CN108977542A - 监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组和检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乳腺癌实时复发监控的探针及应用，所述的乳腺癌实时复发监控是指通过高通量测序技术，对染色体1q21.3区域内三个基因的拷贝数情况进行实时监控，可以作为追踪肿瘤复发的重要生物标志物，也是乳腺癌治疗的可能靶点，其中共包含53条探针。本发明通过检测在染色体1q21.3区域的三个基因的拷贝数情况，来检测乳腺癌是否复发，具有检测灵敏度高，特异性强、不易污染、安全性高，检测周期短等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，通过检测肿瘤患者的染色体1q21.3区域的拷贝数情况，为癌症患者进行最科学的靶向药物疗效，辅助医生为患者制定个性化治疗方案。

Description

监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组和检测方法及应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及乳腺癌实时复发监控检测应用领域。

背景技术

日前，国家癌症中心发布了最新一期的中国恶性肿瘤发病和死亡分析报告，报告显示，据估计，2014年全国新发恶性肿瘤病例约为380.4万例，死亡病例约229.6万例。按此计算，平均每分钟就有7人被确诊为癌症，4人因癌症死亡。常见的恶性肿瘤包括肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、女性乳腺癌、食管癌、甲状腺癌、子宫颈癌、脑瘤和胰腺癌，约占我国肿瘤全部新发病例的77％。主要的肿瘤死因是肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、脑瘤、白血病和淋巴瘤，约占全部肿瘤死亡病例的83％。

其中，占女性肿瘤发病第1位的是乳腺癌，每年新发病例约为27.9万，其次为肺癌、结直肠癌、甲状腺癌和胃癌。尽管乳腺癌的治疗取得了颇多进展，但仍有大量的患者在治疗后数年内发生复发转移并因此死亡。由此可见，复发转移是影响乳腺癌患者生存预后的关键因素，但是其发生机制复杂，目前在临床上尚无可靠的方法做到有效的早期监测乳腺癌的复发转移。现有的临床检测手段如B超、CT、MRI及骨扫描等并不能在早期阶段及时地发现复发转移的亚临床期病灶。因此，识别与肿瘤复发有关的关键分子，开发新的诊断和治疗方案，对于改善患者的生存至关重要。

对于乳腺癌患者，术后的复发转移是造成患者死亡的主要原因，所以，临床医生关注的重点之一是希望尽早预测术后复发转移的可能性，改善患者的生存质量和延长患者的生命周期。有研究表明，1q21.3染色体拷贝数扩增的乳腺细胞具有肿瘤干细胞(Tumor-initiating Cells,TICs)特征，与乳腺癌复发密切相关，并提示1q21.3扩增可以作为追踪肿瘤的重要生物标志物，也是乳腺癌治疗的可能靶点。在一个67例患者的独立验证组中，研究者采用RT-PCR检测了1q21.3区域S100A8基因的拷贝数情况，结果有11例原发乳腺癌患者存在这一基因的拷贝数扩增，且携带扩增的患者总生存率显著低于未携带者，死亡率也高于未携带者。研究人员进一步发现细胞游离DNA

(Cellfree DNA,cfDNA)的该区域扩增与乳腺癌患者早期复发密切相关，同时也可以用于跟踪肿瘤是否对化疗出现耐药性。

随着液体活检技术的不断成熟，检测循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTC)及循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)已经取得不少的进展。ctDNA是人体血液系统中来自肿瘤基因组的DNA片段，这些肿瘤DNA含有肿瘤基因组所特有的基因突变，就像是肿瘤细胞留在血液中的指纹，让我们有可能仅仅凭借一管血，就可以追查癌症的真凶，分析它的各项特征，从而为消灭这个凶手提供不可或缺的信息。在几乎所有种类的癌症中，都检测到了ctDNA所带有的标志性突变，并且肿瘤越晚期，病情越严重，肿瘤的恶性程度越高，ctDNA特有突变的频率就越高。由于ctDNA的浓度与肿瘤的进展高度相关，因此我们可以通过ctDNA来进行肿瘤的分期、预后评估，以及动态监测。它携带的肿瘤信息也可提供用药指导信息，不仅取样简单，还能更全面地掌握肿瘤信息。因此，利用液体活检技术寻找乳腺癌复发转移的生物标志物，对乳腺癌复发进行实时监控是一种实际可行的方案，也是目前很多科研工作者正在致力于此的事情。

