CN109072206A - 转座酶介导的对可接近基因组的成像 - Google Patents

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CN109072206A CN201780021788.6A CN201780021788A CN109072206A CN 109072206 A CN109072206 A CN 109072206A CN 201780021788 A CN201780021788 A CN 201780021788A CN 109072206 A CN109072206 A CN 109072206A
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Abstract

公开了使用转座酶对可接近基因组标记和成像的方法。在一些实施方案中，双功能转座酶复合物或转座体用于将包含化学标记的衔接子选择性地插入活性调控DNA所在的基因组中的可接近位点。各种化学标记可用于在插入位点标记DNA，包括例如用于荧光成像的荧光染料、用于DNA的电子显微镜检查或磁性操作的金属粒子、同位素标签或生物素或其他配体、半抗原、底物或被链霉亲和素、抗体、酶或受体识别的抑制剂。以这种方式标记DNA可用于提供关于在基因组中调控DNA的定位的空间信息，并使得能够基于其调控DNA状态对细胞进行成像和分选。

Description

转座酶介导的对可接近基因组的成像
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院资助的合同HG007735下由政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。
交叉引用
本申请要求2016年3月10日提交的美国临时申请系列号62/306,504的权益，该申请通过引用其全文并入。
背景技术
真核基因组被广泛地压缩在染色质中，除了其接近可控制基因活性的活性调控元件。这些可接近元件在任何给定的细胞类型中占基因组的约1％，并且包括增强子、启动子以及在发育和疾病中关键的其他调控序列。核结构和3D基因组组织与基因表达、复制和DNA修复紧密相关。尽管最近取得了进展，但目前的表观基因组学方法在细胞核的原生环境之外提取调控DNA，并在假想的线性基因组上重建调控，所述调控与活细胞电影中明显的错综复杂的时空组织脱离。
因此，需要更好的表观基因组学方法来研究可接近基因组。
发明内容
本公开尤其提供了使用转座酶标记和分析可接近基因组的方法。本发明的方法可用于捕获空间信息并绘制调控DNA在完整活细胞或固定细胞中的位置。在一些实施方案中，来自可接近染色质区域的DNA可以从单个样品成像和测序。另外，可以对具有通过本发明方法标记的染色质的细胞基于其调控DNA的状态进行分选。
在一些实施方案中，提供了用于检测可接近染色质的方法。在这些实施方案中，该方法可包括获得转座酶复合物，其包含与至少一个DNA衔接子结合的转座酶，所述DNA衔接子中的任一个包含可检测标签；在适合于转座酶与染色质中可接近区域结合的条件下使染色质与转座酶复合物接触；以及检测可检测标签。如果DNA衔接子包含可检测标签，则该方法可包括：获得转座酶复合物，其包含与至少一个DNA衔接子结合的转座酶，所述至少一个DNA衔接子包含转座酶的识别序列和可检测标签；在适合于转座的条件下使染色质与转座酶复合物接触，从而在染色质中的可接近区域使至少一个DNA衔接子与染色质连接；以及检测所插入的DNA衔接子的标签。如果DNA衔接子包含可检测标签，则该方法可包括：获得包含含有可检测标签的转座酶的转座酶复合物，其中所述转座酶与包含转座酶识别序列的至少一个DNA衔接子结合；在适合于转座酶与染色质中可接近区域结合的条件下使染色质与转座酶复合物接触；以及检测转座酶的标签。
该方法可以在活细胞或固定细胞内在染色质上原位进行。可选地，该方法可以在从细胞分离出的染色质上进行。
在一些实施方案中，转座酶是过度活性的转座酶(即，包含一种或多种增强其催化活性的突变或化学修饰)。在一些实施方案中，转座酶是过度活性的Tn5转座酶。
在一些实施方案中，DNA衔接子包含：i)第一寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及ii)第二寡核苷酸，其包含与第一寡核苷酸的一部分充分互补并能够与第一寡核苷酸的一部分杂交的序列，使得DNA衔接子包含呈双链的至少一部分，其中所述双链部分包含转座酶的识别序列。在一些实施方案中，第二寡核苷酸包含选自下组的核苷酸序列，该组由SEQ ID NO：2和SEQID NO：3或其变体组成，该变体包含与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，其中所述DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
在一些实施方案中，转座酶复合物包含与以下项结合的转座酶二聚体：i)第一DNA衔接子，其中所述第一DNA衔接子包含转座酶的第一识别序列和第一可检测标签，以及ii)第二DNA衔接子，其中所述第二DNA衔接子包含转座酶的第二识别序列和第二可检测标签。在一个实施方案中，第一DNA衔接子包含第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性；以及第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在另一个实施方案中，第二DNA衔接子包含第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列；以及第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，其中所述第一DNA衔接子和所述第二DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
在一些实施方案中，第一DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第二寡核苷酸，并且第二DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的第二寡核苷酸。
在一些实施方案中，可检测标签是荧光团、金属粒子、磁性粒子、质量标记、化学发光标签、配体、量子点或半抗原。标记的DNA衔接子在其插入染色质中后的检测依赖于标签的选择，并且可以通过多种方式进行检测。例如，如果用荧光团可检测地标记DNA衔接子，则可以通过进行荧光成像来检测DNA衔接子在染色质中可接近位点的插入。可选地，可以用金属粒子可检测地标记DNA衔接子，在这种情况下，可以通过进行电子显微镜检查或大量细胞计数法(mass cytometry)来检测DNA衔接子在染色质中可接近位点的插入。在进一步的例子中，可以用配体可检测地标记DNA衔接子，在这种情况下，可以使用其结合配偶体(例如，生物素-链霉亲和素、半抗原-抗体或酶-底物)检测DNA衔接子在染色质中可接近位点的插入。在另一个例子中，可以用酶可检测地标记DNA衔接子，在这种情况下，可以使用比色或化学发光测定(例如，采用β-半乳糖苷酶的比色测定、采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的化学发光测定)来检测DNA衔接子在染色质中可接近位点的插入。
在一些实施方案中，该方法进一步包括鉴定可接近染色质中的调控DNA(例如，启动子、增强子或绝缘子的位点)、转录因子结合位点或核小体结合位点。
在一些实施方案中，该方法进一步包括绘制DNA衔接子插入可接近染色质中的位点的位置。
在一些实施方案中，该方法进一步包括对DNA衔接子插入可接近染色质中的位点的DNA进行测序。
在一些实施方案中，该方法进一步包括基于通过本文所述的方法标记细胞中的可接近染色质来分选细胞。
还提供了包含转座酶复合物的组合物。在这些实施方案中，转座酶复合物可包含与DNA衔接子结合的转座酶，其中转座酶或DNA衔接子包含可检测标签。
在一些实施方案中，DNA衔接子可包含i)第一寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，以及ii)第二寡核苷酸，其包含与第一寡核苷酸的一部分充分互补并且能够与第一寡核苷酸的一部分杂交的序列，使得DNA衔接子包含呈双链的至少一部分，其中所述双链部分包含转座酶的识别序列，其中所述DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
在一些实施方案中，DNA衔接子包含选自下组的可检测标签，该组由以下各项组成：荧光团、金属粒子、磁性粒子、同位素标签、量子点、化学发光标签、配体和半抗原。
在一些实施方案中，转座酶包含选自下组的可检测标签，该组由以下各项组成：荧光团、金属粒子、磁性粒子、同位素标签、化学发光标签、量子点、配体和半抗原。在这些实施方案中，例如，可通过使转座酶与活化标签(例如，马来酰亚胺-、碘乙酸盐-、琥珀酰亚胺-酯或异硫氰酸盐-标签缀合物)反应或通过向转座酶添加醛标记，然后使醛标记与荧光团反应，从而使可检测标签直接连接至转座酶(参见，例如，Carrico等人Nat Chem Biol 20073,321–322和Hudak Angew.Chem.Int.Ed.2012 51,4161–4165)。可选地，转座酶可以与荧光蛋白或荧光素酶融合。
在一些实施方案中，转座酶复合物包含与以下项结合的转座酶二聚体：两个DNA衔接子，其中所述第一DNA衔接子包含转座酶的第一识别序列和第一可检测标签，并且所述第二DNA衔接子包含转座酶的第二识别序列和第二可检测标签。在一个实施方案中，第一DNA衔接子包含第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，以及第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ IDNO：2的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性；并且第二DNA衔接子包含第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，以及第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其变体，该变体包含与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有至少约80％-100％序列一致性的序列，包括该范围内的任何百分比一致性，如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性；其中所述第一DNA衔接子和第二DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
在一些实施方案中，第一DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第二寡核苷酸，并且第二DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的第二寡核苷酸。
在另一方面，提供了包含转座酶和至少一个DNA衔接子的试剂盒，所述至少一个DNA衔接子包含转座酶的识别序列。在这些实施方案中，DNA衔接子或识别序列包含可检测标签。试剂盒可以进一步包含用于检测可接近染色质的书面说明书。
鉴于本文的公开内容，本领域技术人员将容易想到本发明的这些以及其他实施方案。
附图说明
本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明的目的。附图并非旨在以任何方式限制本传授的范围。
图1：ATAC-see原位可视化可接近基因组。图a，ATAC-see的示意图。图b，通过使用不同Tn5转座酶生成的GM12878细胞(GM)的ATAC-seq文库的基因组浏览器轨迹：绿色：Nextera Tn5，蓝色：Atto-Tn5，橙色：先前公布的数据。图c，左图：通过使用Nextera Tn5或Atto-Tn5制备的GM12878文库(GM)的ATAC-seq读段的全基因组比较。右图：用不同Tn5转座的GM12878ATAC-seq文库的TSS富集。绿色＝Nextera Tn5，蓝色(Atto)＝Atto-Tn5，橙色＝先前公布的数据。图d，在没有固定和固定的情况下制备的HT1080文库的ATAC-seq读段的全基因组比较。左：所有数据点的散点图。右：Metagene分析以转录起始位点(TSS)为中心。
图2：ATAC-see使得能够对相同细胞中的可接近基因组进行成像和测序。图a，HT1080细胞的ATAC-see结果的代表性图像。在+EDTA阴性对照中观察到非常有限的ATAC-see信号。比例尺＝2μm。图b，将ATAC-see与免疫荧光组合的多模式成像。代表性图像显示通过用细胞核核纤层蛋白B1和线粒体蛋白标志物(Mito)共染色，细胞核外ATAC-see信号与线粒体重叠。比例尺＝2μm。图c，来自标准方案的ATAC-seq数据和成像后载玻片上的Atto-Tn5的基因组轨迹。X轴是基因组坐标；Y轴是归一化的ATAC-seq读段计数。图d，标准ATAC-seq数据和成像后载玻片上的Atto-Tn5的基因组范围比较。左：所有数据点的散点图。右：Metagene分析以转录起始位点(TSS)为中心。
