CN105297144A

CN105297144A - 一种原核生物小rna的高通量文库构建方法

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Publication number: CN105297144A
Application number: CN201510708713.8A
Authority: CN
Inventors: 郑洪坤; 关宁; 方涛
Original assignee: BEIJING BIOMARKER TECHNOLOGIES Co Ltd
Current assignee: BEIJING BIOMARKER TECHNOLOGIES Co Ltd
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明提供了一种针对原核生物小RNA的高通量文库构建方法。该构建方法包括以下步骤：(1)消化总RNA中的DNA；(2)去除rRNA；(3)使用随机引物，合成cDNA第一条链；(4)合成cDNA第二条链；(5)电泳切胶筛选原核生物小RNA；(6)末端修复，加A，加接头后纯化，纯化产物PCR扩增，上机文库纯化，构建上机文库。本发明方法将原核生物小RNA的分离调整至合二链转化为cDNA以后，可以避免在RNA水平上的分离造成的RNA降解，大幅度地降低测序数据中rRNA的比例，获得完整的原核生物小RNA序列。

Description

一种原核生物小RNA的高通量文库构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及高通量测序文库构建领域，更具体地说，本发明涉及一种原核生物小RNA的高通量测序文库构建方法。

背景技术

小RNA是生物体内一类具有重要调控功能的非编码短小RNA的总称，主要包括miRNA、piRNA和siRNA。大量研究已经证实，小RNA几乎参与调控了生物所有的生命过程，包括细胞增殖，分化，凋亡等。小RNA测序正是对这一类重要的调控小RNA展开分析，利用高通量测序技术对样本中的小RNA序列进行鉴定和分析。

在真核生物中，小RNA以茎环结构存在于较长的RNA转录物中，后经胞浆中的Dicer核酸酶剪切成22nt左右的RNA分子，真核小RNA测序就是测定长度在18～30nt的小分子RNA序列。目前，真核小RNA测序已有多款成熟的试剂盒，如MμltiplexSmallRNALibraryPrepSet。原核小RNA与真核小RNA有很大不同，其转录物一般不经过加工,长度约为50nt-500nt。目前，针对原核小RNA测序，并没有成熟的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对原核生物小RNA进行高通量测序文库构建的方法，以实现对原核小RNA进行高质量测序文库的构建。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种针对原核生物小RNA的高通量测序文库构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)去除总RNA中的基因组DNA；

(2)去除总RNA中的rRNA序列；

(3)使用随机引物，以RNA为模板，合成cDNA的第一条链；

(4)以cDNA的第一条链为模板，合成cDNA的第二条链；

(5)电泳分离原核生物小RNA逆转录的cDNA；

(6)对分离的cDNA进行末端修复，加A，加接头后纯化，纯化产物进行PCR扩增，上机文库纯化，构建上机文库。

在本发明的实施例中，步骤(1)去除总RNA中的基因组DNA的方法是利用DNaseI消化RNA样品中的DNA。DNaseI在37℃下孵育，以消化DNA，实现RNA样本中DNA的去除。

去除总RNA中的基因组DNA的28μl反应体系为：总RNA1μg，DNaseIReactionBuffer2.8μl，DNaseI0.2U，加无RNA酶水至28μl；方法为混匀前述体系，瞬时离心后置于37℃孵育10-20min。

本发明构建方法的步骤(2)中，使用与rRNA序列相匹配的探针与rRNA结合，以实现rRNA的去除，包括以下步骤：1)可吸附探针磁珠的制备，使磁珠吸附探针的性能激活；2)探针与rRNA的结合，在70℃下，RNA的二级结构会打开，当温度降低到25℃时，探针与rRNA根据碱基互补配对原则退火结合到一起；3)将可吸附探针的磁珠与退火产物混合在一起，磁珠在吸附探针时，会将与探针结合在一起的rRNA一同吸附，在磁力架上实现rRNA的去除。

上述与rRNA序列相匹配的探针，本领域技术人员可以根据物种rRNA序列设计探针。在本发明的实施例中，使用的是Ribo-Zero或MICROExpress试剂盒中的探针。

步骤(2)所述的rRNA包括5S、5.8S、16S、18S、23S、26S、28S的rRNA。

步骤(3)中，RNA不经打断，直接使用随机引物进行cDNA第一条链的合成。

本发明构建方法的步骤(4)中，加入A、T、C、G四碱基合成cDNA第二条链，可实现非链特异性测序；加入A、U、C、G四碱基合成cDNA第二条链，可实现链特异性测序。