目前，国内并没有对乳腺癌复发转移进行实时监控的液体活检检测产品，目前已有的是利用免疫组化方法检测某些乳腺癌相关蛋白在乳腺组织中的表达情况，但是，如果实验处理不当，很有可能造成结果的假阳性或者假阴性，而且，免疫组化并不适用于实时监控检测，因此该方法不适合作为乳腺癌复发转移的实时临床检测。

因此，急需一种相对方便快捷、测序周期短、针对性强、检测结果准确可靠的检测手段。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组和检测方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组，包含53种不同的单链寡核苷酸探针，其具体序列分别如SEQ ID No：1～53所示。乳腺癌实时复发监控检测探针序列详细信息，具体如下：

优选地，所述寡核苷酸探针组带有生物素标记。

优选地，所述寡核苷酸探针组还包含目标基因和参考基因。

优选地，所述目标基因为1号染色体q21.3区域的基因位点。

本发明经过深入研究乳腺癌复发转移患者中的肿瘤突变情况，发现复发转移患者中存在染色体1q21.3区域的扩增富集情况，因此用该特征可作为乳腺癌复发转移的生物标志物，可对乳腺癌患者的进行预后评估并指导临床治疗。

优选地，所述参考基因为10号染色体上的基因位点。

优选地，所述q21.3区域的基因位点为S100A7、S100A8和TUFT1。

优选地，所述10号染色体上的基因位点为RPP30。

为了保证结果的可靠性和实用性，本发明挑选了染色体1q21.3区域中的其中3个基因作为目标基因，包括S100A7、S100A8和TUFT1，1个参考基因RPP30来自10号染色体，共检测4个基因的拷贝数情况，通过比较目标基因和参考基因的拷贝数差异，判断染色体1q21.3区域的扩增状态，从而用于监测乳腺癌的复发转移。

本发明还提供了一种监控乳腺癌实时复发的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备能够体现生物样本DNA信息的总核酸片段；

(2)将步骤(1)获得的DNA片段进行PCR扩增，建立文库并定量；

(3)将上述的寡核苷酸探针组与步骤(2)的文库进行杂交，然后对杂交产物使用通用引物进行PCR扩增；

(4)通过生物信息学分析的方法，确定样本中含有目标基因的拷贝数。

本发明的另一目的还提供了本发明的寡核苷酸探针组用于监控乳腺癌实时复发的用途。

本发明的有益效果在于：

本发明通过检测在染色体1q21.3区域的三个基因的拷贝数情况，具有检测灵敏度高，特异性强、不易污染、安全性高，检测周期短等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，通过检测肿瘤患者的染色体1q21.3区域的拷贝数情况，为癌症患者进行最科学的靶向药物疗效，辅助医生为患者制定个性化治疗方案。本发明具备检测通量高、灵敏度高、特异性高的特征，能高效的监控乳腺癌复发实时情况，且灵敏度可以达到1％，样本的DNA浓度可以低至0.1～1ng/ul。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。

实施例

一、探针合成

探针合成基于亚磷酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

步骤如下：

第一步：将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。

第二步：将合成DNA的所需原料、亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步：带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。最终产物通过氨水高温处理，合成的目标探针从固相载体被切下来，通过脱盐段纯化后进行定性定量分析。

二、监控检测乳腺癌实时复发

(1)将收到的全血样本在1600g 4℃下进行血浆分离，血浆安排使用QIAGEN QIAmpCirulating Nucleic Aicd Kit(50)进行cfDNA提取；全血安排使用博日MagaBio plus全血基因组DNA纯化试剂盒(预分装板)32T试剂盒进行gDNA提取。gDNA使用Covaris超声破碎仪进行片段化。

(2)分别对cfDNA和片段化的gDNA进行文库制备：用DNA聚合酶，T4DNA磷酸激酶在20℃下孵育30min对DNA两端进行末端修复和磷酸化；使用磁珠对酶反应体系进行纯化；接着使用Klenow(3’-5’exo-)在37℃下孵育30min，给DNA3’末端加上“A”碱基；接着使用T4DNAligase在DNA两端加上Illumina测序接头，使用磁珠对酶反应体系进行纯化。