图3：完整细胞核中具有细胞类型特异性的可接近染色质组织。图a，图像分析。对于每种细胞类型(组织为行)，从左到右列显示以下内容：(i)代表性的ATAC-see图像(红色是ATAC-see，且蓝色是DAPI，比例尺＝2μm)。(ii)ATAC-see和DAPI的信号强度作为距细胞核周边距离的函数。每条迹线都是一个细胞核；n＝分析的细胞核数。(iii)ATAC-see和DAPI信号强度的相关性；示出了皮尔逊相关系数(r)。(iv)ATAC-see簇，量化为ATAC-see的明亮区域与总细胞核区域的比。图b，成像后人嗜中性粒细胞(Neuts)的ATAC-seq的特性。左：人嗜中性粒细胞中的ATAC-seq、来自ENCODE 7细胞系的H3K27Ac层以及NKI核纤层蛋白相关结构域(LAD)的基因组浏览器轨迹。X轴是基因组坐标；Y轴是ATAC-seq归一化读段计数。灰色方块表示在c中选择用于DNA FISH的BAC的位置。右：人嗜中性粒细胞ATAC-seq信号的Metagene图以NKI LAD与相邻序列之间的边界为中心。图c，左：人嗜中性粒细胞中的所示BAC(b中)的DNA FISH的实施例，箭头表示嗜中性粒细胞周围的FISH信号；右：来自人嗜中性粒细胞中的所示BAC的DNA FISH信号的位置量化。在细胞核周边由DNA FISH信号与DAPI染色边缘之间的距离小于0.1μm来定义(参见方法)。n＝在DNA FISH中计数的等位基因数。通过二项检验计算P值。
图4：ATAC-see和ATAC-seq揭示了人NETosis期间的动态染色质组织。图a，指示条件下ATAC-see的代表性图像。PMA刺激时间过程，PAD4抑制剂处理(PAD4i)。比例尺＝2μm。图b，NETosis的表观基因组景观。左列：来自指示条件的ATAC-seq数据的基因组轨迹。示出了NKI核纤层蛋白相关结构域(LAD)的位置。X轴是基因组坐标；Y轴是ATAC-seq归一化读段计数。中：ATAC-seq信号的Metagene图以NKI LAD与相邻序列之间的边界为中心。顶部图与图3b右图相同，并且为了清楚起见，此处再现了此时间过程中的基线。右：相应样品的ATAC-seq插入片段大小分布。标记了可接近DNA、单核小体和二核小体的诊断性插入片段大小。图c，建议的NETosis模型阐明了细胞核结构的协调动力学、可接近的基因组重组和基因组分解。
图5：ATAC-see揭示了细胞周期特异性的基因组可及性。图a，采用ATAC-see的流式细胞术。GM12878细胞的DAPI和ATAC-see的双重染色的信号强度的点图，并且结果显示了四组细胞：G1低、G1高、S期和G2。图b，来自不同组的DAPI(左)和ATAC-see(右)信号的定量。图c，ATAC-see分选的G1高和G1低组中的细胞周期蛋白E1染色：左图是信号强度测量(n＝细胞数)；右图是来自共聚焦显微镜的代表性图像。比例尺＝2μm。图d，热图显示了G1高与G1低组之间的不同ATAC-seq可接近区域的簇(FD>2，FDR<0.05)，并且每组具有一个重复。图e，火山图表示G1高与G1低中的可接近区域的全基因组比较。图f，密度条表示转录起始位点(TSS)中G1高和G1低组中较易接近的区域的分布。两组中较易接近的区域采用颜色编码。
具体实施方式
除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。
本文提及的所有专利和出版物，包括在这样的专利和出版物中公开的所有序列，都明确地通过引用并入本文。
数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则核酸以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左到右书写。
本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制。因此，通过参考整个说明书，可以更全面地定义下面定义的术语。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Singleton,等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY,2D ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Markham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)为技术人员提供了本文所用的许多术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和便于参考，下面定义了某些术语。
必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非内容另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“转座酶”，包括两个或更多个转座酶等。
提供了用于检测可接近染色质的方法。如上所述，在一些实施方案中，该方法可包括获得转座酶复合物，其包含与至少一个DNA衔接子(其长度可为40至150个碱基，例如，50至120个碱基，但是设想了该范围之外的衔接子)结合的转座酶，所述DNA衔接子包含转座酶的识别序列的，其中所述转座酶或DNA衔接子包含可检测标签。如将认识到的，转座子识别序列(也称为转座子末端序列)是转座酶(例如，Tn5转座酶或其变体)结合的双链序列。Tn5转座子识别序列长度为19bp(参见，例如，Vaezeslami等人,J.Bacteriol.2007 189 20:7436-7441)，但许多其他的长度是已知的并且可能是18-20bp，例如长度为19bp。在这些实施方案中，转座酶复合物包含转座酶，其装载有单个衔接子分子，所述衔接子分子在两端含有转座酶的识别序列，或者装载有两个衔接子分子，每个衔接子分子在一端含有转座酶的识别序列。可以使用后一种类型的染色质由ATAC-seq测序(Buenrostro等人,NatureMethods 2013 10:1213–1218)。这类复合物可与染色质组合，以在可接近位点将衔接子分子添加至染色质中。如果转座酶复合物含有在两端含有转座子识别序列的单个衔接子分子，则将衔接子分子插入染色质中。如果转座酶复合物含有在一端含有转座子识别序列的两个衔接子分子，则转座酶同时催化染色质的片段化和采用与转座子识别序列相邻的序列标记片段(即通过“标记”)。用于标记的系统描述于各种出版物中，包括Caruccio(MethodsMol.Biol.2011 733:241-55)和US20100120098，其通过引用并入本文。在一些情况下，转座酶可以以基本上与序列无关的方式将核酸序列插入多核苷酸中。转座酶可以是原核生物的、真核生物的或来自病毒。用于标记的方法以及转座子末端序列是本领域公知的(参见，例如，Picelli等人,Genome Res.2014 24:2033-40；Adey等人,Genome Biol.2010 11:R119和Caruccio等人,Methods Mol.Biol.2011 733:241-55，US20100120098和US20130203605)。用于进行标记的试剂盒由Illumina(San Diego，CA)以商品名NEXTERA TM商业出售。该方法的该初始步骤可以通过用具有已经共同退火的寡核苷酸装载转座酶来完成，使得至少转座酶识别序列是双链的。
该方法中使用的衔接子通常由已经共同退火的寡核苷酸制成，其中寡核苷酸是核苷酸的单链多聚体，其长度为约2至200个核苷酸，长度为多达500个核苷酸。寡核苷酸可以是合成的或可以酶促制备，并且在一些实施方案中，长度为30至150个核苷酸。例如，寡核苷酸长度可以为10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。
在一些实施方案中，DNA衔接子可包含i)与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及ii)第二寡核苷酸，其包含与第一寡核苷酸的一部分充分互补并能够与第一寡核苷酸的一部分杂交的序列，使得DNA衔接子包含呈双链的至少一部分，其中所述双链部分包含转座酶的识别序列。在这些实施方案中，第二寡核苷酸可包含与选自由SEQID NO：2和SEQ ID NO：3组成的组的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，其中所述DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
在一些实施方案中，转座酶复合物可包含与以下项结合的转座酶二聚体：i)第一DNA衔接子，其中所述第一DNA衔接子包含转座酶的第一识别序列和第一可检测标签，以及ii)第二DNA衔接子，其中所述第二DNA衔接子包含转座酶的第二识别序列和第二可检测标签。在这些实施方案中，第一DNA衔接子可包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；并且第二DNA衔接子包含第一寡核苷酸和第三寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第三寡核苷酸包含与SEQ ID NO：3的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；其中所述第一DNA衔接子和所述第二DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。在这些实施方案中，第一DNA衔接子可包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第二寡核苷酸，并且第二DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的第二寡核苷酸。
在一些实施方案中，衔接子与可检测标签连接，例如，在3'末端、5'末端或其间的任何位置。在一些实施方案中，可检测标签可以与转座酶识别序列中的核苷酸连接。在其他实施方案中，可检测标签可以与不在转座酶识别序列中的核苷酸连接。
在一些实施方案中，转座酶可包含可检测标签。在这些实施方案中，转座酶可以用可检测标签标记或可以是融合蛋白，其中所述融合配偶体可以是荧光蛋白或荧光素酶。
可检测标签是易于通过光学手段检测的部分，例如，光生成标签或荧光标签。可检测标签可以是直接可检测的，并且因此可以是荧光的或发光的(例如，化学发光等)或间接可检测的，并且因此可以含有可检测部分，例如，生物素。荧光团能够在可检测范围内显示荧光。可用于本发明实践的标签的具体例子包括但不限于ATTO染料(如ATTO 390、ATTO425、ATTO 488、ATTO 520、ATTO 590、ATTO 655和ATTO 680)，SYBR染料(如SYBR green和SYBR gold)，CAL Fluor染料(如CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange 560、CAL FluorRed 590、CAL Fluor Red 610和CAL Fluor Red 635)，QUASAR染料(如QUASAR 570、QUASAR670和QUASAR 705)，ALEXA Fluor(如ALEXA Fluor 350、ALEXA Fluor 488、ALEXA Fluor546、ALEXA Fluor 555、ALEXA Fluor 594、ALEXA Fluor 647和ALEXA Fluor 784)，花青染料(如Cy 3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)，荧光素，2',4',5',7'-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)，羧基荧光素(FAM)，6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE)，六氯荧光素(HEX)，罗丹明，羧基-X-罗丹明(ROX)，四甲基罗丹明(TAMRA)，FITC，丹磺酰，伞形酮，二甲基吖啶酯(DMAE)，德克萨斯红，鲁米诺，NADPH，辣根过氧化物酶(HRP)，α-β-半乳糖苷酶，铁蛋白和金属粒子(如铂、铂-钯、金-钯、钨-钽、钨、胶体金、银、钛、铅和铀粒子)。
如本文所用，术语“质量标记的”是指用单一种类的稳定同位素标记的分子，其可通过其独特的质量或质量特征或其组合来识别。元素可以作为一种或多种同位素存在，并且该术语还包括正负金属的同位素。术语“质量标记的”和“元素标记的”在本文中可互换使用。质量标记可包括过渡金属、后过渡金属、卤化物、贵金属或镧系元素，其可通过其质量识别，可与其他质量标记区分，并且用于标记生物活性材料或分析物。质量标记具有可与分析样品和目标粒子中存在的原子质量区分的原子质量。术语“单一同位素”意指标记含有单一类型的金属同位素(但是任何一个标记可能含有多个相同类型的金属原子)。例如，在US20150080233中描述了用于将质量标记添加至其他分子的方法。
