CN111826419A - 适用于微量细胞的rip实验的建库测序方法 - Google Patents

适用于微量细胞的rip实验的建库测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种适用于适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法。该方法具体为对RIP实验的结果进行测定并分类，然后根据不同的值进行不同的建库测序。该方法适用于微量细胞，解决了DNA与蛋白，蛋白与蛋白的项目结合导致后续难以去除DNA从而干扰分析数据的问题，而且不需要使用超声打断法将DNA进行片段化，即不会影响RNA与蛋白的结合效率。

Description

适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种适用于适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法。
背景技术
生物的基因调控和表达是极其复杂但有序的过程，RNA，尤其是非编码RNA，之前被认为是一种不具备生物学功能的物质，近年来被证实参与了多种生物学调控过程。其中，RNA与蛋白相互作用，可以结合在基因启动子区，进而调控下游基因的转录表达。
RNA免疫共沉淀技术(RNA Immunoprecipitation,RIP)是研究RNA-蛋白质在体内相互作用的标准方法。RNA免疫共沉淀技术可以定位分析体内蛋白质与RNA的作用位点，运用RIP技术与其他方法相结合，例如与高密度芯片(microarray)、测序(sequencing)、northern bolt等技术相结合可以获得整个系统内与某一特定蛋白产生项目作用的RNA序列，通过序列定位，可以进一步得出这些RNA的序列在基因组上分分布位置，作用方式，结合的靶序列等信息。
RIP技术的一般技术流程为：首先对细胞或组织进行不同时间的甲醛交联，分别裂解细胞膜及细胞核，使用超声方式将染色质打碎成一定长度范围的片段。加入抗体，抗体会特异性地与靶蛋白结合，而后通过磁珠与抗体的相互作用，将靶蛋白及与其结合的RNA以及DNA片段富集。解交联并消化蛋白后，再用DNA酶将DNA消化，最后将RNA提纯，对捕获的RNA片段逆转录建库，进行第二代测序。根据数据片段在基因组上的富集情况，进而获得全基因组水平的特定蛋白与RNA相互作用的图谱。
然而，现有的RIP-seq技术主要存在如下问题：建库效率低，不适用于少量细胞实验；交联后除了RNA与蛋白相互结合并固定以外，DNA与蛋白，蛋白与蛋白的项目结合也同样被固定，在后续实验中很难完全去除DNA的影响，导致分析数据时很难排除DNA的干扰；交联法需要将DNA进行片段化，片段化过程中一般适用超声波破碎打断，这种方法很容易影响RNA与蛋白的结合效率，从而倒是获得的RNA量大受影响。
超声打断法是对染色质进行随机打断，获得一定长度范围内的片段。因此，在靶蛋白及RNA复合物的周围也带有一些非靶蛋白特异结合的RNA序列或是其他蛋白结合的位点。这些非特异性位点在后面建库测序过程中均会被保存下来，成为靶蛋白图谱分析的干扰背景，获得宽峰，降低了检测结合位点的分辨率和准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法。
RIP实验为常规的RIP实验，具体包括以下步骤：(1)将细胞离心获得细胞沉淀A；(2)用预冷的PBS缓冲液冲洗并离心所述细胞沉淀A得细胞沉淀B；(3)用所述与细胞沉淀B等体积的核糖体裂解缓冲液重悬所述细胞沉淀B，并处理成单细胞悬液；(4)准备免疫沉淀用的免疫磁珠以及目标蛋白抗体；(5)免疫沉淀反应获得RNA-蛋白结合的复合物；(6)对所述RNA-蛋白进行处理得RNA。
具体地，步骤(3)后，所述单细胞悬液-5℃—5℃放置3-8min后，放置于-90℃—-70℃；所述PBS缓冲液的pH＝7.4；所述核糖体裂解缓冲液为：1000mM KCl,50mM MgCl2,100mMHEPES-NaOH pH 7,5％NP-40。10倍浓度储存液保存于室温，使用时用水稀释10倍，并添加1mM二硫苏糖醇l(DTT),200units/ml RNA酶抑制剂，以及不包含EDTA的蛋白酶抑制剂复合物；步骤(4)所述的免疫为A蛋白或G蛋白包被的免疫磁珠。