(3)将纯化产区全部用Taq酶和index标签引物进行捕获前文库PCR扩增，扩增完毕以后使用磁珠对酶反应体系进行纯化，使用qubit进行文库定量。

(4)取500ng文库使用乳腺癌复发转移监控的区域特异性探针组对文库进行基因捕获杂交，然后对捕获产物使用通用引物进行捕获后文库PCR扩增。待测DNA样本采用捕获测序技术，针对感兴趣的基因组区域设计特异性探针，将其与基因组DNA进行杂交，富集目标基因组区域DNA片段。扩增完毕以后使用磁珠对酶反应体系进行纯化，使用qPCR和核酸片段分析仪对文库进行质量检测。

(5)将步骤(4)获得的DNA片段，进行大规模的平行测序(二代测序)，仪器获得的结果经数据处理和生物信息学分析，得出样本中含有的拷贝数扩增情况，然后通过大型药物基因组数据库和大数据算法。上机测序反应过程包括Nextseqcn 500测序反应过程，其原理是通过可逆阻断的边合成边测序和CDD阵列采集光学信号来检测合成过程中核苷酸的荧光信号，以此测定DNA的碱基序列。

测序结束后，获得原始测序序列(Raw Data)，进入到生物信息分析阶段，测序数据处理分析包括测序数据的转换、质量评估和过滤、比对、质控、拷贝数变异检测分析等过程。

具体过程如下：

第一步是下机数据转换过程，Illumina产生的下机的数据为bcl格式文件(per-cycle BCL basecall file)，但是下游的分析一般需要fastq格式文件，所以在进行下游分析之前，需要使用bcl2fastq将bcl格式的文件根据每个样本之前添加的index分出，并转为fastq格式的文件。

第二步是原始下机数据质量评估和过滤，质量评估主要通过对测序错误率，数据量等进行统计，评估建库测序过程是否达到了标准，符合标准则进行后续的分析，否则需根据实际情况加测或重新建库；符合标准后，则是对原始测序序列进行过滤，原始序列中含有带接头的、低质量的reads。为了保证信息分析质量，需要对raw reads进行精细过滤，得到clean reads，即有效测序数据，后续分析都基于有效测序数据进行。

第三步是序列比对，有效测序数据通过BWA比对到参考基因组，得到BAM格式的最初的比对结果。然后，用Picard SortSam对比对结果，进行排序；再用PicardMarkDuplicates标记重复reads。

第四步是通过GATK的BQSR(Base quality score recalibration)对bam文件里reads的碱基质量值进行重新校正，使最后输出的bam文件中reads中碱基的质量值能够更加接近真实的与参考基因组之间错配的概率，从而得到一个BQSR后的bam用于后续的拷贝数变异检测。

最后一步是目标基因拷贝数变异检测，使用算法之一为我司开发的基于Read-Depth的CNV calling软件。通过计算肿瘤样本和对照样本的覆盖深度的log2ratio值，还原成0,1,2,3,4这样的拷贝数，得出目标基因的拷贝数状态，若拷贝数状态>5(即log2ratio值>2)则为CNV amplification，代表乳腺癌患者存在高概率的复发，若拷贝数状态<＝1(即log2ratio值<-2)则为CNV loss，代表乳腺癌患者没有复发；另一软件为CNVkit，通过对同一个批次的多个肿瘤配对样本测序进行CNV变异检测，检测结果中直接给出了目标基因的拷贝数和扩增的判定状态。为了降低检测的假阳性，我们结合两个软件确定目标基因拷贝数检出结果，即两个软件的结果一致的情况下，才认为目标基因存在扩增，如果两个软件的结果不一致，则认为该目标基因不存在扩增。

