CN110438220A - 纤毛不动综合症基因面板试剂盒及其应用 - Google Patents

纤毛不动综合症基因面板试剂盒及其应用 Download PDF

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CN110438220A CN201910760042.8A CN201910760042A CN110438220A CN 110438220 A CN110438220 A CN 110438220A CN 201910760042 A CN201910760042 A CN 201910760042A CN 110438220 A CN110438220 A CN 110438220A
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Abstract

本发明涉及生物医药技术、疾病诊断领域，具体提供一种检测纤毛不动综合症致病基因遗传突变的基因面板(Panel)捕获试剂盒及其应用。该基因面板的液相捕获试剂盒包括49个纤毛不动综合症相关致病基因对应的探针。本发明的基因面板捕获试剂盒的设计综合了纤毛不动综合症多层次、多方面的纤毛遗传缺陷的致病因素，覆盖全面，其目标捕获具有明显针对性，可同时对较大通量的致病基因进行准确捕获、遗传检测。通过对人的目标基因外显子区域DNA进行高效富集，然后在二代测序平台上进行高通量、高深度测序，能有效提高基因的测序深度及覆盖度，为获得更为精确的基因致病性遗传突变信息，为疾病的预防以及诊断提供便利。

Description

纤毛不动综合症基因面板试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体提供一种检测纤毛不动综合症多基 因、多位点的基因面板(Panel)捕获试剂盒的设计及其应用。
背景技术
原发纤毛运动障碍(Primary ciliary dyskinesia，PCD)是一种因纤毛结构 缺陷导致的活动障碍，从而引起纤毛功能异常的常染色体隐性遗传病，发病 率约1/10000至1/20000。PCD患者临床表现为反复的呼吸道感染、鼻窦炎、 支气管扩张、内脏转位、不孕不育等，严重影响患者的生活。纤毛不动综合 症(Kartagener syndrome,KTS)为原发纤毛运动障碍的一种，其临床表型还包括 内脏转位。人体内的纤毛结构与以下组织或器官及功能密切相关：如呼吸道、 咽鼓管、输卵管、输精管等。KTS导致的不孕不育男性居多，多表现为无精 症等，女性相对较少，即使怀孕也会由于其携带相关致病基因，存在有极高 的风险导致出生后代具有先天性缺陷的发生，给社会造成较严重的经济损失 与家族负担。由于KTS胎儿的临床症状极不明显，利用B超等常规产前检查 手段来检查、确诊KTS极其困难。因此，开发新的检查手段或技术，确定KTS 患者的致病因素，并准确、有效地对KTS患者的胎儿进行更为明确的诊断， 具有重要的现实意义。
一般KTS的诊断可根据先证者的临床表现和检查结果来判定，如CT/MRI 检查内脏状态、纤毛结构的电镜、纤支镜等检查结果来基本确立，然而仍存 在约30％的纤毛电镜检查阴性的PCD患者漏诊。其次，随着二代基因测序技 术在分子生物学中的高速发展，许多遗传疾病的致病基因被逐渐发现，PCD 目前约有近50个致病基因被鉴定，如DNAH5、DNAH11、CCDC39等，其 中DNAH5占PCD致病基因的15％-29％，国内外均有关于DNAH5致病基因 的遗传位点突变报道。但仍有部分患者的致病基因仍不明确，提示了尚有未 被发现的PCD遗传致病因素。再次，随着KTS研究的深入，大量新的致病基 因被报道，检测的基因数量、内容也需要更新、升级。最后，传统的基因检 测手段覆盖的基因数少，检测的通量较低，无法同时检测大量基因，检测速 度慢、效率低、成本高，如Sanger测序等，通常只能针对部分位点的检查。 因此，开发多基因、多位点的检测技术成为必须。
发明内容
本申请旨在通过设计KTS多个遗传致病基因的特异性生物素探针，利用 试剂盒对目标区域进行捕获、测序，可实现对KTS相关的遗传致病性基因进 行多基因、多位点、全覆盖的准确检测，明确受检者的基因突变情况、发病 因素，为患者的诊断、治疗以及其生育提供指导，指导患者进行明确的产前 致病基因检查，降低出生缺陷的发生，以期实现KTS致病基因的检测在优生 优育筛查或精准治疗的应用，具有重要的现实意义与社会价值。
本发明实施例的目的在于通过设计纤毛不动综合症多个遗传致病基因的 特异性生物素探针，提供一种检测试剂盒。该试剂盒可以对目标区域进行捕 获、测序，可实现对纤毛不动综合症相关的遗传致病性基因进行多基因、多 位点、全覆盖的准确检测，明确受检者的基因突变情况、发病因素，为患者 的诊断、治疗以及其生育提供指导。本发明的方法基于目标区域磁珠法捕获 系统以及全外显子二代测序技术，获得针对纤毛不动综合症的目标基因全外 显子序列信息，通过本发明基因面板对遗传致病性突变位点进行准确检测，该基因面板可用于纤毛不动综合症患者及高风险的相关群体的遗传致病因素 检测、风险评估、疾病诊断、遗传咨询以及胎儿产前遗传筛查等。
本发明实施例提供的检测纤毛不动综合症的基因面板捕获试剂盒包括以 下目标基因对应的探针：
(一)与纤毛外动臂(ODA)和内动力臂(IDA)缺陷相关的基因(26个)
(二)与内脏转位、精子缺陷相关基因(4个)
DNAH1 GALNT11 DNAH9 WDR66
(三)与纤毛中心管缺陷相关及其他基因(19个)
，
其中每个基因至少具有8个对应的探针序列。
优选地，所述探针序列至少包括SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 49。
优选地，本发明实施例提供了上述用于纤毛不动综合症患者的基因突变 检测的基因面板捕获试剂盒，包括对应的生物素标记的探针以及链霉亲和素 磁珠。
本发明的实施方案包括了基因面板捕获试剂盒系统，以及样品的前处理 实验技术以及后续数据分析的平台，其获得的检测遗传突变信息可用于纤毛 不动综合症患者及高风险的相关群体的遗传致病因素检测、风险评估、疾病 诊断、遗传咨询以及胎儿产前遗传筛查等。
