕获质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用的靶板。
用来评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点为：BRAF_p.D594G、BRAF_p.G469A、BRAF_p.G469V、BRAF_p.V600E、EGFR_p.C797S、EGFR_p.D770_N771insSVD、EGFR_p.D770_N771insG、EGFR_p.E709A、EGFR_p.E709G、EGFR_p.E709K、EGFR_p.E746_A750del、EGFR_p.E746_E749del、EGFR_p.E746_S752＞D、EGFR_p.E746_S752＞V、EGFR_p.E746_T751del、EGFR_p.G719A、EGFR_p.G719C、EGFR_p.G719S、EGFR_p.H773_V774insNPH、EGFR_p.H773_V774insH、EGFR_p.L747_A750＞P、EGFR_p.L747_E749del、EGFR_p.L747_P753＞S、EGFR_p.L858R、EGFR_p.L861Q、EGFR_p.L861R、EGFR_p.S768I、EGFR_p.T790M、EGFR_p.V769_D770insASV、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、ERBB2_p.G776＞VC、KRAS_p.G12A、KRAS_p.G12V、KRAS_p.G12D、KRAS_p.G12R、KRAS_p.G12C、KRAS_p.G12S、KRAS_p.G13C、KRAS_p.G13D、KRAS_p.Q61H、KRAS_p.Q61K、KRAS_p.Q61E、KRAS_p.Q61P、KRAS_p.Q61L、KRAS_p.Q61R、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545K、PIK3CA_p.H1047L、PIK3CA_p.H1047R。
上述检测人类肺癌相关基因突变的试剂盒的使用方法，包括如下步骤:
1)多重PCR反应：在一个反应体系内，以待测样本DNA为模板，使用特异性的针对包含所检测基因突变位点的PCR扩增引物，通过多重PCR同时扩增含有不同待检基因位点的序列，得到含扩增目标区域的PCR产物；
2)利用虾碱性磷酸化酶消化步骤1)反应体系中剩余的dNTPs；
3)利用单碱基延伸引物对步骤2)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
4)利用链霉亲和素标记的磁珠捕获单碱基延伸产物中突变型的延伸产物；
5)利用MassARRAY平台进行树脂纯化、芯片点样、质谱检测，结果使用TYPER4.0软件分析并输出结果，通过变异碱基处是否出峰来判断突变类型。
所述步骤1)的PCR反应条件为：95℃、2min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，45个循环；72℃、5min；4℃保持。
所述步骤2)的消化条件为：37℃、40min；85℃、5min；4℃保持。
所述步骤3)的延伸反应条件为：95℃、30s；95℃、5s，(52℃、5s，80℃、5min)5个循环，40个循环；72℃、3min；4℃保持。
本发明的原理在于：提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测人类肺癌相关基因突变的方法。其中，在多重PCR中扩增多达含49个肺癌相关基因突变位点的DNA片段；在单碱基延伸过程中，只加入用于延伸突变型基因的ddNTPs，并且ddNTPs带有生物素标记，使用带有链霉亲和素标记的磁珠对延伸产物进行捕获，去除杂峰的信号干扰，从而大大增加了延伸产物中突变型基因的信号值，提高了试剂盒的灵敏度；单碱基延伸时，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，单碱基延伸产物在49个位点处分别延伸一个碱基，使得所延伸的碱基类型分别与该位点的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，用质谱的方法对待检混合物进行检测，以分子量来区分待检产物中的每种分子，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定各位点的基因型。
具体地说本发明用于检测5个人类肺癌相关基因49个位点的引物组，包含PCR扩增引物、单碱基延伸引物和过程质控引物，其序列如表1所示。
表1
其中，所述用来评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的49个基因突变位点为BRAF_p.D594G、BRAF_p.G469A、BRAF_p.G469V、BRAF_p.V600E、EGFR_p.C797S、EGFR_p.D770_N771insSVD、EGFR_p.D770_N771insG、EGFR_p.E709A、EGFR_p.E709G、EGFR_p.E709K、EGFR_p.E746_A750del、EGFR_p.E746_E749del、EGFR_p.E746_S752＞D、EGFR_p.E746_S752＞V、EGFR_p.E746_T751del、EGFR_p.G719A、EGFR_p.G719C、EGFR_p.G719S、EGFR_p.H773_V774insNPH、EGFR_p.H773_V774insH、EGFR_p.L747_A750＞P、EGFR_p.L747_E749del、EGFR_p.L747_P753＞S、EGFR_p.L858R、EGFR_p.L861Q、EGFR_p.L861R、EGFR_p.S768I、EGFR_p.T790M、EGFR_p.V769_D770insASV、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、ERBB2_p.G776＞VC、KRAS_p.G12A、KRAS_p.G12V、KRAS_p.G12D、KRAS_p.G12R、KRAS_p.G12C、KRAS_p.G12S、KRAS_p.G13C、KRAS_p.G13D、KRAS_p.Q61H、KRAS_p.Q61K、KRAS_p.Q61E、KRAS_p.Q61P、KRAS_p.Q61L、KRAS_p.Q61R、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545K、PIK3CA_p.H1047L、PIK3CA_p.H1047R。
其中，延伸引物根据各位点不同分子量及基因型分为8组，具体分组情况如表2所示。
表2
在一个实施方案中，上述PCR引物序列在5’端加入10bp的tag(5’-ACGTTGGATG-3’)。例如，PCR引物SEQ ID No.1序列为5’-ACGTTGGATGTTACCTTATACACCGTGCCG-3’。