作为一种优选方案，所述步骤(1)具体为：a.将细胞培养在所需的合适的培养基中，并在需要的时间收取细胞，收取细胞时，贴壁生长细胞采用先细胞刮取再离心的形式，悬浮生长的细胞则直接采取离心的方式；b.离心后获得细胞，每一个免疫反应大约需要0-2mg的总蛋白，对应细胞数在5–20×105的哺乳动物细胞c.4°，1000×g离心5min，去掉上清；d.用预冷的PBS缓冲液洗细胞沉淀两次，每次用4°，1000×g离心5min，去掉上清；e.用细胞沉淀等体积的多核糖体裂解缓冲液重选细胞沉淀，用移液枪头上下反复吹打使细胞团块吹打成单细胞悬液；f.冰上孵育5分钟；g.放置于-80°，可以促进细胞裂解，裂解物可以在-80°保存数月，但不超过12个月。
进一步，所述步骤(4)作为一种优选方案为：a.A蛋白或G蛋白包被的免疫磁珠，适用之前充分颠倒混匀或用移液枪吹打混匀；b.吸取75μl A蛋白或G蛋白包被的免疫磁珠到一个新的1.5ml离心管中，并每次用0.5ml NT-2缓冲液洗，洗两次，在磁力架上吸取上清，去掉；c.用100μl NT-2缓冲液重悬磁珠，并加入5ug目标抗体以及阴性对照抗体，一般是同来源的额IgG；d.室温下孵育1小时，以促进抗体与包被磁珠的充分结合；e.在室温下5000×g离心15s，之后将离心管置于磁力架上，静置1-2分钟后吸弃上清；f.从磁力架上取下离心管，加入1ml NT-2缓冲液，然后室温下5000×g离心15s，之后将离心管置于磁力架上，静置1-2分钟后吸弃上清。重复该步骤一共6次；g.将磁珠重悬于900μl NET-2缓冲液，并置于冰上备用。
进一步，所述步骤(5)作为一种优选方案为：a.取出于步骤(3)获得的细胞裂解液，在4°下20,000x g离心10分钟，取100μl上清加入到A2最后一步的离心管中，使总体积变成1ml；b.取出其中10μl(10％)，加入到另一个新的离心管中，并标记为input，保存于-80°直到RNA纯化开始前；c.将所有混合后的离心管至于旋转混合仪上，4°情况下旋转孵育3h以上或至过夜；d.孵育结合过夜后，将离心管至于放在冰上的磁力架上，静置1-2分钟，移液器去除上清；e.从磁力架上取下离心管，每个离心管加入1ml已预冷的NT-2缓冲液，并放回旋转混合仪上4°旋转5分钟；f.将离心管至于放在冰上的磁力架上，静置1-2分钟，移液器去除上清；g.重复步骤5-6，一共5次。
所述建库测序方法为，对RIP实验的结果进行测定并分类判定：
若RNA浓度总量为＞50ng，RNA值为大于7.5，则判定为A；
若RNA浓度总量为20-50ng，RNA值为6.5-7.5，则判定为B；
若RNA浓度总量为10-20ng，RNA值为5.0-6.5，则判定为C；
若RNA浓度总量为＜10ng，RNA值为小于5，则判定为D；
当判定为A时，用illumina方法建库测序；
当判定为B时，用illumina常规方法建库测序；
当判定为C时，用illumina先扩增再建库测序；
当判定为D时，不能建库测序。
进一步，当前RIP建库测序的通用要求是总量>20ng，RNA RIN值大于6.5。
进一步，所述微量细胞的细胞数为1-10×104。
进一步，所述微量细胞为一个免疫反应需要0-2mg的总蛋白且对应细胞数在1–10×104的哺乳动物细胞；所述哺乳动物细胞包括培养的细胞系和分离的原代细胞。
进一步，所述培养的细胞系如293细胞，3T3细胞等；所述分离的原代细胞如间充质干细胞，成体干细胞，免疫细胞等。
进一步，所述RIP实验中RNA-蛋白包括RNA结合蛋白，RNA调控蛋白，转录因子等。
进一步，所述RIP实验中蛋白抗体包括：RNA结合蛋白抗体，RNA调控蛋白抗体，转录因子抗体等。
进一步，所述RIP实验中裂解细胞的方式为非交联方式裂解细胞。
进一步，所述非交联方式裂解细胞具体为：(1)将细胞离心获得细胞沉淀A；(2)用预冷的PBS缓冲液冲洗并离心所述细胞沉淀A得细胞沉淀B；(3)用所述与细胞沉淀B等体积的核糖体裂解缓冲液重悬所述细胞沉淀B，并处理成单细胞悬液。
