KR20090036121A - 시료로부터 사전 추출 없이 거대분자를 변형시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학물질을 이용하여 시료 중의 거대분자를 전환시키고, 경우에 따라, 화학적 중간체를 제거 또는 전환시키고, 수득되는 변형된 거대분자를 정제함으로써, 시료로부터 사전 추출 없이 거대분자를 변형시키는 방법을 포함한다.

거대분자의 변형 방법, 사전 추출, 중아황산염 변형

Description

시료로부터 사전 추출 없이 거대분자를 변형시키는 방법{A method of modifying a macromolecule without prior extraction from a sample}

본 발명은 화학물질을 이용하여 시료 중의 거대분자를 전환시키고, 경우에 따라, 화학적 중간체를 제거 또는 전환시키고, 수득되는 변형된 거대분자를 정제함으로써, 시료로부터 사전 추출 없이 거대분자를 변형시키는 방법을 포함한다.

척추동물 및 고등 식물에서 사용되는 유전자 발현을 조절하는 한가지 방법은 다양한 유전자의 프로모터 영역에 위치한 CpG 섬에서 발견되는 사이토신의 메틸화이다. 이러한 유전자 조절 방법을 연구하기 위해, 비메틸화된 사이토신으로부터 메틸화된 사이토신을 구별하는 기술이 개발되었다. 한가지 방법은, 사이토신은 우라실로 전환되고 5-메틸-사이토신은 상당히 전환되지 않도록 DNA를 화학적으로 처리하는 방법이다[참조: Frommer et al. (1992)]. 변형 절차에 중요한 매개변수에 관한 체계적인 연구도 이루어졌다[참조: Grunau et al.(2001)]. 처리된 DNA는 메틸화 특이적 PCR (MSP)의 주형으로서 사용될 수 있다. DNA 메틸화 및 이와 관련된 방법은 예컨대, 미국특허공개 제20020197639호, 제20030022215호, 제20030032026호, 제 20030082600호, 제20030087258호, 제20030096289호, 제20030129620호, 제20030148290호, 제20030157510호, 제20030170684호, 제20030215842호, 제20030224040호, 제20030232351호, 제20040023279호, 제20040038245호, 제20040048275호, 제20040072197호, 제20040086944호, 제20040101843호, 제20040115663호, 제20040132048호, 제20040137474호, 제20040146866호, 제20040146868호, 제20040152080호, 제20040171118호, 제20040203048호, 제20040241704호, 제20040248090호, 제20040248120호, 제20040265814호, 제20050009059호, 제20050019762호, 제20050026183호, 제20050053937호, 제20050064428호, 제20050069879호, 제20050079527호, 제20050089870호, 제20050130172호, 제20050153296호, 제20050196792호, 제20050208491호, 제20050208538호, 제20050214812호, 제20050233340호, 제20050239101호, 제20050260630호, 제20050266458호, 제20050287553호 및 미국특허 제5786146호, 제6214556호, 제6251594호, 제6331393호 및 제6335165호에서 논의되고 있다.

DNA 변형 키트는 시판되며, 이는 비메틸화된 사이토신을 보유하는 정제된 게놈 DNA를, 비메틸화된 사이토신은 부재하고 부가된 우라실을 보유하는 게놈 DNA로 전환시킨다. 이러한 처리는 중아황산염(bisulfite)에 의해 촉진되는 탈아미노화 반응과 수산화나트륨에 의해 촉진되는 탈설폰화 단계로 이루어진 2단계 화학 공정이다. 통상적으로, 탈아미노화 반응은 액체로서 수행되고, 얼음 상에서의 항온처리 및 이어서 컬럼 결합 완충액의 첨가에 의해 종결된다. 고체상 결합 및 세척 후, DNA를 용출시키고, 탈설폰화 반응을 액체 중에서 수행한다. 에탄올 첨가에 의해 반 응을 종결시키고, 변형된 DNA를 침전에 의해 세척한다. 하지만, 시판되는 2가지 키트(Zymo 및 Chemicon)는 DNA가 컬럼에 결합되어 있는 동안 탈설폰화 반응을 수행하고 컬럼 세척으로 반응을 종결시킨다. 처리된 DNA는 MSP 분석을 위해 컬럼으로부터 용출시킨다. 이러한 변형은 지루하고 수율 손실을 유발하고 작업자 오류를 증가시키는 많은 단계를 거쳐야 한다. 이용할 수 있는 변형 절차는 모두 정제된 게놈 DNA로 시작하며, 이 역시 수율 손실을 유발하고 작업자 오류를 증가시키는 많은 단계를 거치는 지루한 공정이다.

발명의 개요

본 발명은 시료 내의 거대분자를 화학물질을 이용하여 전환시키고, 경우에 따라, 화학적 중간체를 제거하거나 전환시킨 후, 수득되는 변형된 거대분자를 정제함으로써, 시료로부터 사전 추출 없이 거대분자를 변형시키는 방법을 포함한다.

도 1은 생물학적 시료로부터 분리 없이 이루어진 DNA 변형이 분리 후의 변형과 동등하다는 것을 입증하는 도면이다.

본 발명은 시료 내의 거대분자를 화학물질을 이용하여 전환시키고, 경우에 따라, 화학적 중간체를 제거하거나 전환시킨 후, 수득되는 변형된 거대분자를 정제함으로써, 시료로부터 사전 추출 없이 거대분자를 변형시키는 방법을 포함한다.

거대분자는 당업계에 공지된 임의의 물질일 수 있으며, 그 예로는 DNA, RNA, 세포 대사산물, 지질, 탄수화물 및 단백질이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. DNA는 당업계에 공지된 모든 DNA, 예컨대 바이러스 DNA, 핵 DNA, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 세균 DNA 및 합성 DNA 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. RNA는 당업계에 공지된 모든 RNA, 예컨대 rtRNA, tRNA, miRNA, rRNA 및 mRNA 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 세포 대사산물은 당업계에 공지된 모든 것, 예컨대 대사 사이클 또는 효소적 효과에 의해 생산된 것 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 지질은 당업계에 공지된 모든 지질, 예컨대 리포좀, 세포막 지질, 세포내 막 지질 및 세포외 지질 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 탄수화물은 당업계에 공지된 모든 탄수화물, 예컨대 단백질-결합된 탄수화물 및 핵산-결합된 탄수화물 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 단백질은 당업계에 공지된 모든 단백질, 예컨대 세포내 단백질 및 세포외 단백질 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

변형은 당업계에 공지된 모든 변형, 예컨대 DNA 또는 RNA의 중아황산염 변형 및 비오티닐화, RNA의 플루오르화 및 메틸화, 지질의 가열, 리포좀 형성, 마이셀(micelle) 형성, 단일층 형성 및 이중층 형성, 탄수화물의 산화, 탈산화, 아미노화 및 탈아미노화, 및 단백질의 인산화, 탈인산화, 메틸화, 비오티닐화, 아미노화, 탈아미노화, 글리코실화 및 탈글리코실화가 있다[참조: 20070148670; Chuang et al. (2007); Emmerechts et al. (2007); Frommer et al. (1992); Grunau et al. (2001); Hurd et al. (2007); Jin et al. (2007); Oakeley (1999); Rathi et al. (2003); Rein et al. (1998); Sambrook et al. (2000); Wu et al. (2007)].

