CN113249437A - 一种用于sRNA测序的建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于sRNA测序的建库方法，首先对获取的样本进行预处理，进行RNA的提取制备；接着将预腺苷酸化的3’端接头和5’端接头进行预处理，并分别对所述3’端接头和所述5’端接头与制备得到的RNA进行连接和纯化；然后将纯化后的连接产物进行逆转录反应，同时将得到的对应的cDNA链进行纯化，并以所述cDNA链进行PCR富集反应，得到包含adapter的PCR产物；最后根据sRNA文库的需求对所述PCR产物进行大小分选，纯化，即得到sRNA高通量测序文库，降低错配率。
Description
技术领域
本发明涉及small RNA建库技术领域，尤其涉及一种用于sRNA测序的建库方法。
背景技术
Small RNAs(sRNAs)是RNA的一种，在转录及转录后水平的基因调节过程中起着不可或缺的作用。有多种技术应用于sRNAs的定量，包括杂交技术、qPCR和高通量测序技术(NGS)。NGS技术无疑是一种低成本的sRNA的全基因组定量的首选方法。同时，NGS也是唯一能发现新sRNA序列、区分相似的sRNA类别以及证实转录后水平修饰序列的技术。传统的sRNA文库构建工作流程包含：1.添加接头用于单链RNA的连接；2.反转录；3.PCR。大部分的研究表明连接是整个建库过程出现偏差的原因。用于单链连接的连接效率及出现的偏差率取决于目标片段和接头，不同的接头序列使得文库的浓度多样化。目的sRNAs片段和接头是否配对是决定连接效率的主要因素。一些RNA与接头碱基互补配对相比未能与接头互补配对的RNA具有更高的连接效率，或者一些RNA折叠形成二级结构不适合连接，导致构建文库的量出现偏差。
目前已经有一些方法被用于降低连接错配率。例如：添加PEG,用来提高连接效率及降低错配率。之后，发现在接头中添加随机碱基能增加目标片段与接头的配对率并且减少偏差，这一发现已经商业化应用于NEXTflex试剂盒，这一试剂盒中的接头在连接处包含4bp的简并碱基。再后来，一些试剂盒设计为直接减去连接步骤，通过对模板多腺苷酸化，之后反转录构成无需连接的文库。后来证实这种相比接头连接的方法在检测miRNA方面有着更低的检测率，致使错配率增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于sRNA测序的建库方法，降低错配率。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于sRNA测序的建库方法，包括以下步骤：
对获取的样本进行预处理，进行RNA的提取制备；
对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化；
对纯化后的连接产物进行逆转录反应，得到对应的cDNA链并纯化；
对纯化后的所述cDNA链进行PCR富集反应，并利用sRNA文库对得到的PCR产物进行分选，得到sRNA高通量测序文库。
其中，对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化，包括：
将预腺苷酸化的3’端接头和5’端接头重悬于解链缓冲溶液中，并将所述3’端接头在95℃下进行2分钟退火，然后以每分钟一个循环降1℃，直至70个循环完成，同时将所述5’端接头在80℃下进行2分钟退火，并以每秒降0.1℃的温降，直到所述5’端接头的温度为4℃。
其中，对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化，还包括：
利用无酶水将制备得到的所述RNA进行稀释，并加热至70℃，反应5分钟后置于冰上，然后加入多种反应液和预处理后的所述3’端接头，在25℃下的恒温仪中反应1小时。
其中，对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化，还包括：
向所述恒温仪中加入2.5个单位的λ核酸外切酶和25个单位5’-外切核酸酶，依次在多个温度和反应时间下反应后，再加入5个单位的尿嘧啶-DNA-糖基酶和20个单位的核酸外切酶IV在37℃下，反应1小时。
其中，对纯化后的连接产物进行逆转录反应，得到对应的cDNA链并纯化，包括：