大量细胞计数法(包括可制备单细胞悬浮液的方法，可使用例如质量标记抗体来标记细胞的方法，雾化粒子的方法和对粒子进行元素分析的方法)的一般原理以及可以在大量细胞计数法中采用的硬件(包括流通池、电离室、试剂、质谱仪和计算机控制系统)是已知的，并且在各种出版物中进行了综述，包括但不限于Bandura等人Analytical Chemistry2009 81 6813-6822)、Tanner等人(Pure Appl.Chem 2008 80:2627-2641)、美国专利号7,479,630(Method and apparatus for flow cytometry linked with elementalanalysis)和7,135,296(Elemental analysis of tagged biologically activematerials)；以及公开的美国专利申请20080046194，例如，这些出版物通过引用那些方法和硬件的公开内容并入本文。
转座酶的例子包括但不限于Tn转座酶(例如Tn3、Tn5、Tn7、Tn10、Tn552、Tn903)、MuA转座酶、Vibhar转座酶(例如来自哈氏弧菌)、Ac-Ds、Ascot-1、Bs1、Cin4、Copia、En/Spm、F元件、hobo、Hsmar1、Hsmar2、IN(HIV)、IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS6、IS10、IS21、IS30、IS50、IS51、IS150、IS256、IS407、IS427、IS630、IS903、IS911、IS982、IS1031、ISL2、L1、Mariner、P元件、Tam3、Tc1、Tc3、Tel、THE-1、Tn/O、TnA、Tn3、Tn5、Tn7、Tn10、Tn552、Tn903、Tol1、Tol2、TnlO、Tyl或任何原核转座酶或上文列出的那些相关和/或衍生的任何转座酶。在某些情况下，亲代转座酶相关和/或衍生的转座酶可包含与亲代转座酶的相应肽片段具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％氨基酸序列同源性的肽片段。肽片段的长度可以为至少约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约150、约200、约250、约300、约400或约500个氨基酸。例如，衍生自Tn5的转座酶可包含长度为50个氨基酸且与亲代Tn5转座酶中的相应片段约80％同源的肽片段。在一些情况下，可以通过添加一种或多种阳离子来促进和/或引发插入。阳离子可以是二价阳离子，如Ca2+、Mg2+和Mn2+。
在转座酶装载衔接子后，使转座酶复合物在适合于转座酶与染色质结合的条件(即，导致反应例如结合和/或切割/连接的合适的温度、时间和条件)下与染色质接触。在一些情况下，接触可以在适合于转座的条件下进行，从而使至少一个DNA衔接子与染色质在转座酶可接近的位点连接。在这些实施方案中，术语“染色质可及性”是指核酸位点在多核苷酸内如在基因组DNA中可接近的程度，即染色质的“开放”程度。与多肽相关的核酸位点，如核小体中的基因组DNA，通常是不可接近的。不与多肽如与核小体之间的基因组DNA复合的核酸位点通常是可接近的(除了与转录因子和其他DNA结合蛋白复合的核酸位点)。在一些情况下，细胞样品可以任选地固定和/或透性化处理，以允许接近染色质。透性化处理可以以最小程度扰乱细胞核的方式进行。在一些情况下，可以使用透化剂将细胞样品透性化处理，所述透化剂的例子包括但不限于NP40、洋地黄皂苷、吐温、链球菌溶血素和阳离子脂质。在其他情况下，可使用低渗休克和/或超声波处理将细胞透性化处理。在其他情况下，转座酶可以高度带电，这可以使其通过细胞膜。
在转座酶反应后，该方法可包括检测插入的DNA衔接子或转座酶的标签。这可以使用任何合适的方法进行，包括通过流式细胞术、荧光显微镜检查、电子显微镜检查或大量细胞计数法。如果通过流式细胞术检测标签，则数据可以显示为散点图。如果通过荧光成像检测标签，则数据可以显示为至少细胞核的图像。对这类数据的分析可揭示标记的模式，例如细胞内或细胞群中的模式。
该方法可以在细胞群上进行。在一些实施方案中，细胞可以在平面上，例如在显微镜载玻片的平面上。在这些实施方案中，细胞可以已经在表面上生长为单层，在液体培养物中生长，并随后置于表面上，或者可以在已经置于表面上的组织切片中。
在本文中使用的细胞群可以由任何数量的细胞组成，例如，约500至约106或更多个细胞、约500至约100,000个细胞、约500至约50,000个细胞、约500至约10,000个细胞、约50至1000个细胞、约1至500个细胞、约1至100个细胞、约1至50个细胞或单个细胞。在一些情况下，细胞样品可由小于约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10,000、约15,000、约20,000、约25,000、约30,000、约40,000、约50,000、约60,000、约70,000、约80,000、约90,000、约100,000、约120,000、约140,000、约160,000、约180,000、约200,000、约250,000、约300,000、约350,000、约400,000、约450,000、约500,000、约600,000、约700,000、约800,000、约900,000或约1,000,000个细胞组成。在其他情况下，细胞样品可由超过约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10,000、约15,000、约20,000、约25,000、约30,000、约40,000、约50,000、约60,000、约70,000、约80,000、约90,000、约100,000、约120,000、约140,000、约160,000、约180,000、约200,000、约250,000、约300,000、约350,000、约400,000、约450,000、约500,000、约600,000、约700,000、约800,000、约900,000或约1,000,000个细胞组成。
细胞可以来自任何来源。在某些情况下，细胞可以从细胞培养物例如细胞系获得。在其他情况下，细胞可以从个体(例如，患者等)分离。细胞可以从软组织或体液中分离，或从体外培养的细胞培养物中分离。在具体实施方案中，染色质可以从软组织分离，如脑、肾上腺、皮肤、肺、脾、肾、肝、脾、淋巴结、骨髓、膀胱、胃、小肠、大肠或肌肉等。体液包括血液、血浆、唾液、粘液、痰、脑脊液、胸膜液、泪液、乳管液、淋巴液、痰液、脑脊液、滑液、尿、羊水和精液等。
在一些实施方案中，该方法中分析的染色质可以来自血细胞，其中血细胞是指全血样品或全血中的细胞亚群。全血中的细胞亚群包括血小板、红血细胞(红细胞)、血小板和白血细胞(即外周血白细胞，其由嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞组成)。这五种白细胞类型可以进一步分为两组，粒细胞(也称为多形核白细胞，并且包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核白细胞(包括单核细胞和淋巴细胞)。淋巴细胞可进一步分为T细胞、B细胞和NK细胞。外周血细胞发现于血液循环池中，并且不会被隔离在淋巴系统、脾、肝或骨髓内。其他细胞存在于可以分离的血液中。如果首先使血液与试剂接触，然后在测定中使用血液样品，则可以在该方法中使用部分或全部接触的血液。
在某些实施方案中，细胞可以直接从主要来源分离。例如，细胞样品可以直接从新鲜组织中分离。在其他情况下，细胞样品可以直接从冷冻组织中分离。在又其他情况下，细胞样品可以直接从固定组织中分离。细胞样品的主要来源的其他例子包括但不限于从组织解离的细胞、血细胞、FFPE切片中的细胞等。在一些实施方案中，转座酶复合物可以直接与组织样品接触。
在一些实施方案中，分析的细胞具有相同的细胞类型。在这些实施方案中，细胞群可以是培养的细胞，或通过MACS或FACS从异质细胞群(例如血液)中通过已知方法使用针对细胞表面标志物的标记抗体进行选择。可以使用这些方法分离各种各样的细胞，包括干细胞、癌症干细胞和血细胞亚群。在具体实施方案中，可以通过FACS或MACS从血液中分离以下细胞：T细胞(CD3+CD4+CD8+)、B细胞(CD19+CD20+)、树突细胞(CD11c+CD20+)、NK细胞(CD56+)、干细胞/前体细胞(CD34+；仅造血干细胞)、巨噬细胞/单核细胞(CD14+CD33+)、粒细胞(CD66b+)、血小板(CD41+CD61+CD62+)、红细胞(CD235a+)、内皮细胞(CD146+)和上皮细胞(CD326+)。可以使用针对其他细胞表面标志物的抗体分离这些细胞的亚群。
在一些实施方案中，该方法可用于比较两个样品。在这些实施方案中，该方法可以包括使用上述方法分析第一细胞群以产生第一数据集；和使用上述方法分析第二细胞群以产生第二数据集；以及将第一数据集与第二数据集进行比较，例如以查看可接近染色质的位置是否有任何变化。
在一些实施方案中，在不同时间从同一个体收集第一细胞群和第二细胞群。在其他实施方案中，第一细胞群和第二细胞群是从组织或不同个体收集的不同细胞群。
可以在该方法中使用的示例性细胞类型包括，例如，从组织活检(例如，来自具有疾病如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、皮肤癌或被病原体感染等的组织)中分离的细胞，以及来自相同组织例如来自同一患者的正常细胞；在组织培养中生长的永生的细胞(例如，具有增殖突变或永生化转基因的细胞)、被病原体感染的细胞、或经过处理(例如，用环境或化学试剂如肽、激素、改变的温度、生长条件、物理应激、细胞转化等处理)的细胞，以及正常细胞(例如，与实验细胞相同的细胞，只是它们不是永生化的、感染的或经过处理等)；从患有癌症、疾病的哺乳动物、老年哺乳动物或暴露于病况的哺乳动物中分离的细胞，以及来自相同物种例如来自相同家族的健康或年轻的哺乳动物的细胞；以及来自相同哺乳动物的分化细胞和未分化细胞(例如，一种细胞是哺乳动物中另一种细胞的祖细胞)。在一个实施方案中，可以比较不同类型的细胞(例如神经元和非神经元细胞)或不同状态(例如，在对细胞刺激之前和之后)的细胞。在另一个实施方案中，实验材料是易受病原体如病毒例如人免疫缺陷病毒(HIV)等感染的细胞，并且对照材料是对病原体感染具有抗性的细胞。在本发明的另一个实施方案中，样品对由未分化的细胞(例如干细胞)和分化的细胞代表。来自酵母、植物和动物(如鱼、鸟、爬行动物、两栖动物和哺乳动物)的细胞可用于本发明方法中。在某些实施方案中，可以使用哺乳动物细胞，即来自小鼠、兔、灵长类动物或人的细胞，或培养的它们的衍生物。
在一些示例性实施方案中，该方法可用于鉴定测试剂例如药物的效果，或用于确定两种或更多种不同测试剂的效果是否存在差异。在这些实施方案中，可以制备两个或更多个相同的细胞群，并且根据进行实验的方式，可以将一个或多个细胞群与测试剂一起孵育一段确定的时间。与测试剂一起孵育后，可以使用上述方法分析细胞群的染色质，并且可以比较结果。在一个具体实施方案中，细胞可以是血细胞，并且可将细胞与测试剂一起离体孵育。例如，这些方法可用于确定测试剂的作用模式，以鉴定响应于药物的染色质可及性的变化。
上述方法也可用作诊断法(该术语旨在包括提供诊断的方法以及提供预后的方法)。这些方法可包括，例如，使用上述方法分析来自患者的染色质以产生数据；并根据数据提供诊断或预后。
本文所述的方法可用于为与例如改变的染色质可及性相关的任何病况提供可靠的诊断。该方法可以应用于以表观遗传模式(例如，染色质可及性模式)为特征的病况的表征、分类、分化、分级、分期、诊断或预后。例如，该方法可用于确定怀疑受疾病或病况影响的个体的样品的标记模式与被认为关于所述疾病或病况为“正常”的样品的标记模式相同或不同。在具体实施方案中，该方法可以涉及诊断具有以特定标记模式为特征的病况的个体，其中所述模式与所述病况相关。该方法还可用于预测个体对病况的易感性。
适用于使用本文所述方法分析的示例性病况可以是，例如，细胞增殖性病症或细胞增殖性病症的倾向；代谢功能障碍或病症；免疫功能障碍、损伤或病症；CNS功能障碍、损伤或病症；侵袭或行为障碍的症状；脑损伤的临床、心理和社会后果；精神障碍和人格障碍；痴呆或相关综合征；心血管疾病、功能故障和损伤；胃肠道功能障碍、损伤或疾病；呼吸系统功能障碍、损伤或疾病；病变、炎症、感染、免疫和/或康复；作为发育过程中的异常的身体功能障碍、损伤或疾病；皮肤、肌肉、结缔组织或骨骼的功能障碍、损伤或疾病；内分泌和代谢功能障碍、损伤或疾病；头痛或性功能障碍及其组合。
在一些实施方案中，该方法可以提供预后，例如，以确定患者是否有复发风险。癌症复发是与各种类型的癌症有关的问题。预后方法可用于鉴定有可能经历癌症复发的手术治疗的患者，以便为他们提供附加的治疗选择，包括术前或术后辅助，如化疗、放射、生物调节剂和其他合适的治疗方法。该方法对于确定在检查或手术时未表现出可测量转移的患者的转移风险尤其有效。
该方法还可以用作治疗诊断法，即，为患有疾病或病况的患者例如患有癌症的患者提供治疗过程的建议。治疗过程是指诊断后或治疗后对患者采取的治疗措施。例如，确定复发、传播或患者存活的可能性，可以帮助确定是否应该采取更保守或更激进的治疗方法，或者是否应该结合治疗方式。例如，当可能发生癌症复发时，在手术治疗之前或之后采用化学疗法、放射疗法、免疫疗法、生物调节剂疗法、基因疗法、疫苗等，或者调整患者的治疗时间跨度可能是有利的。
