CN114736951A - 一种小分子rna的高通量测序文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其包括步骤：提取待测样品中的RNA；使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶，结合带有polyT的逆转录引物对所述RNA进行加尾和逆转录，得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链；利用外切酶I清除反应体系产物中剩余的逆转录引物；对所述cDNA第一链进行变性后与末端突出的双链DNA接头进行连接，得到连接产物；对所述连接产物用USER酶处理，得到处理后cDNA；对处理后cDNA进行PCR扩增，得到高通量测序文库。本发明实现了对血浆中极其微量的small RNA的文库构建，本发明不依赖于RNA5’端为磷酸化修饰，因而可以对更多不同类型的RNA进行文库构建。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序文库构建领域，特别涉及一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法。
背景技术
Small RNA(小分子RNA)包括rsRNAs、ysRNA、tsRNAs、miRNAs、siRNAs和piRNAs等，是一大类调控分子，几乎存在于所有生物体内。Small RNA可以通过mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除来调控生物体的生长发育、代谢和疾病发生等生理学过程。通过对small RNA进行高通量的测序分析，可以获得物种全基因组水平的small RNA图谱，实现样品间差异small RNA的鉴定、RNA聚类等科学应用。此外，最近研究发现血浆中存在丰富的small RNA，并且在肿瘤、高血压和糖尿病等多种疾病中呈特异性表达，提示血浆中的smallRNA可以作为潜在的生物标记物用于疾病的诊断和治疗。通过对small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的small RNA图谱，实现对不同疾病患者血浆中特异的small RNA标志物鉴定。
目前针对small RNA进行测序的方法已有多款成熟的试剂盒，如NEBNextMultiplex Small RNA Library Prep Set。但这些试剂盒针对的材料主要为组织RNA或细胞RNA，并且只能对5’端为磷酸化修饰的RNA进行文库构建与测序分析。目前，针对5’端为非磷酸化修饰的RNA，并没有成熟的试剂盒，此外对于血浆中的微量RNA，亦没有成熟的试剂盒可以用于small RNA图谱的绘制。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法，旨在解决现有技术无法对微量5’端为非磷酸化修饰的小分子RNA进行测序的问题。
本发明的技术方案如下：
一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其中，包括步骤：
提取待测样品中的RNA，备用；
使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶，结合带有polyT的逆转录引物对所述RNA进行加尾和逆转录，得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链；
利用外切酶I清除反应体系产物中剩余的逆转录引物；
对所述cDNA第一链进行变性后与末端突出的双链DNA接头进行连接，得到连接产物；
对所述连接产物用USER酶处理，得到处理后cDNA；
对处理后cDNA进行PCR扩增，得到高通量测序文库。
所述小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其中，使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶，结合带有polyT的逆转录引物对所述RNA进行加尾和逆转录，得到反应体系产物的步骤包括：
将polyA加尾酶、MMLV逆转录酶、带有polyT的逆转录引物以及逆转录缓冲液混合在一起，得到逆转录混合物；
在70℃条件下处理所述RNA 2min使所述RNA的二级结构打开，当温度降低至25℃时，将所述逆转录混合物和所述RNA混合在一起，得到反应体系；
在37℃将上述反应体系孵育30min后得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链。
所述小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其中，利用外切酶I清除反应体系产物中剩余的逆转录引物的步骤包括：
将外切酶I加入到反应体系产物中，在37℃保温30min，接着以80℃保温20min，清除反应体系产物中的逆转录引物。
所述小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其中，对所述cDNA第一链进行变性后与末端突出的双链DNA接头进行连接，得到连接产物的步骤包括：
对所述cDNA第一链进行95℃，5min孵育使其变性，得到变性cDNA第一链；
使用末端突出的双链DNA接头与变性cDNA第一链在20℃保温1h，接着在65℃保温10min的条件下进行连接，得到连接产物。
所述小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其中，对所述连接产物用USER酶处理，得到处理后cDNA的步骤包括：
利用USER酶对所述连接产物进行37℃15min处理，得到处理后cDNA。
有益效果：本发明在RNA3’端同时使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶的试验方案进行文库构建，这一技术手段的使用不需要进行RNA 3’端的连接反应，因而极大的增强了检测的敏感性，实现了对血浆中极其微量的small RNA的文库构建；此外，本发明不依赖于RNA5’端为磷酸化修饰，因而可以对更多不同类型的RNA进行文库构建。
附图说明
图1为本发明一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法流程图。
