CN109735900A - 一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因测序领域，更具体地，涉及一种适用于Hi‑C的小片段DN A文库构建方法及其应用，所述方法包括以下步骤：首先超声打断目标DNA片段至主带集中在400bp，凝胶回收其中300‑500bp的DNA片段，对回收片段进行末端修复与加A获得末端修复后DNA，对所述末端修复后的DNA进行In dex连接获得连接物料，再对所述连接物料进行纯化获得DNA纯化物料，最后将DNA纯化物料进行PCR扩增获得DNA测序文库。该方法对现有DNA小片段文库构建实验技术进行了多项优化，使得文库构建成功率大大提升，成本显著降低，本发明的技术适用于绝大数物种；该方法操作流程简单，可以复制到其他具备分子生物学基础的其它实验室。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域，更具体地，涉及一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法。
背景技术
高通量测序技术又称为下一代测序技术、以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和读长较短等为标志。第二代高通量illumina测序平台具有测序通量高、准确度高和成本低等优点，并广泛应用于多个领域。
染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术，可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息，此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获，并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来，在第二代测序技术的迅速发展下，由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象，研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中，以整个细胞系为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。将通过第二代测序得到的DNA序列对映射到参考基因组后，如果一对序列对应于不同的n段酶切片段，那么就认为这两个片段之间有n次相互作用，从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间接合频率的矩阵。利用这个频率矩阵，将基因组组装过程中形成的contig、scaffold进行染色体定位、方向没定位，延长拼接结果，辅助基因组组装，尤其对于获得群体困难无法构建遗传图谱的物种意义重大。
基于高通量进行染色体构象捕获的Hi-C技术，是染色体相互作用研究领域的一个巨大的飞跃。但是距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远，Hi-C交互数据包含相当高的随机噪声。同时，实验发现，现有Hi-C高通量测序文库的构建也存在着信息丢失、捕获方法存在一定偏好性造成的获得的有效数据率不高的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，该方法曾加生物素捕获步骤，可用于Hi-C的小片段文库构建；同时该方法可显著减少非特异性扩增，明显改善DNA纯度，对杂质较多的材料明显可提升其建库成功率。
本发明的第一个目的在于提出一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，所述方法包括以下步骤：首先超声打断目标DNA片段至主带集中在400bp，凝胶回收其中300-500bp的DNA片段，对回收片段进行末端修复与加A获得末端修复后DNA，对所述末端修复后的DNA进行Index连接获得连接物料，再对所述连接物料进行纯化获得DNA纯化物料，最后将DNA纯化物料进行PCR扩增获得DNA测序文库。
进一步地，所述超声打断目标DNA片段的操作为：
(1)取2μg DNA样本纯化，溶于50μL去离子水中，使用Qubit定量；
(2)取1μg纯化后的DNA，使用去离子水补足体系至50μL；
(3)将50μL纯化后DNA加入0.2mL PCR管中，并固定在浮漂上，超声波清洗仪水位加至最高并固定浮漂，打断功率为80W，时间为5min。
进一步地，所述末端修复与加A反应体系包括以下用量的各组分：片段DNA50μL、NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3μL、NEB Next Ultra II End Prep ReactionBuffer 3.0μL；反应体系20℃孵育30min，65℃灭活30min，4℃保温。
进一步地，所述Index连接反应体系包括以下用量的各组分：末端修复后的DNA 60μL、NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30μL、NEBNext Ligation Enhancer 1μL、EBNext Adaptor for Illumina 2.5μL；反应体系混匀，20℃孵育15min后，加入3μL USER酶，37℃孵育15min。
进一步地，所述PCR扩增体系包括以下用量的各组分：DNA纯化物料20μL、NEBNextUltra II Q5 Master Mix 25μL、Index Primer/i7 Primer 2.5μL、Universal PCRPrimer/i5 Primer 2.5μL；所述PCR程序为：98℃，30s；(98℃，10s；65℃，75s)6-12cycle；65℃，5min；降至4℃保存。