本发明通过对纤毛不动综合症群体的遗传因素研究，结合目前已报道突 变位点，利用生物信息学分析、设计目标基因的捕获探针，并通过Integrated DNA Technologies平台，筛选获得纤毛不动综合症高风险的遗传致病基因序 列，设计整个捕获芯片及基因panel。该panel可对纤毛不动综合症的风险基 因的全编码外显子区域进行目标捕获，获得目标基因序列信息，随后通过二 代测序，准确检测受检者携带的遗传致病基因突变位点，指导遗传咨询、诊 断治疗及产前诊断。
本发明的基因panel的设计综合了纤毛不动综合症多层次、多方面的遗传 致病因素及表型，覆盖全面，其目标捕获可明显提高基因的测序深度，为获 得更为精确的测序结果提供保障。同时，本发明设计可作为纤毛不动综合症 患者明确的遗传致病因素检查，指导遗传咨询、诊断治疗及产前诊断。
附图说明
图1为本发明一个实施例提供的纤毛不动综合症基因panel的检测试剂盒 检测到的受检者遗传突变位点，LRRC6、GALNT11、CCDC40基因突变型及 野生型位点Sanger测序的验证结果。
图2为本发明一个实施例提供的纤毛不动综合症基因panel的检测试剂盒 检测到的受检者遗传突变位点，DNAH5基因突变型及野生型位点Sanger测 序的验证结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白， 以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所 描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种用于检测纤毛不动综合症的基因panel的捕获试 剂盒(用于检测下列基因)，相关基因信息如上所述(49个基因)，这些基 因组成上述基因面板。
具体地，上述检测包括通过探针来对目标基因进行杂交的步骤，即，该 试剂盒包括上述49个基因对应的探针，每个基因至少对应8个探针，因此应 包括392个探针序列，优选地，该探针序列至少包括SEQ ID NO 1–SEQ ID NO 49。
本发明实施例使用的寡聚核苷酸探针利用生物素在5’端进行标记、合成， 探针通过碱基互补配对与片段化的基因组DNA文库杂交，再用链霉亲和素磁 珠(Streptavidinbeads)纯化将目标区域拉下来进行富集。基于生物素标记的 探针信息，通过纤毛不动综合症患者的基因突变的磁珠捕获系统对目标基因 的目标区域进行有效捕获，通过后续二代测序，可用于检测Panel中基因的遗 传突变。
上述链霉亲和素磁珠以及生物素标记探针的合成为本领域技术人员所熟 知的。
上述49个基因均为本发明的基因panel所必不可少的。
基因panel是一个多基因组合系统，在基因检测中使用基因panel检测 基因的所有遗传编码位点，比常规PCR技术检测通量更大，获得的基因信息 量更多、更完整。本设计整合了纤毛不动综合症发生和功能相关的关键基因， 在用基因panel进行基因检测时，核心点在于如何选择基因组合中与疾病风 险评估、诊断及治疗相关的基因，并评估基因信息、突变位点与各临床表型、 诊疗因素、产前诊断等相关性。
本发明提供的上述基因面板(panel)的检测探针及试剂盒，通过发现基 因突变及基因缺陷，可用于针对纤毛不动综合症患者的明确诊断并指导临床 治疗、协助高风险患者进行遗传咨询、风险评估，以及提供明确遗传缺陷信 息指导产前诊断。这些用途主要通过对本发明的基因panel试剂盒对待检测人 群的目标基因进行有效捕获、测序，检测结果进行基因突变位点分析获得。
本发明基因Panel通过自主调研、研发和测算，整合总共49个纤毛不动 综合症密切相关的目标基因，进行探针设计，区域片段大小198.3kbp；总计 探针大于或等于2237个(见表14)，每个基因至少设计8个探针，优选覆盖 98.56％的区域。
本发明的试剂盒中的探针设计基于人类数据库H.sapiens(UCSC hg19, GRCh37,February 2009)；目标区域探针及位置信息基于数据库：CCDS, Ensembl,Gencode,RefSeq。
探针信息如下表1所示：
表1 探针设计相关信息:基因面板(Panel)中生物素标记基因探针示例
发明人利用以上49个基因panel进行捕获、并测序，具体步骤如下：
实施例1基因组DNA样品提取、制备
使用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN,Cat:Y5-51106)对受试者进行 静脉血DNA的提取和纯化，具体步骤如下：
1.取静脉血，常温下1000g离心15min，吸取1ml的血细胞，加DNA裂 解液3ml,旋涡震荡仪充分混匀后，标记名字及日期。
2.吸取20μl蛋白酶K至1.5ml离心管的底部。
加入200μl血液样品至离心管中，再加入200μl Buffer AL至样品中，涡 旋振荡15s混匀。
3.在56℃孵育10min后，快速离心，去除残留在1.5ml离心管盖子中的 液滴。
4.加入200μl的无水乙醇，涡旋振荡15s混匀。振荡完毕后，快速离心， 将混合物转移至QIAamp Mini离心管柱，6000g离心1min。
5.将QIAamp Mini离心柱放入一个新的干净2ml接收管中，将滤液连同 使用过的收集管丢弃。
6.小心打开QIAamp Mini离心柱，加入500μl Buffer AW1，6000g离心 1min。重复步骤5。
7.打开QIAamp Mini离心柱，加入500μl Buffer AW2，20000g离心3min。
8.将QIAamp Mini离心柱转移到一个新的1.5ml收集管，加入200μl Buffer AE。室温孵育1min，然后6000g离心1min。
9.检测浓度，纯度一般以OD260/280＝1.8～2.0为宜。
启动Covaris破碎仪将gDNA打断，并进行浓度定量，制备成长度为 150-200bp的片段gDNA文库。
实施例2目标基因全外显子组捕获、文库构建
设计并合成探针序列，如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.49所示，并标记 有生物素，制备基因Panel液相捕获探针。
将实施例1中所获取的样品经本发明的全外显子基因panel液相捕获探针 系统捕获、检测，获得测序前捕获的目标区域文库结果。