图2为小分子RNA的高通量测序文库构建的原理图。
图3为实施例1中4例肺癌患者血浆中小分子RNA的高通量测序文库的琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
本发明提供一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，图1为本发明提供的一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法流程图，如图所示，其包括步骤：
S10、提取待测样品中的RNA，备用；
S20、使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶，结合带有polyT的逆转录引物对所述RNA进行加尾和逆转录，得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链；
S30、利用外切酶I清除反应体系产物中剩余的逆转录引物；
S40、对所述cDNA第一链进行变性后与末端突出的双链DNA接头进行连接，得到连接产物；
S50、对所述连接产物用USER酶处理，得到处理后cDNA；
S60、对处理后cDNA进行PCR扩增，得到高通量测序文库。
在本发明中，不同的待测样品可使用不同的试剂盒来提取RNA，作为举例，若待测样品为组织或细胞时，则可采用RNAiso Plus试剂盒来提取样品RNA；若待测样品为血浆时，则可采用Apostle MiniMax High Efficiency cfRNA Isolation试剂盒来提取样品RNA，提取的RNA最终溶解于无RNA酶的水中，备用。
如图2所示，本发明是在RNA3’端同时使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶的试验方案进行文库构建，这一技术手段的使用可大大降低RNA投入量，能够实现对血浆中微量RNA的文库构建，这一技术手段还未有过报道。本发明极大的增强了检测的敏感性，实现了对血浆中极其微量的small RNA的文库构建；本发明不依赖于RNA5’端为磷酸化修饰，因而可以对更多不同类型的RNA进行文库构建。
在一些实施方式，使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶，结合带有polyT的逆转录引物对所述RNA进行加尾和逆转录，得到反应体系产物的步骤包括：将polyA加尾酶、MMLV逆转录酶、结合带有polyT的逆转录引物以及逆转录缓冲液混合在一起，得到逆转录混合物；在70℃条件下处理所述RNA2min使所述RNA的二级结构打开，当温度降低至25℃时，将所述逆转录混合物和所述RNA混合在一起，得到反应体系；在37℃将上述反应体系孵育30min后得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链。在本实施例操作过程中，对不同的样本采用不同的逆转录引物，逆转录引物上额外的加入8个标识碱基，用于不同样本在测序时能够区分开来。
在一些实施方式中，利用外切酶I清除反应体系产物中剩余的逆转录引物的步骤包括：将外切酶I加入到反应体系产物中，在37℃保温30min，接着以80℃保温20min，清除反应体系产物中的逆转录引物。如图2所示，本实施例通过采用外切酶I对反应体系产物进行处理，从而可以去除掉未发生逆转录反应的引物，使得测序数据中引物自连的比列降低到了25％以下(常规比例在60％-70％)。
在一些实施方式中，对所述cDNA第一链进行变性后与末端突出的双链DNA接头进行连接，得到连接产物的步骤包括：对所述cDNA第一链进行95℃，5min孵育使其变性，得到变性cDNA第一链；使用末端突出的双链DNA接头与变性cDNA第一链在20℃保温1h，接着在65℃保温10min的条件下进行连接，得到连接产物。
具体来讲，传统方法仅能对5’端为磷酸化修饰的RNA进行文库构建和测序，而本实施例如图2所示，对所述cDNA第一链进行变性后，通过T4DNA连接酶将变性cDNA第一链与末端突出的双链DNA接头进行连接，通过这一技术手段，完全避免了RNA5’端的修饰对文库构建的影响。
在一些实施方式中，利用USER酶对所述连接产物进行37℃15min处理，得到处理后cDNA。在本实施例中，通过采用USER酶对所述连接产物进行处理，可以降低PCR过程所需要的循环数，减少文库中的冗余。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
实施例1
根据以上small RNA文库构建方法，本例具体对4例肺癌患者200μL血浆中的小分子RNA进行了高通量测序文库构建。先利用Apostle公司的MiniMax TM High EfficiencycfRNA Isolation Kit对血浆中的小分子RNA进行提取，最终体积均为10μL。
文库构建的逆转录引物为SEQ ID NO.1所示序列，其中，“nnnnnnnn”表示8bp的样本标识碱基，即多个样品混合测序时用于区分不同样品的序列。本例针对4例肺癌患者的小分子RNA用到了4条逆转录引物，序列为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.5，其中v表示a，c，g；n表示a，t，c，g。
SEQ ID NO.1:
tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnnnnnnnnttttttttttttttttttvn
SEQ ID NO.2:
tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcctctctgttttttttttttttttttvn
SEQ ID NO.3:
tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcagcctcgttttttttttttttttttvn
SEQ ID NO.4:
tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgcctcttttttttttttttttttttvn
SEQ ID NO.5:
tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcctctacttttttttttttttttttvn
