CN108360074A - 一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，本发明首先对动物组织进行前处理，剪碎后过滤，利用细胞分离液进行单个核细胞分离，保证收集的单个核细胞细胞活性较高，加入DnaseI消化死亡细胞的DNA，并利用细胞洗涤液进行洗涤，有效降低背景干扰和成本，再进行Tn5转座酶切反应与纯化，qPCR确定建库所需循环数，最后对得到的单个文库进行等摩尔混合，采用优化过的两轮磁珠比例分选得到高质量的上机文库，为广大科研人员研究动物组织淋巴细胞易接近转座酶核染色质高通量测序提供重要的实验方法参考。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法。
背景技术
淋巴细胞在免疫反应过程中起着十分重要的作用，它的数目和功能状态反应了机体所处的免疫状态，与一些先天或后天的免疫缺陷性疾病、传染性疾病以及恶性肿瘤等免疫功能障碍等疾病有密切关联。因此，研究淋巴细胞对各种疾病的诊断、预防及治疗有着极为重要的意义。
ATAC-seq是通过使用高通量测序对转座酶可接近性核染色质区域进行分析(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)的一种创新表观遗传学研究技术。该技术通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。
真核细胞将基因组DNA与组蛋白通过不同层次的折叠组装成染色质，这些精密组装信息在基因转录调控中起决定性作用。染色质区域的可接近性是特异性反式作用因子和顺式调控元件相互作用的前提，基因表达的异常或者染色质调控因子的改变都将对细胞的命运产生深远的影响，进而导致各种疾病的发生与发展。目前该技术已被广泛应用于转录调控序列的鉴定。ATAC-seq技术可运用于所有真核细胞重编程的研究，在医学领域是重大疾病发病机制、药物作用机制、新药研发和生物标志物功能等研究的新一代有利工具。
染色质结构在促进基因表达控制方面起着关键作用。转录因子结合的顺式元件通常与染色质区域的可接近性相关。因此，在动物基因组中识别这些可接近性区域，将有利于提高对转录因子结合、染色质状态和基因表达调控三者之间关系的理解。ATAC-seq现在通常被用于系统地鉴定动物基因组中的顺式调控区域和DNA足迹，目前，这种方法应用于培养的单细胞悬液中已逐渐普及开来，但直接利用组织进行淋巴细胞检测实验仍未见报道，一是大大节约了时间周期，无需先将组织消化进行培养；二是为一些科研单位没有条件进行细胞培养，时间紧迫想直接利用收集的动物组织进行ATAC-seq研究提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，大大的节约了时间周期和解决了一些硬件条件限制，采用优化过的实验条件，有效降低了背景干扰，通过两轮磁珠分选，保留最佳上机测序文库大小，从而得到高质量上机数据，为组织淋巴细胞易接近转座酶核染色质的研究提供重要的实验方法参考。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，包括以下步骤：
S1：动物组织经剪碎过滤处理后，得到单细胞悬浮液A；
S2：对单细胞悬浮液A进行单个核细胞分离，得到单个核细胞液B；
S3：对单个核细胞液B进行细胞裂解转座反应与纯化，得到转座产物C；
S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；
S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；
S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。
作为优选，S1具体步骤如下：在超净台中摘取动物组织10～20mg，用眼科剪将组织在5mL分离液中剪成匀浆状，收集细胞悬液，以200目尼龙网过滤，除去组织碎片，得到单细胞悬浮液A。
作为优选，S2具体步骤如下：将单细胞悬浮液A转移至新的离心管中，向离心管内的单细胞悬浮液A上加入500μL RPMI-1640培养基(保持液面分界明显)，进行离心操作，吸取中间的淋巴细胞液层即得单个核细胞液B(位于上部覆盖层RPMI-1640培养基下方，底部分离液上方)。
作为优选，离心操作时，离心力为800～1200×g，离心时间20～45min。
作为优选，所述分离液组分构成如下：Iodixanol 12％～20％，RPMI-1640培养基70％～80％，超纯水8％～12％。
作为优选，S3具体步骤如下：取单个核细胞液B，用预冷的PBS洗涤两次，加入RPMI-1640培养基和DnaseI消化20～30min后洗涤进行细胞计数，吸取5000-50000个细胞，加入1mL细胞洗涤液I洗涤后离心去上清，加入50μL细胞裂解液裂解后，再加入1mL细胞洗涤液II混匀离心弃上清，立即进行转座反应，加入Tn5转座酶和酶切缓冲液后，37℃水浴反应30～70min，对水浴后的转座产物进行纯化，得到转座产物C。作为优选，加入DnaseI的终浓度为100～200U/mL；离心条件为4℃、500×g离心10min；细胞洗涤液I配方为：10～20mM Tris-HCl,pH7.4；10～20mM NaCl；3～10mM MgCl2，细胞洗涤液II配方为：10～20mM Tris-HCl,pH7.4；10～20mM NaCl；3～10mM MgCl2；0.1％Tween-20(体积比)；细胞裂解液配方为：10～20mM Tris-HCl,pH7.4；10～20mM NaCl；3～10mM MgCl2；0.1～0.5％NP-40(体积比)；0.1～0.5％Tween-20(体积比)；0.01～0.05％Digitonin(洋地黄皂苷，体积比)。
