CN111996598A - 一种单细胞染色质可及性的建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单细胞染色质可及性的建库方法,包括设计一对可荧光藕连的寡核苷酸链,结合Tn5转座酶制备荧光转座体,解离单细胞悬液,加入针对目标群体特定蛋白的荧光抗体孵育,进行荧光标记,分选富集,进行PCR建库,文库测序。本发明提出的单细胞染色质可及性的建库方法能在保证细胞体内活性的条件下,筛选目的细胞群体;本发明设计一套可荧光藕连的寡核苷酸链,结合Tn5转座酶制备荧光转座体,进行定量操作,适用性广,尤其适用于物种或组织稀少、保存状态较差组织进行构建;适用于占比极少的细胞群体。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,更具体的是涉及一种单细胞染色质可及性的建库方法。
背景技术
核小体是真核细胞染色质的基本结构单位,由DNA和组蛋白构成。每个核小体由146bp的DNA缠绕在八聚体的组蛋白上形成,两个核小体之间通过一段连接DNA相连,DNA与组蛋白的结合可以发生动态变化。缠绕在组蛋白上的DNA不易与其它蛋白结合,这些DNA通常处于表达抑制状态。没有核小体结合的开放的DNA区域易于与调控蛋白相结合,则可以使其下游的基因处于活跃表达的状态。细胞通过改变DNA与组蛋白的结合位置,从而调控基因的表达。因此,获得处于开放状态的DNA序列可用于研究基因表达的调控机制,是表观遗传学研究的热点,而ATAC-seq则是用于这类研究的最佳利器。
作为可以在少数细胞内检测全基因组染色质可及性的高通量测序技术,ATAC-seq(染色质可及性测序)已经被广泛应用于研究细胞生长发育,新陈代谢,疾病发生发展等许多重要的生物过程,如造血干细胞(HSC)的分化,胚胎发育,神经活动和再生,肿瘤细胞转移,以及患者对抗癌药物治疗的反应。近期,处于对检测精度的进一步提升,领域内已经开发了数个实验技术用于捕获染色质在单个细胞/细胞核的分辨率,即单细胞ATAC-seq(scATAC-seq)、单核ATAC-seq(snATAC-seq)和单细胞组合索引ATAC-seq(sciATAC-seq),这显著拓展了研究者发现细胞间表观遗传变异和其他从相同DNA序列产生异质性的基本机制的能力。
然而,在实际应用中人们发现,由于很多起关键调控作用的细胞群体数目通常很少,比如:肿瘤组织中的肿瘤干细胞占比不到1%,胸腺T细胞发育中的双阴性细胞占比不到3%,等等。用上述技术研究相关细胞,所需细胞数目极具增加,造成不必要的成本浪费。如果用流式分选技术,把相关的细胞分选再进行单细胞ATAC-seq测序,又破坏了细胞在机体内的正常生理条件,引入了不必要的误差。因此,缺乏一种技术,能结合单细胞ATAC-seq测序和流式分选,从而获得少量目的细胞的建库技术。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,本发明提出了一种单细胞染色质可及性的建库方法,能在保证细胞体内活性的条件下,筛选目的细胞群体。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种单细胞染色质可及性的建库方法,所述建库方法包括以下步骤:
1)设计一对可荧光藕连的寡核苷酸链;
2)利用步骤1)的寡核苷酸链,结合Tn5转座酶制备荧光转座体;
3)将样本组织在生理条件下研磨,筛选,解离成单细胞悬液;
4)将步骤3)的单细胞悬液固定后,加入针对目标群体特定蛋白的荧光抗体孵育;
5)在步骤4)中加入2)所制备的荧光转座体进行荧光标记;
6)利用流式细胞仪,对步骤5)标记后的细胞进行分选富集,得到对应的细胞;
7)步骤6)分选富集后的细胞,收入孔板中,每个孔中只有一个细胞;
8)针对步骤7)的孔中细胞进行PCR建库;
9)进行文库测序。
作为优选,步骤1)中所述寡核苷酸链的分别为AF488-R1与AF488-R2;其中,
AF488-R1的序列:5'-AF488-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3';AF488-R2的序列:5'-AF488-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3';
步骤2)中Tn5ME转座酶的序列:5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'。
作为优选,所述步骤2)制备荧光转座体是将50个AF488-R1/Tn5ME和AF488-R2/Tn5ME分别在TE buffer中变性,温度95℃5min,冷却至22℃,降温速率0.1℃/s;根据普通ATAC-seq建库流程,将af488标记的适配体组装到Tn5转座酶上,形成荧光转座体。