시료는 당업계에 공지된 모든 시료, 예컨대 조직, 체액, 생검 시료 및 보존된 조직 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 조직은 당업계에 공지된 모든 조직, 예컨대 전체 기관, 절제된 기관, 상피, 신경, 위장관, 근육, 심장, 점막 및 내피 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 체액은 당업계에 공지된 모든 체액, 예컨대 전혈, 혈장, 소변, 타액, 유리체 및 혈청을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 생검 시료는 당업계에 공지된 모든 시료, 예컨대 미세 바늘 흡인물, 조직 절편 및 피부 시료를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 보존된 조직은 당업계에 공지된 모든 조직, 예컨대 신선 동결 조직, 파라핀 포매 조직 및 보존 시약에 보존된 것을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 보존 시약은 당업계에 공지된 모든 시약, 예컨대 포르말린, 알엔에이레이터(RNAlater)® 및 디메틸설폭사이드 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

정제는 당업계에 공지된 모든 정제, 예컨대 입자 기반 정제, 침전, 원심분리, 전기영동 및 전하 교환 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 입자 기반 정제는 당업계에 공지된 모든 것, 예컨대 친화성 입자, 분립(sizing) 입자 및 자성 입자 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 분립 입자는 당업계에 공지된 모든 입자, 예컨대 실리카계 입자 및 규조토 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전기영동 분리 정제는 당업계에 공지된 모든 전기영동 분리 정제, 예컨대 크기 및/또는 전하에 의한 전기영동 분리 정제 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전기영동 분리 정제는 당업계에 공지된 모든 전기영동 분리 정제, 예컨대 저분자량 중합체로 형성된 겔 및/또는 모세관에 의한 전기영동 분리 정제 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명은 중아황산염 변형된 DNA를 수득하는 신속하고 효과적인 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술된 이 방법은 종래의 방법들의 많은 단계들을 효과적으로 제거하여 가능한 오류를 감소시키면서 우수한 결과를 산출한다. 또한, 4 내지 5시간의 상당한 시간 절감도 실현한다.

본 발명은 DNA 시료를 수득하는 단계; 상기 시료와 일정량의 중아황산염을, 상기 DNA 내의 비메틸화된 사이토신 잔기의 적어도 95%가 우라실 잔기로 전환되기에 충분한 시간과 조건 하에 항온처리하는 단계; 상기 시료 중의 DNA를 컬럼에 결합시키는 단계; 결합된 DNA를 세척하여 오염물을 제거하는 단계; 컬럼에 결합된 DNA와 탈설폰화 시약을, 탈설폰화가 일어나기에 충분한 시간과 조건 하에 항온처리하는 단계; 결합된 DNA를 세척하여 탈설폰화 시약을 제거하는 단계; 및 중아황산염에 의해 변형된 DNA를 컬럼으로부터 용출시키는 단계에 의해 DNA를 추출 및 변형시키는 방법을 제공한다.

DNA는 농도가 약 0.01 내지 약 30㎍이고 당업계에 공지된 모든 방법에 의해 수득될 수 있으며, 정제된 DNA이거나 세포 용해물로부터 직접 수득된 DNA일 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 임의의 적당한 조직으로부터 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 형성되어, 직접 중아황산염 시약으로 처리될 수 있다. 세포 용해는 예컨대 프로테이나제 및/또는 고농도의 염 및/또는 세제와의 항온처리, 초음파처리, 동결-해동 처리 또는 기계적 파괴에 의해 이루어질 수 있다. 모든 세포 시료는 본 발명에 사용하기에 적합하며, 조직, 체액, 생검 시료 또는 보존된 조직으로부터 수득될 수 있다.

중아황산염 시약은 당업계에 공지된 모든 시약, 에컨대 중아황산나트륨 또는 메타중아황산염 등일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 시약은 예컨대 미국특허공개 제20050089898호, 제20050095623호 및 제20050153308호에 논의되어있다.

단계 b의 항온처리 조건은 열순환(thermocycling)을 수행하거나 수행하지 않고 50 내지 95℃에서 약 1 내지 16시간일 수 있다. 열순환은 예컨대 70℃에서 3시간, 90℃에서 1시간, 또는 50℃와 95℃ 사이에서의 순환일 수 있다.

컬럼은 당업계에 공지된 모든 컬럼일 수 있고, 실리카계 또는 규조토 컬럼이 바람직하다. 탈설폰화는 당업계에 공지된 모든 방법에 의해 수행될 수 있고, 수산화나트륨과 알콜로 수행되는 것이 바람직하다. 알콜은 이소프로판올 또는 에탄올인 것이 바람직하다. 컬럼이 실리카계 컬럼인 경우에, 알콜은 에탄올이고, 컬럼이 규조토인 경우에 알콜은 이소프로판올인 것이 더욱 바람직하다. 탈설폰화는 바람직하게는 약 0℃ 내지 약 50℃에서, 약 0 내지 30분, 바람직하게는 약 5 내지 15분, 더욱 바람직하게는 약 15분 동안 수행한다. 온도는 대략 실온인 것이 바람직하다.

변형된 거대분자는 당업계에 공지된 모든 방법으로 용출시킬 수 있으며, 예컨대 물 또는 적당한 완충액에 의한 용출이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

다음의 실시예는 청구된 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 제한하는 것이 아니다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 발명에 참조로서 인용된다.