作为优选，S5中确定额外所需PCR循环数，其计算方式如下：根据荧光定量PCR曲线图，取最大荧光值1/4时对应的循环数为额外所需的循环数。该循环数的数值为0～7，优选4～6个循环。
作为优选，S6具体步骤如下：将扩增产物E分别纯化后，得到单一文库，测定单一文库的浓度，根据浓度将多个单一文库等摩尔浓度混合成混合文库，混合文库使用两轮DNA磁珠进行片段分选，保留100～1000bp(优选200～700bp)的DNA片段得到分选后文库，使用核酸分析仪器进行文库质量检测，检测合格后得到上机文库。
作为优选，混合文库使用两轮DNA磁珠进行片段分选，第一轮磁珠的体积比例为0.4×～0.9×，第二轮磁珠的体积比例为0.5×～1.0×。磁珠体积比例×的含义为：DNA磁珠与扩增产物E的体积比。优选的分选条件为第一轮磁珠体积比例为0.5×，第二轮磁珠体积比例为0.7×。
本发明的有益效果是：本发明首先对动物组织进行前处理，剪碎后过滤，利用细胞分离液进行单个核细胞分离，保证收集的单个核细胞细胞活性较高，加入DnaseI消化死亡细胞的DNA，并利用细胞洗涤液进行洗涤，有效降低背景干扰和成本，再进行Tn5转座酶切反应与纯化，qPCR确定建库所需循环数，最后对得到的单个文库进行等摩尔混合，采用优化过的两轮磁珠比例分选得到高质量的上机文库，为广大科研人员研究动物组织淋巴细胞易接近转座酶核染色质高通量测序提供重要的实验方法参考。
附图说明
图1是本发明的方法流程示意图。
图2是实施例1小鼠脾脏组织淋巴细胞的ATAC-seq文库检测图。
图3是实施例2大鼠肿瘤浸润组织的ATAC-seq文库检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
总实施方案：
一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，包括以下步骤：
S1：动物组织经剪碎过滤处理后，得到单细胞悬浮液A；
S2：对单细胞悬浮液A进行单个核细胞分离，得到单个核细胞液B；
S3：对单个核细胞液B进行细胞裂解转座反应与纯化，得到转座产物C；
S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；
S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；
S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。
应用本发明的技术方案，在收集动物组织单细胞悬浮液过程中，利用剪碎再过滤的方法，减少细胞死亡。利用Iodixanol细胞分离液进行单个核细胞分离，可极大程度上消除死亡细胞及红细胞的污染，收集细胞后，加入DnaseI消化死亡细胞的DNA，并利用细胞洗涤液进行洗涤，有效降低背景干扰。利用Tn5转座酶，一方面，所需的细胞数目少，另一方面，Tn5转座酶可在切割染色质活跃区域的同时，为切割好的片段加上接头序列，节约实验所需时间。利用qPCR确定额外所需循环数，可避免因PCR引入的偏好性以及扩增冗余等问题。利用两轮磁珠分选，可保留上机测序最佳文库大小，从而得到高质量上机数据。本发明利用多种技术手段，为动物组织淋巴细胞易接近转座酶核染色质的研究提供重要的实验方法参考。
优选的，S1包括动物组织的称取，组织剪碎及过滤收集。
优选的，S2包括单细胞悬液的单个核细胞分离，离心，单个核细胞的洗涤。
优选的，S3包括单个核细胞的裂解、洗涤、染色质的Tn5转座酶处理，酶切产物的纯化。
优选的，S4和S5包括纯化DNA的PCR，PCR所需额外循环数的确定，剩余PCR产物的继续扩增。
优选的，S6包括PCR产物的纯化，纯化产物的片段筛选，文库浓度检测，文库质量的Bioanalyzer检测，文库的高通量测序，数据的生物信息学分析。
实施例1：
一种适用于小鼠组织淋巴转座酶可接近性染色质分析的建库方法，参照图1的流程图，具体实施步骤如下：
(1)单个核细胞悬液制备
a.细胞分离液配制：Iodixanol 16.0％，RPMI-1640培养基73.0％，超纯水11％，密度：1.088±0.002g/mL；
b.称取20mg小鼠脾脏组织；
c.用眼科剪将小鼠组织在5mL分离液中剪成匀浆状；
d.把悬有脾脏细胞的分离液立即转移至15mL离心管中，覆盖500uL RPMI1640培养基(保持液面分界明显)；
e.进行离心操作，4℃，离心力800×g，离心时间30min，吸取淋巴细胞层，位于覆盖层RPMI1640培养基下方，分离液上方；
(2)单个核细胞计数、洗涤及裂解
a.在收集到的淋巴细胞中加入5mL预冷的PBS洗涤两次后离心弃上清，加入1mL不含EDTA细胞培养基，加入200U的DnaseI 37℃反应30min,结束后离心弃上清，加入1mL预冷的PBS，混匀后进行细胞数量及活性计数；
b.根据计数结果，稀释后吸取40000个细胞，4℃、800×g离心15min，弃去上清；
c.加入预冷的细胞洗液I洗涤一次，离心后弃去上清；
d.加入50uL预冷的细胞裂解液,4℃、500×g离心10min,弃去上清，加入预冷的细胞洗涤液II洗涤一次，4℃800×g离心10min后弃去上清，立即进行转座酶切反应。
(3)Tn5转座酶反应
a.转座酶修饰。转座酶包被接头序列：
Adapter1：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.1)3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’(SEQ ID No.2)，
Adapter2：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.3)3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’(SEQ ID No.4)。