向纯化后的连接产物中加入浓度为50mM，PH7.5的Tris-HCl Buffer、浓度为75mM的氯化钾溶液、浓度为10mM的二流苏糖醇、浓度为10mM的三磷酸脱氧核苷、20个单位的抑制剂和200个单位的反转录酶，在42℃下的恒温仪中反应1小时，得到cDNA链。
其中，对纯化后的连接产物进行逆转录反应，得到对应的cDNA链并纯化，还包括：
利用70μl的DNA纯化磁珠及70μl的无水乙醇对所述cDNA链进行纯化，然后用10μl的无酶水进行洗脱。
本发明的一种用于sRNA测序的建库方法，首先对获取的样本进行预处理，进行RNA的提取制备；接着将预腺苷酸化的3’端接头和5’端接头进行预处理，并分别对所述3’端接头和所述5’端接头与制备得到的RNA进行连接和纯化；然后将纯化后的连接产物进行逆转录反应，同时将得到的对应的cDNA链进行纯化，并以所述cDNA链进行PCR富集反应，得到包含接头的PCR产物；最后根据sRNA文库的需求对所述PCR产物进行大小分选，纯化，即得到sRNA高通量测序文库，降低错配率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的一种用于sRNA测序的建库方法的步骤示意图。
图2是本发明提供的用于sRNA测序的建库方法的流程示意图。
图3是本发明提供的测序检测出miRNA的数量对比图。
图4是本发明提供的测序检测出tRNA片段的数量对比图。
图5是本发明提供的测序检测出各类型tRNA片段的数量对比图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
请参阅图1和图2，本发明提供一种用于sRNA测序的建库方法，包括以下步骤：
S101、对获取的样本进行预处理，进行RNA的提取制备。
具体的，使用Zymo Reasearch的Direct-zol RNA Miniprep Kits对小鼠脑组织中总RNA进行提取，具体为：
1.取30mg的样本组织(小鼠脑组织)，添加1ml的RNA提取TRIzol溶液，裂解之后离心去除不溶的组织，然后将上清液移置到一个无核酸酶(RNase-free)的离心管内进行后续样品纯化步骤；
2.加入等体积无水乙醇到上一步TRIzol裂解液中混匀；
3.将上述混合液倒入套在收集管内的核酸纯化柱(Zymo-Spin IICR Column)柱内，离心1min，去除滤液；
4.柱上DNase I消化处理去除痕量的DNA。
a.添加400μl的RNA洗涤液到Zymo-Spin IICR Column柱里，离心1min，去除滤出液；
b.取一个RNase-free离心管，添加5μl DNaseI(6U/μl)，75μl DNA消化液，混匀，倒入Zymo-Spin IICR Column柱；
c.20-30℃孵育15min。
5.添加400μl RNA洗涤液到Zymo-Spin IICR Column柱，离心1min，去除滤出液；
6.添加700μl的RNA清洗缓冲液到Zymo-Spin IICR Column柱，离心1min，去除滤出液；
7.空转2min去除残留的乙醇；
8.取出Zymo-Spin IICR Column柱，放入一个新的无RNA酶的离心管，在柱吸附膜中间部位添加50μl无核酸酶水，室温静置2min，离心1min洗脱RNA。
S102、对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化。
具体的，将预腺苷酸化的3’端接头(3’-adapter)和5’端接头(5’-adapter)重悬于解链缓冲(Buffer)溶液中，解链Buffe溶液由10mM Tris-HCl缓冲液、50mM氯化钠(NaCl)和0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)组成，3’-adapter经过95℃，2min退火，接着每min一个循环降1℃，共70个循环。5’-adapter则在80℃，2min退火，接下来每秒降0.1℃，直到反应温度降至4℃。
然后进行连接反应，先进行3’-adapter的连接，再进行5’-adapter的连接，使RNA分别在3’端和5’端连上接头；所述接头adapters为双链结构，且包含一段由6bp简并碱基的组成的短的单链突出结构。双链结构adapters的两条链分别作用于sRNA链的两端，结合在3’端的称之为3’-adapter，结合在5’端的称之为5’-adapter，且adapter的反义链的3’端包含一段由6bp简并碱基组成的短片段，用于与sRNA结合。其中，3’-adapter和5’-adapter的正反义链的序列分别如下：