실시예 1

신선 동결된 파라핀 포매된 조직으로부터 수득된 세포 용해물로부터의 DNA 의 신속한 중아황산염 변형

PBS에 세포 배양물 펠릿을 담고 있는 마이크로원심분리관

· DNA 추출 완충액(75mM NaCl, 25mM EDTA 및 0.5% Tween 20) 100㎕를 첨가하고, 56℃에서 10분 동안 항온처리한다.

·이하에 기술되는 3M NaOH 첨가를 진행한다.

또는 5개(최대)의 10 마이크론 FFPE 블록 슬라이스를 담고 있는 마이크로원심분리관.

FFPE 슬라이스는 탈파라핀화를 필요로 한다:

·튜브에 1ml 자일렌을 첨가하고 여러번 뒤집어 혼합한다.

·RT에서 5분 동안 항온처리하고 RT에서 5분 동안 최대 속도로 원심분리한다.

·어떠한 펠릿도 제거하지 않고 상청액을 제거한다.

·1ml 자일렌 추출을 반복한다.

·펠릿에 1ml EtOH(100%)를 첨가하고, 뒤집어 서서히 혼합한다.

·RT에서 최대 속도로 5분 동안 원심분리한다.

·어떠한 펠릿도 제거하지 않고 피펫팅으로 EtOH를 조심스럽게 제거한다.

·EtOH 세척을 반복한다.

·마이크로원심분리관을 개방한 상태로 37℃ 가열 블록에서 펠릿을 건조한다.

FFPE 시료의 추출/변형 절차

·90㎕ 추출 완충액(10mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 2mM EDTA 및 0.5% SDS) 및 10㎕ 프로테이나제 K를 첨가하고 56℃에서 하룻밤 동안 항온처리한다.

·항온처리 후 추출물은 투명해야 하며, 그렇지 않으면 10㎕ 프로테이나제 K를 첨가하고 1시간 동안 항온처리한다.

·용해물이 투명해질 때까지 반복하고 3M NaOH 첨가를 아래에 기술된 바와 같이 진행한다.

·1/10 용적의 3M NaOH를 첨가하고 56℃에서 10분 동안 항온처리한다.

·중아황산나트륨 포화 용액(pH 5.0) 2 용적을 10mM 하이드로퀴논과 함께 첨가하고, 70℃, 암실에서 3시간 동안 항온처리한다.

·얼음에서 10분 동안 항온처리하여 반응을 정지시킨다. 이소프로판올 0.5 용적을 첨가하고, 서서히 볼텍싱하거나 위아래로 피펫팅한다.

·시료를 Qiagen DNA 정제 컬럼(QiaAmp DNA 정제 키트)에 첨가하고, 1분간 스핀시킨 후, 폐 튜브를 비운다.

·AW1 세척 완충액 500㎕를 첨가하고, 1분간 스핀시킨 후, 폐 튜브를 비운다.

·AW2 세척 완충액 500㎕를 첨가하고, 1분간 스핀시킨 후, 폐 튜브를 비운다.

·탈설폰화 완충액(300mM NaOH, 80% 이소프로판올) 200㎕를 첨가하고, 실온에서 10분간 항온처리한 후, 1분간 스핀시킨 후, 폐 튜브를 비운다.

·AW2 세척 완충액 500㎕를 첨가하고, 1분간 스핀시킨 후, 폐 튜브를 비우고, 1분간 스핀시킨다.

·AW2 세척 완충액 500㎕를 첨가하고, 1분간 스핀시킨 후, 폐 튜브를 비우고, 1분간 스핀시킨다.

·50㎕ TE로 용출시키고, 새로운 1.5ml 마이크로원심분리관에서 1분간 스핀시킨 후, -20℃에 보관한다.

이 절차의 효율은 마커로서 GSTP1을 이용하는 β-액틴 및 정량적 PCR을 이용하여 분석한다. β-액틴 프로모터는 메틸화되어 있지 않으며, 이 마커는 변형 절차의 대조군 역할을 한다. 이 마커에 의해 얻어진 Ct 값은 이 분석에 첨가된 게놈 등가물의 수를 반영한다. 이에 반해 GSTP1 프로모터는 후생적으로 메틸화된 것으로서, 암성 상태를 반영할 수 있다. 따라서, GHSTP1 마커 Ct 값은 더욱 가변적이고 보통 β-액틴 Ct 값보다 크다. 전립선 FFPE 블록은 애스터랜드(Asterand)로부터 수득했다. "Zymo" 처리는 자이모 리서치(Zymo Research)에서 EZ DNA 메틸화 키트로서 시판하는 DNA 변형 키트를 의미한다. 2단계 절차는 DNA 정제 키트(Qiagen QiaAmp 미니 DNA 정제 키트) 및 Zymo 키트와 같은 DNA 변형 키트를 이용하는 분리된 2단계 절차를 의미한다. Zymo 1단계 절차는, 3M NaOH 대신에 M-희석 완충액을 사용하여 Zymo DNA 변형 절차를 진행하는 3M NaOH 단계까지는 ID 절차와 동일하다.

세포 배양물 펠릿을 이용한 표 1에 제시된 결과는 1단계 방법이 더 낮은 Ct 값을 나타내는 바, Quigen/Zymo 2단계 절차와 비교했을 때 더 우수한 결과를 제공한다는 것을 시사한다. 통계적으로, 대응 T 검정은 β-액틴 마커를 이용하는 방법들은 P 값이 0.00006으로 서로 유의적인 차이가 있지만, GSTP1 마커는 P 값이 0.0001이라는 것을 나타낸다. 표 2에 제시된 결과는 β-액틴 마커가 0.02의 P값을 나타내고 GSTP1 마커가 0.003의 P값을 나타내는 Zymo 1단계 방법과 비교했을 때, ID 1단계 절차가 더 낮은 Ct 값을 나타낸다는 것을 시사한다.