b.加入修饰后的Tn5转座酶和缓冲液进行转座反应。取10μL 5×TTBL Buffer(TruePrep Tagment Buffer L南京诺唯赞生物科技有限公司)，5μL Tn5转座酶，35μL无菌超纯水，移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，37℃水浴反应45min。
(4)酶切产物纯化
a.转座反应完成后，Qiagen MinElute Kit(全称QIAGEN MinElute PCRPurification Kit，Cat No.28204)进行纯化。
b.酶切产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH指示剂I，市售)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column(市售)，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column(柱)放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入26μL Nuclease free water(无核酸酶水)，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
(5)PCR富集
a.冰上配制以下混合液：
。
b.混和均匀后瞬时离心，于PCR仪上进行如下反应：
c.各引物序列如下：
Custom Primer 1(人工序列)：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC index TCGTCGGCAGCGTCAGATGT-3’(SEQ IDNo.5)
Custom Primer 2(人工序列)：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT index GTCTCGTGGGCTCGGAGATG-3’(SEQ IDNo.6)
P5(人工序列)：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’(SEQ ID No.7)
P7(人工序列)：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’(SEQ ID No.8)。
(6)qPCR确定额外循环数
a.冰上配制以下混合液，取5μL PCR产物进行反应，剩余产物置于冰上：
。
b.混和均匀后瞬时离心，于qPCR仪上进行如下反应：
。
c.根据qPCR结果计算额外所需循环数。计算方法为最大荧光值1/4处所对应的循环数。根据计算结果，额外所计需的循环数为6cycles，将剩余的样品放入PCR仪中继续反应。
(7)PCR产物纯化
a.PCR产物用Qiagen MinElute kit进行纯化。
b.PCR产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH indicator I)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入22μL Nuclease free water，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
(8)文库质量评估1：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gelmatrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到过滤柱中，2240×g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“卡”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease freewater。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
Agilent 2100检测结果见附图2，取200-700bp文库范围，数据结果如下：
。
(9)文库片段筛选
a.将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从2-8℃取出，平衡至室温，颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀。
b.根据洗脱溶液体积加入0.5×体积(25μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
c.室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上。
d.将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心取上清于新的EP管中。
e.在管中加入洗脱溶液体积的0.7×体积(35μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
f.室温孵育5min，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心去除上清。
g.保持样品始终置于磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％的乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
h.重复用酒精漂洗一次。