本发明目的之二在于提供一种适用于微量细胞的RIP实验的计算机建库测序系统。
所述计算机建库测序系统包括：
RIP实验值接收判定模块，接收RIP实验值后与所述计算机建库测序系统的数据库进行匹配然后判定；
若接收实验值为：RNA浓度总量为＞50ng，RNA值为大于7.5；则判定为A，输出结果；
若接收实验值为：RNA浓度总量为20-50ng，RNA值为6.5-7.5；则判定为B，输出结果；
若接收实验值为：RNA浓度总量为10-20ng，RNA值为5.0-6.5；则判定为C，输出结果；
若接收实验值为：RNA浓度总量为＜10ng，RNA值为小于5；则判定为D，输出结果；
建库测序模块，根据所述RIP实验值接收判定模块的数值匹配判定的情况，所述建库测序模块执行下一步；
若所述输出结果为A，则所述建库测序模块执行illumina方法建库测序；
若所述输出结果为B，则所述建库测序模块执行illumina方法建库测序；
若所述输出结果为C，则所述建库测序模块执行illumina先扩增再建库测序；
若所述输出结果为D，则所述建库测序模块不执行。
进一步，当前RIP建库测序的通用要求是总量>20ng，RNA RIN值大于6.5。
进一步，所述微量细胞数量为1-10×104。
进一步，所述微量细胞为一个免疫反应需要0-2mg的总蛋白且对应细胞数在1–10×104的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括培养的细胞系和分离的原代细胞。
进一步，培养的细胞系所述如293细胞，3T3细胞等；所述分离的原代细胞如间充质干细胞，成体干细胞，免疫细胞等。
进一步，所述RIP实验中RNA-蛋白包括RNA结合蛋白，RNA调控蛋白，转录因子等。
进一步，所述RIP实验中蛋白抗体包括：RNA结合蛋白抗体，RNA调控蛋白抗体，转录因子抗体等。
进一步，所述RIP实验中裂解细胞的方式为非交联方式裂解细胞。
进一步，所述非交联方式裂解细胞具体为：(1)将细胞离心获得细胞沉淀A；(2)用预冷的PBS缓冲液冲洗并离心所述细胞沉淀A得细胞沉淀B；(3)用所述与细胞沉淀B等体积的核糖体裂解缓冲液重悬所述细胞沉淀B，并处理成单细胞悬液。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的建库测序方法效率高，适用于少量的细胞实验。
本发明提供的建库测序方法解决了DNA与蛋白，蛋白与蛋白的项目结合导致后续难以去除DNA从而干扰分析数据的问题。
本发明提供的建库测序方法不需要使用超声打断法将DNA进行片段化，即不会影响RNA与蛋白的结合效率。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例使用材料：
磷酸盐缓冲液：PBS,pH7.4,室温保存)
多核糖体裂解缓冲液：配置10倍浓度，用时稀释到一倍；1000mM KCl,50mM MgCl2,100mM HEPES-NaOH pH 7,5％NP-40。10倍浓度储存液保存于室温，用时用水稀释10倍，并添加1mM二硫苏糖醇l(DTT),200units/ml RNA酶抑制剂,以及不包含EDTA的蛋白酶抑制剂复合物。
NT-2缓冲液(5×):250mM Tris-HCl pH 7.4,750mM NaCl,5mM MgCl2,0.25％NP-40.保存于4°，用之前稀释5倍。
NET-2缓冲液:1×NT-2缓冲液添加20mM EDTA pH 8.0,1mM DTT,200units/ml RNA酶抑制剂。
细胞裂解缓冲液:10mM Tris-HCl pH 7.4,10mM NaCl,0.5％NP-40.添加1mM二硫苏糖醇l(DTT),200units/ml RNA酶抑制剂,以及不包含EDTA的蛋白酶抑制剂复合物。
细胞核重悬缓冲液:50mM HEPES-NaOH pH 7,10mM MgCl2.添加1mM二硫苏糖醇l(DTT),200units/ml RNA酶抑制剂,以及不包含EDTA的蛋白酶抑制剂复合物。