所述步骤(5)中，使用低分子量琼脂糖凝胶电泳分离小RNA，分离的小RNA大小包括50-100bp、100-150bp、150-200bp、200-250bp、250-300bp、300-350bp、350-400bp、400-450bp、450-500bp及其任意组合。

本发明构建方法中，在步骤(1)的DNaseI处理后，需要进行酶失活与纯化操作，本发明将酶失活纯化与步骤(2)结合到一起，在70℃孵育时同时实现了酶失活与RNA二级结构的打开，降低了RNA在高温下降解的可能性。步骤(3)使用随机引物作为逆转录时的引物，使所有类型的RNA都可以进行逆转录。在步骤(5)中，低分子量琼脂糖用来实现高分辨率的DNA分子的分离，通过加入已知片段大小的DNA标记，实现对样本DNA大小的度量。在步骤(6)中，通过末端修复酶的聚合特性，补平3’端与5’端，使RNA分子保持完整，通过在PCR扩增时的引物上额外的加入5-8个标识碱基，使不同样本在测序时能够区分开来，通过磁珠纯化，可以降低成本，节约时间。

本发明的关键点和欲保护点：(1)是原核小RNA的分离是在逆转录为cDNA之后进行，将小RNA的分离放置在合成cDNA第二条链合成以后，可以极大的降低在RNA水平上分离引入的RNA降解；(2)是RNA或DNA均不进行打断。文库构建过程中不经过打断，可以避免16S、18S、23S、26S、28S等大片段的rRNA的影响，使测序数据中的rRNA比例降低到10％以下(常规比例在30％～60％)；(3)通过将DNaseI消化与rRNA去除结合到一起，减少了纯化操作，降低了RNA降解的概率；通过低分子量琼脂糖电泳分离原核生物小RNA片段。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：可以针对原核生物小RNA进行文库构建；可以在DNA水平上分离原核生物小RNA，避免在RNA水平上分离造成的降解；样本无需打断，可获得全长原核小RNA文库；不依赖于样本RNA是否有DNA污染；可以避免样本中16S、18S、23S、26S、28S等大片段的rRNA的影响，测序数据中rRNA比例在10％以下；可选择性的构建链特异性或非连特异性文库。

附图说明

图1为本发明实施例1中样品1-样品3在低分子量琼脂糖上的电泳分离示意图。

图2为本发明实施例1中样品1测序数据的插入片段分布示意图。

具体实施方式

下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的实施方式及增益效果。

下列实施例中，如无特殊说明，所有的试剂均来自NEB。下列实施例1与实施例2分别是对十五份厌氧细菌样品(样品1-样品15)与三份耻垢分枝杆菌小RNA进行连特异性文库与非链特异性文库构建的方法。