i.保持样品始终处于磁力架上，开盖室温干燥磁珠3min。
j.将样品从磁力架上取下来，加入适量的Nuclease free water。移液器吹打混匀，室温孵育5min。
k.样品置于磁力架上2min，待溶液澄清后，小心转移上清到新的离心管中。
(10)文库质量评估2：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gelmatrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到过滤柱中，2240g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“咔”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease freewater。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
(11)文库上机
根据步骤(10)所得的文库浓度为8.68ng/μL，文库平均大小为358bp，摩尔浓度为36.74nM，将文库稀释到上机要求之后，采用Nextseq500PE150策略进行测序，结果进行生物信息分析。
实施例2：
一种适用于大鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，参照图1的流程图，具体实施步骤如下：
(1)单个核细胞悬液制备
a.细胞分离液配制：Iodixanol 15.6％，RPMI-1640培养基74.4％，超纯水10％，密度：1.084±0.002g/mL；
b.称取20mg大鼠肿瘤浸润组织；
c.用眼科剪将肿瘤组织在5mL分离液中剪成匀浆状；
d.把悬有肿瘤浸润组织细胞的分离液立即转移至15mL离心管中，覆盖500uLRPMI1640培养基(保持液面分界明显)；
e.进行离心操作，离心力800×g，离心时间30min，吸取淋巴细胞层，位于覆盖层RPMI1640培养基下方，分离液上方。
(2)单个核细胞计数、洗涤及裂解
a.在收集到的淋巴细胞中加入5mL预冷的PBS洗涤两次后离心弃上清，加入1mL不含EDTA细胞培养基，加入200U的Dnase I 37℃反应30min,结束后离心弃上清，加入1mL预冷的PBS，混匀后进行细胞数量及活性计数；
b.根据计数结果，稀释后吸取20000个细胞，4℃、800×g离心15min，弃去上清；
c.加入预冷的细胞洗液I洗涤一次，离心后弃去上清；
d.加入50uL预冷的细胞裂解液,4℃、500×g离心10min,弃去上清，加入预冷的细胞洗液II洗涤一次，4℃800×g离心10min后弃去上清，立即进行转座酶切反应。
(3)Tn5转座酶反应
a.转座酶修饰。转座酶包被接头序列：
Adapter1：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.1)
3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’(SEQ ID No.2)，
Adapter2：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.3)
3’-TCTACACATATTCTCTGTC-5’(SEQ ID No.4)。
b.加入修饰后的Tn5转座酶和缓冲液进行转座反应。取10μL 5×TTBL Buffer(TruePrep Tagment Buffer L南京诺唯赞生物科技有限公司)，5μL Tn5转座酶，35μL无菌超纯水，移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，37℃水浴反应30min。
(4)酶切产物纯化
a.转座反应完成后，用Qiagen MinElute kit(全称是QIAGEN MinElute PCRPurification Kit，Cat No.28204)进行纯化。
b.酶切产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH指示剂I，市售)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column(市售)，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column(柱)放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入26μL Nuclease free water(无核酸酶水)，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
(5)PCR富集
a.冰上配制以下混合液：
。
b.混和均匀后瞬时离心，于PCR仪上进行如下反应：
c.各引物序列同实施例1。
(6)qPCR确定额外循环数
a.冰上配制以下混合液，取5μL PCR产物进行反应，剩余产物置于冰上：
。
b.混和均匀后瞬时离心，于qPCR仪上进行如下反应：
。
c.根据qPCR结果计算额外所需循环数。计算方法为最大荧光值1/4处所对应的循环数。根据计算结果，额外所计需的循环数为6cycles，将剩余的样品放入PCR仪中继续反应。
(7)PCR产物纯化
a.PCR产物用Qiagen MinElute kit进行纯化。
b.PCR产物中加入5倍体积的Buffer PB(已加pH indicator I)，混和均匀。
c.将混合液转移至MinElute column，室温下13000rpm离心1min。
d.弃滤液，将column放回2mL收集管中，加入750μL Buffer PE(已加无水乙醇)，室温下13000rpm离心1min。