免疫沉淀缓冲液:150mM NaCl，10mM Tris–HCl pH 7.4，1mM EDTA,1mM EGTA pH8，1％Triton X-100,0.5％NP-40.添加1mM二硫苏糖醇l(DTT),200units/ml RNA酶抑制剂，以及不包含EDTA的蛋白酶抑制剂复合物。
蛋白酶K消化缓冲液:1×NT-2缓冲液添加1％十二烷基磺酸钠(SDS),1.2mg/ml蛋白酶K。
实施例1细胞裂解准备
(1)将细胞培养在所需的合适的培养基中，并在需要的时间收取细胞，收取细胞时，贴壁生长细胞采用先细胞刮取再离心的形式，悬浮生长的细胞则直接采取离心的方式。
(2)离心后获得细胞，每一个免疫反应大约需要0-2mg的总蛋白，对应细胞数在5–20×105的哺乳动物细胞。
(3)4°，1000×g离心5min，去掉上清。
(4)用预冷的PBS缓冲液洗细胞沉淀两次，每次用4°，1000×g离心5min，去掉上清。
(5)用细胞沉淀等体积的多核糖体裂解缓冲液重选细胞沉淀，用移液枪头上下反复吹打使细胞团块吹打成单细胞悬液。
(6)冰上孵育5分钟。
(7)放置于-80°，可以促进细胞裂解，裂解物可以在-80°保存数月，但不超过12个月。
实施例2准备免疫沉淀用的免疫磁珠以及抗体
(1)购买的A蛋白或G蛋白包被的免疫磁珠，适用之前充分颠倒混匀或用移液枪吹打混匀。
(2)吸取75μl A蛋白或G蛋白包被的免疫磁珠到一个新的1.5ml离心管中，并每次用0.5ml NT-2缓冲液洗，洗两次，在磁力架上吸取上清，去掉。
用100μl NT-2缓冲液重悬磁珠，并加入5ug目标抗体以及阴性对照抗体，一般是同来源的额IgG。
(3)室温下孵育1小时，以促进抗体与包被磁珠的充分结合。
在室温下5000×g离心15s，之后将离心管置于磁力架上，静置1-2分钟后吸弃上清。
(4)从磁力架上取下离心管，加入1ml NT-2缓冲液，然后室温下5000×g离心15s，之后将离心管置于磁力架上，静置1-2分钟后吸弃上清。重复该步骤一共6次。
(5)将磁珠重悬于900μl NET-2缓冲液，并置于冰上备用。
实施例3免疫沉淀反应获得RNA-蛋白结合复合物
(1)取出于A1最后一步获得的细胞裂解液，在4°下20,000x g离心10分钟，取100μl上清加入到A2最后一步的离心管中，使总体积变成1ml。
(2)取出其中10μl(10％)，加入到另一个新的离心管中，并标记为input，保存于-80°直到RNA纯化开始前。
(3)将所有混合后的离心管至于旋转混合仪上，4°情况下旋转孵育3h以上或至过夜。
(4)孵育结合过夜后，将离心管至于放在冰上的磁力架上，静置1-2分钟，移液器去除上清。
(5)从磁力架上取下离心管，每个离心管加入1ml已预冷的NT-2缓冲液，并放回旋转混合仪上4°旋转5分钟。
(6)将离心管至于放在冰上的磁力架上，静置1-2分钟，移液器去除上清。
(7)重复步骤5-6，一共5次。
实施例4 RNA纯化
(1)每一个免疫反应用150μl蛋白酶K缓冲液重悬；每一个“input”里加入107μl ofNT-2,15μl 10％SDS,以及18μl蛋白酶K，使总体积为150μl。所有离心管置于震荡金属浴上，55℃，孵育30分钟以消化蛋白。
(2)孵育30分钟后，取下所有离心管，置于磁力架上，静置1-2分钟，将上清液转移至新的离心管中，加入250μl NT-2缓冲液。
(3)加入400μl酚氯仿，涡旋振荡仪上剧烈涡旋15秒。20,000×g室温离心10分钟。
(4)小心将上层水相转移至新的离心管中，避免吸到中间蛋白层。加入400μl异丙醇，涡旋振荡15秒，20,000×g室温离心10分钟。
(5)缓慢吸取300μl上层水相并转移至新的离心管中。加入50μl 5M的醋酸铵，15μl7.5M的氯化锂，5μl糖原(5mg/ml)，850μl无水乙醇。
(6)置于-80℃ 1小时以上或至过夜使RNA沉淀，20,000×g 4℃离心30分钟，小心去除上清。
(7)沉淀用500μl医预冷的80％乙醇洗一次。
(8)20,000×g 4℃离心15分钟。完全去除上清并风干沉淀。
(9)用10–20μl无RNA酶的水重悬沉淀并置于冰上。