하지만, 전립선 FFPE 블록을 이용한 표 1에 제시된 결과는 Zymo 2단계 방법이 1단계 방법보다 더 낮은 Ct 값을 나타내어, 세포 배양물과 상반된 결과를 나타낸다. β-액틴 마커의 결과는 이 방법이 0.021의 P 값으로 유의적인 차이가 있다는 것을 시사하며, GSTP1 결과는 0.054의 P 값으로 다를 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 상이한 결과는 세포 배양물의 추출 완충액이 조직 블록을 용해하는데 충분하지 않았을 수 있다는 것을 시사했다. 표 4의 결과는 전립선 조직 블록을 사용하면서 Tween을 SDS로 교체하여 더 공격적인 추출 완충액을 사용함으로써 ID 1단계와 Zymo 1단계 방법을 비교한다. ID 1단계 방법이 다시 우수한 결과를 보였고, 이는 표 3에서 우수한 결과를 수득하지 못한 것이 추출 완충액 때문이었다는 것을 시사 한다. β-액틴 마커 결과는 이 방법이 0.0008의 P 값으로 유의적인 차이가 있다는 것을 시사하며, GSTP1 결과는 0.056의 P 값으로 다를 수 있다는 것을 시사한다. QPCR 분석법은 40 사이클만으로 이루어지기 때문에, 일단 이 분석법으로 Ct 값을 얻지 못하면, Ct 값을 얻은 분석과 비교하는 것이 의미가 없다. 두 시료의 분석이 실패했다면, P 값은 0.0025일 것이며, 이는 GSTP1 마커를 이용한 방법이 유의적인 차이가 있다는 것을 시사한다.

실시예 2

소변으로부터 수득한 DNA 의 중아황산염 처리

본 실험의 목적은 LnCAP 세포 및 소변으로부터 수득된 정제된 DNA에 대해 DEM 키트와 Zymo EZ 변형 키트를 비교하기 위한 것이다. 10개의 정규화된 랜덤 시료를 2개의 키트에 나누었다.

·키트(DEM 및 Zymo)당 시료 5개

·Fast Start Taq(GSTP1, β-액틴 및 APC)를 이용하여 이중으로 수행되는 PCR

ANOVA 분석은 P 값이 0.663임을 시사하고 대응 T-검정은 GSTP1에 대해 DEM와 Zymo 사이에 통계적 차이가 없음을 시사한다.

ANOVA 분석은 P 값이 0.008임을 시사하고 대응 T-검정은 β-액틴에 대해 DEM와 Zymo 사이에 통계적 차이가 있음을 시사한다.

·결과는 Zymo와 DEM 키트가 GSTP1에 대해서는 동등하다는 것을 시사한다.

·DEM 키트는 정제된 DNA에 반대로 조직에 대해서 최적화되었고, ProMU 내에서의 추가적인 최적화는 더 낮은 CT 값을 유도할 수 있다.

·DEM 키트는 더 높은 β-액틴 값을 입증한다.

DNA를 함유하는 조 용해물 또는 정제된 게놈 DNA의 결합은 중황산염 전환으로부터 존재하는 고농도의 염을 이용하여 실리카겔계 컬럼에 특이하게 결합한다.

오직 전환 시약의 용해만을 위해 결합 전에 에탄올을 시료에 첨가한다.

·1/10 용적의 M-희석 완충액을 첨가하고 70℃에서 20분 동안 항온처리하여 이본쇄 DNA를 화학적으로 변성시킨다.

·2 용적의 CT 전환 시약(Zymo)을 첨가하고 70℃에서 3시간 동안 항온처리한다.

·0.5 용적의 에탄올(100%)을 첨가하고 서서히 볼텍싱하거나 위아래로 피펫팅한다.

소변으로부터의 정제된 DNA를 45㎕의 출발 부피로 함유하는 마이크로원심분리관

·이하에 기술되는 바와 같은 M-희석 완충액 첨가를 진행한다.

·또는, GSTP1 과메틸화를 발현하는 것으로 공지된, 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 세포 배양물 펠릿의 10 마이크론 FFPE 블록 슬라이스 5개(최대)를 함유하는 마이크로원심분리관.

FFPE 슬라이스는 탈파라핀화를 필요로 한다:

·자일렌 1ml를 튜브에 첨가하고 여러번 뒤집어 혼합한다.

·RT에서 5분 동안 항온처리하고 RT에서 13,200rpm으로 5분 동안 원심분리한다.

·어떠한 펠릿도 제거하지 않고 상청액을 제거한다.

·1ml 자일렌 추출을 반복한다.

·1ml EtOH(100%)를 펠릿에 첨가하고 뒤집어 서서히 혼합한다.

·RT에서 13,200rpm으로 5분 동안 원심분리한다.

·어떠한 펠릿도 제거하지 않고 피펫팅으로 EtOH를 조심스럽게 제거한다.

·EtOH 세척을 반복한다.

·펠릿을 건조하고 마이크로원심분리관을 개방한 상태에서 37℃ 가열 블록 내의 잔류 에탄올을 약 10분 동안 제거한다.

FFPE 시료의 추출/변형 절차

·35㎕ 완충액 ATL(Qiagen) 및 10㎕ 프로테이나제 K(Qiagen)를 첨가하고, 56℃에서 하룻밤 동안 항온처리한다.

·항온처리 후, 추출물은 투명하고 균질해야 한다.

·이하에 기술되는 바와 같은 M-희석 완충액(Zymo Research) 첨가를 진행한다.

·Qiagen DNA 정제 컬럼(QiaAmp Micro DNA 정제 키트)에 시료를 첨가하고, 13,200rpm에서 1분간 스핀시키고 폐 튜브를 비운다.

·AW1 세척 완충액 500㎕를 첨가하고, 13,200rpm에서 1분간 스핀시키고 폐 튜브를 비운다.

·탈설폰화 완충액(300mM NaOH, 90% 에탄올) 200㎕를 첨가하고, 실온에서 20분간 항온처리하고 13,200rpm에서 1분간 스핀시키고 폐 튜브를 비운다.

·AW2 세척 완충액 500㎕를 첨가하고, 1분간 스핀(13,200rpm)시킨 후, 폐 튜브를 비우고, 3분간 스핀(13,200rpm)시킨다.

·20 내지 25㎕의 완충액 AE, TE 또는 뉴클레아제 미함유 물로 용출시킨다. 컬럼을 실온에서 3분 동안 항온처리하고 새로운 1.5ml 마이크로원심분리관에 넣어 1분간 스핀시키고 -20℃ 또는 -80℃ foe에서 보관한다.

실시예 3

대규모 DNA 변형

대규모 DNA 변형은 메틸화 특이적 PCR 방법 및 키트의 품질 대조 시험을 위한 패널을 제조하는데 필요할 수 있다.

1. 전립선 세포 배양 세포주 22Rv1 게놈 DNA(ATCC) 20㎍을 TE 225㎕ + 3.0M NaOH 용액 27.5㎕의 총 용적에서 변성시킨다. 37℃에서 10분간 항온처리한다.

