CN115197997A - 一种应用于植物花粉的CUT&Tag方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用于植物花粉的CUT&Tag方法。本发明所保护的植物花粉的CUT&Tag方法中的细胞核提取液中含有Percoll，用以去除花粉细胞中淀粉。所述方法在去除淀粉后还包括使用含有1,6‑己二醇与甘油的缓冲液去除花粉细胞中多糖和多酚的步骤。所述Percoll在所述细胞核提取液中的浓度可为60％。实验证明，本发明中所建立的植物花粉CUT&Tag方法，可以对花粉中富含的多糖、多酚、高淀粉等杂质做有效的清除，可以有效鉴定植物花粉中DNA与蛋白质之间的相互作用。本发明的方法也可推广至玉米的其它组织或其它植物中DNA与蛋白质之间的相互作用的研究。

Description

一种应用于植物花粉的CUT＆Tag方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中包含核酸的测定方法，具体涉及一种应用于植物花粉的CUT&Tag方法。

背景技术

CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法，相较于传统的ChIP-Seq具有以下优点：省时高效，所需的样品量少，背景信号低，可重复性好等优点，甚至可用于单细胞水平测序。CUT&Tag有望将蛋白质与DNA之间互相作用的研究变成了一种类似PCR反应的常规操作，对基因调控、表观遗传等领域的研究具有革命性的意义。

在生物学研究中，DNA与蛋白质之间的相互作用(DNA-Protein Interaction,DPI)是至关重要的，基因的表达、调控、复制、重组和修复，RNA的转运、翻译和调控，都离不开DPI，几乎所有的生命活动都会涉及DPI。

CUT&Tag技术的基本原理(参考文献：Kaya-Okur,H.S.et al.CUT&Tag forefficient epigenomic profiling of small samples and singlecells.Nat.Commun.10(2019))为：在某一特定抗体介导下，pA-Tn5融合蛋白仅在目的组蛋白修饰标志、转录因子或染色质调控蛋白结合染色质的局部进行目的DNA的片段化，同时添加测序接头，由于pA-Tn5转座体仅结合并切割其邻近空间内的DNA，因此整个实验的信噪比大幅提高，同时简化了实验步骤。该方法可一管式高通量应用，亦可应用于单细胞测序。

CUT&Tag方法包括如下步骤：

A1)提取细胞核，得到细胞核提取液；细胞核提取液中的目的蛋白结合有待检测的目的DNA；

A2)向A1)所得细胞核提取液中加入与目的蛋白特异性结合的抗体，以结合目的蛋白；在提取得到细胞核心的后续步骤中，向A1)所得细胞核提取液中添加蛋白酶抑制剂和/或细胞膜通透处理液；

A3)加入pA-Tn5转座体结合所述抗体；pA-Tn5转座体中的Tn5转座酶可特异性的切割目的蛋白附近的DNA片段，使目的DNA片段化；

A4)激活pA-Tn5转座体，使目的DNA片段化，得到含有片段化目的DNA的混合液；目的DNA片段化的过程中添加所述蛋白酶抑制剂和/或所述细胞膜通透处理液；

A5)提取所述片段化目的DNA，经测序得到目的DNA的核苷酸序列。

由于CUT&Tag技术具有不需要交联、起始细胞量少、信噪比高等优点，目前已有取代ChIP-seq技术的趋势，而其自身的应用也扩展到单细胞CUT&Tag及在同一组织中检测多种DPI的Multi-CUT&Tag等应用。然而，其仍然存在进一步完善的空间。对于植物组织花粉而言，由于其富含多糖、多酚、淀粉等杂质，导致不易提纯染色质从而鉴定DPI困难。截止目前，全世界尚无一例关于植物花粉的CUT&Tag应用报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何在植物花粉进行CUT&Tag和/或如何鉴定植物花粉组织中DNA与蛋白质之间的相互作用。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了植物花粉的CUT&Tag的方法。