以上所述实施方式仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 监控乳腺癌实时复发

<120> 监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组

<130> 2018.7.6

<160> 53

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagttggagc cagacagcgg ggtggacaag tggcgtgtgt gctgcgaccc cgagggaaga 60

tgaacgggac gcggaactgg tgtaccctgg tggacgtgca cccagaggac caggcggcgg 120

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aatatgctag tcttgtaaag tgcatcaata acttgctggc tggttgtcag gagcagaaat 60

tctggattga ggatgagcag tccaggaatg acctctctac aactagagaa agaagaatgc 120

<210> 3

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcaatgtg ttccctgtag tccaagaacc agggtagccc tgctggagct ctacagagcc 60

atgtgccagg taatctttgt tgtgaaagaa aaaactgttg ggtggtccca gagtcaccac 120

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

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gttgctgtca ttgtcattat tagggcagcg tggacattct caggctgact ctccagggtg 60

aactgacagg agatgaactt gaacacatag cccagaaggt actgcggaat tctggtgggc 120

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttggccagg cgggcaggaa gacctatgcc atggtgtcca gccactcagc tggtcattct 60

ctggcttcag aactggtgga gtcccatgat ggacatgagg agatcattaa ggtaagctta 120

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggtgttctt atttcaggtg tacttgaagg ggaggtctgg agacaagatg attcacgaga 60

agaatattaa ccagctgaag agtgaggtcc agtacatcca ggaggtgggc accccttacc 120

<210> 7

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccctcccct cccaggccag gaactgccta cagaagctcc gggaggatat aagtagcaag 60

cttgacagga acctaggaga ttctctccat cgacaggaga tacaggtaat aggaaatggt 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctaccaattt tatttttctt tgaacaggtg gtgctagaaa agccaaatgg ctttagtcag 60

agtcccacag ccctgtacag cagcccacct gaggtaggta acagaggaca ccatggtggc 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taggtggaca cctgtataaa tgaggatgtt gagagcttga ggaagacggt gcaggacttg 60

ctggccaagc ttcaggaggc caagcggcaa caccagtcag actgtgtggc ttttgaggtg 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttccatgttt gctctttttt ccacaccatt taacatattc ctgctccgtg ttttaggtca 60

cactcagccg gtaccagagg gaagcagaac aaagtaatgt ggcccttcag agagaggagg 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acagagtgga gcagaaagag gcagaagtcg gagagctgca gaggcgcttg ctagggatgg 60

agacggtaac cgggggatct tgcttgtcag tgcctggact cctgggctgg aaggggcctg 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tggcccaccc aggagcatca ggccttactg gcgaaagtga gggaagggga ggtggcccta 60

gaggaacttc ggagcaacaa tgctgactgc caagcagaac gagaaaagta agggcttggc 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tccccagggc tgctaccctg gaaaaggaag tggccgggtt gcgggagaag atccaccact 60

tggatgacat gctcaagagc cagcagcgga aagtccggca aatgatagag caggtaagtt 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctcccacac ctttgcagct ccagaattca aaagctgtga tccagtcaaa ggacgccacc 60

atccaggagc tcaaggagaa aatcgcctat ctggaggcag aggtgtgtgt gctgggcagc 120

<210> 15

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgtgttacag aatttagaga tgcatgaccg gatggaacac ctgatagaaa aacaaatcag 60

tcatggcaac ttcagcaccc aggcccgggc caagacagag aacccgggca ggtgagtgag 120

<210> 16

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tccaaccttc ttttcagtat taggatatcc aagccgccta gcccgaagcc catgcctgtc 60

atccgagtgg tggaaacctg agctgcctgg agatggttgc tgccattgct gctgcctctg 120

<210> 17

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cctcggagaa gcccactgcc cctgttggct gttaacactg cctttgactt cctgactgtc 60

ccctggctgc acccaggact tcgggctcct gtgtctcacc attcccaagc ccctggccac 120

<210> 18

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tctaagctgg gcagacggag cacgagcacc tattcaaggc actgcagccc tttggaagac 60

attgtcctgc aagcaggagc cagggcaata tctatattcc tacagtgact atttttctct 120

<210> 19

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtagagagcc tcccttctgt tgtagactgg actctggctg tgccataagc caggccttca 60

tcagattggg agaggtgaca agatttgcct cagccctaaa agctggagac acagatgtcc 120

<210> 20

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agagtgattg gagaatgtcc tgggggaatg aagttccttc cacaaacaca gctcagttct 60

tagcaacaaa ctgtttgttt ttctacttgc tccatctgca gcctacgctg ccctggcctc 120

<210> 21

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctgcagacag atagtggggt tacctggcaa ggcctggtga gagccagtga acctaagctt 60