4例肺癌患者血浆中小分子RNA逆转录后所得cDNA连接相同的双链DNA接头，其由序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的两条DNA分子退火形成。
SEQ ID NO.6:
cacctctctauacacucttucccuacacgacgctctuccgatcunnnnnn
SEQ ID NO.7:
agatcggaagagcgtcgtgtagggaaagagtgtatagagaggtg
4例肺癌患者血浆中小分子RNA逆转录产物cDNA连接接头后，采用相同的PcR引物进行扩增，即SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
SEQ ID NO.8:
aatgatacggcgaccaccgagatctacacctctctatacactctt
SEQ ID NO.9:
caagcagaagacggcatacgagatgtgactggagtt
本例中4例肺癌患者血浆中小分子RNA高通量测序文库构建的具体反应体系和条件如下：
1、小分子RNA加PolyA尾与逆转录
首先将血浆中提取的6.75μL无核酸酶的小分子RNA与0.05μM的逆转录引物1μL混合，制备成混合样品后置于70℃孵育2min后立即放置于冰上，备用。
然后配制总体积为2.25μL的反应液，包括4×PolyA加尾缓冲液0.625μL，4×逆转录缓冲液0.625μL，PolyA加尾酶0.5μL，逆转录酶0.5μL。
将2.25μL的反应液与放置于冰上的混合样品混匀后置于37℃孵育30min，即完成了小分子RNA加PolyA尾与逆转录，得到了cDNA。
2、去除残留逆转录引物
在上述逆转录产物中加入核酸外切酶I1ul后混匀置于37℃孵育30min，80℃孵育20min，95℃孵育5min后迅速置于冰上备用，即完成了cDNA中残留逆转录引物的去除。
3、接头的制备
首先分别将5μL制备接头所用的100μM的两条DNA分子混合后置于冰上，向混合物中加入5μL的10×NEBbuffer2.1并混匀，加入35μL无核酸酶的水后混匀并放置于冰上备用，总反应体系为50μL。
然后混合液置于Thermal cycler中，并运行下述程序：95℃5min，然后进入70个循环：每个循环温度降低1℃并孵育1min，最终于25℃孵育1min后停止，将混合液置于冰上备用，即得到了接头。
4、逆转录产物连接接头
首先配制总体积为9μL的反应液：10×T4 DNA ligase buffer 1μL、10mM ATP 2μL、50％PEG4000 2μL、接头1μL、T4 DNA ligase 1μL、无核酸酶水2μL，混匀后置于冰上备用。
然后将配好的反应液加入到步骤2中的cDNA中，混匀后置于20℃孵育60min，65℃孵育15min即完成了接头的连接，将产物置于冰上备用。
5、USER酶消化接头
将1ul USER酶加入到步骤4的产物中，混匀后置于37℃孵育15min即完成了对接头的消化，将产物置于冰上备用。
6、PCR扩增制备文库
首先取新的PCR管，配制总体积为35μL的反应液：2×Kapa hifi ready mix 25μL、10μM的扩增引物分别1μL，无核酸酶的水8μL，混合后置于冰上备用。
吸取15μL步骤5中的产物并加入至上述PCR反应液中，混合后在Thermal cycler上进行如下反应：95℃孵育1min，然后进入16个循环：98℃20s、60℃30s、72℃30s，循环结束后，72℃孵育1min，15℃保持，即得到了扩增产物。
7、利用XP beads纯化回收PCR产物
首先向PCR产物中加入90μL XP bead后混匀，室温放置15min，期间振荡混匀1次。
然后置于磁力架上3-5min后丢弃上清，用200μL 80％乙醇清洗两次，清洗时将PCR管前后方向反转5次，使beads在乙醇中得到充分洗涤。
打开PCR管盖，将其置于室温下晾干剩余乙醇。加入30μL蒸馏水后振荡混匀，使beads悬浮于溶液中，室温放置15min，期间再振荡混匀1次。
置于磁力架上3-5min后将上清转移至新的EP管中，即为本例中得到的4例肺癌患者血浆中小分子RNA的高通量测序文库。
采用3％的琼脂糖凝胶电泳对文库进行质检，所得结果如图3所示。采用本发明所述方法得到了平均长度约为180bp的文库，与预期结果一致。
采用QubitTM dsDNA Assay Kit对文库进行浓度测定后，分别取30ng文库混匀后在Illumina测序平台进行测序。
对本例的小分子RNA文库测序进行分析，具体如下：
1、对于4个不同样本数据的拆分
根据4个不同肺癌样本血浆小分子RNA在逆转录过程中携带的样本标签不同，对测序原始数据中R2 reads的前8个碱基进行判断可得每条reads对应的样本。本例中对原始测序数据进行拆分后，所得每个样本的测序数据量均大于25M reads。
2、小分子RNA文库测序结果分析
通过数据拆分得到4例肺癌样本的测序结果后，首先去除接头序列，然后通过判断插入片段的大小判断接头自连比例。本例中以15bp为筛选条件，即插入片段小于15bp为接头自连产物，插入片段大于15bp为小分子RNA逆转录产物。如表1所示，数据经过分析发现4例肺癌样本文库中接头自连比列分别为：22.9％、25.2％、22.4％和24.5％。
表1 4例肺癌样品测序数据分析表
该结果表明本发明在对微量小分子RNA进行文库构建过程中仅产生少量的接头自连。如表1所示，对去除掉接头自连后的序列进行比对分析发现了5种不同来源的小分子RNA，包括rsRNA、ysRNA、tsRNA、miRNA、piRNA。该结果表明利用本发明可以得到肺癌患者血浆中丰富的5’端不含磷酸化修饰的小分子RNA信息，可以为癌症的早期诊断及预后标志物的筛选奠定基础。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法
<160> 9
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<221> 杂项特征
<222> (43) ..(50)
<223> n =a，t，c，g
<221> 杂项特征
<222> (69) ..(69)
<223> v =a，c，g
<221> 杂项特征
<222> (70) ..(70)
<223> n =a，t，c，g
<400> 1