实施例1十五份厌氧细菌原核小RNA链特异性文库构建

一、总RNA中DNA的去除

1.采用下列28μl反应体系进行DNA的去除反应：

2.混匀，瞬时离心后置于37℃孵育15min。

二、去除DNA后的RNA样品中rRNA的去除

采用Illumina的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，步骤如下：

1.RiboZero^TM磁珠的准备

A.涡旋混匀已室温平衡30min的磁珠，取225μl至低吸附无RNA酶的1.5ml离心管，置于磁力架2min至上清液澄清，移弃上清液。

B.从磁力架上取下离心管，加入225μL已室温平衡的无RNA酶水，在管底吹吸十次混匀，置于磁力架上2min，移弃上清液。

C.重复该步骤(2)一次，第二次清洗后用10μl枪头将上清液去除干净。

D.从磁力架上取下离心管，加入65μL磁珠重悬液，在管底吹吸十次混匀。

E.加入1μlRiboGuardRNase抑制剂，涡旋混匀。

2.探针与rRNA结合形成探针复合物

A.反应体系如下：

B.吹吸混匀，瞬时离心后70℃孵育10min，使RNA变性。

3.探针复合物的捕获与去除

A.将探针复合物迅速转移准备好的磁珠中，并立即涡旋混匀，室温孵育5min。

B.孵育结束后，置于50℃5min，磁力架上2min至上清液澄清。

C.转移上清到新的无RNA酶的1.5ml离心管，加入无RNA酶的水补至180μl

4.去除rRNA样品的纯化

A.反应体系如下：

B.涡旋混匀，-80℃放置30min以上或者过夜。

C.低温离心机4℃，14000rpm，离心20min。

D.移去上清液，加入500μl预冷的70％乙醇，4℃，14000rpm，离心5min。

E.移去上清液，加入8.5μl无RNA酶的水溶解RNA。

三、合成cDNA第一条链

1.反应体系如下：

2.混匀后，瞬时离心，在PCR仪上进行如下反应：25℃10min，42℃50min，70℃15min。

四、合成cDNA第二条链

1.反应体系如下：

2.混匀后，瞬时离心，16℃孵育1h。

3.使用AMPureXP磁珠纯化反应产物，具体步骤如下：

A.将反应产物转入1.5ml低吸附离心管中，加入144μl已混匀的磁珠，吹吸10次混匀，旋转混匀仪上5min。

B.置于磁力架上静置5min，移弃上清液。

C.离心管置于磁力架上，用200μl新鲜配制的80％乙醇吹吸6次清洗磁珠，磁力架上静置30s，移弃上清液。

D.重复清洗一次，第二次清洗后用10μl枪头将上清液去除干净，打开管盖，空气干燥10min。

E.取下离心管，加入55μl无RNA酶水，吹吸六次混匀，室温静置5min，而后磁力架上静置5min，吸取50μl上清液至新的离心管中。

五、分离原核生物小RNA逆转录的cDNA

1.使用2％低分子量琼脂糖凝胶电泳分离逆转录的cDNA，电泳条件为110V，120min。

2.依据50bp大小的Marker作为参考，切胶筛选50-250bp大小的cDNA(图1)。

3.使用QIAGEN纯化柱回收cDNA，最后加入55.5μl的无RNA酶水溶解DNA。

六、末端修复与加A，加接头，构建上机文库

1.按如下体系配制末端修复与加A反应：

2.混匀后，瞬时离心，20℃孵育30min，65℃孵育30min。

3.按如下体系配制加接头反应：

4.混匀后，瞬时离心，20℃孵育15min。

5.使用AMPureXP磁珠纯化反应产物，具体步骤如下：

A.将反应产物转到1.5ml低吸附离心管中，加入100μl已混匀的磁珠，吹吸10次混匀，旋转混匀仪上5min。

B.置于磁力架上静置5min，移弃上清液。

E.取下离心管，加入22μl无RNA酶水，吹吸六次混匀，室温静置5min，而后磁力架上静置5min，吸取20μl上清液至新的0.2ml离心管中。

6.按如下体系配制SolexaPCR反应：纯化产物20μl

×表示Index引物中的标识碱基，本次实施例标识碱基如下：

样品1：ATCACG

样品2：CGATGT

样品3：TTAGGC

样品4：GGACTC

样品5：TAGGCA

样品6：GTAGAG

样品7：ACAAAC

样品8：AGGAGT

样品9：GGTAGC

样品10：CAACTA

样品11：CTATAC

样品12：TAATCG

样品13：TACAGC

样品14：TCCCGA

样品15：TGACCA

7.混匀后，瞬时离心，在PCR仪上进行如下反应：94℃30s；94℃15s，62℃30s，70℃15s，13个循环；70℃5min。

8.上机文库纯化，具体步骤如下：

A.使用2％低分子量琼脂糖凝胶电泳分离逆转录的cDNA，电泳条件为110V，120min。

B.依据50bp大小的Marker作为参考，切胶筛选200-400bp大小的cDNA。

C.使用QIAGEN纯化柱回收cDNA，最后加入25μl的无RNA酶水溶解DNA。

将上机文库在Illumina平台上进行双端测序，测序数据的rRNA比例均在10％以下，测序数据Q30均在85％以上。测序数据比对到基因组上的插入片段长度分布见图2。从图2中可以看出，片段主要分布在50-250bp内，符合预期的设想与理论上原核小RNA的长度分布一致。

