CN111269284A - 同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和rna的试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速高效分离动物细胞蛋白质和RNA的提取试剂和方法。利用细胞裂解液和苯酚氯仿抽提法,通过优化提取条件,实现从细胞质或细胞核中同步分离蛋白质和RNA的目的。该方法适用于少量或珍贵细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学蛋白提取技术领域,涉及一种利用细胞裂解液和苯酚 氯仿抽提法,从细胞质或细胞核中同步分离蛋白质和RNA的提取试剂和方 法,该方法适用于少量细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。
背景技术
随着精准医学和肿瘤生物学的快速发展,从大量临床样本中获取更多的 疾病遗传信息受到越来越多的关注。整合蛋白质组学、转录组学以及代谢组 学信息,可以全面的了解疾病发生发展的规律,为临床治疗寻找药物作用靶 点。然而,由于试验样本有限,有时候不能同步提取DNA、RNA、蛋白质 或代谢物,结果造成样本信息不对等,引起试验结果偏差较大等实际问题。 因此,为了充分利用试验样本,从相同样本中同时获取蛋白、核酸或代谢物 等信息,获取更多有价值的遗传背景信息,很多试剂公司或研究人员都致力 于开发一些可以同步提取蛋白、核酸或代谢物的试剂或方法。
近些年蛋白质的提取方法主要包括水溶液提取法和有机溶剂提取法。前 者适合提取大部分可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液的蛋白质,后者用来提取 少数与脂类结合的蛋白质,常用有机溶剂包括乙醇、丙酮或丁醇等。提取出 来的蛋白质可通过盐析、等电点沉淀、离子交换层析或亲和层析等方法进行 分离。目前分离动物细胞蛋白质的试剂主要包括RIPA试剂,根据表面活性 剂种类和比例不同,又分为强、中、弱细胞裂解液,适用于提取胞浆、胞核 或细胞膜蛋白,满足后续WB或IP等实验要求。常用的表面活性剂有SDS、 TritonX-100和NP-40等。
现阶段RNA提取试剂主要包括Trizol、RNAiso等试剂,其内含异硫氰 酸胍和酚等物质,能迅速破碎细胞和溶解细胞中的其它成分,抑制细胞释放 出核酸酶,维持细胞中RNA的稳定。当加入氯仿离心后,RNA进入水相, 再用异丙醇沉淀水相中的RNA,即可达到提取总RNA的目的。该法所提 RNA纯度高,完整性好,可用于定量PCR、Northern Blot、体外翻译和分子 克隆等实验。
尽管有关蛋白质或RNA的提取试剂很多,提取方法比较成熟,但是可以 同步分离蛋白质和RNA或DNA的试剂却很少,提取方法不够成熟,不能满 足少量或珍贵细胞样本的实验要求,亟待解决。
发明内容
本发明的目的:一是提供一种高效快速地从动物细胞质或细胞核中提取 总蛋白和RNA的提取试剂;二是利用上述提取试剂建立一种同步提取蛋白 质和RNA的实验方法,可从少量或珍贵实验样本中同时分离细胞总蛋白和 RNA,用于同步研究细胞蛋白组和转录组,节约细胞样本、获取很多有效数 据。
本发明的技术方案如下:
一种快速高效提取动物细胞总蛋白和RNA的提取试剂,包括以下三种 组分:
试剂A:包括20mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.1%NP40、 1mMEDTA(pH8.0)和10%Glycerol,使用前添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶 抑制剂和RNA分解酶抑制剂(现用现配)。
试剂B:100mM Tris-HCl(pH7.4)、2mM Na3VO4、100mM NaCl、1% TritonX-100、1mMEDTA、10%Glycerol、1mM EGTA、0.1%SDS、1mM NaF、 0.5%deoxycholate和2mM Na4P2O7。
试剂C:包含质量浓度为0.1%异硫氰酸胍盐和0.2%β-巯基乙醇的水饱和苯 酚溶液;
一种利用上述提取试剂同步提取细胞质或细胞核蛋白和RNA的方法, 包括以下步骤:
1、配制提取试剂A、B和C。使用前在试剂A和C中分别添加1%的磷酸酶 抑制剂、1%蛋白酶抑制剂和1U//μl RNase分解酶抑制剂(现用现配);
2、准备实验样品。按照常规方法收集细胞(1×106~5×106)。使用预冷PBS 清洗细胞两次。离心1000rpm×5min×4℃,收集细胞沉淀;
3、添加500μl提取试剂A,冰上静置60min,每10分钟混匀一次,充分裂 解细胞;
4、离心3000rpm×10min×4℃,上清液中含有细胞质蛋白及RNA,而沉淀中 含有细胞核蛋白及RNA;