在具体实施方案中，实验室将从远程位置(例如，医生的办公室或医院)接收样品(例如，血液)，实验室将如上所述分析样品中的细胞以产生数据，并且数据可以被转发到远程位置进行分析。
还提供了包含双链转座酶识别序列和可检测标签的衔接子。转座酶识别序列的一条链可以具有SEQ ID NO：1的序列。衔接子可以与可检测标签连接，例如，在3'末端、5'末端或其间的任何位置。在一些实施方案中，可检测标签可以与转座酶识别序列中的核苷酸连接。在其他实施方案中，可检测标签可以与不在转座酶识别序列中的核苷酸连接。
还提供了包含含有与DNA衔接子结合的转座酶的转座酶复合物的组合物，其中转座酶或DNA衔接子包含可检测标签。在一些实施方案中，转座酶复合物可包含转座酶，其包含可检测标签。在一些实施方案中，转座酶复合物可包含与包含可检测标签的DNA衔接子结合的转座酶。在这些实施方案中，DNA衔接子可包含i)第一寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及ii)第二寡核苷酸，其包含与第一寡核苷酸的一部分充分互补并能够与第一寡核苷酸的一部分杂交的序列，使得DNA衔接子包含呈双链的至少一部分，其中所述双链部分包含转座酶的识别序列，其中所述DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。在这些实施方案中，转座酶复合物包含与以下项结合的转座酶二聚体：两个DNA衔接子，其中所述第一DNA衔接子包含转座酶的第一识别序列和第一可检测标签，并且所述第二DNA衔接子包含转座酶的第二识别序列和第二可检测标签。第一DNA衔接子可包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；并且第二DNA衔接子包含第一寡核苷酸和第三寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第三寡核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；其中所述第一DNA衔接子和所述第二DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。在这些实施方案中，第一DNA衔接子包含含有SEQ IDNO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第二寡核苷酸，并且第二DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的第二寡核苷酸。可检测标签是荧光团、金属粒子、磁性粒子、同位素标签、化学发光标签、配体或半抗原。
本公开还提供了包含转座酶和至少一个DNA衔接子的试剂盒，所述至少一个DNA衔接子包含转座酶的识别序列，其中所述DNA衔接子或所述识别序列包含可检测标签。在一些实施方案中，试剂盒可包含用于检测可接近染色质的说明书。在一些实施方案中，试剂盒可包含过度活性的转座酶和至少一个DNA衔接子，所述DNA衔接子包含转座酶的识别序列和可检测标签。所述至少一个DNA衔接子可包含第一DNA衔接子，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与SEQID NO：2的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；以及第二DNA衔接子，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列。至少一个DNA衔接子可包含第一DNA衔接子，其包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ IDNO：2的核苷酸序列的第二寡核苷酸；以及第二DNA衔接子，其包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的第二寡核苷酸。
试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者某些相容的组分可以根据需要预先组合到单个容器中。除探针外，试剂盒还可包含上述方法中使用的任何附加组分，例如缓冲液等。
除上述组分外，本发明试剂盒可进一步包含使用试剂盒的组分来实践本发明方法的说明书，即用于样品分析的说明书。
实施方案
实施方案1.一种用于检测可接近染色质的方法，该方法包括：a)提供转座酶复合物，其包含与至少一个DNA衔接子结合的转座酶，其中所述DNA衔接子包含转座酶的识别序列和可检测标签；b)使染色质与转座酶复合物接触，从而在转座酶可接近的位点处将所述至少一个DNA衔接子插入染色质中；以及c)检测所插入的DNA衔接子的标签。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述转座酶是过度活性的Tn5转座酶。
实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其中所述DNA衔接子包含i)第一寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及ii)第二寡核苷酸，其包含与第一寡核苷酸的一部分充分互补并能够与第一寡核苷酸的一部分杂交的序列，使得DNA衔接子包含呈双链的至少一部分，其中所述双链部分包含转座酶的识别序列。
实施方案4.根据实施方案3所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含选自由SEQID NO：2和SEQ ID NO：3组成的组的核苷酸序列，或与选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3组成的组的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，其中所述DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
实施方案5.根据实施方案1所述的方法，其中所述转座酶复合物包含与以下项结合的转座酶二聚体：i)第一DNA衔接子，其中所述第一DNA衔接子包含转座酶的第一识别序列和第一可检测标签，以及ii)第二DNA衔接子，其中所述第二DNA衔接子包含转座酶的第二识别序列和第二可检测标签。
实施方案6.根据实施方案5所述的方法，其中所述第一DNA衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；并且第二DNA衔接子包含第一寡核苷酸和第三寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第三寡核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；其中所述第一DNA衔接子和所述第二DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
实施方案7.根据实施方案6所述的方法，其中所述第一DNA衔接子包含含有SEQ IDNO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第二寡核苷酸，并且第二DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的第二寡核苷酸。
实施方案8.根据实施方案1所述的方法，其中所述可检测标签是荧光团、金属粒子、磁性粒子、同位素标签、化学发光标签、配体或半抗原。
实施方案9.根据实施方案8所述的方法，其中所述荧光团是ATTO荧光染料。
实施方案10.根据实施方案8所述的方法，其中所述检测包括进行荧光成像。
实施方案11.根据实施方案8所述的方法，其中所述检测包括进行电子显微镜检查。
实施方案12.根据实施方案1所述的方法，其进一步包括鉴定可接近染色质中的调控DNA、转录因子结合位点或核小体结合位点。
实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其中调控DNA包含启动子、增强子或绝缘子。
实施方案14.根据实施方案1所述的方法，其进一步包括绘制DNA衔接子插入可接近染色质中的位点的位置。
实施方案15.根据实施方案1所述的方法，其进一步包括对DNA衔接子插入可接近染色质中的位点的DNA进行测序。
实施方案16.根据实施方案1所述的方法，其中所述方法在活细胞或固定细胞内原位染色质上进行。
实施方案17.根据实施方案1所述的方法，其中所述方法在分离的染色质上进行。
实施方案18.根据实施方案1所述的方法，其进一步包括基于通过DNA衔接子标记细胞中的可接近染色质来分选细胞。
实施方案19.一种包含转座酶复合物的组合物，所述转座酶复合物包含与含有可检测标签的DNA衔接子结合的转座酶，其中所述DNA衔接子包含i)第一寡核苷酸，其包含SEQID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及ii)第二寡核苷酸，其包含与第一寡核苷酸的一部分充分互补并能够与第一寡核苷酸的一部分杂交的序列，使得DNA衔接子包含呈双链的至少一部分，其中所述双链部分包含转座酶的识别序列，其中所述DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
实施方案20.根据实施方案19所述的组合物，其中所述转座酶复合物包含与以下项结合的转座酶二聚体：两个DNA衔接子，其中所述第一DNA衔接子包含转座酶的第一识别序列和第一可检测标签，并且所述第二DNA衔接子包含转座酶的第二识别序列和第二可检测标签。
实施方案21.根据实施方案20所述的组合物，其中所述第一DNA衔接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ IDNO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；并且第二DNA衔接子包含第一寡核苷酸和第三寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第三寡核苷酸包含SEQ IDNO：3的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；其中所述第一DNA衔接子和所述第二DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
实施方案22.根据实施方案21所述的组合物，其中所述第一DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第二寡核苷酸，并且第二DNA衔接子包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQID NO：3的核苷酸序列的第二寡核苷酸。
实施方案23.根据实施方案19所述的组合物，其中所述可检测标签是荧光团、金属粒子、磁性粒子、同位素标签、化学发光标签、配体或半抗原。
实施方案24.一种包含实施方案19所述的组合物和检测可接近染色质的说明书的试剂盒。
实施方案25.一种包含过度活性的转座酶和至少一个DNA衔接子的试剂盒，所述DNA衔接子包含转座酶的识别序列和可检测标签。
实施方案26.根据实施方案25所述的试剂盒，其中所述至少一个DNA衔接子包含第一DNA衔接子，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；以及第二DNA衔接子，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列。
实施方案27.根据实施方案26所述的试剂盒，其中所述至少一个DNA衔接子包含第一DNA衔接子，其包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的第二寡核苷酸；以及第二DNA衔接子，其包含含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第一寡核苷酸和含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的第二寡核苷酸。
根据以下实施例可以进一步理解本传授的各方面，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本传授的范围。
实施例
基因组的空间组织在基因表达、DNA复制和修复中发挥重要作用。但目前的表观基因组方法在没有细胞核的原生环境的情况下主要绘制了DNA调控元件。本文描述了一种称为ATAC-see(伴随可视化的转座酶可接近染色质的测定)的技术，这是一种转座酶介导的成像技术，它实现了可接近基因组的原位直接成像、细胞分选和深度测序以揭示成像元件的身份。ATAC-see揭示了可接近基因组的细胞类型特异性的空间组织，以及嗜中性粒细胞挤压其染色质的协调过程(NETosis)。ATAC-see与流式细胞术的整合实现了作为染色质可及性的函数的自动定量和前瞻性细胞分离，并揭示了染色质可及性的细胞周期依赖性，其在G1期尤其是动态的。成像和表观基因组学的整合为破译基因控制的时空结构提供了一般且可扩展的方法。