进一步地，所述方法还包括在PCR扩增后凝胶回收400-600bp文库片段来上机测序获得DNA测序文库。
本发明的第二个目的是提出一种小片段DNA文库，该文库由上述任一项所述的方法构建。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提出的一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，对现有DNA小片段文库构建实验技术进行了多项优化，使得文库构建成功率大大提升，成本显著降低，本发明的技术适用于绝大数物种；该方法操作流程简单，可以复制到其他具备分子生物学基础的其它实验室。
(2)本发明在现有DNA小片段文库构建的基础上，曾加生物素捕获步骤，使该方法可用于Hi-C小片段文库构建。
(3)本发明的方法利用超声波破碎的方式将基因组大片段打断至400bp左右，覆盖全基因组范围信息；在DNA片段化后增加凝胶回收步骤，不仅进行了片段筛选，而且纯化了DNA，对杂质较多的材料可显著提升其建库存成功率，对于物种的适应性大大增加。
(4)本发明的方法在末端修复之前进行凝胶回收，缩小目标片段范围至300-500bp，可显著减少非特异性扩增，有效提高有效数据率。
附图说明
图1为实施例1中末端修复之前进行片段筛选和不进行片段筛选两种情况，后续进行PCR扩增的结果示意图。
图2为本实施例1构建的钉螺Hi-C的小片段DNA文库的Agilent 2100大小检测图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
本实施例提供钉螺Hi-C的小片段DNA文库构建方法，所述方法包括以下步骤。
1.超声打断目标DNA片段
1)取2μg左右DNA样本进行纯化，溶于50μL去离子水中，使用Qubit定量；
2)取1μg纯化后的DNA，使用去离子水补足体系至50μL；
3)将50μL纯化后DNA加入0.2mL PCR管中，并固定在浮漂上，超声波清洗仪水位加至最高并固定浮漂，打断功率选择最大，时间选择1-10min梯度摸索合适的打断条件；
4)打断后取2.5μL样品电泳检测打断效果，打断至主带集中在400bp的时间，即最佳打断时间；
5)打断条件摸索一次后即可适用于大多数纯化DNA样本，无需多次摸索适合条件；最终确定的打断功率为80W，时间为5min。
2.目的片段回收
1)使用1.5×琼脂糖凝胶电泳与QIAquick Gel Extraction Kit回收300-500bp大小的片段；
2)在紫外灯下小心地把大小约300-500bp的DNA的片段切下来，并尽量去除多余的凝胶；
3)空离心管重称，切下的凝胶装在15mL离心管中并称重，算出凝胶重，1:1确定其体积，并加入3倍体积的Buffer QG，常温摇晃10min；
4)待凝胶块彻底溶解后，观察混合溶液的颜色是不是黄色，若颜色为黄色，则继续下步操作，若为橙色，则加入100μL醋酸钠，使溶液恢复黄色再继续下步操作；
5)向溶液中加入一个胶体积的异丙醇并充分混匀；
6)将离心柱(QIAquick spin column)装在一个干净的2mL收集管中；
7)把5)中的溶液加入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃掉废液，并把QIAquick离心柱重新套回2mL收集管中，若溶液体积大于700μL，则分数次加入，直至全部液体过柱；
8)在离心柱中加入0.5mL Buffer QG 12,000rpm离心1min，弃滤液；
9)在离心柱中加0.75mL Buffer PE 12,000rpm离心1min，弃滤液，在离心柱中再次加0.75mL Buffer PE 12,000rpm离心1min，弃滤液；
10)再次12,000rpm离心1min；
11)取出离心柱，把离心柱装在一个干净的1.5mL离心管上；
12)在吸附柱的中间部位加25μL Buffer EB(10mM Tris-HCl,pH,8.0)，温室放置3min，再次12,000rpm离心1min，取上清液，用于后续文库构建或-20℃保存备用。
3.目的片段的末端修复与接头连接
1)DNA末端修复与加A
参照如下体系依次加入试剂
反应体系20℃孵育30min，65℃灭活30min，4℃保温。
2)接头连接
参照如下体系依次加入试剂：
混匀，20℃孵育15min后，加入3μL USER酶，37℃孵育15min。
4.Ampure XP beads纯化
1)加DNA溶液的1.5倍体积磁珠溶液到DNA连接产物中；振荡数秒混匀，室温孵育5min；
2)瞬时离心，将离心管放在磁力架上静置2min，移去上清；
3)离心管保持在磁力架上，加入1mL的75％乙醇清洗磁珠，弃乙醇，重复此步骤一次；
4)打开管盖，室温风干30s；加入52μL去离子水，振荡将磁珠重新混悬，室温孵育5min；
5)瞬时离心，将离心管放到磁力架上静置1min，吸取50μL上清转移至新离心管中，若感觉吸到磁珠，可再用磁力架吸附一次，保证磁珠完全去除，文库可进行下步操作或保存于-20℃冰箱。
5.目标片段富集
1)配置Streptaridin Beads结合液及洗涤液
2)涡旋磁珠，取10μL加入1.5mL LoBind离心管中；使用100μL 1×TWB(TweenWashing Buffer)清洗，室温震荡3min；磁力架吸附磁珠，弃上清；
3)再次使用100μL 1×TWB清洗磁珠，室温震荡3min；磁力架吸附磁珠，弃上清；