2. 2x 용적의 전환 시약(Zymo)을 첨가한다; 70℃에서 3시간 항온처리한 후, 얼음 위에서 10분간 항온처리한다.

지지체 매트릭스(Promega)를 함유하는 결합 완충액 2ml를 첨가하고, 이것을 주사기 컬럼 진공 장치에 가하여 고체상 지지체에 DNA를 결합시킨다. 진공을 사용하여 매트릭스를 여과한다.

진공을 이용하여 매트릭스를 80% IPA 1ml로 세척한다.

2ml OD 탈설폰화 완충액(80% IPA 중의 0.3M NaOH)을 첨가하고 실온에서 10분 동안 항온처리한다. 진공을 이용하여 완충액을 제거한다.

진공을 이용하여 80% IPA 1ml로 세척한다.

3. 컬럼을 주사기에서 분리하여 1.5ml 마이크로원심분리관에 넣는다. 5 x 200㎕ 용출시킨 후 1ml EB를 첨가한다.

표 5는 얻어진 결과를 제시한 것이다.

이 세포주에서 GSTP1 프로모터는 탈메틸화된 것으로 알려져 있는바, 이 마커에 대한 Ct 값의 결여가 예상된다.

실시예 4

게놈 DNA 의 신속하고 효율적인 중아황산염 변형을 위한 변형된 프로토콜

DNA의 중아황산염 변형을 수행하기 위해 Zymo Research(Orange, CA)로부터 EZ DNA 메틸화 키트를 제공받았다. 제조업자의 권장사항에 따라, 변형시킬 DNA 시료를 중아황산염 전환 시약과 함께 50℃에서 12 내지 16시간 동안 항온처리한다. 이 조건은 훨씬 더 짧은 시간에 비슷한 품질의 중아황산염 전환된 DNA가 생성되도록 조정되었다. 상이한 시간 동안 여러 온도를 시험한 결과, 70℃에서 1 내지 3시간 동안 중아황산염 전환 시약과 DNA 시료를 항온처리하는 것이 키트에서 권장된 변형 조건과 비슷한 효율적인 중아황산염 변형을 제공하는 것으로 입증되었다. 이하의 데이터는 상이한 온도에서 상이한 시간 동안 중아황산염 시약과 함께 항온처리된 DNA 시료를 사용한 메틸화 특이적 PCR 분석을 제시한 것이다.

도 1은 70℃에서 2시간 또는 3시간 동안 전환시키는 Veridex 변형 프로토콜이 제조업자가 권장하는 50℃, 16시간과 동등한 결과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 혁신은 이 절차를 훨씬 더 빠르게 한다.

실시예 5

파라핀 포매된 조직으로부터의 DNA 추출 및 변형을 위한 신속하고 효율적인 프로토콜

MSP 반응에 사용하기 전에 게놈 DNA의 추출과 이의 중아황산염 변형은 이 시험관내 진단 분석의 일부인 매우 상당한 전처리 절차를 포함한다. 이 절차는 많은 지루한 단계들을 수반하여 시간 소모적일 수 있고, 시료의 오염 기회를 증가시킬 수도 있다. 프로테이나제 K를 포함하는 용해 완충액, 10mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.5% SDS와 중아황산염 변형 키트의 사용을 조합함으로써, 상기 시료 종류로부터 얻을 수 있는 최소한의 DNA의 양을 회수 및 변형하는 신속하고 간단한 시료 처리 프로토콜이 개발되었다.

다음과 같은 단계가 수행되었다:

1. FFPE 조직(생검)(5 x 10μ 절편)을 에펜도르프 튜브에 담는다.

2. 튜브를 잠깐동안 스핀시키고 500㎕ 자일렌을 첨가하고, 중간 속도로 잠깐동안 볼텍싱한다.

3. RT에서 10분 동안 항온처리한다(항온처리 동안 2회 이상 간격을 두고 시료를 여러번 뒤집어 혼합한다).

4. 실온에서 10분 동안 최고 속도로 원심분리한다.

5. 펠릿의 유실 없이 조심스럽게 액체를 따라 내어 상청액을 제거한다.

6. 펠릿에 500㎕ 에탄올(100%, 200 프루프(proof))을 첨가하여 잔류 자일렌을 제거한다. 중간 속도로 잠깐동안 볼텍싱하고, 튜브를 5분 동안 방치한 후, 여러번 뒤집어 혼합한다.

7. 실온에서 10분 동안 최고 속도로 원심분리한다.

8. 펠릿의 유실 없이 조심스럽게 액체를 따라 내어 상청액을 제거한다.

9. 단계 7 내지 10을 반복한다. 이 단계를 통해 대부분의 액체를 확실하게 따라낸다.

10. 개방시킨 마이크로원심분리관을 오븐에서 50 내지 55℃로 10 내지 15분 동안 항온처리하여 잔류 에탄올을 증발시킨다. 다음 단계로 진행하기 전에 모든 에탄올이 증발되었는지를 확인한다. 그렇지 않다면, 더 오래 항온처리한다.

11. TNES 용해 완충액(10mM Tris pH 8.0; 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.5% SDS) 40㎕를 첨가하고, 튜브를 가볍게 쳐서 조직을 현탁시킨다.

12. 10㎕ 프로테이나제 K(20mg/ml)를 첨가하고, 잠깐동안 볼텍싱한 후, 아주 잠깐동안 스핀시킨다.

13. 시료를 500rpm으로 진탕시키면서 가열 블록에서 56℃로 하룻밤 동안 항온처리한다.

14. 다음 날 아침, 튜브를 잠깐동안 스핀시키고 조직이 완전 분해되었는지 조사한다. 남은 조직이 있다면, 새로운 프로테이나제 K(20mg/ml) 2㎕를 첨가하고, 서서히 볼텍싱하여 혼합한 후, 다시 가열 블록에서 56℃, 500rpm 하에 1시간 동안 항온처리한다.

15. 가열 블록에서 70℃ x 10분간 튜브를 항온처리하고, 스핀시킨 후, 장기간 보관을 위해서 -20℃에 보관하거나, 자이모리서치(ZymoResearch)로부터 시판되는 DNA 변형 키트를 이용하여 추출된 DNA의 중아황산염 변형을 즉시 진행한다.

16. M-희석 완충액 5㎕를 조직 용해물 45㎕에 직접 첨가한다.

17. 시료를 가볍게 치거나 위아래로 피펫팅하여 혼합한다. 시료를 잠깐동안 스핀시킨다. 시료를 가열 블록에서 1100rpm 진탕 하에 37℃에서 15분 동안 항온처리한다.