e.弃滤液，将column放回2mL收集管中，13000rpm空离心2min。
f.转移column至干净的1.5mL离心管中，打开盖子，室温干燥3min。
g.在column膜中心加入22μL Nuclease free water，室温放置2min，13000rpm离心2min收集滤液。
(8)文库质量评估1：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gelmatrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到过滤柱中，2240×g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“卡”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease freewater。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
Agilent 2100检测结果见附图3，取200-700bp文库范围，数据结果如下：
。
(9)文库片段筛选
a.将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从2-8℃取出，平衡至室温，颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀。
b.根据洗脱溶液体积加入0.5×体积(25μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
c.室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上。
d.将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心取上清于新的EP管中。
e.在管中加入洗脱溶液体积的0.7×体积(35μL)的磁珠，移液器吹打混匀。
f.室温孵育5min，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心去除上清。
g.保持样品始终置于磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％的乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
h.重复用酒精漂洗一次。
i.保持样品始终处于磁力架上，开盖室温干燥磁珠3min。
j.将样品从磁力架上取下来，加入适量的Nuclease free water。移液器吹打混匀，室温孵育5min。
k.样品置于磁力架上2min，待溶液澄清后，小心转移上清到新的离心管中。
(10)文库质量评估2：Agilent 2100
a.试剂盒(DNA dye concentrate，DNA gel matrix)室温平衡30min。
b.涡旋DNA dye concentrate 10sec，离心后吸取25μL染料加入到DNA gelmatrix中充分涡旋混匀，瞬离。
c.转移混合液到过滤柱中，2240g±20％室温离心15min。
d.离心的胶染料4℃避光保存。
e.调整压胶器弹夹于C档位(最后一档)，将注射器活塞置于1.0mL处。
f.取出一个新的DNA1000芯片，在标记为G的孔内加入9μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
g.将芯片放在priming station中并关上(priming station正确关闭时能听到“咔”声音)。
h.将注射活塞慢慢向下压直至被弹夹卡住。保持60sec，释放弹夹，活塞自动弹回(活塞应立即弹回到0.7mL的位置，否则可能priming station漏气)。
i.缓慢地将活塞拉回1.0mL位置，打开压胶器将检测芯片取出。
j.向剩余的2个标记有G的孔中加入9.0μL gel-dye mix(移液枪倒吸)。
k.在12个样品孔内和1个Ladder孔内入5μL DNA Marker(绿色)。
l.在Ladder孔内加入1μL处理过的Ladder(Ladder需要分装，每管1.1μL，-80℃保存)。
m.在每个样品孔内加入1μL样本，在未使用的孔内加入1μL Nuclease freewater。
n.将芯片混匀离心1min，制备好的芯片需要在5min内上机检测，检测前需确定每个孔中没有气泡。
(11)文库上机
根据步骤(10)所得的文库浓度为2.68ng/μL，文库平均大小为348bp，摩尔浓度为11.67nM，将文库稀释到上机要求之后，采用Nextseq500PE150策略进行测序，结果进行生物信息分析。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 奥明（杭州）基因科技有限公司
<120> 一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法
<130> 2018.2
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 2
tctacacata ttctctgtc 19
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 3
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 4
tctacacata ttctctgtc 19
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgt 49