所述方法包括用含有Percoll的提取液从植物花粉中提取细胞核，得到去除花粉细胞中淀粉的细胞核提取液，所述细胞核提取液含有结合有DNA的目的蛋白。

所述Percoll用以去除花粉细胞中的淀粉。

所述植物花粉的CUT&Tag的方法可为获取与目的蛋白结合的DNA的方法或为获取与目的蛋白相互作用的DNA的方法。

上述方法可包括用含有1,6-己二醇与甘油的提取液去除所述去除花粉细胞中淀粉的细胞核提取液中的多糖和多酚，得到去除花粉细胞中淀粉、多糖和多酚的细胞核提取液的步骤。

上述方法可包括如下步骤：

A1)沉淀目的蛋白：将靶标抗体与所述去除花粉细胞中淀粉、多糖和多酚的细胞核提取液混合，使所述靶标抗体与所述目的蛋白特异性结合；

A2)目的DNA片段化：加入pA-Tn5转座体，得到pA-Tn5转座体与所述靶标抗体及所述目的蛋白的耦合物；所述耦合物含有与所述目的蛋白结合的DNA；

A3)激活pA-Tn5转座体：激活所述pA-Tn5转座体将所述DNA片段化，得到含有片段化DNA的混合液。

上述方法中，所述Percoll在含有Percoll的提取液中的体积含量可为60％。所述含有1,6-己二醇与甘油的提取液中，1,6-己二醇的浓度为1M，甘油的体积浓度为20％。

所述含有Percoll的提取液的组成可为：60％(体积含量，v/v)Percoll，10mM TrispH 8.0，400mM蔗糖，10mM丁酸钠，0.1mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂，5mMβ-巯基乙醇，其余为水。所述含有1,6-己二醇与甘油的提取液的组成可为：10mM Tris pH8.0，400mM蔗糖，10mM丁酸钠，1M 1,6-己二醇，20％v/v甘油，0.1mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂，5mMβ-巯基乙醇，其余为水。

上述方法中，所述DNA片段化的过程中可不添加蛋白酶抑制剂和/或细胞膜通透处理液。

上述方法中，所述目的蛋白可为组蛋白或组蛋白变体。所述组蛋白可为H3K27ac；所述组蛋白变体可为着丝粒组蛋白CENH3。所述目的蛋白还可为转录因子等其他蛋白。所述靶标抗体可为H3K27ac抗体；也可为CENH3抗体rabbit anti-CENH3antibody。

上述方法中，所述pA-Tn5转座体可为Protein A与Tn5转座酶的融合蛋白复合体ProteinA-Tn5，也可为Protein G与Tn5转座酶的融合蛋白复合体ProteinG-Tn5。

上述方法中，所述细胞预处理中，所述花粉细胞的用量可为0.1-0.2g。

上文任一所述的方法在检测花粉细胞中与目的蛋白相互作用的DNA中的应用也属于本发明的保护范围。

Percoll、1,6-己二醇和甘油在植物花粉的CUT&Tag的方法中去除植物花粉中淀粉、多糖和多酚中的应用也属于本发明的保护范围。

上述方法中，所述植物可为玉米。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了组合物。所述组合物用于在植物花粉的CUT&Tag的方法中去除植物花粉的淀粉、多糖和多酚。所述组合物可由Percoll、1,6-己二醇和甘油组成。

上述组合物中，Percoll、1,6-己二醇和甘油这三种物质可单独包装，在植物花粉的CUT&Tag的方法的不同步骤中使用。

本发明的实施例中，在植物花粉的CUT&Tag方法的细胞核提取液中加入了60％的Percoll，可以有效去除花粉细胞中的淀粉，并在去除淀粉后使用了含有1,6-己二醇与甘油的缓冲液去除花粉细胞中多糖和多酚。结果显示，本发明中所建立的植物花粉CUT&Tag方法，可以对花粉中富含的多糖、多酚、高淀粉等杂质做有效的清除，可以有效鉴定植物花粉中DNA与蛋白质之间的相互作用，通过使用H3K27ac抗体对玉米花粉中与组蛋白H3K27ac相互作用的DNA进行鉴定。本发明的方法也可推广至玉米的其它组织或其它植物中DNA与蛋白质之间的相互作用的研究。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明首创了一种可用于花粉的CUT&Tag方法。