15분 항온처리 동안, CT 전환 시약(제조업자의 지시에 따라)을 준비한다.

18. 상기 15분간의 항온처리 후, 준비한 CT 전환 시약(잠깐동안 스핀시킨 후) 100㎕를 각 시료에 첨가하고 가볍게 볼텍싱한다(시료가 혼탁해질 수 있다). 시료를 잠깐동안 스핀시킨다. 시료를 알루미늄 박으로 씌운 가열 블록(1100rpm 하에 진탕)에서 70℃로 3시간 동안 항온처리한다. (CT 전환 시약은 감광성이므로, 반응물이 빛에 최소한으로 노출되도록 한다).

19. 시료를 잠깐동안 스핀 다운시킨다. 시료를 얼음에서 10분 동안 항온처리한다.

20. 시료에 M-결합 완충액 400㎕를 첨가하고, 위아래로 피펫팅하여 혼합한다.

21. 모든 상청액(임의의 침전물을 포함함)을 Zymo-Spin I 컬럼 위에 로딩하고, 컬럼을 2ml 수집 관에 배치한 후, 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리한다. 관류물은 폐기한다.

22. M-세척 완충액 200㎕를 컬럼에 첨가한다.

23. 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리한다. 관류물은 폐기한다.

24. M-탈설폰화 완충액 200㎕를 컬럼에 첨가하고, 이 컬럼을 실온에서 15분 동안 방치한다.

25. 최대 속도로 15 내지 30초간 원심분리한다. 관류물은 폐기한다.

26. M-세척 완충액 200㎕를 컬럼에 첨가한다.

27. 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리한다.

28. 다시 M-세척 완충액 200㎕를 컬럼에 첨가한다.

29. 최대 속도로 30초 동안 원심분리한다(이 마지막 세척에서 더 오랜 스핀 시간은 세척 완충액 잔류물의 완전한 제거를 위해 필요하다).

30. 컬럼을 깨끗한 1.5ml 튜브에 배치한다.

31. M-용출 완충액 25㎕를 컬럼 매트릭스에 직접 첨가한다. 컬럼을 RT에서 1분 동안 방치한다. 최대 속도로 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용출시킨다.

32. 용출된 DNA를 -80℃에서 보관한다.

33. MSP 반응에 5㎕를 사용한다.

전술한 프로토콜에는 중아황산염 변형 전에 DNA 정제 키트의 사용이 없으며, 이로 인해 시료 처리 시간의 감소, 정제 동안 DNA 유실 방지, 비용 절감 및 오염 기회 감소를 얻을 수 있다.

표 6은 조직 용해물을 DNA의 중아황산염 변형에 직접 사용한 경우, Qiagen DNA 분리 키트를 사용하여 정제한 DNA와 비슷하거나 더 낮은 Ct 값을 제공한다는 것을 보여준다. 따라서, 자이모리서치 EZ DNA 메틸화 키트를 이용한 DNA 메틸화 전에 DNA의 추가 정제도 필요하지 않다. 또한, 이 데이터는 TNES/PK 분해 및 EZ DNA 메틸화 키트의 조합으로 더 많은 DNA 시료가 수득된다는 것을 보여준다.

표 7은 FFPE 생검 조직으로부터의 용해물이 후속 DNA 변형에 Qiagen DNA 분리 키트를 사용한 경우와 비교했을 때, 비슷하거나 더 우수한 결과를 나타내면서 성공적으로 사용될 수 있어, 불필요한 DNA 정제 단계 및 유실을 피할 수 있다는 것을 보여준다.

DNA 메틸화 분석은, 암 및 다양한 다른 질환의 해독 연구에 귀중한 자원을 포함하는, 보관된 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 조직, 새로 수집된 소변 및 혈액 시료와 같은 환자 시료에 사용하기 위해 개발된다. 시료 처리는 이러한 진단 분석의 주요 전처리 부분이다. 통상적으로, DNA를 이러한 시료 형태에서 표준 페놀-클로로포름 추출 또는 컬럼 기반 절차를 사용하여 정제한 후, 중아황산염 변형 절차로 처리한다. 파라핀 포매된 보존된 조직 및 체액으로부터 DNA를 정제하기 위한 다수의 키트가 시판된다. 하지만, 이러한 광범위한 정제 절차 동안의 유실은 특히 이용할 수 있는 출발 조직 또는 체액 시료 종류가 극소량인 경우에는 DNA 수율을 상당히 저하시킬 수 있다. 낮은 DNA 수율은 후처리 분석 성능에 상당한 영향을 미칠 수 있고, 시간 소모적일 수도 있다. DNA 유실을 피하기 위해 몇몇 연구에서는, 분해된 조직 용해물을 표준 용액내 중아황산염 변형 프로토콜을 이용한 게놈 DNA의 중아황산염 변형에 직접 사용했다. 본 발명에서 개발된 프로토콜(TNES 프로토콜이라고도 지칭함)은 소변 침전물로부터의 단백질제거되고 용해된 조직 추출물 또는 용해된 세포를 사용하고, 이것을 임의의 추가 정제 단계없이 후처리 중아황산염 변형을 위한 자이모리서치 EZ와 같은 시판되는 DNA 메틸화 키트와 함께 직접 사용하여, 게놈 DNA를 신속하고 효율적으로 추출하고 중아황산염 변형시킨다. 또한, 본 발명은 추가 정제 단계 동안의 유실을 최소화하여 다중 PCR 분석 성능을 향상시킨다.

실시예 6

소변으로부터의 DNA 시료의 처리

A. 소변 시료로부터 DNA를 추출하기 위한 프로토콜(TNES 프로토콜)

1. 수집 후, 소변은 처리 전까지 4℃에서 유지되어야 한다.

2. 소변을 표지된 50ml Falcon 폴리프로필렌 튜브에 넣고, 전립선 암 환자의 탈락된 종양 세포를 나타내는 LNCap 세포(10,000개 세포/50ml)를 튜브마다 첨가한다. 그 다음, 세포와 미립자를 3,000 x g, 4℃에서 원심분리하여 펠릿화한다.

3. 원심분리 후, 소변 상청액을 멸균 표지된 50ml 튜브에 조심스럽게 따라 넣고, 펠릿 세척을 2 단계로 수행한다.