采用本发明的基因panel液相芯片系统，对实施例1的目标基因DNA的 全外显子区域DNA进行高效富集，然后在Illumina Hiseq平台上进行高通量、 高深度测序。建库和捕获实验采用本发明的基因panel液相捕获探针系统，所 选取的配套试剂和耗材由对应供应商提供，包括但不限于本设计列出的试剂 和耗材供应商，各常规实验为本领域技术人员所熟知的。操作均按以下实验 流程及说明书调整适宜方案进行使用，实验流程步骤经优化后进行操作。
实验基本流程如下(注：以下英文名称均为说明书上的名称)：
一、DNA样品制备：
启动Covaris破碎仪，将冷却器温度设定在2℃至5℃之间，确保水浴中 的温度读数显示为5℃。检测确定gDNA样品浓度。用1x Low TE Buffer在 1.5-mL LoBind管中，将200ng gDNA稀释到总体积为50μL，将微管固定在 支架中，按表2设置仪器参数，将gDNA打断成长度为150-200bp的片段。
表2 Covaris剪切设置(SonoLab software v7)
二、文库构建：
2.1末端修复：准备末端修复混合试剂，如表3所示，全程在冰上操作， 旋涡震荡仪上混匀。为保证反应充分，每步反应都应准备过量试剂。
表3 末端修复混合试剂的制备
2.2 PCR板上每孔加入52μL末端修复混合试剂和50μL打断的DNA片 段，充分混匀。PCR板在20℃孵育30分钟。
2.3样品纯化：使磁珠在室温下孵育30分钟后，混匀，加入经末端修复 的DNA中，PCR板每孔加入180μL，吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟 后，再将板放入磁分选装置中5分钟。将板转移到磁性支架上，在每个样品 中加入200μL新配的70％乙醇，静置1分钟后，去除乙醇。添加乙醇和去除 乙醇的步骤重复一次。在热循环器上干燥样品，将样品保持在37℃，持续3 至5分钟，直到残余乙醇完全蒸发，再加入32μL无核酸酶(nuclease-free)的 水到每个样品中，混匀，室温下孵育2分钟。将板放在磁性支架中，放置3 分钟，直到溶液澄清为止。然后将上清液(约30μL)移至新的PCR板，弃去 磁珠。
2.4 DNA片段3'末端腺苷酸化加A：使用表4在冰上制备Adenylation A mastermix，旋涡震荡仪上混匀，对DNA片段3'端腺苷酸化。
表4 Adenylation Master mix的制备
往步骤2.3中获得的经末端修复的纯化后的DNA样品中加入Adenylation Mastermix，每孔20μL，在热循环器中37℃孵育30分钟。
2.5磁珠纯化，操作步骤同2.3，最后用无核酸酶水回溶。
2.6连接DNA片段两端接头：连接酶将A、B接头的3'末端连接到DNA 片段两端。A、B接头都是44bp的双链寡聚核苷酸，不同样品用的接头序列 是不一样的，对应indexprimer。按nuclease-free water：Oligo Mix＝1：10 的比例稀释，现配现用，如表5在冰上制备连接主混合液(Ligation master mix)， 旋涡震荡仪上混匀。
表5 Ligation master mix的制备
往步骤2.5中获得的添加A尾的纯化后的DNA样品中加入Ligation master mix，每孔37μL，在热循环器中20℃孵育15分钟。
2.7磁珠纯化，操作步骤同2.3，最后用无核酸酶水回溶。
三、文库扩增：
3.1如表6所示制备预捕获PCR反应混合液，全程在冰上操作，旋涡震荡 仪上混匀。为保证反应充分，每步反应的应准备过量试剂。
表6 预捕获PCR反应混合液
往步骤2.7中获得纯化后的DNA样品中加入预捕获PCR反应混合液，每孔 20μL，按表7运行预捕获PCR热循环程序。
表7 预捕获PCR热循环程序
3.2磁珠纯化，操作步骤同2.3，最后用无核酸酶水回溶，收集上清用于捕获、 杂交实验。
3.3文库质量和数量评估：使用2100Bioanalyzer和DNA 1000仪器进行 样品分析。分析结果如图1所示，验证电泳图谱显示DNA片段大小约为225 至275bp时出现峰值。峰下积分法检测文库DNA的浓度。Qubit测定DNA 浓度，计算杂交时DNA加入体积。
四、杂交和捕获
4.1将DNA样品杂交到探针，制备捕获文库：
将文库扩增所得产物用于后续探针杂交反应。杂交反应需要样品约750ng DNA。
4.1.1对于DNA浓度高于221ng/L的预处理文库，稀释到221ng/μL， 取3.4μL体积备用。
4.1.2对于DNA浓度低于221ng/L的预处理文库，使用真空浓缩器将 样品在45℃浓缩，再用无核酸酶的水重溶，使其最终浓度为221ng/L。在旋 涡震荡仪上混匀后，在离心机中旋转1分钟。
4.1.3将每个3.4μL的gDNA文库样品(750ng)转移到96孔板，密 封后放置在冰上保存。
4.1.4提前将捕获探针的杂交缓冲液复温。如果出现沉淀，将杂交缓冲 液在65℃中复温5分钟。杂交缓冲液使用前在室温下放置。
4.1.5如表8所示将各试剂混合，制备封闭混合液。制备好的溶液使用 前在冰上放置。
表8 封闭混合液的制备
4.1.6将步骤4.1.3中准备好的gDNA文库样品96孔板取出，每孔加入 封闭混合液。吸管上下混合。
4.1.7然后将96孔板密封后转移到热循环器，在热循环器中95℃孵育 5分钟，然后在65℃中保温5分钟以上。
4.1.8根据捕获文库的大小准备适当稀释的RNase封闭液。为保证反应 充分，在制备过程中，准备过量的RNase封闭液。RNase封闭液使用前放置 在冰上保存。
4.1.9根据表9制备捕获文库混合液，室温下保存备用。
表9 探针捕获文库混合液制备
4.1.10将捕获文库杂交混合液加入步骤4.1.7中的96孔板中，每孔加入 25μL。吹打8至10次混匀。
4.1.11将96孔板密封后，65℃孵育16至24小时。
4.2.杂交产物链霉亲和素磁珠捕获、纯化
链霉亲和素包被磁珠的制备：
4.2.1在循环水浴中，65℃预热Wash Buffer 2备用。
4.2.2在涡旋混合器上充分混匀Dyabead MyOne链霉亲和素T1磁珠。
4.2.3使用新的PCR板，每个样品每孔加入50μL重悬浮珠。
4.2.4清洗磁珠：加入200μl Binding Buffer，抽吸混匀，直到珠子完全 重新悬浮，将PCR板放入磁选装置中。等到溶液澄清后，取出并弃上清液。 再重复两次，总共洗涤3次。
4.2.5用200μL的Binding Buffer重悬磁珠。
4.3.用链霉亲和素包被磁珠捕获杂交DNA
4.3.1估算并记录24小时孵育后剩余的杂交溶液的体积。