实施例一通过本发明技术检测肺癌相关基因突变位点
一、引物设计及合成
针对BRAF_p.D594G、BRAF_p.G469A、BRAF_p.G469V、BRAF_p.V600E、EGFR_p.C797S、EGFR_p.D770_N771insSVD、EGFR_p.D770_N771insG、EGFR_p.E709A、EGFR_p.E709G、EGFR_p.E709K、EGFR_p.E746_A750del、EGFR_p.E746_E749del、EGFR_p.E746_S752＞D、EGFR_p.E746_S752＞V、EGFR_p.E746_T751del、EGFR_p.G719A、EGFR_p.G719C、EGFR_p.G719S、EGFR_p.H773_V774insNPH、EGFR_p.H773_V774insH、EGFR_p.L747_A750＞P、EGFR_p.L747_E749del、EGFR_p.L747_P753＞S、EGFR_p.L858R、EGFR_p.L861Q、EGFR_p.L861R、EGFR_p.S768I、EGFR_p.T790M、EGFR_p.V769_D770insASV、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、ERBB2_p.G776＞VC、KRAS_p.G12A、KRAS_p.G12V、KRAS_p.G12D、KRAS_p.G12R、KRAS_p.G12C、KRAS_p.G12S、KRAS_p.G13C、KRAS_p.G13D、KRAS_p.Q61H、KRAS_p.Q61K、KRAS_p.Q61E、KRAS_p.Q61P、KRAS_p.Q61L、KRAS_p.Q61R、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545K、PIK3CA_p.H1047L、PIK3CA_p.H1047R。等49个用来评估人类罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点，设计对应的特异性PCR引物核心序列(SEQ ID No.1至SEQ ID No.22)和特异性延伸引物(SEQ ID No.23至SEQ ID No.62)。
其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测的窗口而干扰检测结果，在每条PCR引物5’端引入一定数目的碱基，如10bp的tag(ACGTTGGATG)，以增大每条PCR引物的分子量，从而超过质谱仪检测的窗口，避免影响结果判读。
二、样本DNA提取
采用商业化的核酸提取试剂盒(艾德生物核酸提取试剂(循环DNA))进行DNA提取。提取的DNA以Qubit(Thermo公司)进行定量。提取后的DNA按要求，在2～8℃保存不超过24小时，-15～-25℃保存不超过两年，-75～-85℃可长期保存，应避免反复冻融，如需进行运输，请使用冰盒。
1、样本为血浆样本，按照说明书要求，应保证样本未发生溶血。提取步骤按说明书进行操作。
2、样本为DNA样本，经质检合格后，-15～-25℃保存备用。
三、质谱检测
(一)PCR扩增反应
1准备一个1.5ml离心管，根据样本数量，按下表配制PCR反应液。PCR反应液各组分见表4：
表4
| 组分名称 | 单反应体积(μL) |
| HPLC级水 | 8.05 |
| PCR反应缓冲液 | 7.00 |
| MgCl<sub>2</sub> | 2.80 |
| dUTP/dNTP Mix | 0.35 |
| PCR扩增引物 | 14.00 |
| 耐高温DNA聚合酶 | 2.80 |
| PCR反应液总体积 | 35.00 |
2准备一个96孔板，根据样本数量将上述PCR反应液分装至反应孔中，每孔35μL。
3向已分装有PCR反应液的反应孔中加入稀释好的DNA样本，使样本最终使用量为20ng，PCR反应总体积70μL，不足的加水补齐。
4将加好样的96孔板置于PCR扩增仪上，按表5的程序进行PCR扩增反应。
表5
(二)虾碱性磷酸酶消化
1应用虾碱性磷酸酶对PCR扩增的产物进行消化，根据样本数配制消化反应液，消化反应液各组分见表6
表6
| 组分名称 | 单反应体积(μL) |
| HPLC级水 | 21.42 |
| 虾碱性磷酸酶缓冲液 | 2.38 |
| 虾碱性磷酸酶 | 4.20 |
| 消化反应液总体积 | 28.00 |
2像96孔板中加入消化反应液，每孔28μL。
3将96孔板置于PCR仪中，按表7的程序对PCR产物进行消化处理。
表7
(三)单碱基延伸
1对步骤二中的消化产物进行单碱基延伸，每个样本的一个消化产物对应8个延伸反应。取1个1.5mL离心管，根据样本数配制单碱基延伸反应液1，反应液各组分见表8。
表8
| 组分名称 | 单反应体积(μL) |
| HPLC级水 | 0.519 |
| 延伸反应缓冲液 | 0.200 |
| 单碱基延伸酶 | 0.041 |
| 捕获质控品 | 0.100 |
| 延伸反应液1总体积 | 0.860 |
2将配置好的延伸反应液1根据样本数分装于8个PCR管内，编号1-8。
3另取五个新的1.5mL离心管，根据表9配制Termination mix，此Termination Mix可供整个Panel试剂盒使用，不用时放置2～8℃储存。
表9
4根据样本数量，按表10配制延伸反应液E1-E8。其中Termination Mix与延伸引物为一一对应的关系，其对应关系见表11。
表10
| 组分名称 | 单反应体积(μL) |
| 延伸反应液1 | 0.86 |
| 延伸引物(E1-E8) | 0.94 |
| Termination Mix | 0.20 |
| 延伸反应液E1-E8 | 2.00 |
表11
5另取一个新的96孔板，将步骤二的消化产物中每个样本分到8个反应孔中，每孔7μL。
6将延伸反应液E1-E8一一对应的加入到每个样本的1-8号反应孔中，每孔2μL。
7将96孔板置于PCR仪中，按表12的程序进行单碱基延伸反应。
表12
(四)链霉亲和素磁珠捕获
1准备好1.5mL离心管，按每个反应孔4.25μL的磁珠计算。
2注：链霉亲和素磁珠必须在4℃保存，使用前用移液器吹吸混匀。
3将离心管放置磁力架上，1分钟后使用1mL枪头吸走储存液(不要破坏磁珠)。
4加入同样体积的结合/清洗缓冲液，重悬并简短离心(保证盖子上无液体)，再将离心管放置磁力架上，1分钟后吸走结合/清洗缓冲液。
5重复步骤4两次。
6从磁力架上拿下离心管。使用5mL的离心管，按每个反应(反应数与步骤1相同)25μL加入相应体积的结合/清洗缓冲液。
7按每个反应(反应数与步骤1相同)16μL加入HPLC级水并重悬。
8将重悬后的磁珠从5mL离心管中转移到V形槽中。
9用排枪向96孔板中加入磁珠，每个孔41μL(每个反应总体积50μL)。
10密封96孔板，置于板式旋转器上，室温孵育至少30min。
11孵育完离心，将96孔板置于板式磁力架上，1min后除去上清。