本发明在整个实验流程中，蛋白酶抑制剂和洋地黄皂苷分别仅需在提取细胞核的过程中添加一次，而非目前在植物中已发表不同版本CUT&Tag的多次添加，进一步节省了成本。

本发明在玉米花粉中建立了一种成熟稳定的CUT&Tag方法；本方法亦可扩展至玉米其它组织或其它植物中。

本方法对于交联或未交联的植物组织均适用。

附图说明

图1为玉米花粉中H3K27ac抗体介导的CUT&Tag方法的PCR电泳图。左侧泳道为DNA纯化片段的毛细管电泳结果，右侧泳道为DNA Marker。

图2为H3K27ac抗体介导的ChIP-seq与CUT&Tag方法鉴定得到的峰图比较。A-D为四个基因的峰图位置的比较。图的最上部是峰所在的基因或其侧翼基因在染色体上的起止位置，基因名称位于相应基因位置之上。每个图中上半部分是B73幼苗中H3K27ac抗体介导的ChIP-seq结果，下半部分是B73花粉中H3K27ac抗体介导的CUT&Tag结果。

图3为CENH3抗体介导的CUT&Tag方法在两个生物学重复中的峰图比较。A和B为两个基因的峰图位置的比较。图的最上部是峰所在的基因或其侧翼基因在染色体上的起止位置，基因名称位于相应基因位置之上。每个图中上半部分峰值图为B73花粉中CENH3抗体介导的CUT&Tag的第一个生物学重复的结果，下半部分峰值图是B73花粉中CENH3抗体介导的CUT&Tag的第二个生物学重复的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中试剂及耗材来源如下：

Tris pH 8.0：Thermo，货号AM9858；

蔗糖(Sucrose)：Sigma，货号V900116-500G；

丁酸钠(Na-butyrate)：Sigma，货号V900464-25g；

苯甲基磺酰氟(PMSF)：Sigma，货号P7626-5G；

1×蛋白酶抑制剂(Proteinase Inhibitors)：Roche，货号04693159001；

β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)：Sigma，货号M6250-250ML；

Percoll：Merck，货号P4937-500ML；

1,6-己二醇(1,6-Hexanediol solution)：Sigma，货号88571-100ML-F；

甘油(Glycerol)Sigma，货号G9012-100ML；

EDTA：Invitrogen，货号AM9260G；

Triton X-100：Sigma，货号T8787-100ML；

氯化钠(NaCl)：Sigma，货号S5150-1L；

牛血清白蛋白(BSA)：Sigma，货号V900933-100G；

洋地黄皂苷(Digitonin)：Invitrogen，货号BN2006；

H3K27ac抗体：Abcam，货号ab4729。

亚精胺(spermidine)：Sigma，货号S2501-1G；

Tween-40：Sigma，货号P1504-500ML；

氯化镁(Magnesium chloride hexahydrate)：Sigma，货号M2670-100G；

EDTA：Invitrogen，货号AM9260G；

SDS：Merck，货号75746-1KG；

蛋白酶K(Proteinase K)：Thermo，货号EO6491；

GlycoBlue：Ambion,货号AM9740；

醋酸钠(pH5.2)(Sodium acetate)：Sigma，货号S7899-100ML；

Hyperactive pA-Tn5 Transposase for CUT&Tag(以下实验步骤中简称pA-Tn5)：Vazyme，货号S603-02；

Phase Lock Gel Heavy：天根，货号WM5-2302830；

TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina：Vazyme，货号TD501-01。

实施例1、植物花粉的CUT&Tag方法(应用于组蛋白修饰抗体)

1.植物花粉的CUT&Tag方法

进行植物花粉的CUT&Tag，并分析与花粉中目的蛋白H3K27ac相互作用的DNA。

1.1花粉研磨

采集新鲜的玉米自交系昌7-2花粉，速冻于液氮。取1.0g用液氮研磨，研磨约30min，使研磨粉末务必均匀。

1.2花粉细胞预处理(提取细胞核)