实施例2三份耻垢分枝杆菌小RNA高通量测序文库构建

一、总RNA中DNA的去除

1.采用下列28μl反应体系进行DNA的去除反应：

2.对上述28μl反应体系进行吹吸混匀，瞬时离心后置于37℃孵育15min。

二、去除DNA后的RNA样品中rRNA的去除

采用Illumina的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，步骤如下：

1.RiboZero^TM磁珠的准备

E.加入1μlRiboGuardRNase抑制剂，涡旋混匀。

2.探针与rRNA结合形成探针复合物

A.反应体系如下：

B.吹吸混匀，瞬时离心后70℃孵育10min，使RNA变性。

3.探针复合物的捕获与去除

B.孵育结束后，置于50℃5min，磁力架上2min至上清液澄清。

4.去除rRNA样品的纯化

A.反应体系如下：

B.涡旋混匀，-80℃放置30min以上或者过夜。

C.低温离心机4℃，14000rpm，离心20min。

E.移去上清液，加入13.5μl无RNA酶的水溶解RNA。

三、合成cDNA第一条链

1.反应体系如下：

四、合成cDNA第二条链

1.反应体系如下：

2.混匀后，瞬时离心，16℃孵育1h。

3.使用AMPureXP磁珠纯化反应产物，具体步骤如下：

B.置于磁力架上静置5min，移弃上清液。

五、分离原核生物小RNA逆转录的cDNA

2.依据50bp大小的Marker作为参考，切胶筛选50-100bp大小的cDNA。

六、末端修复与加A，加接头，构建上机文库

1.按如下体系配制末端修复与加A反应：

2.混匀后，瞬时离心，20℃孵育30min，65℃孵育30min。

3.按如下体系配制加接头反应：

4.混匀后，瞬时离心，20℃孵育15min。

5.加入3μl的USER酶，37℃孵育15min。

6.使用AMPureXP磁珠纯化反应产物，具体步骤如下：

B.置于磁力架上静置5min，移弃上清液。

E.取下离心管加入22μl无RNA酶水，吹吸6次混匀，室温静置5min，而后磁力架上静置5min，吸取23μl上清液至新的0.2ml离心管中。

7.按如下体系配制SolexaPCR反应：

×表示Index引物中的标识碱基，本次实施例标识碱基如下：

样品1：GGACTC

样品2：TAGGCA

样品3：GTAGAG

8.混匀后，瞬时离心，在PCR仪上进行如下反应：94℃30s；94℃15s，62℃30s，70℃15s，14个循环；70℃5min。

9.上机文库纯化，具体步骤如下：

B.依据50bp大小的Marker作为参考，切胶筛选200-250bp大小的cDNA。

10.将文库在Illumina平台上进行测序，数据产出见表1。从表中可以看出，rRNA比例在7.02％以下，远低于常规小RNA项目30％～60％的rRNA比例。数据Q30均在85％以上，说明测序质量达到预期水平。

表1三份耻垢分枝杆菌小RNA测序数据产出表

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种原核生物小RNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)去除总RNA中的基因组DNA；

(2)去除总RNA中的rRNA序列；

(3)使用随机引物，以RNA为模板，合成cDNA的第一条链；

(4)以cDNA的第一条链为模板，合成cDNA的第二条链；

(5)电泳分离原核生物小RNA逆转录的cDNA；

(6)对分离的cDNA进行末端修复，加A，加接头后纯化，纯化产物PCR，上机文库纯化，构建上机文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)去除总RNA中的基因组DNA的方法是利用DNaseI消化RNA样品中的DNA。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，去除总RNA中的基因组DNA的28μl反应体系为：总RNA1μg，DNaseIReactionBuffer2.8μl，DNaseI0.2U，加无RNA酶水至28μl；方法为混匀前述体系，瞬时离心后置于37℃孵育10-20min。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，使用与rRNA序列相匹配的探针与rRNA结合，以实现rRNA的去除，包括以下步骤：1)可吸附探针磁珠的制备，使磁珠吸附探针的性能激活；2)探针与rRNA的结合，在70℃下，RNA的二级结构会打开，当温度降低到25℃时，探针与rRNA根据碱基互补配对原则退火结合到一起；3)将可吸附探针的磁珠与退火产物混合在一起，磁珠在吸附探针时，会将与探针结合在一起的rRNA一同吸附，在磁力架上实现rRNA的去除。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的rRNA包括5S、5.8S、16S、18S、23S、26S、28S的rRNA。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，RNA不经打断，直接使用随机引物进行cDNA第一条链的合成。

7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中，加入A、T、C、G四碱基合成cDNA第二条链，可实现非链特异性测序；加入A、U、C、G四碱基合成cDNA第二条链，可实现链特异性测序。

8.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中，使用低分子量琼脂糖凝胶电泳分离小RNA，分离的小RNA大小包括50-100bp、100-150bp、150-200bp、200-250bp、250-300bp、300-350bp、350-400bp、400-450bp、450-500bp及其任意组合。

9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，原核小RNA的分离是在逆转录为cDNA之后进行。

10.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于RNA或DNA均不进行打断。