作为优选,步骤3)为:收集并分离组织,于RPMI-1640中研磨,得到单细胞悬液;计数细胞后,用PerCP-Cy5.5-anti-CD45、PE-anti-CD8a、APC-Cy7-anti-CD4抗体染色,在PBS中室温固定5min,洗涤后计数细胞,完成步骤3)。
作为优选,步骤5):将步骤4)得到的细胞重悬于含NP-40的TD缓冲液中,加入步骤2)制得的荧光转座体混合;55℃进行30min的荧光标记后加入EDTA停止。
作为优选,步骤6):将步骤5)得到细胞置于384孔板中分选、孵育后进行第一轮PCR;然后进行第二轮PCR;收集并纯化。
作为优选,第一轮PCR中,每孔加入4.2微升的缓冲液,第一轮缓冲液为:1微升100微摩尔的MgCl2,3微升的2×I-5PCR mix,10微摩AF488-R1和AF488-R2引物各0.1微升;第二轮PCR中,每孔加入4微升的缓冲液,第二轮缓冲液为:2微升I-5PCR-5Mix,0.5微升Ad1引物和带编码的Ad2引物,1微升ddH2O。
作为优选,所述的分选是将步骤5)中处理过的细胞装载在流式细胞仪上,通过目的抗体和荧光基团筛选被Tn5成功标记的少量细胞,分选后可用于下一步单细胞染色质可及性建库。
本发明的有益效果是:本发明提出的单细胞染色质可及性的建库方法能在保证细胞体内活性的条件下,筛选目的细胞群体;本发明设计一套可荧光藕连的寡核苷酸链,结合Tn5转座酶制备荧光转座体,进行定量操作,适用性广,尤其适用于物种或组织稀少、保存状态较差组织进行构建;适用于占比极少的细胞群体。
附图说明
图1是本发明的建库流程示意图;
图2是流式分选过程图;
图3是分选后T细胞比例图。
具体实施方式
为了能够更清楚的理解本发明的技术内容,特举以下实例详细说明。下面参照附图,用本发明的示例性实施例对本发明进行更全面的描述及说明,但并不意味这本发明仅限于此。
在本发明中PerCP-Cy5.5-anti-CD45、PE-anti-CD8a、APC-Cy7-anti-CD4抗体,是从Biolegend公司购得。
Ad1引物和Ad2引物为ATAC-seq建库扩增通用名词,本领域内通识,故不再赘述。
在一种实施方式中,我们利用小鼠胸腺细胞为试验样本,目的研究小鼠胸腺中的T细胞,并进一步富集含量不足3%的双阴性T细胞。
参见图1,由生工生物技术公司合成了Alexa Fluor 488标记的接头寡核苷酸:
名称Tn5ME,序列:5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3';
名称AF488-R1,序列:
5'-AF488-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3';
和名称AF488-R2,序列:
5'-AF488-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'。
然后将50个AF488-R1/Tn5ME和AF488-R2/Tn5ME分别在TE buffer(Qiagen)中变性,温度95℃5min,冷却至22℃,降温速率0.1℃/s,根据普通ATAC-seq建库流程,将af488标记的adaptor组装到Tn5转座酶上,形成荧光转座体。
从6-8周大的雄性小鼠中分离出胸腺组织,轻轻地研磨在1mL RPMI-1640中。单细胞悬浮液经40叉尼龙网后计数胸腺细胞。用PerCP-Cy5.5-anti-CD45、PE-anti-CD8a、APC-Cy7-anti-CD4抗体(Biolegend)染色,共1×106个胸腺细胞,在含1%甲醛的1×PBS中室温固定5min。用1×PBS洗涤2次后,再次计数细胞。将1×105个固定细胞重悬于含0.1%NP-40的1×TD缓冲液(5mM Tris-HC,pH 8.0,5mM MgCl2,10%DMF)中,浓度为40mol/L。然后加入10个荧光转座体,轻轻混合。在55℃下进行30min的荧光标记,直接在反应混合液中加入200微升的100mM的EDTA停止。将细胞装载在Sony SH800S分选机上,97.9%的细胞被Tn5荧光转座体有效的标记,如果不进行分选,只有3%左右的细胞是双阴性细胞(DN)(见图2)。将CD45+/AF488-Tn5hi群体的单个细胞,按所需要的细胞群体及数目,进一步分选到384孔板的每孔中。在使用前,将用于获取已分选细胞的384孔板加载2×L释放缓冲液(50mM EDTA,0.02%SDS)。分选后,细胞在孔中孵育1min。未立即处理的盘子保存在-80℃。