12将反应板从磁力架上拿下，用排枪向每个反应孔中加入100μL HPLC级水，吹吸混匀至少8次，扔掉枪头。保证磁珠被完全重悬。
13简短离心，将96孔板置于板式磁力架上，1min后除去上清。
14重复步骤12-13一次。
15将反应板从磁力架上拿下。将生物素溶液倒入V形槽中，用排枪向96孔板每个孔中加入13μL生物素溶液。
16密封反应板，涡旋震荡5次重悬磁珠，后短暂离心置于PCR仪中进行以下热循环：
表13
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 90℃ | 5minutes | 1 |
| 10℃ | Hold |
17反应完后，离心反应板1000×g 1min。转移反应板中的溶液至新的96孔板中。
(五)上机检测及结果判读
1将96孔板置于质谱仪中，利用MassARRAY Chip prep module系统进行树脂纯化及芯片点样。
2点样后利用MassARRAY Analyzer进行质谱检测。
3如前述表3所示，每条延伸引物及他们在不同基因位点上产生的延伸产物都具有不同的分子量，这些分子量对应不同的质谱峰，若在某分子量出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的延伸引物或产物。
判断标准：
捕获质控品应出现五个分子量不同的峰，分别为：4694.2Da、4998.4Da、9316.2Da、9620.4Da、7134.8Da。过程质控品应出现一个峰(NTC中过程质控品无峰)。
1)捕获质控品的质谱峰及过程质控品的质谱峰有一种未出现，无论延伸产物峰出现与否，均判断为实验失败。
2)若突变型对应的质谱峰出现，则判断为该峰对应的突变型。
3)若突变型对应的质谱峰未出现，则判断为野生型。
实施例二：标准品检测
选用已知突变的9例标准品DNA样本(购于Horizon公司)进行检测，编号A1-A9。其中，A1-A8各样本对应的每种突变位点突变频率均为0.1％，A9为野生型。
根据本发明的方法，依照实施例一所描述的步骤，对9例标准品DNA样本进行质谱检测。根据实施例一种描述的判定标准对该9例标准品样本进行结果分析，得到表14。
表14
检测结果，8例突变型标准品样本所对应的突变均能正常检出，说明本发明方法能检出20ng上样量低至0.1％突变频率的位点，具有前沿优势。
实施例三：游离DNA样本检测
根据本发明的方法，依照实施例一所描述的步骤，对30例肺癌患者的游离DNA样本进行质谱检测，样本编号为B1-B30。根据实施例一种描述的判定标准对该30例样本进行结果分析，得到表15。
表15
| 样本 | 检出的突变 | 样本 | 检出的突变 |
| B1 | KRAS_p.G12D | B16 | EGFR_p.S768I |
| B2 | KRAS_p.G12C | B17 | EGFR_p.L858R |
| B3 | EGFR_p.G719S、EGFR_p.L861Q | B18 | ERBB2_p.A775_G776insYVMA |
| B4 | EGFR_p.G719S、EGFR_p.L861Q | B19 | KRAS_p.G12S |
| B5 | EGFR_p.T790M | B20 | EGFR_p.E746_A750del |
| B6 | EGFR_p.E746_A750del | B21 | KRAS_p.G12D |
| B7 | BRAF_p.V600E | B22 | EGFR_p.V769_D770insASV |
| B8 | EGFR_p.S768I、EGFR_p.L858R | B23 | EGFR_p.E746_A750del |
| B9 | EGFR_p.L861Q | B24 | EGFR_p.S768I、EGFR_p.L858R |
| B10 | EGFR_p.L858R | B25 | KRAS_p.G12V |
| B11 | EGFR_p.L858R | B26 | EGFR_p.E746_A750del |
| B12 | KRAS_p.G12S | B27 | EGFR_p.L858R |
| B13 | BRAF_p.V600E | B28 | EGFR_p.L858R |
| B14 | PIK3CA_p.H1047R | B29 | BRAF_p.V600E |
| B15 | EGFR_p.L858R | B30 | KRAS_p.G12S、EGFR_p.L858R |
在30例患者中，共检出BRAF_p.V600E突变3例、EGFR_p.E746_A750del突变4例、EGFR_p.G719S突变2例、EGFR_p.L861Q突变3例、EGFR_p.L858R突变9例、EGFR_p.S768I突变3例、EGFR_p.T790M突变1例、EGFR_p.V769_D770insASV突变1例、ERBB2_p.A775_G776insYVMA突变1例、KRAS_p.G12C突变1例、KRAS_p.G12D突变2例、KRAS_p.G12S突变3例、KRAS_p.G12V突变1例、PIK3CA_p.H1047R突变1例。检测结果与中源协和医学检验所有限公司二代测序结果完全一致。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
序列表
<110> 中源协和（天津）医学检验所有限公司
<120> 检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法
<160> 65
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg ttaccttata caccgtgc 28
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg caaccaagct ctcttga 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg atcgaggatt tccttgtt 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg gaaagttaaa attcccgt 28
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg tctccctccc tccagga 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg aggtgaggca gatgccc 27
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg ctgcctcacc tccaccgt 28
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg tttgtgttcc cggacat 27
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgttggatg tggtattctt tctcttccg 29