4.3.2在使用多通道移液器每个杂交混合物的整个体积(大约25至29μL) 转移到4.2.5准备好的含有200μl链霉亲和素磁珠的PCR板中，保持在65℃， 缓慢地上下抽吸，直到珠子完全混合。
4.3.3密封PCR板后，在96孔板混合器上混合孵育，在室温下剧烈搅 拌(1400-1800rpm)30分钟，确保样品充分混合。
4.3.4简单离心后，将板放入磁选装置中收集磁珠。待溶液澄清后，取 出并弃上清液。
4.3.5在200μL的Wash Buffer 1重悬磁珠。上下抽吸，直到珠子完全重 新悬浮。
4.3.6将样品在室温下孵育15分钟后，重复步骤4.3.4一次。
4.3.7用65℃预热的200μL的Wash Buffer 2重悬磁珠。上下抽吸直至 珠子完全悬浮。热循环器上65℃孵育样品板10分钟后，放入磁选装置中。 等溶液清澈后，去除上清液。共洗涤3次，确保Wash Buffer 2在最后的操作 中被完全去除。
4.3.8每个样品孔中加入30μL无核酸酶水，抽吸混匀，重悬磁珠，置 于冰上备用(用于步骤5.1.5)。
五、样品Indexing及捕获后PCR文库
5.1用索引引物(indexing primers)扩增捕获的文库
此步骤中，DNA文库在PCR反应中被扩增，PCR反应中包含适合每个 样品的indexing primer。
5.1.1为每个样本分配适当的index。获得用于在这个步骤中扩增DNA文 库的8bpIndexes从A01到H12的indexing primers的部分序列。在同一条lane 上使用不同的indexing primers对每个样品进行测序。
5.1.2准备适当体积的PCR反应混合物，如表10所示，在冰上制备，旋 涡震荡仪上混合。
表10 捕获后PCR反应混合物的制备
5.1.3在新的PCR板中，每个样品孔加入31μL捕获后PCR反应混合物。
5.1.4选取不同的indexing primer，往步骤5.1.3中的PCR板中每孔添加 5μL。
5.1.5将DNA文库样品添加到PCR反应体系中：从冰中取出含有30μL 富集靶DNA磁珠样品的PCR板(步骤4.3.8中获得)，将每个DNA样品上 下抽吸直至珠悬浮液均匀，然后将14μL的样品转移到含有PCR反应混合物 和indexing primer的PCR板中，混匀。将剩余磁珠样品储存在-20℃以备将来 使用。
5.1.6将PCR板转移到热循环器，并运行表11所示的PCR扩增程序。
表11 捕获后PCR扩增程序
5.1.7 PCR程序结束后，简单地离心PCR板。
5.2样品纯化：使磁珠在室温下孵育30分钟后，混匀，每个含50μL扩 增DNA样品的孔中加入90μL清洗磁珠，抽吸10次充分混匀。室温孵育5 分钟后，放于磁力分选装置中直至溶液清澈，弃去每孔中的上层清澈液体。 再将板放入磁分选装置中5分钟。将板转移到磁力架上，在每个样品中加入 200μL新配的70％乙醇，静置1分钟后，去除乙醇。添加乙醇和去除乙醇的 步骤重复一次。在热循环器上干燥样品，将样品保持在37℃，持续3至5 分钟，直到残余乙醇完全蒸发，再加入32μL无核酸酶(nuclease-free)的水到 每个样品中，混匀，室温下孵育2分钟。将板放在磁性支架中，放置3分钟， 直到溶液澄清为止。然后将上清液(约30μL)移至新的PCR板，弃去磁珠。
5.3文库质量和数量评估，操作流程如步骤3.3
5.4调整样品池的量和最终浓度到合适状态。
六、上机测序
库检合格，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行Illumina Hiseq平台 测序。
七、数据分析与处理
经过数据比对、生物信息学序列分析，个性化数据过滤和解读；最终确 定目标基因中具有致病性的SNP位点，包括风险位点、与药物治疗剂量相关 位点等。
八、Sanger测序验证Panel检测结果的准确性
选取通过基因panel捕获后测序检出的阳性位点，作为本发明Panel检测 纤毛不动综合症遗传信息的有效结果，并设计对应的Sanger测序引物组合验 证位点的可靠性。
实施例3应用实施例
利用实施例2基因panel液相芯片系统捕获并检测出的致病位点信息，制 备对应的引物组合，验证结果。
下表12为本发明实施方案中应于基因panel捕获并检测出的致病位点信 息：
表12 遗传致病位点信息
为验证本发明实施方案中基因panel捕获并检测出的致病位点的准确性， 利用下表13中的Sanger测序引物进行验证：
表13 引物序列
上述引物的设计是本领域技术人员利用现有的工具可以处理的。利用引 物对受试者的DNA进行扩增调取对应的基因序列进行测序。基因扩增及基因 序列测序为本领域技术人员熟知。根据测序结果分析患者的基因突变情况， 验证确认Panel对目标区域的捕获测序结果的准确性。图2显示了利用本发明 的试剂盒(针对纤毛不动综合症的基因panel)对患者对应基因扩增后的部分 测序验证结果，其中箭头指向位点为突变位点。其中图2显示的是DNAH5 位点突变、野生型的情况。
表14为本发明实施例涉及的全部2237个探针对应位置的详细信息
表14
本发明提供了一种针对纤毛不动综合症的49人遗传致病性基因panel试 剂盒，利用该基因panel捕获试剂盒可以捕获49个目标基因的外显子区域并 检测出相应的致病性遗传突变位点。利用该基因panel捕获系统获得基因的遗 传突变信息，明确受检者的基因突变的携带情况、发病因素，为患者的诊断、 治疗以及其生育提供指导，指导患者进行明确的产前致病基因检查，降低出 生缺陷的发生，以期实现KTS致病基因的检测在优生优育筛查或精准治疗的 应用，具有重要的现实意义与社会价值。。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本 发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市人民医院
<120> 纤毛不动综合症基因面板试剂盒及其应用
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggaaaagg tggacgctgt tgtctctttc tctttctgct ctgatgtagt gcgtgtgcta 60
agctcaggtc tgagcacggt ggatcccatg ggtgtggctc tgaggaaatt gacgcagtgg 120