ATAC-see通过在基因组中共价插入荧光团分子，揭示了任何细胞类型的可接近基因组在其原生环境中的空间组织。ATAC-see与标志性蛋白质的多模式成像、流式细胞术相容，并且能够进行复杂的调节组分析。ATAC-see与固定样品的相容性使其容易地应用于人类临床标本。在FACS分选中应用ATAC-see的能力应增强细胞异质性的染色质基础的分析。ATAC-see提供丰富的空间和表观基因组信息，它们共同给出细胞的分子肖像。ATAC-see可用于鉴定包含人类细胞图谱的不同人类细胞类型和器官中可接近基因组的独特空间组织，以及通过使用超分辨率显微镜检查揭示临床诊断中可接近染色质组织的精细结构。最后，转座体工程化促进了成像和表观基因组学的成功结合；将该方法扩展可促进基因组询问和控制的新模式。
材料和方法
细胞培养：使GM12878细胞在RPMI 1640(11875-093，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(25030-081，Gibco)、15％胎牛血清(07905，Gi bco)和1％Pen/Strep(15140-122，Gibco)中生长。将HT1080细胞在DMEM/F-12、GlutaMAXTM补充物(10565-018，Gibco)、10％胎牛血清(07905，Gibco)和1％Pen/Strep(15140-122，Gibco)中培养。将HeLa细胞维持在DMEM(11965-092，Gibco)、10％胎牛血清(07905，Gibco)和1％Pen/Strep(15140-122，Gibco)中。将神经祖细胞(NPC)在补充有EGF和FGF(各10ng/mL)(315-09和100-18B，Peprotech)的N2B27培养基(DMEM/F12，Invitrogen11320-033；Neurobasal，Gibco 21103-049；NDiffNeuro-2 Medium Supplement Millipore，SCM012；B27 Supplement，Gibco 17504-044)中培养。将NPC每隔一天用Accutase(SCR005，Millipore)传代并接种在明胶涂覆的平板上。将所有细胞保持在标准37℃和5％CO2条件下。
人CD4+T细胞分离：按照斯坦福大学IRB批准的方案，从健康供体的全血中分离人CD4+T细胞。简而言之，将人CD4+T细胞富集混合物添加至全血中，最终浓度为50μL/mL，并将该混合物在室温下孵育20min。孵育后，用等体积的PBS+2％FBS(07905，Gibco)稀释全血。然后将稀释的样品在密度培养基上分层，并在室温下关闭制动器，以1200xg离心20min。将富集的细胞收集到新管中并用PBS+2％FBS洗涤两次。在室温下用缓冲液EL(79217，Qiagen)溶解残留的红细胞5min。
中性粒细胞分离：按照斯坦福大学IRB批准的方案23所述，从健康供体的血液中分离人嗜中性粒细胞。简而言之，将7ml肝素化血液在15ml Falcon管中的7ml Histopaque1119(11191-100ML，Sigma Aldrich)上分层，并在室温下将该混合物以800xg旋转20min。弃中间相(淋巴细胞和单核细胞)，并将的Histopaque 1119的富含粒细胞层(RBC沉淀上方的弥漫性红相)收集在新管中。用10ml培养基(HBSS+)洗涤5ml细胞，并在室温下以200xg旋转10min。将细胞重悬于含有0.5％人血清白蛋白的3ml DPBS(101-15-50，Lee BioSolutions)中，并将细胞悬浮液在10ml不连续的Percoll梯度(85％至65％Percoll)上分层，并在室温下以800xg旋转20min。将70％至75％Percoll层之间的中间相收集在新的15ml管中。向管中加入含有0.5％人血清白蛋白的DPBS至15ml，并在室温下以200xg旋转10min。将细胞沉淀以1.5x106个细胞/ml重悬于RPMI-HEPES(10mM)中，以用于嗜中性粒细胞活化。
人嗜中性粒细胞活化：如上所述23通过肉豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)刺激人嗜中性粒细胞。简而言之，将纯化的嗜中性粒细胞悬浮于3ml RPMI 1640中，在松散帽15ml falcon管中最终浓度为1.5x106/ml，并在最终浓度为30nM PMA的细胞培养CO2培养箱(5％CO2，37℃)中分别孵育1h、3h和5h。模拟2h后，将蛋白酶抑制剂混合物以1:200稀释度添加至对照和模拟管中。在各个时间点，在室温下用1％甲醛固定嗜中性粒细胞10min，并在室温下将固定的嗜中性粒细胞在玻璃载玻片上用细胞离心器以1000rpm旋转5分钟，以供ATAC-see或免疫染色。
人嗜中性粒细胞中的PAD4抑制剂治疗：如前所述25进行PAD4抑制。简而言之，在PMA刺激之前，将分离的人嗜中性粒细胞与200μM Cl-脒一起孵育30min。
过度活性Tn5产生：如前所述30产生过度活性的Tn5。简而言之，将pTXB1-Tn5质粒(60240，Addgene)引入T7 Express LysY/Iq大肠杆菌菌株(C3013，NEB)中。将10ml过夜培养的大肠杆菌接种至500ml LB培养基。在37℃下孵育1.5hr后，将细菌在室温下孵育约2.5hr。当OD600＝0.9时，通过添加0.25mM IPTG诱导Tn5蛋白4hr。将大肠杆菌沉淀重悬于裂解缓冲液(20mM HEPES-KOH pH 7.2，0.8M NaCl，1mM EDTA，10％甘油，0.2％triton X-100，完全蛋白酶抑制剂(11697498001，Roche))中并通过超声处理裂解。将10％PEI添加至裂解物的上清液以去除细菌基因组DNA。将10ml壳多糖树脂(S6651L，NEB)添加至上清液并在4℃下旋转孵育1hr。树脂被裂解缓冲液充分洗涤。为了从内含肽切割Tn5蛋白，将含有100mM DTT的裂解缓冲液添加至树脂并在4℃下储存。48hr后，通过重力流洗脱蛋白质并收集在1ml级分中。将1ul的各级分添加至洗涤剂相容的Bradford测定(23246，ThermoFisher Scientific)中，合并峰化的级分并用2X透析缓冲液(100mM HEPE-KOH pH7.2，0.2M NaCl，0.2mM EDTA，2mMDTT，0.2％triton X-100，20％甘油)透析。通过使用ultracel 30-K柱(UFC903024，Millipore)浓缩透析的Tn5蛋白，并通过Bradford测定测量Tn5的量，并在NuPAGENovex4％-12％Bis-Tris凝胶(NP0321，ThermoFisher Scientific)上可视化，然后进行考马斯蓝(Coomassie blue)染色。
衔接子序列：用于Tn5转座体衔接子的Atto-590N标记的寡核苷酸在INTERGATEDDNA TECHNOLOGIES(IDT)上合成，并且寡核苷酸的序列如下：Tn5MErev，5'-[phos]CTGTCTCTTATACACAT CT-3'(SEQ ID NO：1)；Tn5ME-A-ATTO590，5'-/5ATTO590/TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'(SEQ ID NO：2)；Tn5ME-B-ATTO590：5'-/ATTO590/GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTG TATAAGAGACAG-3'(SEQ ID NO：3)。
Tn5转座体组装：如上所述30进行Tn5转座体的组装。简而言之，将寡核苷酸(Tn5ME-A-ATTO590，Tn5ME-B-ATTO590，Tn5MErev)重悬于水中至最终浓度均为100μM。将等摩尔量的Tn5MErev/Tn5ME-A-ATTO590和Tn5MErev/Tn5ME-B-ATTO590在单独的200μl PCR管中混合。将这两个寡核苷酸混合物的管在热循环仪上在95℃下变性5min，并通过关闭热循环仪在热循环仪上缓慢冷却。将Tn5转座体与以下组分组装：0.25vol Tn5MErev/Tn5ME-A-ATTO590+Tn5MErev/Tn5ME-B-ATTO590(每个双链寡核苷酸的最终浓度现在均为50μM)、0.4vol甘油(100％溶液)、0.12vol 2X透析缓冲液(pH 7.2的100mM HEPES-KOH，0.2M NaCl，0.2mMEDTA，2mM DTT，0.2％Triton X-100，20％甘油)、0.1vol SL-Tn5(50μM)、0.13vol水。将试剂充分但轻柔地混合，将溶液在室温下放置在工作台上1h，以使寡核苷酸退火至Tn5。
载玻片制备和固定：HT1080细胞和HeLa细胞在secureSlip细胞培养系统(0515073，GRACE BIO-LABS)上生长直至80％-90％汇合，并在室温下用1％甲醛(Sigma-Aldrich)固定10min。在室温下将GM12878细胞用1％甲醛(Sigma)固定10min，并在玻璃载玻片上用细胞离心器以1000rpm离心5min，每个载玻片30-50,000个细胞。
免疫染色：将甲醛固定的载玻片在PBS中清洗并在室温下在PBS0.5％Triton-X100中透性化处理10min。然后，在室温下用抗体稀释试剂(00-3218，ThermoFisherScientific)封闭载玻片1h。在抗体稀释试剂中以1:500稀释一级抗体：兔抗核纤层蛋白B1(ab16048，Abcam)、小鼠抗线粒体(ab3298，Abcam)和抗细胞周期蛋白E1抗体[EP435E](Alexa488)(ab194068，Abcam)、兔抗H3K9me3(SAB4800027-100UL，Sigma)、兔抗H3K9me2(39375，Active Motif)、兔抗H3K27乙酰化(25238，BPS Bioscience)、兔抗H3瓜氨酸(ab5103，Abcam)、小鼠抗Phospho RNA聚合酶II CTD(Ser5)mAb(MABI0603，MBLInternational)，并在4℃下孵育过夜。用含有0.05％吐温20的PBS洗涤3次各10min后，室温下将载玻片与二级抗体山羊抗兔ATTO488(18772-1ML-F，Sigma-Aldrich)或山羊抗小鼠Atto647N(50185-1ML-F，Sigma-Aldrich)一起孵育45min。用含0.05％吐温20的PBS洗涤载玻片3次各10min，使用具有DAPI的Vectashield(H-1200，Vector labs)进行固定，并使用Leica SP8或Zeiss LSM 700进行成像。
对于采用表观遗传标记或RNAP II的ATAC-see共染色，首先进行ATAC-see，然后在同一载玻片上进行免疫染色。所有一级抗体均以1:500比例稀释，并且抗体信息如下：兔抗H3K9me3(SAB4800027-100UL，Sigma)；兔抗H3K4me3(ab8580，Abcam)；兔抗H3K27乙酰化(25238，BPS Bioscience)；小鼠抗磷酸化RNA聚合酶II CTD(Ser5)mAb(MABI0603，MBLInternational)；小鼠抗H3K27me3(ab6147，Abcam)；兔抗RNA聚合酶II CTD(Ser-5)抗体(ab5095，Abcam)。
ATAC-see：固定后，在室温下用裂解缓冲液(10mM Tris-Cl，pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2，0.01％Igepal CA-630)将细胞(在载玻片上生长或在具有细胞离心器的载玻片上离心)透性化处理10min。透性化处理后，将载玻片在PBS中清洗两次，并置于37℃的潮湿箱盒中。将转座酶混合物溶液(25μl 2X TD缓冲液，最终浓度为100nM Tn5-ATTO-59ON，添加dH2O至50μl)添加在载玻片上并在37℃下孵育30min。转座反应后，在55℃下用PBS 0.01％SDS洗涤载玻片3次各15min。洗涤后，使用具有DAPI的Vectashield(H-1200，Vector labs)固定载玻片，以供Leica SP8或Zeiss 700进行成像或采用核纤层蛋白B1或线粒体进行另外的共染色(参见上述材料和方法)。
采用XIST RNA FISH的ATAC-see：雌性小鼠神经祖细胞(NPC)在secureSlip细胞培养系统(0515073，GRACE BIO-LABS)上生长直至80％-90％汇合，并在室温下用1％甲醛(Sigma-Aldrich)固定10min。用PBS洗涤三次(每次5min)后，在室温下用PBS 0.1％NP-40透性化处理载玻片10min。如上所述在标准方案下进行ATAC-see(具有Atto-480标记的Tn5)。在ATAC-see之后，在4℃下将载玻片在70％EtOH中脱水1hr，并在室温下在2X SSC+10％甲酰胺中再水合5min。在37℃下将XIST RNA FISH探针(Stellaris mXist)在载玻片上杂交过夜。在以下条件下进行洗涤：在37℃下在2X SSC+10％甲酰胺中2X 30min，以及在37℃下在2X SSC中5min。RNA FISH洗涤后，用Vectashield(H-1200，Vector labs)固定载玻片。