tacgagatgt gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn tttttttttt 60
ttttttttvn 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<221> 杂项特征
<222> (69) ..(69)
<223> v =a，c，g
<221> 杂项特征
<222> (70) ..(70)
<223> n =a，t，c，g
<400> 2
tacgagatgt gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcctctctg tttttttttt 60
ttttttttvn 70
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<221> 杂项特征
<222> (69) ..(69)
<223> v =a，c，g
<221> 杂项特征
<222> (70) ..(70)
<223> n =a，t，c，g
<400> 3
tacgagatgt gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcagcctcg tttttttttt 60
ttttttttvn 70
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<221> 杂项特征
<222> (69) ..(69)
<223> v =a，c，g
<221> 杂项特征
<222> (70) ..(70)
<223> n =a，t，c，g
<400> 4
tacgagatgt gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttgcctctt tttttttttt 60
ttttttttvn 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<221> 杂项特征
<222> (69) ..(69)
<223> v =a，c，g
<221> 杂项特征
<222> (70) ..(70)
<223> n =a，t，c，g
<400> 5
tacgagatgt gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttcctctac tttttttttt 60
ttttttttvn 70
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<221> 杂项特征
<222> (45) ..(50)
<223> n =a，t，c，g
<400> 6
cacctctcta uacacucttu cccuacacga cgctctuccg atcunnnnnn 50
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 7
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgtatagaga ggtg 44
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctataca ctctt 45
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagtt 36
Claims (5)
1.一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，包括步骤：
提取待测样品中的RNA，备用；
使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶，结合带有polyT的逆转录引物对所述RNA进行加尾和逆转录，得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链；
利用外切酶I清除反应体系产物中剩余的逆转录引物；
对所述cDNA第一链进行变性后与末端突出的双链DNA接头进行连接，得到连接产物；
对所述连接产物用USER酶处理，得到处理后cDNA；
对处理后cDNA进行PCR扩增，得到高通量测序文库。
2.根据权利要求1所述小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶，结合带有polyT的逆转录引物对所述RNA进行加尾和逆转录，得到反应体系产物的步骤包括：
将polyA加尾酶、MMLV逆转录酶、结合带有polyT的逆转录引物以及逆转录缓冲液混合在一起，得到逆转录混合物；
在70℃条件下处理所述RNA 2min使所述RNA的二级结构打开，当温度降低至25℃时，将所述逆转录混合物和所述RNA混合在一起，得到反应体系；
在37℃将上述反应体系孵育30min后得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链。
3.根据权利要求1所述小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，利用外切酶I清除反应体系产物中剩余的逆转录引物的步骤包括：
将外切酶I加入到反应体系产物中，在37℃保温30min，接着以80℃保温20min，清除反应体系产物中的逆转录引物。
4.根据权利要求1所述小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，对所述cDNA第一链进行变性后与末端突出的双链DNA接头进行连接，得到连接产物的步骤包括：
对所述cDNA第一链进行95℃，5min孵育使其变性，得到变性cDNA第一链；
使用末端突出的双链DNA接头与变性cDNA第一链在20℃保温1h，接着在65℃保温10min的条件下进行连接，得到连接产物。
5.根据权利要求1所述小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，对所述连接产物用USER酶处理，得到处理后cDNA的步骤包括：
利用USER酶对所述连接产物进行37℃15min处理，得到处理后cDNA。
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