3’-adapter正义链：
5’-/5Phos/AGATCGGAAGAGCACACGTCT-3’
3’-adapter反义链：
5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCUNNNNNN/3InvdT/-3’
5’-adapter正义链：
5’-rGrUrUrCrArGrArGrUrUrCrUrArCrArGrUrCrCrGrArCrGrArUrC-3’
5’-adapter反义链：
5’-mNmNmNmNmNmNrGrArUrCrGrUrCrGrGrArCrUrGrUrArGrArAr
CrUrCrUrGrArArC/3InvdT/-3’
其中，N可重复的选自A、T、C或G。
1、RNA与3’-adapter的连接反应
以100ng上述提取的RNA作为模板进行高通量测序文库的构建。具体步骤如下：将总RNA用无酶水稀释到5μl，并加热到70℃，5min，然后置于冰上。接下来在20μl反应体系中加入如下成分：1X T4 RNA连接缓冲液、终浓度20％的PEG、终浓度0.05％的Tween 20、2.5pmol的解链3’-adapter、200个单位的T4 RNA连接酶2，KQ截断体；RNA 5μl，加无酶水补至20μl。然后将上述反应液在恒温仪上执行以下程序：25℃，1h。接着在上述反应液中加入2.5个单位的λ核酸外切酶和25个单位5’-外切核酸酶，置于恒温仪上30℃，15min；37℃，15min；最后75℃，5min；最后在反应液中加入5个单位的尿嘧啶-DNA-糖基酶和20个单位的核酸外切酶IV，置于恒温仪上37℃，1h。
3’-adapter的正向链5’端提前进行经过腺苷酸化修饰，修饰后的adapter能减少自连并有序的与目标片段连接，反义链在简并碱基的3’末端和3’adapter的末端处有一个反向的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，此核苷酸通过阻止adapter发生自连来增加连接效率；且在3’-adapter的简并碱基开始的位置设计了一个脱氧尿苷酸。同时脱氧尿苷酸能用尿嘧啶-DNA糖基化酶与DNA核酸内切酶VIII混合物切除使得简并碱基的短序列移除，以保证这段序列不会被整合到cDNA产物中，且降低了adapter二聚体形成的概率，同时保留3’-adapter，作为cDNA合成的引物，且在5’-adapter连接之前切除简并序列，能有效的减少接头二聚体的形成，降低偏差。
2、RNA与5’-adapter的反应
在3’端接头连接体系中加入ATP使得终浓度为1mM，5pM的5’端接头，20个单位的T4RNA连接酶2。将此反应液置于恒温仪上37℃，1h。
S103、对纯化后的连接产物进行逆转录反应，得到对应的cDNA链并纯化。
具体的，以3’端接头作为引物，向连接产物体系中，加入PH7.5的Tris-HCl缓冲液(终浓度50mM)，KCl(终浓度75mM)，DTT(二硫苏糖醇，终浓度10mM)，DNTP(三磷酸脱氧核苷，终浓度10mM)，20个单位的小鼠Rnase抑制剂，200个单位的ProtoScript II反转录酶，无酶水补至终体积50μl。将反应体系置于恒温仪上42℃，1h。即得到cDNA产物。并将cDNA产物用70μl的核酸纯化磁珠及70μl的无水乙醇纯化，并用10μl的无酶水进行洗脱。
S104、对纯化后的所述cDNA链进行PCR富集反应，并利用sRNA文库对得到的PCR产物进行分选，得到sRNA高通量测序文库。
具体的，PCR扩增反应体系用DNA聚合酶及25mM的正向引物与反向引物。将反应液在PCR仪上执行以下程序：98℃，30S预变性；98℃变性10S；62℃退火30S；72℃延伸30S；共15个循环，72℃延伸5min。
利用核酸纯化磁珠根据sRNA测序文库构建试剂盒中的文库大小筛选法进行分选纯化，即得到sRNA文库。