ATAC-see的FACS分选和分析：用PBS洗涤GM12878细胞，然后在室温下用1％甲醛固定10min。固定后，用裂解缓冲液(10mM Tris-Cl，pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2，0.01％Igepal CA-630)将细胞透性化处理，并在室温下以700g离心10min。然后将5x 106个细胞用DAPI染色(用于阴性对照)，或在37℃下使用Atto-594标记的内部Tn5转座30min(参见上述材料和方法)。转座反应后，将细胞离心并用DAPI染色，使用BD FACS-Aria II(BDBiosciences)分析和分选。收集的G1高、G1低、S和G2通过标准ATAC-seq PCR反应进行反向交联、纯化和扩增，并且在Stanford Functional Genomics Facility的Illumina NextSeq上对文库进行测序。使用细胞离心器在玻璃载玻片上收集分选的ATAC-see不同组，并在Zeiss 700下拍摄图像。收集分选的ATAC-See G1高和G1低细胞，并通过使用细胞离心器离心，并且抗细胞周期蛋白E1抗体[EP435E](Alexa488)(ab194068，Abcam)在不同组上染色。对于骨髓祖细胞研究，从股骨、胫骨和肱骨收获细胞。用研钵和研杵使骨碎裂，并使用Histopaque1119(Sigma-Aldrich)通过梯度离心去除碎片。使细胞通过70-uM过滤器，并用ACK裂解缓冲液裂解红血细胞。在4℃下将5-10x10^6个细胞在FACS缓冲液(DPBS+0.5％BSA+2mm EDTA)中以1:200稀释度用以下抗体染色：CD16/32 eFluor450(93，eBioscience)、CD117 FITC(2B8，eBioscience、CD11b-redFluor710或APC(M1/70，Tonbo Bioscience)、B220-PE(RA3-6B2，eBioscience)和CD105-PE(MJ7/18，eBioscience)。然后如上所述将细胞洗涤、固定和转座。CMP被鉴定为Lineagec kithiCD16/32-。GMP被鉴定为Lineage-ckithiCD16/32+。带状嗜中性粒细胞被鉴定为Lineage-ckit-CD11b+CD16/32+。将细胞分选至FACS缓冲液中，并通过分选后分析来确认至少95％的细胞纯度。
ATAC-seq：如上所述3进行采用人GM-12878细胞中的Illumina Tn5转座酶(Nextera)和Atto-590标记的自制Tn5的ATAC-seq。简而言之，在室温下将50,000个细胞以500g离心5min。将细胞沉淀重悬于50μl裂解缓冲液(10mM Tris-Cl，pH 7.4，10mM NaCl，3mMMgCl2，0.01％Igepal CA-630)中，并在4℃下立即以500g离心10min。将细胞沉淀重悬于50μl转座酶混合物(25μl 2X TD缓冲液，22.5μl dH2O和2.5μl Illumina Tn5转座酶或最终浓度为100nM Atto-590标记的内部Tn5)中，并在37℃下孵育30min。转座后，将混合物用Qiagen迷你纯化试剂盒纯化，并在10μl Qiagen EB洗脱缓冲液中洗脱。按照原始ATAC-seq方案3制备测序文库。在Stanford Functional Genomics Facility的Illumina NextSeq上进行测序。
固定细胞中的ATAC-seq：用1％甲醛(Sigma，USA)固定人HT1080细胞10min，并在室温下用0.125M甘氨酸猝灭5min。固定后，计数细胞，并且每次ATAC-seq反应使用50,000个细胞。转座反应与正常ATAC-seq相同，只是在裂解缓冲液中具有0.05％Igepal CA-630。转座酶反应后，添加反向交联溶液(最终浓度为50mM Tris-Cl，1mM EDTA，1％SDS，0.2M NaCl，5ng/ml蛋白酶K)至200μl。将混合物在65℃下在加热块中以1000rpm振荡培养过夜，然后用Qiagen迷你纯化试剂盒纯化，并在10μl Quiagen EB洗脱缓冲液中洗脱。按照原始ATAC-seq方案3制备测序文库。在Stanford Functional Genomics Facility的Illumina NextSeq上进行测序。
成像后ATAC-seq：在8孔室载玻片中生长的80％汇合的人HT1080细胞(30-50,000个细胞)用1％甲醛(Sigma，USA)固定10min，并在室温下用0.125M甘氨酸猝灭5min。固定后，将载玻片置于4℃的PBS中。用裂解缓冲液(10mM Tris-Cl，pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2，0.05％Igepal CA-630)将载玻片上的细胞透性化处理10min。将50μl转座酶反应溶液添加至载玻片上，并将载玻片上的细胞在37℃下孵育30min。对于成像和测序，使用Vectorshield固定载玻片，并用Zeiss LSM 700拍摄图像。成像后，移去盖玻片，并在室温下在载玻片上用50μl的50mM Tris-Cl、1mM EDTA、1％SDS、0.2M NaCl裂解细胞5min。将细胞裂解物小心地转移至1.5ml eppendorf管中。将玻璃载玻片用50μl相同的缓冲液洗涤另外3次，并将洗涤溶液小心地转移至相同的管中。将最终浓度为50μg/μl的蛋白酶K添加至细胞裂物后，将混合物在65℃下在加热块中以1000rpm振荡培养过夜，用Qiagen迷你纯化试剂盒纯化，并在10μl Qiagen EB洗脱液中洗脱。按照原始ATAC-seq方案3制备测序文库。在Stanford Functional Genomics Facility的Illumina NextSeq上进行测序。对于人嗜中性粒细胞成像后的ATAC-seq，将50,000个细胞在具有细胞离心器的玻璃载玻片上离心。其余步骤与HT1080细胞相同，只是裂解缓冲液含有0.01％Igepal CA-630。
对于成像后ATAC-seq的系统敏感性测定，将不同量的细胞(50000、5000、500和50个细胞)接种在8孔室中并重复，并且在接种6h后如上所述固定细胞。以下程序与上述相同。
DNA FISH探针标记：如前所述31进行DNA FISH探针标记。简而言之，基于标准方案培养BAC克隆(ThermoFisher Scientific)、RP11-626N18、RP11-832P24、RP1163J14、RP11637D5、RP11-368K11、RP11-116A9，并用BACMAXTM DNA纯化试剂盒(BMAX044，Epicenter)纯化。纯化后，用超声处理将BAC剪切成300-800bp。通过与Cy3-dCTP(RP11-626N18，RP1163J14)(PA53021，GE healthcare life science，USA)、Green 496dUTP(RP11-832P24，RP11637D5)(ENZ-42831L-0050，Enzo life science)或Cy5-dCTP(RP11-368K11，RP11-116A9)(PA55021，GE healthcare life science)混合，用Array CGH基因组标记系统(18095-011，Thermo Fisher scientific)标记剪切的BAC DNA。用MinElute PCR纯化试剂盒(28006，Qiagen)纯化标记的探针。
人嗜中性粒细胞中的DNA FISH：如前所述31进行DNA FISH。简而言之，将纯化的人嗜中性粒细胞在室温下用1％甲醛固定10min，在具有细胞离心器的玻璃载玻片上离心并储存在70％乙醇中。将载玻片上的嗜中性粒细胞在PBS 0.5％Triton-x 100中在室温下透性化处理10min，在PBS中清洗，在80℃下在2xSSC/50％甲酰胺中变性30min，并在冰冷的2xSSC中放置5min。同时，40μl的杂交混合物、100ng BAC探针、1x DNA FISH杂交缓冲液(2xSSC，10％硫酸葡聚糖，50％甲酰胺)，最终浓度为100ng/μl的人Cot-1DNA(15279-011，ThermoFisher scientific)在95℃下变性5min并在冰上放置5分钟。将变性的探针添加至载玻片上的变性嗜中性粒细胞上后，将载玻片在潮湿的暗箱中在37℃下杂交14h。第二天，在40℃下将载玻片在2xSSC/50％甲酰胺中依次洗涤两次各15分钟，并在40℃下用2xSSC洗涤两次各15分钟。洗涤后，使用具有DAPI的Vectashield(H-1200，Vector labs)固定载玻片。用Zeiss LSM 700拍摄3D DNA FISH图像。DNA FISH信号中心与DAPI染色边缘之间的距离在Volocity(Perkin Elmer)中手动测量，并且在细胞核周边上由小于0.1μm的距离定义。
用于ATAC-See信号的成像处理：通过高斯过滤原始DAPI图像数据来识别和分割细胞核，然后应用强度阈值以生成细胞核轮廓。随机选择细胞核，并为每种细胞系选择超过约30个细胞核。通过眼睛验证所有细胞核轮廓。使用线粒体掩模从所有分析中排除含有线粒体的细胞区域，类似地通过高斯过滤Mito-Tracker图像数据生成，并应用强度阈值。
DAPI与ATAC-see之间的相关性在细胞核内逐像素的基础上测量信号，其中每个通道归一化为其每个细胞核的平均强度。相关性数据符合基于每个细胞和细胞群的线性回归。通过测量通过每个细胞核轮廓的迭代腐蚀产生的一系列1像素宽的环内的平均强度，测量作为从细胞核边缘到核心的径向距离的函数的DAPI和ATAC-see信号的强度分布。每个通道再次归一化为每个细胞核的平均强度。
每个细胞核内ATAC-see信号的明亮区域通过高斯过滤原始数据来识别，然后进行阈值处理以找到比平均过滤强度亮50％以上的所有区域。每个细胞的明亮区域内的面积分数被计算为总细胞核区域上的总亮点面积。所有分析都是使用自定义编写的python和C++代码进行的，大量使用NumPy和SciPy。
信号强度测量在Volocity软件(PerkinElmer)中进行，通过使用DAPI染色作为掩模由Volocity软件计算ATAC-see和其他标记(包括H3K4me3、H3K27Ac、H3K9me3、H3K27me3、RNAPII ser-2、RNAPII ser-5)或XIST RNA-FISH的信号强度相关性，并在自定义书写的R脚本中绘图。
ATAC-seq文库数据预处理：使用内部脚本为Illumina衔接子序列和转座酶序列修剪ATAC-seq配对末端读段，并使用具有非常灵敏的参数的Bowtie232v2.1.0将其映射至hg19。在每个测序文库中生成超过约1100万个映射读段并用于下游数据挖掘，并且在来自人嗜中性粒细胞和NETosis的每个测序文库中存在超过约3500万个映射读段。用Picard(http://picard.sourceforge.net)v1.79去除重复读段。通过参数为q 0.01-nomodel-shift 0的MACS233窄峰模式进行峰调用。将所有样品的重叠峰合并为一致峰列表，将各个单独样品的映射至每个峰的唯一且正确配对的读段的数量进行定量以计算皮尔逊相关系数。根据双端读段之间的距离估算片段的插入大小，并在直方图中针对频率进行绘制。在GREAT软件34中进行基因组本体富集分析。EdgeR用于识别Atto-Tn5与Nextera之间的可变峰，以及从Atto-Tn5到Nextera的技术重复之间的可变峰。
TSS周围的ATAC-seq信号强度：以TSS为中心的2kb窗口被分成40个相等大小的50bp的箱元(bin)。计算与每个箱元重叠的唯一映射且正确配对的ATAC-Seq标记的数量。将绘制在每个箱元中的平均片段计数归一化为总计1000万个读段。
LAD周围的ATAC-seq信号强度：下载了人类核纤层蛋白相关结构域(LAD)。所有1,302个LAD通过其左边界或右边界对齐，并计算了在合并的2,604个边界上ATAC-Seq读段覆盖率的平均分布图。详细地，以2,604LAD边界为中心的200kb窗口被分成40个相等大小的50kb的箱元。LAD右边界的箱元顺序与左边界的顺序相反。计算了每个箱元中唯一映射且正确配对的ATAC-seq标记的数量。将绘制在每个箱元中的平均片段计数归一化为总计1000万个读段。为了比较LAD内外的ATAC-seq信号，采集人类基因组上的10kb非重叠滑动窗口，并计算每个窗口中的ATAC-Seq读段计数。窗口在LAD内部标记为1，在LAD外部标记为0，然后在框图中在两组中绘制ATAC-seq信号。应用T检验来比较两组的平均值。
ATAC-Seq峰的差异分析：采用edgeR35使用重叠峰列表中每个样品的原始计数鉴定来自联合峰列表的差异可接近峰。edgeR以默认设置运行，其中倍数变化阈值为2，FDR<0.05。使用基于来自GM12878细胞系上的ENCODE组蛋白标志物的15种chromHMM状态36的功能基因组注释进一步研究人类基因组上的差异峰的分布。
材料和方法的参考文献
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36.Ernst et al..Nature methods 9，215-216(2012).