4)50μL 2×BB(Binding Buffer)和50μL Hi-C DNA重悬磁珠；室温震荡15min；磁力架吸附磁珠2-3min，弃上清；
5)使用100μL 1×TWB清洗磁珠并转移至一新LoBind离心管中；磁力架吸附磁珠，弃上清；
6)重复2次1×TWB清洗磁珠；
7)加入25μL水，70℃温浴5min洗脱DNA，磁力架吸附，回收上清；
8)加入20μL水，70℃温浴5min洗脱DNA，磁力架吸附，回收上清；
9)总体积45μL，4μL用于跑圈，20μL用于PCR扩增切胶，剩余21μL文库可于-20℃长期保存。
6.Illumina试剂盒扩增嵌合片段
1)将PCR仪设置如下参数，并预热PCR仪
2)参照如下体系依次加入试剂：
3)PCR扩增放大目的片段
7.片段筛选
1)1.5％agarose，100V约60min凝胶回收400-600bp片段，使用Qiagen凝胶回收试剂盒进行操作，溶于20-30μL EB，浓度≥3ng/μL；
图1为末端修复之前进行凝胶回收和不进行凝胶回收两种情况下的结果，后续进行PCR扩增的结果示意图。从图上可以看到，PCR在第6-8个循环即可产生足够的产物，且经凝胶回收片段筛选的文库，可显著减少非特异性扩增，文库大小集中在400-600bp(PCR扩增的文库会加上引物接头，接头长度约为120bp，所以PCR电泳图会比实际凝胶回收获得的片段大120bp左右)，而未经片段筛选的文库，非特异性扩增十分明显，片段范围增大至200-800bp。
2)回收产物使用Agilent 2100对文库大小分布进行检测，文库大小合适分布均匀，可以进行高通量测序。
图2为本实施例构建的钉螺Hi-C的小片段DNA文库的Agilent 2100大小检测图，结果表明主峰在483bp，且峰宽不超过400bp，是一个良好的文库大小分布峰图。
实施例2：
本实施例以钉螺Hi-C连接产物DNA为研究对象，对连接产物进行超声打断，凝胶回收300-500bp片段，最后进行文库构建，构建文库的中间步骤增加一步生物素捕获步骤，即可获得含有生物素标记的片段，再进行文库的PCR扩增，第二次凝胶回收400-600bp的片段，即可获得可上机测序的文库，在上机测序前进行Agilent 2100对文库大小分布进行检测，文库大小合适分布均匀，可以进行高通量测序。
测序完成后，对质控得到的clean data，使用ICE3软件对数据进行迭代比对，并进行噪音reads过滤。
表5钉螺DNA小片段文库数据分析结果说明
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先超声打断目标DNA片段至主带集中在400bp，凝胶回收其中300-500bp的DNA片段，对回收片段进行末端修复与加A获得末端修复后DNA，对所述末端修复后的DNA进行Index连接获得连接物料，再对所述连接物料进行纯化获得DNA纯化物料，最后将DNA纯化物料进行PCR扩增获得DNA测序文库。
2.根据权利要求1所述的一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，其特征在于，所述超声打断目标DNA片段的操作为：
(1)取2μg DNA样本纯化，溶于50μL去离子水中，使用Qubit定量；
(2)取1μg纯化后的DNA，使用去离子水补足体系至50μL；
(3)将50μL纯化后DNA加入0.2mL PCR管中，并固定在浮漂上，超声波清洗仪水位加至最高并固定浮漂，打断功率为80W，时间为5min。
3.根据权利要求1所述的一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，其特征在于，所述末端修复与加A反应体系包括以下用量的各组分：片段DNA 50μL、NEB Next Ultra IIEnd Prep Enzyme Mix 3μL、NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer 3.0μL；反应体系20℃孵育30min，65℃灭活30min，4℃保温。
4.根据权利要求1所述的一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，其特征在于，所述Index连接反应体系包括以下用量的各组分：末端修复后的DNA 60μL、NEBNext Ultra IILigation Master Mix 30μL、NEBNext Ligation Enhancer 1μL、EBNext Adaptor forIllumina 2.5μL；反应体系混匀，20℃孵育15min后，加入3μL USER酶，37℃孵育15min。
5.根据权利要求1所述的一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，其特征在于，所述PCR扩增体系包括以下用量的各组分：DNA纯化物料20μL、NEBNext Ultra II Q5 MasterMix 25μL、Index Primer/i7 Primer 2.5μL、Universal PCR Primer/i5 Primer 2.5μL；所述PCR程序为：98℃，30s；(98℃，10s；65℃，75s)6-12cycle；65℃，5min；降至4℃保存。
6.根据权利要求1所述的一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法，其特征在于，所述方法还包括在PCR扩增后凝胶回收400-600bp文库片段来上机测序获得DNA测序文库。
7.一种小片段DNA文库，其特征在于，由权利要求1-6中任一项所述的方法构建。
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