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcacgatggc tactggggag ctcggggact tgggtggcta ctacttcagg ttcttgcctc 60
agaaaacctt ccagtctctg agctctaagg agatcaccag ccggctccgc cagtggtgag 120
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctgcccgc cgcagcccgg gcgttgaagg tagtaaagcg gccacccggc cgcatcatgg 60
tgaccccctg tcccaccagc ccctcgagcc ccgccgcccg agcggggagg cgggacaacg 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtcccggcc cggccggatg ttgacagcgt cgcctagcaa cgggaaatgg cggaaccggg 60
cggcgcggcg ggccggtaag ccgggccgag gggcagcggg tcttggagtc gccaggccgc 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcgtggaa acgttgccgg aagtggagac tgaaagcggc ggaagggacg ctggaatgtg 60
gagcggttgt ggggcggcag ctgcggaact gcgcgattgt ggttcccgcc gtatttcccg 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacgcgggcc gaggcagacc gaggcttctt tcccggatcc aatcccctgc ccccatgcct 60
aagaaagaaa aaatggccaa gacgcccctg tccgatgaga agcagctgct tctgtttcag 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcttatatgt ccatccctac aggagcccca ccctgtttgg ccaggatgcc tttgggacgc 60
ttggcaggga gcgcccgctc cgaggaggga agcgaggcat ttctggaggg aatgggtaat 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgccgtcca cacccacaca tgcaccctcc ggttgccccc tgtaagaaac tgaggtgccc 60
tcccacccgc tcgttcacac ctacacgagg ccggagcaaa ggtcagtatc caccgcaccc 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcccccgtcc cgaaggggac tcgaaaatgt acagccagcg gtttggcacc gtacagcggg 60
aggttaaggg ccccaccccc aaagtggtga tcgtggtaag cacaggatat gtctgccaga 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tatccgtttg cagtcatgag tagcgaattc ctggctgagc tgcactggga ggatgggttc 60
gccatcccgg tggcgaacga ggagaacaag ctactggaag atcaggtgag atcaattgaa 120
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgactgtcc actgacatgt attccctttg ccttcccagg cacaggccat ggaaaggaat 60
gacatcatca acttcaaggc tttggagaaa gagctgcagg ctgcactcac tgctgatgag 120
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagtaaggat gacttttcgg gccacagata gtgaatttga cctgacaaat attgaagagt 60
atgccgaaaa ttctgcactt tcaagactga ataatataaa agccaaacaa agagtgagtt 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tataattcta ggtttcgaag tataaagcat tccgcacgac gggggatgga gaaggatgct 60
gaagatggcg ccccttctga gggagcagag gctcctccct ctacggaaga ggctgcccct 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agggaaaccg atgcagctgg aggccgcgcg cgatgcggct cgcggaggag cgggccgcgc 60
tcgcggcgga gaacgcggat ggggaacccg gcgccgaccg acgactgcga ctcctgggga 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggccaagat gacaatggcc ccggacgtca gactagagta tctggaggaa gttgcctcca 60
tcgtcctgaa gttcaagccg gacaagtgga gcaagctgat aggcgccgag gagaacgtgg 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcgaccgcg gaggagggtg ggcgcctgcg gaggtgtcct cgctcacttc ggggggccca 60