5、添加PBS清洗沉淀两遍,可用移液枪轻缓吹打。离心3000rpm×10min×4℃, 收集沉淀;
6、向沉淀中添加25μl试剂B,放置在冰上裂解30min,每10分钟涡悬震荡 30s,重复三次;
7、离心14000rpm×20min×4℃,上清液中含有细胞核蛋白和RNA提取物;
同步提取细胞质或细胞核中的RNA,具体步骤如下:
8、吸取上述步骤4的细胞质裂解液200μl、步骤7的细胞核裂解液50μl,分 别添加600μl、150μl试剂C(3倍体积),混合均匀,室温静置5min;
9、加入总体积20%的氯仿,涡悬震荡混匀,室温静置10min;
10、离心12000rpm×10min×4℃,将上清液转移到新的无RNA分解酶的无菌 离心管中;
11、加入与上清液等体积的异丙醇后,混合均匀,室温静置10min;
12、离心12000rpm×10min×4℃,保留沉淀,添加500μl 75%乙醇清洗沉淀;
13、离心8000rpm×5min×4℃,保留沉淀;
14、室温干燥沉淀。添加DEPC处理水溶解RNA。
该方法适用于少量或珍贵细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
一、现有的蛋白质提取试剂和RNA提取试剂通常是分开使用的,不能同时 提取蛋白质和RNA,操作步骤繁琐,需要较多实验样本,不适合少量或珍 贵细胞样本的检测分析。本发明通过优化提取液配方、改进实验流程,将细 胞蛋白质和RNA提取方法融合在一起,可以同时分离细胞蛋白质和RNA, 简化了实验步骤,节约实验样本,提高工作效率。
二、与Trizol试剂相比,本方法通过优化细胞裂解液配方、调整细胞破碎时 间,优先分离出细胞质蛋白和RNA,然后再分离出细胞核蛋白和RNA,保 证了蛋白质活性和RNA完整性,可用于后续的蛋白组功能研究及转录组分 析检测。
附图说明
图1利用本发明试剂同步分离提取细胞质/细胞核蛋白和RNA的实验流程图;
图2利用本发明方法提取的细胞质和细胞核蛋白,免疫印迹检测结果 (WesternBlotting)。利用凯基生物商品化细胞质/细胞核蛋白提取试剂 和本发明提取试剂,分别提取肝癌细胞SMMC7721细胞质和细胞核蛋白, 并进行Western blotting检测。结果表明,商品化试剂盒和本发明试剂都可以 很好的分离出细胞质蛋白,纯度很好(核蛋白Lambin B没有出现在细胞质 蛋白中);但是商品化试剂盒分离的细胞核蛋白有少量胞质蛋白残留(如箭 头所示,胞质蛋白Tubulin出现在胞核蛋白中),而利用本发明提取试剂分离 的胞核蛋白中没有出现胞质蛋白Tubulin残留,说明本发明试剂在去除细胞 核蛋白残留方面效果更好。
图3利用本发明试剂和提取方法获取的细胞质和细胞核RNA,进行 qRT-PCR检测结果。
利用本发明方法提取的细胞质和细胞核RNA,进行qRT-PCR检测。结 果表明,RNA纯度很好,qPCR产物特异性很好,可用于后续RNA检测分 析。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。在实际应用中本领域技术人员根 据本发明做出的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。
实施例1
利用本发明的细胞质/细胞核蛋白和RNA同步提取试剂与凯基生物公司 商品化细胞核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒,分别提取人肝癌细胞SMMC7721 胞质和胞核蛋白,并进行Western Blotting检测,评价本试剂盒胞质和胞核蛋 白的提取效果[见图2]。
实验步骤如下:
一.配制提取试剂组分:
(1)配制100ml细胞裂解液A:
按照如下方法称量试剂粉末,并依次溶于双蒸水中,混匀后用0.22μm滤膜 过滤除菌,备用。
组分 | 厂家 | 用量 | 终浓度 |
Tris-HCl | 科密欧 | 0.2423g | 20mM(pH7.4) |
NaCl | 科密欧 | 0.0585g | 10mM |
MgCl<sub>2</sub> | 科密欧 | 0.06099g | 3mM |
NP40 | Sigma | 0.1ml | 0.1% |
EDTA | 科密欧 | 0.037224g | 1mM(pH8.0) |
Glycerol(甘油) | Sigma | 10ml | 10% |
(2)配制100ml细胞裂解液B:
按照如下方法称量试剂粉末,并依次溶于双蒸水中,混匀后用0.22μm滤膜 过滤除菌,备用。
组分 | 厂家 | 用量 | 终浓度 |
Tris-HCl | 科密欧 | 1.211g | 100mM(pH7.4) |
Na<sub>3</sub>VO<sub>4</sub> | Sigma | 0.036782g | 2mM |