4. 1차 세척을 위해, 펠릿을 원래의 50ml 튜브에서 냉 PBS 40ml로 4℃에서 세척하고, 여러번 튜브를 서서히 뒤집어 펠릿을 재현탁한 후, 3,000 x g에서 원심분리한다. PBS 세척물을 세장형 유리 또는 플라스틱 튜브에 부착된 진공을 이용하여 흡인하여(연장된 Pasteur 피펫 또는 긴 플라스틱 팁), 세척물을 가능한 한 많이 제거하고 튜브의 큰 면적에 걸친 펠릿의 제거를 방지한다(세척물 폐기).

5. 2차 세척을 위해, 펠릿을 더 소량인 1ml의 냉 PBS 중에 Pipetman을 이용하여 서서히 위아래로 피펫팅하여 재현탁시킨다. 펠릿이 현탁되면, 50ml 튜브에서 1.5ml 마이크로원심분리관으로 옮긴다. 다시 0.4ml PBS로 팁과 50ml 튜브를 헹구어 가능한 한 많은 펠릿을 회수하고 1.5ml 튜브 중의 1ml와 합한다.

6. 10,000 x g로 5분간 원심분리하고 세척물을 연장된 피펫/플라스틱 팁을 이용한 진공 흡인으로 제거한다. 가능한 한 많은 액체를 제거하기 위해 튜브를 약간 기울여 사용한다(세척물 폐기). 이어서, 세척된 소변 펠릿을 함유하는 튜브를 정화된 소변의 50ml 튜브와 동일한 박스에 넣고, 운반 시까지 -20℃에서 보관한다.

7. 세척된 펠릿 약 100㎕에 TNES 용해 완충액(10mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.5% SDS)을 첨가하고, 56℃에서 30분간 항온처리한 후, 중아황산염 변형 키트로 처리할 때까지 -20℃에서 보관한다(이하, 파트 II 참조). 세포만 존재하는 경우에는 TNES 완충액 20㎕를 세포 현탁액 20㎕에 첨가했다.

II. 자이모리서치의 EZ-DNA 메틸화 키트를 이용한 게놈 DNA의 중아황산나트륨 변형

DNA의 중아황산염 변형을 수행하기 위해 자이모리서치(Orange, CA)로부터 EZ DNA 메틸화 키트를 공급받았다. 제조업자의 권장사항에 따라, 변형시킬 DNA 시료를 50℃에서 12 내지 16시간 동안 중아황산염 전환 시약과 함께 항온처리한다. 여기서, 이러한 조건은 훨씬 더 짧은 시간 내에 비슷한 품질의 중아황산염 전환된 DNA를 생성시키기 위해 조정되었다. 여러 온도 및 상이한 시간을 시험한 결과, 70℃에서 1 내지 3시간 동안의 중아황산염 전환 시약과 DNA 시료의 항온처리가 키트에서 권장된 변형 조건과 비슷한 중아황산염 변형 효과를 제공하는 것으로 입증되었다.

프로토콜은 소변 시료를 처리하기 위한 다음과 같은 프로토콜이다:

M-세척 완충액(키트를 사용하여 시작 전에 준비한다)

M-세척 완충액의 제조: M-세척 완충액 농축물에 24ml 무수에탄올을 첨가하여 D5001을 위한 최종 M-세척 완충액을 제조한다(D5002의 경우에는 96ml 에탄올을 사용한다).

1. DNA 변형 절차

a. 소변 용해물 45㎕에 M-희석 완충액 5㎕를 직접 첨가하거나, 시료가 더 많은 경우에는 M-희석 완충액 및 소변 조 용해물을 비례하게 증량시킨다. 예를 들어, 소변 용해물 150㎕에는 M-희석 완충액 20㎕와 물 30㎕를 첨가한다(총 200㎕).

b. 시료를 가볍게 치거나 또는 위아래로 피펫팅하여 혼합한다. 시료를 잠깐동안 스핀시킨다. 시료를 가열 블록에서 1100rpm의 진탕 하에 37℃에서 15분 동안 항온처리한다. 15분간 항온처리하는 동안, CT 전환 시약(제조업자의 지시에 따라)을 준비한다.

c. 상기 15분간의 항온처리 후에, 준비한 CT 전환 시약(잠깐동안 스핀시킨 후) 100㎕를 각 시료에 첨가하고(또는 증량된 프로토콜에서는 400㎕ CT 시약을 첨가한다) 가볍게 볼텍싱한다(시료가 혼탁해질 수 있다). 시료를 잠깐동안 스핀시킨다. 시료를 알루미늄 박으로 덮인 가열 블록(1100rpm으로 진탕)으로 70℃에서 3시간 항온처리한다(CT 전환 시약은 감광성이므로, 반응물이 빛에 최소한으로 노출되도록 한다).

2. 탈염

a. 시료를 잠깐동안 스핀다운시킨다. 시료를 얼음에서 10분 동안 항온처리한다. 더 많은 양의 소변 시료를 사용하는 경우에는, 각각 300㎕씩 2개의 튜브에 분취한다.

b. 시료에 M-결합 완충액 400㎕를 첨가하고, 위아래로 피펫팅하여 혼합하거나, 증량된 소변 시료의 경우에는 M-결합 완충액 800㎕를 각 분취량에 첨가하고 혼합한 후 신속하게 스핀시킨다.

c. 상청액(임의의 침전물 포함함)을 모두 Zymo-Spin I 컬럼에 로딩하고 컬럼을 2ml 수집관에 배치한 후, 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리한다. 관류물은 폐기한다. 더 많은 양의 시료의 경우에는, 각 분취된 튜브로부터의 상청액을 한번에 하나씩 칼럼에 가하고 모든 시료가 칼럼에 로딩될 때까지 원심분리하여 이 단계를 반복한다.

d. M-세척 완충액 200㎕를 컬럼에 첨가한다.

e. 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리한다. 관류물은 폐기한다.