使用含有Percoll的核酸提取液II(含有Percoll的提取液)和核酸提取液III(含有1,6-己二醇与甘油的提取液)提取花粉细胞核，可有效去除花粉细胞中富含的淀粉和多糖多酚。

(1)称取0.2g研磨好的玉米花粉，溶于20mL核酸提取液I(Nuclear ExtractionBuffer I)中，涡旋混匀得到混合物。

其中，核酸提取液I的组成为：10mM Tris pH 8.0，400mM蔗糖，10mM丁酸钠，0.1mMPMSF，1×蛋白酶抑制剂，5mMβ-巯基乙醇，其余为水。

(2)将混合物置于冰中，在水平摇床上转速100rpm，轻柔旋转15min，得到充分分散的花粉细胞核提取混合物。

(3)配制核酸提取液II(Nuclear Extraction Buffer II)(含有60％v/vPercoll)，涡旋混匀。

其中，核酸提取液II的组成为：60％(体积含量，v/v)Percoll，10mM Tris pH 8.0，400mM蔗糖，10mM丁酸钠，0.1mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂，5mMβ-巯基乙醇，其余为水。其中的60％Percoll用于去除花粉中富含的淀粉；PMSF、蛋白酶抑制剂与β-巯基乙醇联合使用，可抑制多种蛋白酶和其它酶类。

在50mL BD离心管中，加入2 0mL核酸提取液II，取步骤(2)中充分分散的花粉细胞核提取混合物，缓慢倾倒于核酸提取液II上。

(4)以2880g及最小加速度，于4℃离心20min。

(5)取另一50mL BD离心管，新鲜配制核酸提取液III(Nuclear ExtractionBuffer III)(含有1M 1,6-己二醇和20％甘油的提取液)，涡旋混匀，预冷。取约1mL核酸提取液III转移至另一无菌1.5mL离心管备用。

其中，核酸提取液III的组成为：10mM Tris pH 8.0，400mM蔗糖，10mM丁酸钠，1M1,6-己二醇，20％v/v甘油，0.1mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂，5mMβ-巯基乙醇，其余为水。其中的1,6-己二醇与甘油，可有效去除花粉细胞中的多糖多酚；PMSF、蛋白酶抑制剂与β-巯基乙醇联合使用，可抑制多种蛋白酶和其它酶类。

(6)待步骤(4)离心结束后，管中混合物溶液界面呈分层状。吸取中间层，转移至含有19mL核酸提取液III的BD离心管中，柔和上下混合。

(7)以2880g及最小加速度，于4℃离心10min。

(8)弃上清，加入步骤(5)中配制的1mL核酸提取液III溶液，轻柔吹打混匀。转移至1.5mL Eppendorf离心管中。

(9)以1000g及最小加速度，于4℃离心5min。

(10)弃上清，加入120μL预冷的稀释缓冲液(Dilution Buffer)，轻柔吹散细胞核，即得到花粉细胞核提取液。该细胞核提取液中含有目的蛋白H3K27ac，该目的蛋白结合有待检测的目的DNA。其中洋地黄皂苷用于细胞核膜的通透。

其中，稀释缓冲液的组成为：50mM Tris pH 8.0，1mM EDTA，0.1％v/v Triton X-100，150mM氯化钠，10μg/mL牛血清白蛋白和1.5μL 5％洋地黄皂苷，其余为水。