tgactgggtg gccttgtctt tctggggagg agggaatgta cattcaggga gtagcctttt 120

<210> 22

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcggaaaaat tctctagggc tacagacagt catgtgtgac ttctctctgc tgtgaaaact 60

cccagagtct ctttagggat tttccctaag gtgtaccacc aggcacacct cagtcttctt 120

<210> 23

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gacccagagc ctgaaaactg ttttcactgg gttccaccag tcccagcaaa atcctctttg 60

tatttatttt gctaagttat tggtggtttt gcttacatct catgattgat ataataccaa 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agttctatag ccttctcttg cagtatttgg atttgcttga aaccgggaaa actgttccca 60

ttaggcttgt taatgtcaga gtgacactat tatgaatctt tctctccctt tcctctgcct 120

<210> 25

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtttcttctc tctttctcct tcaaacttgc tctgcagcta aggaaggtga gtctactttc 60

cctgaggctt tggggtcaga gtatatgttg tttggagaaa gagggcaatc aggactcttc 120

<210> 26

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgggacccag atgagttctt cactagccct tctgaacccc ttgctccata attggtcttt 60

tatcctggct ctgaatgacc ctgcaggtca tcatggtttt ctttttttat tgttttttt 119

<210> 27

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ttgagctact gcgcccggcc catggtgttt ttctttaggg ctcttcctac aaccttgaga 60

agtagatagg catcagagta tggtactata ggaatcagaa aaattcaaaa caaatgtgga 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agataggcat cagagtatgg tactatagga atcagaaaaa ttcaaaacaa atgtggatta 60

agtgtttagg ctctatgtgg ctcacgcagc cagaatcctt aagtctgtgt gtttctgtgt 120

<210> 29

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gtttaggctc tatgtggctc acgcagccag aatccttaag tctgtgtgtt tctgtgtctc 60

aagactgggc tcacattctg gctttgtcca taacaatgct ctgggatttc agggagttcc 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tttcttccct ttctgatatt gttgtctgtg gcatattctt tgtatggcga atttaataaa 60

ttatattaat gtgtctcttt gacctcctgg tctggtttcc tttcactttt cagggaggat 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ctcaatcttg acagaaaaag ggtgcagacg tctggttcaa agagttggat atcaacactg 60

atggtgcagt taacttccag gagttcctca ttctggtgat aaagatgggc gtggcagccc 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

acaaaaaaag ccatgaagaa agccacaaag agtagctgag ttactgggcc cagaggctgg 60

gcccctggac atgtacctgc agaataataa agtcatcaat acctcatgcc tctctcttat 120

<210> 33

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gatgcaaatt ccctgccatg ggattcccca gaaggttctg tttttcaggt ggggcaagtc 60

cgtgggcatc atgttgaccg agctggagaa agccttgaac tctatcatcg acgtctacca 120

<210> 34

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

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gctagagacc gagtgtcctc agtatatcag ggtgaggagg ggctgggtgt ggcgggggc 119

<210> 35

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acccaaaatt ttcattctgc acagtgattg ccacattcac ctggttgaga aaccagagac 60

tgtagcaact ctggcaggga gaagctgtct ctgatggcct gaagctgtgg gcagctggcc 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

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tttcagaaga cctggtaagt gggactgtct gggttggccc cgcactttgg gcttctcttg 120

<210> 37

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

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gaggataaga agattgattt ttctgagttt ctgtccttgc tgggagacat agccacagac 120

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<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

taccacaagc agagccatgg agcagcgccc tgttccgggg gcagccagtg acccagcccc 60

accaatgggc ctccagagac cccaggaaca ataaaatgtc ttctcccacc agacacttgc 120

<210> 39

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ttaaatgaag ggaaaaaaat gattgtcttt atttcctgaa ggctttttga aagcaaagat 60

gagcaacact caagctgaga ggtccataat aggcatgatc gacatgtttc acaaatacac 120

<210> 40

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cagacgtgat gacaagattg agaagccaag cctgctgacg atgatgaagg agaacttccc 60

caacttcctt agtgcctgtg tgagtcggtg tctagcttct caatgttgga ggatacattt 120

<210> 41

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

agccaggctg agccttataa aggactgctc tttgtccaaa cacacacatc tcactcatcc 60

ttctactcgt gacgcttccc agctctggta agtctcacct gcctctttgc gttttctaga 120

<210> 42

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gcagactggc gcgcgcggac ggtcatggga cttcagcatg gcggtgtttg cagatttgga 60