gagtctcggg tgaggagcca gccggcctcg cgttccctcg gacggttgcc caatggcagc 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccctgagaag cagcatggag cagcctaaca gtaaaggcta tagcctggga aggacccctc 60
agggcccaga gtgcagcagt gctcctgcag tccaagtggg gacccacagg ggcctagagt 120
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgagggagc gttttgtagg ctctccaggg gttgagatga ttcctgcttc tgcgaaggct 60
ccccataaac agcctcataa gcaggtaacg tacgcacacc ttccttctga tgacctctga 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gccgtcgccg ccgccgcgcc ggaagagtcc gcggaccggt ccggaactga cggccaggcc 60
tgcgcttccg ctcgcgaggg ggaggcggga cccgcgagga gtcgcgcgga ggacggaggc 120
<210> 20
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctccctctgc cccccagcag ccggcaccat ggagattgtg tacgtgtacg tcaagaagcg 60
cagcgagttc gggaagcagt gcaatttctc ggaccgccag gccgagctga acatcgacat 120
<210> 21
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acgcgcactg accccgcggg ccctagcaac cagagcagtg acagtagcaa ccgccggaat 60
ggtgagtacc tttcgggccg cgtagccaaa gctgagagaa gattgggagt ggaaaagggt 120
<210> 22
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggtggtgcgg agggagccgc ctagggacca gggactcctg ccatgaatcc gccggggtcc 60
ctagaggccc tggacccgaa cgtggacgag cacttgtcca cccagattct cgcgccctcg 120
<210> 23
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tccgccgcga acctgggccc cccaaagctg cggggcgttc ggtgtcgccg aagtaaacat 60
gcaccctgag ccctcggagc ctgcgacagg tggtgcagca gagctggatt gcgcgcagga 120
<210> 24
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcaaccaagc aggcgcaaga agcaaccagc cgcgctatcc gctcccgttg ctaccggaat 60
gcctcttcag gttagcgatt acagctggca gcagacgaag actgcggtct ttctgtctct 120
<210> 25
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcgggcctcg ctcactctca ttggtcagtt gctcgctgtg gtcccatccc acatgcttcc 60
attgcttgat tcctcgaaaa gggcggggac tctgggcagc ggttgtggag tgccgcgggt 120
<210> 26
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agggcctgac tgccagctag ccagccatgg gccaggatta ttactctgtg ctcgggatca 60
ctcgcaattc agaggatgcc cagatcaagc aggcgtaagt tggggtggga gccaggcctt 120
<210> 27
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcttccgggg gcgggcgccc tggtcccgga gtcgccgctg ggcctgtccg ctggcgtcat 60
ggtgagcagg ggcgggagcg gggctggggt cctcggcagg ggcccggaga cctcggggca 120
<210> 28
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cagtgggaga ggggaggtgc ccacctcctg ccctgctggg gtccagccat gtcccagcct 60
gcgggaggca ggaggaagcc caggacccta gggccgcctg tgtgcagtat ccggcctttc 120
<210> 29
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
taggctgtgc ggctccgtgg ttaccgtggc aacggacggc aacagctcgg gcggcgcatg 60
gagagtgcgg gcggcttcaa gctgggtatg gagcccctca gcggcggcgg ggtctgtgag 120