1.3加入抗体结合目的蛋白

(1)在步骤1.2所得细胞核提取液中加入1.0μg H3K27ac抗体，轻柔上下颠倒若干次混匀；置于IntelliMixer仪上，在4℃旋转2h(或过夜)。

(2)1000g低速离心5min，用200μL移液器小心去除上清。

(3)加入1mL预冷的洗涤缓冲液(Wash Buffer)，轻柔吹打，室温静置5min。

其中，洗涤缓冲液的组成为：10mM Tris pH 8.0，0.5mM亚精胺，0.05％v/v Tween-40，150mM氯化钠，其余为水。

(4)1000g低速离心5min，用200μl移液器小心去除上清。

(5)重复步骤(3)～(4)。

1.4pA-Tn5转座体与抗体及目的DNA的耦合

(1)加入150μL转座酶孵育缓冲液(Incubation Buffer)，轻柔吹打细胞核使之分散。

其中，转座酶孵育缓冲液的组成为：20mM Tris pH 8.0，300mM氯化钠，0.5mM亚精胺，其余为水。

(2)加入1.4μL pA-Tn5，轻柔上下颠倒若干次混匀。置于IntelliMixer仪上，在4℃旋转1小时。

(3)1000g低速离心5min，用200μL移液器小心去除上清。

(4)加入1mL预冷的洗涤缓冲液(Wash Buffer)，轻柔吹打，室温静置5min。

(5)1000g低速离心5min，用200μl移液器小心去除上清。

(6)重复步骤(4)～(5)。

1.5激活pA-Tn5转座体，使与目的蛋白结合的目的DNA片段化

(1)加入200μL含镁离子的片段化缓冲液(Tagmentation Buffer)，轻柔吹打细胞核使之分散。

其中，片段化缓冲液的组成为：20mM Tris pH 8.0，10mM氯化镁，300mM氯化钠，0.5mM亚精胺，其余为水。

(2)在37℃金属浴上反应1～2h。得到含有片段化目的DNA(与目的蛋白H3K27ac结合的DNA)的混合液。

1.6目的DNA提取和PCR扩增及产物纯化

(1)在步骤1.4得到的含有片段化目的DNA的混合液中加入6μL 0.5M EDTA、2μL10％SDS，上下颠倒混匀。

(2)加入200μL洗脱缓冲液(Elution Buffer)，再加入8μL 20mg/mL蛋白酶K，上下颠倒，涡旋混匀。

其中，洗脱缓冲液的组成为：10mM Tris pH 8.0，1mM EDTA，1％SDS，其余为水。

(3)置于55℃水浴，反应至少1h。

(4)加入400μL室温温度下的酚:氯仿:异丙醇混合液(体积百分比为：25:24:1)，剧烈涡旋至少10s，转移至2mL Phase Lock Gel Heavy离心管。

(5)13000rpm，室温离心5min。

(6)取上清，转移至一新的1.5mL Eppendorf离心管中，加入2μL 20mg/mLGlycoBlue、40μL醋酸钠(pH5.5)、400μL异丙醇，剧烈涡旋至少10s得到混合液，用液氮速冻至少30s。

(7)从液氮中取出混合液，待管中液体略融化，4℃，13000rpm离心30min。

(8)用预冷的80％乙醇清洗两次，空气中晾干。

(9)加入50μL ddH₂O，37℃使之充分溶解。

(10)取24μL作为模板，用TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina，进行18个循环的PCR。PCR条件如下：

(11)取5μl PCR产物，在1.5％琼脂糖胶上观测其产物大小区间。

(12)用XP磁珠回收300～700bp大小的目的DNA纯化片段，PCR产物富集于300～500bp之间(图1)。

1.7.目的DNA测序

在NovaSeq测序仪上，对步骤1.5得到的纯化的目的DNA片段以PE150测序10G，得到包含测序读长(reads)的测序数据。

2.花粉的CUT&Tag方法结果分析

2.1测序数据比对到参考基因组使用bowtie2(相关文献：Langmead,B.&Salzberg,S.L.Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.Nat.Methods 9,357-359(2012))将reads比对到玉米B73 v4参考基因组(相关文献：Jiao,Y.et al.Improved maizereference genome with single-molecule technologies.Nature 546,524-527(2017))上。

2.2寻峰

使用samtools(相关文献：Li,H.et al.The Sequence Alignment/Map formatand SAMtools.Bioinformatics 25,2078-2079(2009))和macs2(相关文献：Zhang,Y.etal.Model-based Analysis of ChIP-Seq(MACS).Genome Biology 9,R137(2008))进行寻峰(peak calling)，每个峰代表与H3K27ac结合的DNA的信息。最终得到与H3K27ac相互作用的DNA序列及其在基因组上的位置。