实施例1
ATAC-see用于调控DNA成像和测序
设计、产生和优化具有荧光衔接子的双功能Tn5转座体。装载有Atto590荧光团缀合的衔接子重组纯化的过度活性的Tn5转座酶(Atto-Tn5)保留了标准未标记的Tn5转座体(Nextera Tn5)的活性和选择性(图1，图b，c)。人B细胞的ATAC-seq(GM12878)显示用Atto-Tn5生成的DNA可及性谱与使用Nextera Tn5获得的DNA可及性谱高度相关(R＝0.96)(图1的图c)。此外，标准质量控制指标，如DNA插入片段长度分布、转录起始位点(TSS)富集和ATAC-seq峰的基因组分布在Atto-Tn5、Nextera Tn5和公布的来自相同的细胞系ATAC-seq数据3中也非常相似(图1的图c)。Atto-Tn5与Nextera Tn5的比较显示没有比Nextera Tn5的技术重复之间更大的变异，这表明带有分子标记的双功能Tn5转座体不影响转座酶活性。我们的标记策略是一般性的，并且与不同的荧光团和其他化学标记兼容(数据未示出)。
开发了在交联样品中进行ATAC-seq的方法，因为细胞固定是保持细胞核结构和细胞组成的常见且必要的步骤。甲醛固定的细胞的转座产生了具有短DNA片段的偏向文库3。开发了与ATAC-seq相容的反向交联方法。来自以这种方式固定的HT1080纤维肉瘤细胞的ATAC-seq数据与来自活细胞的标准ATAC-seq相当(R＝0.93)(图1的图d)，这表明固定条件不影响完整细胞核中的Tn5标记效率。将转座体工程化为标记在固定样品中的可接近DNA的能力为可接近基因组的顺序成像和测序奠定了基础。
ATAC-see实验揭示了可接近DNA的原位三维空间组织。粘附HT1080细胞通过甲醛/标准免疫荧光(IF)固定在玻璃载玻片上，并与Atto-Tn5反应。然后严格洗涤样品，通过DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)对总DNA进行复染，并用共聚焦显微镜进行成像。图像显示，可接近染色质在整个细胞核中是非均匀分布的，且与DAPI信号不同(其区分出了紧密堆积的DNA)。在一些但不是所有细胞中，ATAC-see信号被集中于几个细胞核焦点中(图2的图a)。这一结果表明，可接近基因组在完整的细胞核中形成更高级的结构；可接近基因组的这些焦点可能反映了染色体构象捕获技术6检测到的富含开放染色质的“A区室”。添加使Tn5活性失活的50mM EDTA 3,9-11将ATAC-see信号大大降低至对照的2.69％±0.04％(图2的图a)。因此，ATAC-see信号反映了荧光团标记的衔接子整合到可接近基因组DNA中。
开发了用ATAC-see进行多模式标记和成像的条件。已知ATAC-seq可捕获线粒体DNA(其未染色)。将ATAC-see、DAPI核核纤层蛋白B1的IF以及线粒体蛋白标志物结合的四色成像清楚地描绘了细胞核可接近基因组，并揭示了线粒体与细胞核外的ATAC-see信号之间的强重叠(图2的图b)。采用4个组蛋白标记和2种形式的RNA聚合酶II(RNAPII ser-2和ser-5磷酸化)的结合的ATAC-see和IF显示了在细胞核区域中ATAC-see与活性标记H3K4me3、H3K27ac和RNAPII(R为约0.80)的强共定位，但与抑制标记H3K27me3和H3K9me3(R＝0至0.20)不相关或负相关。为了进一步证实ATAC-see特异性标记可接近染色质，将ATAC-see与Xist RNA FISH结合，后者标记雌性细胞中无活性的X染色体。发现Xist RNA云位于ATAC-see空“洞”内，其中Xist结构域内的ATAC-see信号比Xist结构域外低2.3±0.14倍(p<0.005)。这些结果验证了ATAC-see在定位活性调控元件中的特异性，并通过排除验证了细胞核中的异染色质。将ATAC-see与IF成像的广泛工具包结合起来的能力表明，它可以轻松采用并广泛影响生物医学。
为了在成像后进行测序，开发了与ATAC-see样品相容的载玻片上的裂解程序。相同样品的ATAC-see成像后的ATAC-seq数据与平行细胞样品的标准ATAC-seq高度相关(R＝0.95；图2的图c、图d)。此外，ATAC-seq峰的差异峰分析显示Atto-Tn5与Nextera Tn5之间的差异不大于Nextera Tn5技术重复之间的差异。采用连续细胞稀释的载玻片上和固定的ATAC-see显示了高度可重复的DNA可及性绘图，其中输入范围为50,000至500个细胞。通过测序对序列成像和开放染色质景观的准确绘图表明，ATAC-see捕获可接近基因组的空间组织的全面肖像。
实施例2
可接近基因组的细胞类型特异性的空间组织
五种人类细胞类型的ATAC-see揭示，染色质可及性以细胞类型特异性方式进行空间组织，其伴随重叠的单细胞变异(图3的图a)。细胞核结构分层组织成不同的区室、拓扑结构域和染色体环1,14。异染色质被认为是物理凝聚的，渴望DAPI的，并且通常位于细胞核周边附近15。相反，常染色质含有可接近的调控元件和活性基因，并且往往位于核内部1,10,16。ATAC-see信号在细胞核内部可能更突出并且与单独细胞核中的DAPI信号反相关。线粒体对ATAC-see信号的贡献被掩盖。在HeLa细胞中，ATAC-see信号确实从细胞核周边逐渐增加到内部，并且与DAPI染色呈负相关(R＝-0.584，图3的图a)。然而，使用相同策略对附加的细胞类型的分析显示了这种简单图片的多个例外。原代人CD4+T细胞在ATAC-see与DAPI信号之间显示出较低的反相关性(R＝-0.243)，并且ATAC-see信号的细胞核内分布在细胞之间变化很大。此外，一些但不是全部的CD4+ T细胞具有ATAC-see信号的聚集焦点的十字形图案。约40％的CD4+ T细胞在细胞核周边具有半圆形“帽模式”的强的ATAC-see。B成淋巴细胞样GM12878细胞也表现出单细胞ATAC-see变异，但缺乏ATAC-see焦点的细胞核内簇。相反，粘附的HT1080纤维肉瘤细胞在富含DAPI的异染色质分离到细胞核周边和细胞核内部ATAC-see时更接近HeLa细胞，其中ATAC-see焦点的突出核簇显著不同。
嗜中性粒细胞是丰富的免疫细胞，它们在感染控制和炎症中发挥重要作用18；它们还具有独特的多叶状核。原发性人嗜中性粒细胞的ATAC-see揭示了可接近基因组的突出且独特的组织-嗜中性粒细胞中绝大多数ATAC-see信号位于细胞核周边以形成边缘结构(图3的图a)。嗜中性粒细胞ATAC-see信号强度从细胞核周边向内部减小，并且ATAC-see与DAPI信号之间几乎没有相关性(R＝-0.045)。ATAC-see信号的边缘模式不是由线粒体引起的，如相同细胞中线粒体标志物的不同染色模式所证明的。成像后相同样品的ATAC-seq证实大于99％的ATAC-see信号来自基因组DNA。此外，嗜中性粒细胞的染色质可及性的焦点峰比具有相似测序深度和比对率的其他细胞类型低50倍19。相反，嗜中性粒细胞含有大量多千碱基的可接近染色质块，其与来自7ENCODE细胞系的H3K27Ac呈负相关，但与核纤层蛋白相关结构域(LAD)显著相关(R＝0.31全基因组，p<0.0001，图3的图b)20。DNA荧光原位杂交(FISH)验证了ATAC-see指示的六个基因座中的六个位于嗜中性粒细胞的细胞核周边(图3的图c)。
其他细胞类型中的LAD与嗜中性粒细胞中的ATAC-seq读段之间的显著相关性表明现在可接近嗜中性粒细胞中的LAD。成像显示原代人嗜中性粒细胞下调核纤层蛋白B1蛋白的同时在细胞核周边放置可接近基因组。我们的结果还表明，对于LAD的外周定位，不需要核纤层蛋白B1，这与另一项研究21一致。接下来，测试嗜中性粒细胞是否像棒状感光细胞22中那样反转它们的核结构，然而，常染色质标记与异染色质标记的空间分布以预期模式位于嗜中性粒细胞核中。因此，人嗜中性粒细胞在细胞核周边具有显著的转座酶可接近DNA，但这种可接近DNA不具有标准的常染色标记。总的来说，这些观察结果表明，不同的人类细胞类型通常具有可接近基因组的独特和各种各样的空间组织(图3a)，以人嗜中性粒细胞为代表。
实施例3
ATAC-see揭示了NETosis的染色质动力学
探讨了嗜中性粒细胞中可接近基因组的异常空间组织如何促进嗜中性粒细胞功能。当成熟的嗜中性粒细胞遇到血液或组织中的细菌时，嗜中性粒细胞可释放其染色质并杀死细菌，这是一种程序性细胞死亡的独特形式，称为嗜中性粒细胞胞外陷阱(NETosis)23。NETosis也被认为促成人类炎症性疾病，但尚不清楚基因组是否随机片段化或以有组织的方式进行NET释放。有理由认为，在核周边预先定位开放的DNA可能会制备嗜中性粒细胞以引发NETosis。将相同细胞的ATAC-see和ATAC-seq的分子成像和表观基因组测序结合，并发现了NETosis中的两个关键步骤(图4)。
首先，在嗜中性粒细胞活化后，位于核周边的LAD用作染色质分解成单核小体的焦点。用肉豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)刺激原代嗜中性粒细胞以引发NETosis25 1、3和5hr。在1hr，ATAC-see显示可接近基因组现在被分裂成粗颗粒，并延伸到细胞核内部(图4的图a)。相同细胞的ATAC-seq在与先前靠近的LAD相邻的基因座显示出染色质可及性的增加；这些可接近位点主要是单核小体的形式(图4的图b)。因此，NETosis在LAD周围开始染色质可及性的重大重组，并从细胞核周边扩散到基因组的其余部分。
第二，随着持续的嗜中性粒细胞活化，单核小体被进一步分解成游离DNA和组蛋白，这一步骤需要组蛋白瓜氨酸化。在PMA刺激3hr后，约一半的嗜中性粒细胞(49.7％)已将其染色质释放到细胞外空间。NET具有广泛的ATAC-see信号，并含有多个明亮的焦点，这与去浓缩的染色质一致。相同样品的ATAC-seq表明整个基因组是可接近的，并且NET主要是游离DNA的形式，基本上与纯化的基因组DNA的阅读长度分布无法区分3,10。这种状态在PMA刺激5hr后保持不变，59.7％的嗜中性粒细胞释放NET(图4的图a、图b)。据报道，通过PAD4酶进行组蛋白瓜氨酸化可介导NETosis和染色质去浓缩26,27。用PAD4抑制剂Cl-脒(PAD4i)和PMA同时处理嗜中性粒细胞抑制了组蛋白瓜氨酸化和NETosis。PAD4i处理的活性嗜中性粒细胞使LAD周围染色质可及性的增加并将染色质加工成单核小体，但即使在嗜中性粒细胞活化5hr后也不能从单核小体释放游离DNA(图4的图a、图b)。形态学和基因组学分析表明，PAD4i处理的细胞在嗜中性粒细胞活化1至3hr的步骤中被捕获(图a、图b)。因此，NETosis可分为两个不同的步骤，并且PAD4介导的组蛋白瓜氨酸化仅在第二步中被需要用于分解核小体以释放DNA作为NET。