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agatggcggc gctgggggtg gcggaggccg tggcggcccc acacccggct gagggggccg 60
agacggctga ggcggtggag ctgagccgcg ccctgagccg cctgctgccg gggctggagg 120
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agcgtcattc gaggtccggg tccggcttgc ggggtcagcg aactggagag gcgccatggg 60
ctggagtaag cccccctcca ccttccgtcc tcgatcgttc cccttgtgga agtagtcccg 120
<210> 32
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcactgtgcc tctgtcagca ggtgacatgt gaatggatct gggctgggac agatcccgtg 60
ggcctcggcg gagcacctcc agcgtccggg tgcgggagct gagctggcaa ggcctgcaca 120
<210> 33
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tcgctgcccc agcccgggcc gccgcctccg agcagtcggc acccggaggc aggaggcaca 60
atgcaggcgt gcgggggcgg cgcggccggc cgtcgggcct tcgacagcat ctgccccaac 120
<210> 34
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agggatccct aataaaatca gctatgagga caacaaggtg aagaatgaaa ccaatttacc 60
ttcacaatca tctaaaggta actaccatga agttgtgttc ctaaatacat attcacctgg 120
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cctacttaaa aatttttctt tctttttcct atgatagtag ataaatggca agcaaaaaac 60
gagaagtcca gttacaggtg ggtctgacat atcaacaatt ctttatctgg tgcactagtg 120
<210> 36
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agaaaagtaa aatacctctt tctgattatc tttttcttca gataatggaa tctgaaaata 60
tggattctga aaatatgaag acagaaaata tggaatctca aaatgtagac tttgagagtg 120
<210> 37
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctacagcctc ctggccccgg cgcaggctgc ccgtactgcc cgtggcatga gggagccgga 60
agagctgatg cccggtgagt tgcgcccgcg ccggtggcgg aaggccggga gggagggtcc 120
<210> 38
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cagccaccgt tgccccgcag gcctcaagga tgacggtcaa gccagccaag gccgcctccc 60
tagccaggaa cctcgcaaag cgcaggcgca cctacctggg tggcgcggct gggcggagtc 120
<210> 39
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gctgtgatcc aggctggggc gagaccatgt cggacctggg ctcggaggag ttggaggagg 60
agggagagaa tgatattggg gtgagagctc ctggtgagaa agggcttccc agggtgcgca 120
<210> 40
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gacctgatgg acgccgacag cctcctgctg tctctggagc tggcgtccgg cagtgggcag 60
ggcctcagcc cggaccgtcg ggcctcgctg ctcacgtctc ttatgctggt taagcgcgac 120
<210> 41
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tttcttgaac tgcttccatg gaggactcaa cctccccgaa gcaagaaaaa gaaaaccaag 60
aagaactagg ggaaacaagg cggccatggg aaggaaagac agcagcttct ccccaatatt 120
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agtattattt atacattaga ttaataactt ttaaatattg tatttcagct atgaccacca 60
aagattatcc atcattgtgg ggctttggaa caacaaaaac attcaaaatt cccattgaac 120
<210> 43
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggatggagca gtgagcgggt ctgggcggct gctggcagcg ccatggagac ggtacagctg 60