采用本发明所建立的方法，在玉米B73自交系花粉中，用H3K27ac抗体鉴定到30446个峰(peaks)。与已发表的用相同的玉米自交系、相同抗体的14天幼苗组织使用ChIP-seq方法得到的与H3K27ac结合的DNA的信息(相关文献：Li,E.et al.Long-range interactionsbetween proximal and distal regulatory regions in maize.Nat.Commun.10,2633(2019))结果相比较，两者共有26221个共有peaks。

图2为H3K27ac抗体介导的ChIP-seq与CUT&Tag方法鉴定得到的峰图比较，可以看出，除极少部分可能是由组织特异性造成的差异性峰以外，两者鉴定得到的峰图高度相似。同时，后者的峰值均高于前者。

实施例2、植物花粉的CUT&Tag方法的应用(应用于着丝粒组蛋白CENH3抗体)

本实施例中，采用实施例1中建立的植物花粉的CUT&Tag方法，使用着丝粒组蛋白CENH3抗体分析与着丝粒组蛋白CENH3结合的DNA。

实验材料、CUT&Tag方法与结果分析方法均同实施例1，目的蛋白为着丝粒组蛋白CENH3，目的蛋白抗体为rabbit anti-CENH3 antibody(中国农业大学金危危教授实验室惠赠，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明。相关文献：Han,Y.et al.Divergence incentromere structure distinguishes related genomes in Coix lacryma-jobi andits wild relative.Chromosoma 119,89-98(2010))。

分析结果显示，在玉米B73自交系花粉中，用CENH3抗体鉴定到16672个峰，最终得到与CENH3相互作用的DNA序列及其在基因组上的位置。图3中结果为CENH3抗体介导的CUT&Tag方法在两个生物学重复中鉴定到的峰图比较，可见两个重复之间的峰在染色体上的位置高度吻合。

综上，本发明中所建立的植物花粉CUT&Tag方法，对花粉中富含的多糖、多酚、高淀粉等杂质做了有效清除，可以有效鉴定植物花粉中DNA与蛋白质之间的相互作用，如可应用于各种与组蛋白或转录因子相互作用的DNA的鉴定；也可推广至玉米的其它组织或其它植物中DNA与蛋白质之间的相互作用的研究。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.植物花粉的CUT&Tag的方法，其特征在于：所述方法包括用含有Percoll的提取液从植物花粉中提取细胞核，得到去除花粉细胞中淀粉的细胞核提取液，所述细胞核提取液含有结合有DNA的目的蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括用含有1,6-己二醇与甘油的提取液去除所述去除花粉细胞中淀粉的细胞核提取液中的多糖和多酚，得到去除花粉细胞中淀粉、多糖和多酚的细胞核提取液的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

A1)沉淀目的蛋白：将靶标抗体与所述去除花粉细胞中淀粉、多糖和多酚的细胞核提取液混合，使所述靶标抗体与所述目的蛋白特异性结合；

A2)DNA片段化：加入pA-Tn5转座体，得到pA-Tn5转座体与所述靶标抗体及所述目的蛋白的耦合物；所述耦合物含有与所述目的蛋白结合的DNA；

A3)激活pA-Tn5转座体：激活所述pA-Tn5转座体将所述DNA片段化，得到含有片段化DNA的混合液。

4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述Percoll在含有Percoll的提取液中的体积含量为60％。

5.根据权利要求2-4中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述含有1,6-己二醇与甘油的提取液中，1,6-己二醇的浓度为1M，甘油的体积浓度为20％。

6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述DNA片段化的过程中不添加蛋白酶抑制剂和/或细胞膜通透处理液。

7.权利要求1-6中任一权利要求所述的方法在检测花粉细胞中与目的蛋白相互作用的DNA中的应用。

8.Percoll、1,6-己二醇和甘油在植物花粉的CUT&Tag的方法中去除植物花粉中淀粉、多糖和多酚中的应用。

9.组合物，其特征在于：所述组合物用于在植物花粉的CUT&Tag的方法中去除植物花粉的淀粉、多糖和多酚，所述组合物由Percoll、1,6-己二醇和甘油组成。

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