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg gcagcatgtc aagatcac 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgttggatg ttataaggcc tgctgaaa 28
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgttggatg gctgtatcgt caaggcact 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgttggatg ctgaagatgt acctatggt 29
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgttggatg agtcctgagc ctgttttg 28
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgttggatg tccagacaac tgttcaaact 30
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgttggatg ttcatgaaga cctcacagta a 31
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgttggatg agctcaaagc aatttctaca 30
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgttggatg tagcacttac ctgtgact 28
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgttggatg aatccatttt tgttgtcca 29
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgttggatg aactgagcaa gaggctttgg 30
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acgttggatg gtggggcgcc ccaggcac 28
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgttggatg cttccttaat gtcacgcacg a 31
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agccctcccg ggcagcgtcg t 21
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gccagcgtgg acaaccc 17
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agctctcttg aggatcttga agg 23
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
actcttgcct acgcca 16
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttagtctgga atgcggactc atgaaa 26
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttgcgaatac tactcatgat atg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cttctcttaa ttccttgata gcg 23
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggctttcgga gatgtt 16
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccgcacccag cagtttggcc 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aaacttgtgg tagttggagc t 21
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acttacaggc ttcacccatg act 23
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtgattttgg tctagctaca g 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cttgtggtag ttggagctg 19
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttgatctttt tgaattcagt tt 22
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tttgggctgg ccaaac 16
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tggtagttgg agctggt 17
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttaaaattcc cgtcgctatc aa 22
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acaccgtgcc gaacgcaccg gag 23
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agcctacgtg atggcca 17
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggcactcttg cctacg 16
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tagaaaatct ttctcctgct 20
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gaattcaaaa agatcaaagt gctg 24
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acgtgatggc cagcgtgg 18
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caccgtgcag ctcatca 17