为制备单细胞ATAC-seq文库,将含有荧光标记细胞的板置于55℃孵育30分钟。然后,在每孔中加入4.2微升的PCR第1轮缓冲液(1微升100微摩尔的MgCl2,3微升的2×I-5PCRmix[MCLAB],10微摩AF488-R1和AF488-R2引物各0.1微升),PCR:72℃10min;98℃3min;98℃10s,63℃30s,72℃1min,共10次循环;72℃3min;保持在4℃。之后,各孔分别加入4微升PCRround 2buffer(2微升I-5PCR-5Mix,0.5微升Ad1引物和带编码的Ad2引物,1微升ddH2O),进行最终PCR扩增:98℃3min;98℃10s,63℃30s,72℃1min共12次循环;72℃3分钟;保持在4℃。收集含有不同Ad2条形码的孔,用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。文库在Illumina HiSeq X Ten系统上进行测序。通过对测序结果的数据分析,我们发现通过本建库方法能有效将少量双阴性细胞富集到20%左右(见图3)。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种单细胞染色质可及性的建库方法,其特征在于,所述建库方法包括以下步骤:
1)设计一对可荧光藕连的寡核苷酸链;
2)利用步骤1)的寡核苷酸链,结合Tn5转座酶制备荧光转座体;
3)将样本组织在生理条件下研磨,筛选,解离成单细胞悬液;
4)将步骤3)的单细胞悬液固定后,加入针对目标群体特定蛋白的荧光抗体孵育;
5)在步骤4)中加入2)所制备的荧光转座体进行荧光标记;
6)利用流式细胞仪,对步骤5)标记后的细胞进行分选富集,得到对应的细胞;
7)步骤6)分选富集后的细胞,收入孔板中,每个孔中只有一个细胞;
8)针对步骤7)的孔中细胞进行PCR建库;
9)进行文库测序。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞染色质可及性的建库方法,其特征在于,步骤1)中所述寡核苷酸链的分别为AF488-R1与AF488-R2;其中,
AF488-R1的序列:5'-AF488-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3';
AF488-R2的序列:5'-AF488-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3';
步骤2)中Tn5ME转座酶的序列:5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'。
3.根据权利要求1所述的一种单细胞染色质可及性的建库方法,其特征在于,所述步骤2)制备荧光转座体是将50个AF488-R1/Tn5ME和AF488-R2/Tn5ME分别在TE buffer中变性,温度95℃5min,冷却至22℃,降温速率0.1℃/s;根据普通ATAC-seq建库流程,将af488标记的适配体组装到Tn5转座酶上,形成荧光转座体。
4.根据权利要求1所述的一种单细胞染色质可及性的建库方法,其特征在于,步骤3)为:收集并分离组织,于RPMI-1640中研磨,得到单细胞悬液;计数细胞后,用PerCP-Cy5.5-anti-CD45、PE-anti-CD8a、APC-Cy7-anti-CD4抗体染色,在PBS中室温固定5min,洗涤后计数细胞,完成步骤3)。
5.根据权利要求1所述的一种单细胞染色质可及性的建库方法,其特征在于,步骤5):将步骤4)得到的细胞重悬于含NP-40的TD缓冲液中,加入步骤2)制得的荧光转座体混合;55℃进行30min的荧光标记后加入EDTA停止。
6.根据权利要求1所述的一种单细胞染色质可及性的建库方法,其特征在于,步骤6):将步骤5)得到细胞置于384孔板中分选、孵育后进行第一轮PCR;然后进行第二轮PCR;收集并纯化。
7.根据权利要求6所述的一种单细胞染色质可及性的建库方法,其特征在于,第一轮PCR中,每孔加入4.2微升的缓冲液,第一轮缓冲液为:1微升100微摩尔的MgCl2,3微升的2×I-5PCR mix,10微摩AF488-R1和AF488-R2引物各0.1微升;第二轮PCR中,每孔加入4微升的缓冲液,第二轮缓冲液为:2微升I-5PCR-5Mix,0.5微升Ad1引物和带编码的Ad2引物,1微升ddH2O。
8.根据权利要求6所述的一种单细胞染色质可及性的建库方法,其特征在于,所述的分选是将步骤5)中处理过的细胞装载在流式细胞仪上,通过目的抗体和荧光基团筛选被Tn5成功标记的少量细胞,分选后可用于下一步单细胞染色质可及性建库。
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