这些结果表明，NETosis是一种程序化的基因组分解，它精确地在空间上进行组织和序列编程(图4的图c)。NETosis从细胞核的边缘到内部由外而内地发生。位于细胞核周边的LAD的染色质可及性用作将染色质加工成核小体的初始引发点，然后组蛋白瓜氨酸化从组蛋白中分解DNA。对相同细胞的可接近基因组进行成像和测序的能力(“see和seq”)极大地促进了我们破译这种独特形式的程序性细胞死亡的空间编排的能力。
实施例4
采用流式细胞术的ATAC-see通过染色质可及性将细胞去卷积
最后，将ATAC-see与流式细胞术整合以探索作为染色质可及性的函数的定量细胞计数和前瞻性细胞分选。表观遗传学的核心问题是染色质组织在细胞周期中如何被分解和重新组装28。DNA内容物的ATAC-see和DAPI染色用于人B细胞系GM12878中的荧光活化细胞分选(FACS)。发现四组细胞-G1低、G1高、S期和G2-G1中约一半的细胞(2N DNA内容物)具有较低水平的ATAC-see信号(图5的图a、图b)。假设G1低细胞处于早期G1，因为染色质结构在有丝分裂期间的最大染色体压缩后开始解凝。用晚期G1/S转换标志物29细胞周期蛋白E1染色清楚地显示，G1中低和高DNA可接近细胞对应于早期和晚期G1(图5的图c，p<0.001)。
ATAC-seq进一步显示两个G1群相互之间以及与S期和G2期细胞相比具有不同的DNA可及性谱。聚焦于G1低和G1高细胞，鉴定了G1低细胞中具有相对较高可及性(倍数变化(FC)>2，FDR<0.05)的96个基因座；相反，与G1低细胞相比，2067个基因座在G1高中具有增加的DNA可及性(FC>2，FDR<0.05)(图5的图d-图e)。值得注意的是，G1低细胞中较易接近的基因座中的大多数(59.3％)是增强子，而G1高细胞中较易接近的基因座中最大的类别(57.4％)是启动子(图5的图f)。这些结果提高了某些增强子在早期G1中首先可接近的的可能性，随后是中后期G1的许多启动子。基因本体分析显示，G1高细胞中的可接近元件富含具有组蛋白乙酰转移酶活性、组蛋白修饰、基因转录、核体和其他生物过程的基因，这与从细胞分裂后的早期G1到晚期G1阶段逐步重建染色质和细胞核结构一致。在单独的应用中，发现小鼠骨髓细胞的ATAC-see可通过流式细胞术区分几种髓样细胞群，从而分离常见的髓样祖(CMP)细胞、粒细胞-单核细胞祖(GMP)细胞和嗜中性粒细胞。这些FACS数据通过共焦成像证实。这些实验共同证明了ATAC-see和流式细胞术对于分析细胞群异质性和增强细胞状态特异性信号的可行性，所述信号可能在大量人群中平均化。
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本领域技术人员还将认识到，尽管上面已经根据优选实施方案描述了本发明，但是本发明不限于此。上述发明的各种特征和方面可以单独使用或联合使用。此外，尽管已经在特定环境中实施本发明的背景下描述了本发明，并且对于特定应用，本领域技术人员将认识到其有用性不限于此并且本发明可以有利地用于许多需要检查分析物的环境和实施中。因此，应当根据本文所公开的本发明的全部范围和精神来解释下面提出的权利要求。
序列表
<110> 斯坦福大学托管董事会（The Board of Trustees of the Leland StanfordJunior University）
<120> 转座酶介导的对可接近基因组的成像
<130> STAN-1394WO
<150> 62/306,504
<151> 2016-03-10
<160> 3
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
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tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

Claims (22)

1.一种用于检测可接近染色质的方法，其包括：
a)获得包含与至少一个DNA衔接子结合的转座酶的转座酶复合物，所述DNA衔接子中的任何一个包含可检测标签；
b)在适合于转座酶与所述染色质中可接近区域结合的条件下使染色质与所述转座酶复合物接触；并且
c)检测所述可检测标签。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
a)获得包含与至少一个DNA衔接子结合的转座酶的转座酶复合物，所述至少一个DNA衔接子包含所述转座酶的识别序列和可检测标签；
b)在适合于转座的条件下使染色质与所述转座酶复合物接触，从而在所述染色质中的可接近区域将所述至少一个DNA衔接子与所述染色质连接；并且
c)检测所插入的DNA衔接子的标签。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
a)获得转座酶复合物，所述转座酶复合物包含含有可检测标签的转座酶，其中所述转座酶与包含所述转座酶的识别序列的至少一个DNA衔接子结合；
b)在适合于所述转座酶与染色质中可接近区域结合的条件下使所述染色质与所述转座酶复合物接触；并且
c)检测所述转座酶的标签。
4.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述转座酶是过度活性的Tn5转座酶。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述DNA衔接子包含i)第一寡核苷酸，其包含SEQ IDNO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及ii)第二寡核苷酸，其包含与所述第一寡核苷酸的一部分充分互补并能够与所述第一寡核苷酸的一部分杂交的序列，使得所述DNA衔接子包含呈双链的至少一部分，其中所述双链部分包含所述转座酶的所述识别序列。
6.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述可检测标签是荧光团、金属粒子、磁性粒子、同位素标签、化学发光标签、配体、质量标记、量子点或半抗原。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述荧光团是ATTO荧光染料。
8.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述检测包括进行荧光成像或流式细胞术。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述检测包括进行电子显微镜检查。
10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述检测包括进行大量细胞计数法。
11.如任何前述权利要求所述的方法，其进一步包括鉴定所述可接近染色质中的调控DNA、转录因子结合位点或核小体结合位点。
12.如任何前述权利要求所述的方法，其进一步包括绘制所述DNA衔接子插入所述可接近染色质中的位点的位置。
13.如任何前述权利要求所述的方法，其进一步包括对所述DNA衔接子插入所述可接近染色质中的位点的DNA进行测序。
14.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述方法在活细胞或固定细胞内在染色质上原位进行。
15.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述方法在分离的染色质上进行。
16.如任何前述权利要求所述的方法，其进一步包括基于通过所述DNA衔接子标记细胞中的可接近染色质来分选所述细胞。
17.一种包含含有与DNA衔接子结合的转座酶的转座酶复合物的组合物，其中所述转座酶或DNA衔接子包含可检测标签。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述DNA衔接子包含i)第一寡核苷酸，其包含SEQID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及ii)第二寡核苷酸，其包含与所述第一寡核苷酸的一部分充分互补并能够与所述第一寡核苷酸的一部分杂交的序列，使得所述DNA衔接子包含呈双链的至少一部分，其中所述双链部分包含所述转座酶的识别序列，其中所述DNA衔接子能够经转座酶催化插入可接近染色质中。
19.如权利要求17-18中任一项所述的组合物，其中所述可检测标签是荧光团、金属粒子、磁性粒子、同位素标签、化学发光标签、配体、质量标记、量子点或半抗原。
20.如权利要求17-19中任一项所述的组合物，其中所述转座酶复合物包含：
与至少一个DNA衔接子结合的转座酶，所述至少一个DNA衔接子包含所述转座酶的识别序列和可检测标签；或
包含可检测标签的转座酶，其中所述转座酶与包含所述转座酶的识别序列的至少一个DNA衔接子结合。
21.一种包含转座酶和至少一个DNA衔接子以及检测可接近染色质的说明书的试剂盒，所述至少一个DNA衔接子包含所述转座酶的识别序列，其中所述DNA衔接子或所述识别序列包含可检测标签。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述至少一个DNA衔接子包含第一DNA衔接子，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ IDNO：2的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列；以及第二DNA衔接子，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的序列具有至少95％一致性的核苷酸序列。
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