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tggtagttgg agctggtg 18
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tttgttgtcc agccaccatg a 21
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tccactgtgc gacgagctg 19
<210> 50
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgtgatggc cagcgtg 17
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
acgtgatggc cagcgtgg 18
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttgctgcagc ccaacaact 19
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cgtgtttgcc ttcacgacct gc 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tgtattcgcc cgacgtacct gc 22
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
caagatcaca gattttgggc 20
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ctgacgaggc gggcagtgtg t 21
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttggctttcg gagatgt 17
<210> 58
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctcctgctca gtgattt 17
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agccatggag tacctgg 17
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
atgtacagtc ttcccacacg act 23
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ttgctacgtc ccaacaact 19
<210> 62
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tcagcaggtc agagagc 17
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acgttggatg aagttaggtt ttgtcaagaa 30
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acgttggatg cagcaagcag gagtatgacg 30
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gggtccagac tctgcccgtt tggt 24
Claims (4)
1.一种检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的试剂盒，其特征在于，包括检测基因突变位点的引物组：PCR扩增引物序列为SEQ ID No.1-22，单碱基延伸引物序列为：SEQID No.23-62，过程质控引物序列为：SEQ ID No.63-65；
所述基因突变位点为：BRAF_p.D594G、BRAF_p.G469A、BRAF_p.G469V、BRAF_p.V600E、EGFR_p.C797S、EGFR_p.D770_N771insSVD、EGFR_p.D770_N771insG、EGFR_p.E709A、EGFR_p.E709G、EGFR_p.E709K、EGFR_p.E746_A750del、EGFR_p.E746_E749del、EGFR_p.E746_S752＞D、EGFR_p.E746_S752＞V、EGFR_p.E746_T751del、EGFR_p.G719A、EGFR_p.G719C、EGFR_p.G719S、EGFR_p.H773_V774insNPH、EGFR_p.H773_V774insH、EGFR_p.L747_A750＞P、EGFR_p.L747_E749del、EGFR_p.L747_P753＞S、EGFR_p.L858R、EGFR_p.L861Q、EGFR_p.L861R、EGFR_p.S768I、EGFR_p.T790M、EGFR_p.V769_D770insASV、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、ERBB2_p.G776＞VC、KRAS_p.G12A、KRAS_p.G12V、KRAS_p.G12D、KRAS_p.G12R、KRAS_p.G12C、KRAS_p.G12S、KRAS_p.G13C、KRAS_p.G13D、KRAS_p.Q61H、KRAS_p.Q61K、KRAS_p.Q61E、KRAS_p.Q61P、KRAS_p.Q61L、KRAS_p.Q61R、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545K、PIK3CA_p.H1047L、PIK3CA_p.H1047R。
所述单碱基延伸引物分为8组：
2.根据权利要求1所述检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中用于PCR反应的试剂除权利要求1中所述PCR扩增引物、过程质控引物外，还包括耐高温的DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、PCR反应缓冲液。
3.根据权利要求1所述检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于PCR产物纯化的试剂，包括虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶缓冲液。
4.根据权利要求1所述检测人类循环肿瘤DNA中肺癌相关基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中用于单碱基延伸的试剂除权利要求1中所述单碱基延伸引物、过程质控引物外，还包括耐高温的单碱基延伸酶、生物素标记的ddNTPs、延伸反应缓冲液。
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