NaCl | 科密欧 | 0.585g | 100mM |
TritonX-100 | Sigma | 1ml | 1% |
EDTA | 科密欧 | 0.037224g | 1mM |
Glycerol(甘油) | Sigma | 10ml | 10% |
EGTA | Sigma | 0.038035g | 1mM |
SDS | 科密欧 | 0.1g | 0.1% |
NaF | Sigma | 0.0041199g | 1mM |
Deoxycholate | Sigma | 0.5g | 0.5% |
Na4P<sub>2</sub>O<sub>7</sub> | Sigma | 0.89212g | 2mM |
(3)配制100ml细胞裂解液C:
组分 | 厂家 | 用量 | 终浓度 |
重蒸酚 | 贝斯特 | 250ml | 100ml(PH4.7) |
β-巯基乙醇 | Sigma | 200μl | 0.2% |
异硫氰酸胍 | Sigma | 0.1g | 0.1% |
具体方法如下:
①取出重蒸酚(贝斯特),室温放置,至室温后68℃度水浴融化;分取250ml 重蒸酚,添加750ml双蒸水(重蒸酚与水的体积比1:3),放置在通风橱中, 搅拌4小时;然后室温静置过夜。
②次日,可见溶液分层:上层为水相,下层为水饱和酚相。从下层取出100ml 水饱和酚,添加200μl的β-巯基乙醇和0.1g的异硫氰酸胍,搅拌均匀,4℃ 保存备用。
二、同步提取细胞质和细胞核蛋白质和RNA实验方法如下:
1、使用前在试剂A和C中分别添加1%的磷酸酶抑制剂、1%蛋白酶抑制剂 和1U//μl RNase分解酶抑制剂(现用现配);
2.取出新鲜培养的SMMC7721肝癌细胞(1×106~5×106),使用预冷PBS清 洗细胞两次,离心1000rpm×5min×4℃,收集细胞沉淀;
3、添加500μl提取试剂A,冰上静置60min,每10分钟震荡混匀一次,充 分裂解细胞;
4、离心3000rpm×10min×4℃,将上清液转移到新的1.5ml离心管中保存(含 有胞质蛋白及RNA),而沉淀中含有细胞核蛋白及RNA;
5、添加500μl PBS清洗沉淀两遍,可用移液枪轻缓吹打。离心 3000rpm×10min×4℃,弃上清,保留沉淀,近量吸干残留的液体;
6、加入100μl试剂B于细胞沉淀,放置在冰上裂解30min,每10分钟涡悬 震荡30s,重复三次;
7、离心14000rpm×20min×4℃,上清液中含有细胞核蛋白和RNA提取物; 在上述蛋白提取过程中,可以同时提取细胞质或细胞核中的RNA,具体步 骤如下:
8、吸取上述步骤4的细胞质裂解液200μl、步骤7的细胞核裂解液50μl,分 别添加600μl、150μl试剂C(3倍体积),混合均匀,室温静置5min;
9、加入总体积20%的氯仿,涡悬震荡混匀,室温静置10min;
10、离心12000rpm×10min×4℃,将上清液转移到新的无菌离心管中;
11、加入与上清液等体积的异丙醇后,混合均匀,室温静置10min;
12、离心12000rpm×10min×4℃,保留RNA沉淀,添加500μl 75%乙醇溶液 清洗沉淀;
13、离心12000rpm×5min×4℃,保留沉淀;
14、室温自然干燥,添加50~100μl的DEPC处理水溶解RNA。待检测。
三、选取凯基生物的核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒作为对照,分离肝癌细胞SMMC7721胞质和胞核蛋白,提取方法详见产品说明书(略)。
四、实验结果
利用蛋白免疫印迹方法(Western Blotting),检测人肝癌细胞质和细胞核 蛋白分离效果。结果显示,利用本发明试剂提取的细胞质和细胞核蛋白 分离得很彻底,在细胞质和细胞核蛋白之间没有残留或干扰,可以很好的定 位目标蛋白的分布。而对照商品化的试剂盒,细胞质蛋白分离效果很好,而 胞核蛋白中可见少量胞质蛋白(Tubulin)残留,表明对胞质和胞核蛋白分离 得不够彻底。可见,本发明的细胞质和细胞核蛋白提取试剂分离性能更为优 越(附图2)。
实施例2
利用本发明试剂分离人肝癌细胞SMMC7721细胞质和细胞核RNA,并进 行qRT-PCR检测。评价本试剂盒胞质和胞核RNA的提取效果。
一、实验步骤:
1、利用本发明试剂提取细胞质和细胞核RNA的方法,具体操作步骤详见实 施例1。
2、采用Nanodrop仪器,对提取的RNA进行浓度测定(见表1)。
3、对提取的RNA进行反转录合成cDNA。
cDNA合成试剂:PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa);
具体步骤如下:
cDNA合成反应:
4、对合成的cDNA,进行qRT-PCR检测。
定量PCR试剂:TaKaRa TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)