cctgcgagcg ggttctgacc tgaaggctct gcgcggactt gtggagacag ccgctcaccg 120

<210> 43

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tttaacaaaa gtgttcaatt tttctttttc agttggctat tcagttgttg ctatcaatca 60

tatcgttgac tttaaggaaa agaaacaggt aaaataatat ttctaaagtt aataagttca 120

<210> 44

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

aatctgcagt aactatttat cgtttgttgt aggaaattga aaaaccagta gctgtttctg 60

aactcttcac aactttgcca attgtacagg taggtgtttt gttgtttacg aagcataata 120

<210> 45

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

acatcatgtc ttttttaaat agggaaaatc aagaccaatt aaaattttaa ctagattaac 60

aattattgtc tcggatccat ctcactgcaa tgttttggta agttaattat ttttcttctc 120

<210> 46

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ataacattct ttttgtattc ctagagagca acttcttcaa gggcccggct ctatgatgtt 60

gttgcagttt ttccaaagac agaaaagctt tttcatgtga gtaacagata agtaaaagaa 120

<210> 47

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ttttcttctt tacagattgc ttgcacacat ttagatgtgg atttagtctg cataactgta 60

acagagaaac taccatttta cttcaaaaga cctcctatta atgtggtaag tgtactttcc 120

<210> 48

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

aggcgattga ccgaggcctg gcttttgaac ttgtctatag ccctgctatc aaagactcca 60

caatgagaag gtatacaatt tccagtgccc tcaatttgat gcaaatctgc aaaggaaagg 120

<210> 49

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tttacattta tctaagatta atattagtca ctttctattt tgtagaatgt aattatatct 60

agtgctgcag aaagggtaag tctagcatga agtactttgt tttcatcttt caggttataa 120

<210> 50

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aataattttc tcatatctac tctttgttca ttttatttca gcctttagaa ataagagggc 60

catatgacgt ggcaaatctg tatccttttc tgagtaaaaa gttgttgaca ttgtctttca 120

<210> 51

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

atctttaatg ctcccccaag aggcttgctg tttgggctct ctgaaagtga cgccaaggct 60

gcggtgtcca ccaactgccg agcagcgctt ctccatggag gtaagcaagt tcttccagta 120

<210> 52

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tgttttacag aaactagaaa aactgctttt ggaattatct ctacagtgaa gaaacctcgg 60

ccatcagaag gagatgaaga ttgtcttcca gcttccaaga aagccaagtg tgagggctga 120

<210> 53

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

gctttaaagg aactagaatt caacaaagac aacttttgat ctctcatcag agagatcata 60

ctcccaagaa caggctttga cccttcttta aaaggttggt acccaagtat acatttatct 120

Claims (9)

1.监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组，其特征在于，包含53种不同的单链寡核苷酸探针，其具体序列分别如SEQ ID No：1～53所示。

2.如权利要求1所述的监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组，其特征在于，所述寡核苷酸探针组带有生物素标记。

3.如权利要求1或2所述的监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组，其特征在于，还包含目标基因和参考基因。

4.如权利要求3所述监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组，其特征在于，所述目标基因为1号染色体q21.3区域的基因位点。

5.如权利要求3所述监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组，其特征在于，所述参考基因为10号染色体上的基因位点。

6.如权利要求4所述监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组，其特征在于，所述q21.3区域的基因位点为S100A7、S100A8和TUFT1。

7.如权利要求5所述监控乳腺癌实时复发的寡核苷酸探针组，其特征在于，所述10号染色体上的基因位点为RPP30。

8.一种监控乳腺癌实时复发的检测方法，所述方法包括步骤：

(1)制备能够体现生物样本DNA信息的总核酸片段；

(2)将步骤(1)获得的DNA片段进行PCR扩增，建立文库并定量；

(3)将如权利要求1～7任一项所述的寡核苷酸探针组与步骤(2)的文库进行杂交，然后对杂交产物使用通用引物进行PCR扩增；

(4)通过生物信息学分析的方法，确定样本中含有目标基因的拷贝数。

9.如权利要求1～7任一项所述的寡核苷酸探针组用于乳腺癌实时复发监控检测的用途。