(10)加入1-2μl DNA酶以去除残留的DNA，之后样本保存与-80℃用于后续实验。
实施例5 RNA浓度、片段大小测定
对实施例4获得的RNA进行浓度测定，片段大小测定，测试结果如下表1。
表1实施例4得到的RNA浓度片段大小测定结果表
Figure BDA0002570915950000091
Figure BDA0002570915950000101
当前RIP建库测序的通用要求是总量>20ng，RNA RIN值大于6.5。本实施例的结果总量为106ng，大于20ng，RIN值为7.2，大于6.5，符合当前RIP建库测序的通用要求。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法，其特征在于，对RIP实验的结果进行测定并分类判定：
若RNA浓度总量为＞50ng，RNA值为大于7.5，则判定为A；
若RNA浓度总量为20-50ng，RNA值为6.5-7.5，则判定为B；
若RNA浓度总量为10-20ng，RNA值为5.0-6.5，则判定为C；
若RNA浓度总量为＜10ng，RNA值为小于5，则判定为D；
当判定为A时，用illumina方法建库测序；
当判定为B时，用illumina常规方法建库测序；
当判定为C时，用illumina先扩增再建库测序；
当判定为D时，不能建库测序。
2.根据权利要求1所述的建库测序方法，其特征在于，所述微量细胞的细胞数为1-10x104。
3.根据权利要求2所述的建库测序方法，其特征在于，所述微量细胞为一个免疫反应需要0-2mg的总蛋白且对应细胞数在1–10×104的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括培养的细胞系、分离的原代细胞。
4.根据权利要求3所述的建库测序方法，其特征在于，所述RIP实验中RNA-蛋白包括RNA结合蛋白、RNA调控蛋白、转录因子。
5.根据权利要求4所述的建库测序方法，其特征在于，所述RIP实验中蛋白抗体包括：RNA结合蛋白抗体、RNA调控蛋白抗体、转录因子抗体。
6.根据权利要求1所述建库测序方法，其特征在于，所述RIP实验中裂解细胞的方式为非交联方式裂解细胞。
7.根据权利要求6所述的建库测序方法，其特征在于，所述非交联方式裂解细胞具体为：(1)将细胞离心获得细胞沉淀A；(2)用预冷的PBS缓冲液冲洗并离心所述细胞沉淀A得细胞沉淀B；(3)用所述与细胞沉淀B等体积的核糖体裂解缓冲液重悬所述细胞沉淀B，并处理成单细胞悬液。
8.适用于微量细胞的RIP实验的计算机建库测序系统，其特征在于，所述计算机建库测序系统包括：
RIP实验值接收判定模块，接收RIP实验值后与所述计算机建库测序系统的数据库进行匹配然后判定；
若接收实验值为：RNA浓度总量为＞50ng，RNA值为大于7.5；则判定为A，输出结果；
若接收实验值为：RNA浓度总量为20-50ng，RNA值为6.5-7.5；则判定为B，输出结果；
若接收实验值为：RNA浓度总量为10-20ng，RNA值为5.0-6.5；则判定为C，输出结果；
若接收实验值为：RNA浓度总量为＜10ng，RNA值为小于5；则判定为D，输出结果；
建库测序模块，根据所述RIP实验值接收判定模块的数值匹配判定的情况，所述建库测序模块执行下一步；
若所述输出结果为A，则所述建库测序模块执行illumina方法建库测序；
若所述输出结果为B，则所述建库测序模块执行illumina方法建库测序；
若所述输出结果为C，则所述建库测序模块执行illumina先扩增再建库测序；
若所述输出结果为D，则所述建库测序模块不执行。
9.根据权利要求8所述的计算机建库测序系统，其特征在于，所述微量细胞数量为1–10×104。
10.根据权利要求8所述的计算机建库测序系统，其特征在于，所述微量细胞为一个免疫反应需要0-2mg的总蛋白且对应细胞数在1–10×104的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括培养的细胞系、分离的原代细胞。
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