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatg 44
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agat 24
Claims (10)
1.一种组织淋巴细胞转座酶可接近性染色质分析的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：动物组织经剪碎过滤处理后，得到单细胞悬浮液A；
S2：对单细胞悬浮液A进行单个核细胞分离，得到单个核细胞液B；
S3：对单个核细胞液B进行细胞裂解转座反应与纯化，得到转座产物C；
S4：对转座产物C进行PCR扩增，得到扩增产物D；
S5：取部分扩增产物D进行qPCR以确定额外所需PCR循环数，根据确定的额外所需PCR循环数对剩余扩增产物D继续扩增，得到扩增产物E；
S6：纯化扩增产物E得到单一文库，单一文库进行片段分选，得到上机文库。
2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，S1具体步骤如下：在超净台中摘取动物组织10～20mg，用眼科剪将组织在5mL分离液中剪成匀浆状，收集细胞悬液，以200目尼龙网过滤，除去组织碎片，得到单细胞悬浮液A。
3.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，S2具体步骤如下：将单细胞悬浮液A转移至新的离心管中，向离心管内的单细胞悬浮液A上加入500μL RPMI-1640培养基(保持液面分界明显)，进行离心操作，吸取中间的淋巴细胞液层即得单个核细胞液B。
4.根据权利要求3所述的建库方法，其特征在于，离心操作时，离心力为800～1200×g，离心时间20～45min。
5.根据权利要求2所述的建库方法，其特征在于，所述分离液组分构成如下：Iodixanol12％～20％，RPMI-1640培养基70％～80％，超纯水8％～12％。
6.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，S3具体步骤如下：取单个核细胞液B，用预冷的PBS洗涤两次，加入RPMI-1640培养基和DnaseI消化20～30min后洗涤进行细胞计数，吸取5000-50000个细胞，加入1mL细胞洗涤液I洗涤后离心去上清，加入50μL细胞裂解液裂解后，再加入1mL细胞洗涤液II混匀离心弃上清，立即进行转座反应，加入Tn5转座酶和酶切缓冲液后，37℃水浴反应30～70min，对水浴后的转座产物进行纯化，得到转座产物C。
7.根据权利要求6所述的建库方法，其特征在于，加入DnaseI的终浓度为100～200U/mL；离心条件为4℃、500×g离心10min；细胞洗涤液I配方为：10～20mM Tris-HCl,pH7.4；10～20mM NaCl；3～10mM MgCl2，细胞洗涤液II配方为：10～20mM Tris-HCl,pH7.4；10～20mMNaCl；3～10mM MgCl2；0.1％Tween-20；细胞裂解液配方为：10～20mM Tris-HCl,pH7.4；10～20mM NaCl；3～10mM MgCl2；0.1～0.5％NP-40；0.1～0.5％Tween-20；0.01～0.05％Digitonin。
8.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，S5中确定额外所需PCR循环数，其计算方式如下：根据荧光定量PCR曲线图，取最大荧光值1/4时对应的循环数为额外所需的循环数。
9.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，S6具体步骤如下：将扩增产物E分别纯化后，得到单一文库，测定单一文库的浓度，根据浓度将多个单一文库等摩尔浓度混合成混合文库，混合文库使用两轮DNA磁珠进行片段分选，保留100～1000bp的DNA片段得到分选后文库，使用核酸分析仪器进行文库质量检测，检测合格后得到上机文库。
10.根据权利要求9所述的建库方法，其特征在于，混合文库使用两轮DNA磁珠进行片段分选，第一轮磁珠的体积比例为0.4×～0.9×，第二轮磁珠的体积比例为0.5×～1.0×。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN111996598A (zh) * | 2020-08-11 | 2020-11-27 | 杭州瀚因生命科技有限公司 | 一种单细胞染色质可及性的建库方法 |
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| WO2014189957A2 (en) * | 2013-05-23 | 2014-11-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Transposition into native chromatin for personal epigenomics |
| CN105463089A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-04-06 | 同济大学 | 应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验的方法 |
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2018
- 2018-02-11 CN CN201810139118.0A patent/CN108360074B/zh active Active
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