传统方法构建sRNA高通量测序文库分别采用sRNA测序文库构建试剂盒。测序平台采用Illumina Hiseq 2500测序平台。对测序得到的single-end Raw Reads进行质控，去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据质控，得到可供后续分析的高质量的目标序列。再将目标序列进行比对，对sRNA进行分类和注释，后续生物学分析及作图用R完成。如图3、图4和图5所示，其中，A代表使用传统方法构建sRNA文库的结果，B代表使用本发明中的方法构建sRNA文库的结果。图3显示的是通过高通量测序在小脑组织中检测出的miRNA的数量。其中A代表传统sRNA建库方法的结果，B代表采用本发明的sRNA建库方法的结果，误差棒代表平均值的偏差，经过T检验，P＜0.001。图4显示的是通过高通量测序在小脑组织中检测出的tRNA的数量。其中A代表传统sRNA建库方法的结果，B代表采用本发明的sRNA建库方法的结果，误差棒代表平均值的偏差，经过T检验，P＜0.001。图5显示的是通过高通量测序在小脑组织中检测出的tRNA结构片段的数量。其中A代表传统sRNA建库方法的结果，B代表采用本发明的sRNA建库方法的结果，1，2,3,4,5代表tRNA形成过程中产生的构成tRNA的结构片段。
本发明的一种用于sRNA测序的建库方法，首先对获取的样本进行预处理，进行RNA的提取制备；接着将预腺苷酸化的3’端接头和5’端接头进行预处理，并分别对所述3’端接头和所述5’端接头与制备得到的RNA进行连接和纯化；然后将纯化后的连接产物进行逆转录反应，同时将得到的对应的cDNA链进行纯化，并以所述cDNA链进行PCR富集反应，得到包含adapter的PCR产物；最后根据sRNA文库的需求对所述PCR产物进行大小分选，纯化，即得到sRNA高通量测序文库，降低错配率。。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (6)
1.一种用于sRNA测序的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
对获取的样本进行预处理，进行RNA的提取制备；
对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化；
对纯化后的连接产物进行逆转录反应，得到对应的cDNA链并纯化；
对纯化后的所述cDNA链进行PCR富集反应，并利用sRNA文库对得到的PCR产物进行分选，得到sRNA高通量测序文库。
2.如权利要求1所述的用于sRNA测序的建库方法，其特征在于，对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化，包括：
将预腺苷酸化的3’端接头和5’端接头重悬于解链缓冲溶液中，并将所述3’端接头在95℃下进行2分钟退火，然后以每分钟一个循环降1℃，直至70个循环完成，同时将所述5’端接头在80℃下进行2分钟退火，并以每秒降0.1℃的温降，直到所述5’端接头的温度为4℃。
3.如权利要求2所述的用于sRNA测序的建库方法，其特征在于，对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化，还包括：
利用无酶水将制备得到的所述RNA进行稀释，并加热至70℃，反应5分钟后置于冰上，然后加入多种反应液和预处理后的所述3’端接头，在25℃下的恒温仪中反应1小时。
4.如权利要求3所述的用于sRNA测序的建库方法，其特征在于，对3’端接头和5’端接头进行预处理，并依次连接和纯化，还包括：
向所述恒温仪中加入2.5个单位的λ核酸外切酶和25个单位5’-外切核酸酶，依次在多个温度和反应时间下反应后，再加入5个单位的尿嘧啶-DNA-糖基酶和20个单位的核酸外切酶IV在37℃下，反应1小时。
5.如权利要求1所述的用于sRNA测序的建库方法，其特征在于，对纯化后的连接产物进行逆转录反应，得到对应的cDNA链并纯化，包括：
向纯化后的连接产物中加入浓度为50mM，PH7.5的Tris-HCl缓冲液、浓度为75mM的氯化钾溶液、浓度为10mM的二流苏糖醇、浓度为10mM的三磷酸脱氧核苷、20个单位的抑制剂和200个单位的反转录酶，在42℃下的恒温仪中反应1小时，得到cDNA链。
6.如权利要求5所述的用于sRNA测序的建库方法，其特征在于，对纯化后的连接产物进行逆转录反应，得到对应的cDNA链并纯化，还包括：
利用70μl的DNA纯化磁珠及70μl的无水乙醇对所述cDNA链进行纯化，然后用10μl的无酶水进行洗脱。
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