aggaacccgc cgcgccggtg aggggccact ggctaagagg acgggcatgg ggtcagggga 120
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gatcctgaaa cctctgtcat ggaaaagtac cacgtgttgg agatgattgg agaaggctct 60
tttgggaggg tgtacaaggg tcgaagaaaa tacagtgctc aggtgttgca caaagaggga 120
<210> 45
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
accatgtcgg accccgaagg cgagaccttg cgaagcacct ttccctctta tatggccgaa 60
ggcgagcggc tctacctgtg cggggaattt tctaaagccg cgcagagctt cagcaacgtg 120
<210> 46
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gaggacagag tccagaccac aaggatctgg agctcaggag agactcgtgg gccacagccc 60
gagaaagcgc tgggaatcca aatactatgg cgattggcag tcgcgtaggc gaggcgggct 120
<210> 47
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tgggaagctg agggccagct ggttattatg gtcaaaatct ctctagagga aactctacag 60
agaagaatgt cagatgcagc agaagctccc cgagaagcaa caggagaaaa tggagaaaca 120
<210> 48
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tgtggatctc aggacagccc agacccctga acactgggtg ctccgtgggg ttgcccttct 60
gtgtgatgtc aagtaacatg tggggagtgt ccccacccaa tgctttggaa aatgcaagat 120
<210> 49
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gacaatggcc cttcagctat gctaggtcta taatgggaag tgtcacagtt cggtatttct 60
gttatgggtg cctttttaca tctgcgacct ggacagtttt gctttttgtt tatttcaact 120
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
caggcagact tcgacacact 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
caggacctct gtgtgagtgg 20
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttaaatcccg gcaccattta tc 22
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aacacaaatg cgttaacaac ac 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cttcaccaaa ctcctcctct ac 22
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aagttgagca tatttgaacc ctaac 25
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
caacctggca agattgaaga ttt 23
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
actaaagaca tgggacgatg c 21
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gacttcaacc tagagacaac ctaa 24
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gcaaatccga taaggcacat ac 22

Claims (8)

1.一种检测纤毛不动综合症的液相基因面板捕获试剂盒，包括针对以下目标基因的探针序列：
(一)与纤毛外动臂和内动力臂缺陷相关的基因
(二)与内脏转位、精子缺陷相关基因
DNAH1 GALNT11 DNAH9 WDR66
(三)与纤毛中心管缺陷相关及其他缺陷相关的基因
，其中每个基因至少具有8个对应的探针序列。
2.根据权利要求1所述的液相基因面板捕获试剂盒，其特征在于，所述探针序列至少包括SEQ ID NO1-SEQ ID NO49，且所述探针序列5’端标记有生物素。
3.根据权利要求1所述的液相基因面板捕获试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为液相芯片，所述液相芯片还包括链霉亲和素磁珠。
4.根据权利要求1所述的液相基因面板捕获试剂盒，其特征在于，所述探针对于目标基因的基因度覆盖不低于98.56％。
5.探针序列SEQ ID NO1-SEQ ID NO49用于制备捕获、检测纤毛不动综合症的液相基因面板的试剂盒的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括链霉亲和素磁珠。
7.根据权利要求1所述的液相基因面板捕获试剂盒，其特征在于，所述探针序列的数量为2237。
8.根据权利要求1所述的液相基因面板捕获试剂盒，其特征在于，所述探针序列对应的位置如表14所示。
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