定量PCR反应体系:
二、实验结果:
1、利用本发明试剂提取的细胞质和细胞核RNA,浓度测定结果如表1所示。 RNA纯度在1.8~2.0之间,满足qPCR实验检测要求。
表1利用本发明试剂提取的细胞质和细胞核RNA浓度测定结果
2、采用qRT-PCR方法,检测人肝癌细胞质和细胞核RNA的扩增性能。
定量PCR检测结果显示,利用本试剂提取的RNA纯度很好,可以进行反 转录合成cDNA和定量PCR检测,条带特异性很好(附图3)。
注意事项:
RNA分离的最关键的因素是尽量减少RNA的污染,RNA酶,尤其 是胰RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类,除细胞内RNase以外,环境 中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液、以及唾液中均存在RNase,故 在提取RNA时,应尽量减少RNA酶对RNA的降解作用,做好灭菌工作。
Claims (4)
1.同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的试剂,主要包括下述三种组分:
试剂A:包含20mM~100mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM~100mM NaCl、1mM~10mM MgCl2、体积浓度0.1%~1%NP40、1mM~10mM EDTA(pH8.0)和体积浓度1%~10%Glycerol;
试剂B包含10mM~100mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM~5mM Na3VO4、10mM~100mM NaCl、0.1%~1%TritonX-100、1mM~10mM EDTA、体积浓度1%~10%Glycerol、1mM~10mMEGTA、质量浓度0.1%~10%SDS、1mM~10mM NaF、质量浓度0.1%~0.5%Deoxycholate和1mM~10mM Na4P2O7;
试剂C包含质量浓度为0.1~1%异硫氰酸胍盐和0.1~0.5%β-巯基乙醇的水饱和苯酚溶液。
2.同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的方法,采用权利要求1所述提取试剂进行提取,利用细胞裂解液和苯酚氯仿抽提法,实现同步分离细胞蛋白质和RNA的目的;
(1)在提取细胞蛋白质和RNA前,需要在试剂A和C中分别添加终体积浓度1%磷酸酶抑制剂、终体积浓度1%蛋白酶抑制剂和终浓度1U/ul RNase分解酶抑制剂;
(2)准备新鲜细胞样品,离心收集细胞(1×106~5×106),添加1~2ml PBS缓冲液清洗两遍;
(3)添加0.1~1ml提取试剂A,冰上(范围-4℃~4℃)裂解细胞60min,释放出细胞质蛋白和RNA;
(4)离心3000rpm×10min×4℃,上清液中含有细胞质蛋白及RNA,沉淀中含有细胞核蛋白及RNA;
(5)添加1~2ml PBS缓冲液清洗沉淀两遍;离心3000rpm×10min×4℃,收集沉淀;
(6)向细胞沉淀中添加提取试剂B(0.01~1倍体积的试剂A),最佳体积比例为试剂A的1/20,放置在冰上(范围-4℃~4℃)裂解30min,每间隔10min涡旋震荡一次;
(7)离心14000rpm×15min×4℃,上清液中含有细胞核蛋白和RNA。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述的细胞质或细胞核中RNA提取方法和步骤如下:
a、将上述权利要求2步骤(4)所述的细胞质裂解液和权利要求2步骤(7)所述的细胞核裂解液,分别取部分细胞上清液,然后添加细胞上清液3倍体积的试剂C,震荡混合,室温放置5~10min;
b、向上述溶液中加入终体积20%的氯仿,涡悬震荡混匀,室温静置10min;
c、离心12000rpm×10min×4℃,将含有RNA的上清液转移到无RNase分解酶的离心管中,沉淀物中含有蛋白;
d、向上述上清液中添加0.5~1倍体积的异丙醇,混合均匀,室温静置10min;
e、离心12000rpm×10min×4℃,保留沉淀;添加与试剂C等体积的体积浓度75%乙醇清洗沉淀;
f、离心8000rpm×5min×4℃,保留沉淀;
g、室温干燥沉淀;DEPC处理水溶解RNA。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于:该方法适用于所有人或动物来源的细胞株。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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