3. 탈설폰화, 2차 탈염 및 용출

a. M-탈설폰화 완충액 200㎕를 컬럼에 첨가하고, 이 컬럼을 실온에서 15분 동안 방치한다.

b. 최대 속도로 15 내지 30초간 원심분리한다. 관류물은 폐기한다.

c. M-세척 완충액 200㎕를 컬럼에 첨가한다.

d. 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리한다.

e. 다시 M-세척 완충액 200㎕를 컬럼에 첨가한다.

f. 최대 속도로 30초 동안 원심분리한다(이 마지막 세척에서 더 오랜 스핀 시간은 세척 완충액 잔류물의 완전한 제거를 위해 필요하다). 관류물은 폐기한다.

g. 컬럼을 깨끗한 1.5ml 튜브에 배치한다.

h. M-용출 완충액 25㎕를 컬럼 매트릭스에 직접 첨가한다. 컬럼을 RT에서 1분 동안 방치한다. 최대 속도로 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용출시킨다.

i. 용출된 DNA를 -80℃에서 보관한다.

j. MSP 반응에 5㎕를 사용한다.

결과:

전술한 프로토콜에는 중아황산염 변형 전에 DNA 정제 키트의 사용이 없으며, 이로 인해 시료 처리 시간의 감소, 정제 동안 DNA 유실 방지, 비용 절감 및 오염 기회 감소를 얻을 수 있다.

표 8은 소변 50ml로부터 TNES 프로토콜에 의해 처리된 DNA 시료를 이용하여 Cepheid Smart Cycler 상에서 실시한 MSP 분석의 최종 결과를 제시한 것이다. 전술한 TNES/PK 분해 프로토콜의 사용시에는, 시판되는 Qiagen DNA 분리 키트(QiAmp Viral RNA 키트)를 이용하여 정제된 DNA를 사용한 경우보다 더 우수한 β-액틴 및 GSTP1 Ct 값(최대 3 Ct 더 낮은 값)이 관찰되었다. 따라서, 이 방법을 이용하면 DNA 변형 전에 추가 DNA 정제가 필요하지 않다. 또한, 데이터는 TNES/PK 분해 및 EZ DNA 메틸화 키트의 조합으로 더 많은 DNA 시료가 수득된다는 것을 보여준다.

TNES 추출 프로토콜을 사용하여 얻은 결과는 LNCaP 전립선 세포의 연속 희석물에 대해서는 더욱 설득력이 있다(건강한 공여자들로부터 수집된 소변 50ml당 10,000 내지 100개가 혼입됨). DNA 추출 후 바로 중아황산염 변형을 실시하는 조합 프로토콜은 전립선 메틸화 분석의 감도를 2개의 시판되는 키트를 조합한 경우와 비교하여 10배 더 향상시켰다. TNES 프로토콜은 50ml의 소변당 세포 100개를 검출할 수 있으며, 이러한 수준은 Ct 값과 카피수 분석을 이용하는 Qiagen 프로토콜에 의해서는 검출될 수 없는 수준이다.

이상의 본 발명은 명료한 이해를 위해 예시와 실시예로서 다소 상세하게 설명했지만, 상세한 설명과 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안 된다.

참고문헌

Claims (38)

1. 시료로부터 사전 추출 없이 거대분자를 변형시키는 방법으로서,

   a. 상기 시료 내의 거대분자를 화학물질을 이용하여 전환시키는 단계,

   b. 경우에 따라, 화학적 중간체를 제거하거나 전환시키는 단계, 및

   c. 수득되는 변형된 거대분자를 정제하는 단계

   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 거대분자가 DNA, RNA, 세포 대사산물, 지질, 탄수화물 및 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 거대분자가 DNA이고, 바이러스 DNA, 핵 DNA, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 세균 DNA 및 합성 DNA 중에서 선택되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 거대분자가 RNA이고, rtRNA, tRNA, miRNA, rRNA 및 mRNA 중에서 선택되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 거대분자가 세포 대사 산물이고, 대사 사이클 또는 효소 효과에 의해 생산된 것 중에서 선택되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 거대분자가 지질이고, 리포좀, 세포막 지질, 세포내 막 지질 및 세포외 지질 중에서 선택되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 거대분자가 탄수화물이고, 단백질-결합된 탄수화물 및 핵산-결합된 탄수화물 중에서 선택되는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 거대분자가 단백질이고, 세포내 단백질 및 세포외 단백질 중에서 선택되는 것인 방법.
9. 제3항에 있어서, 변형이 중아황산염 변형 및 비오티닐화 중에서 선택되는 것인 방법.
10. 제4항에 있어서, 변형이 플루오르화 및 메틸화 중에서 선택되는 것인 방법.
11. 제6항에 있어서, 변형이 가열, 리포좀 형성, 마이셀(micelle) 형성, 단일층 형성 및 이중층 형성 중에서 선택되는 것인 방법.
12. 제7항에 있어서, 변형이 산화, 탈산화, 아미노화 및 탈아미노화 중에서 선택되는 것인 방법.
13. 제8항에 있어서, 변형이 인산화, 탈인산화, 메틸화, 비오티닐화, 아미노화, 탈아미노화, 글리코실화 및 탈글리코실화 중에서 선택되는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 시료가 조직, 체액, 생검 시료 및 보존된 조직 중에서 선택되는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 시료가 조직이고, 전체 기관, 절제된 기관, 상피, 신경, 위장관, 근육, 심장, 점막 및 내피 중에서 선택되는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 시료가 체액이고, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 유리체 및 혈청 중에서 선택되는 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 시료가 생검 시료이고, 미세 바늘 흡인물, 조직 절편 및 피부 시료 중에서 선택되는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 시료가 보존된 조직이고, 신선 동결 조직, 파라핀 포매 조직 및 보존 시약에 보존된 조직 중에서 선택되는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 보존 시약이 포르말린, 알엔에이레이터(RNAlater)® 및 디메틸설폭사이드 중에서 선택되는 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, 정제가 입자 기반 정제, 침전, 원심분리, 전기영동 및 전하 교환 중에서 선택되는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 정제가 입자 기반 정제이고, 친화성 입자, 분립(sizing) 입자 및 자성 입자 중에서 선택되는 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 분립 입자가 실리카계 입자 및 규조토 중에서 선택되는 것인 방법.
23. 제20항에 있어서, 전기영동 분리가 크기 및/또는 전하에 의한 것인 방법.
24. 제20항에 있어서, 전기영동 분리가 저분자량 중합체로 형성된 겔 및/또는 모세관에 의한 것인 방법.
25. DNA를 추출 및 변형시키는 방법으로서,

    a. DNA를 함유하는 시료를 수득하는 단계;

    b. 상기 시료와 일정량의 중아황산염을, 상기 DNA 내의 비메틸화된 사이토신 잔기의 충분한 양이 우라실 잔기로 전환되기에 충분한 시간과 조건 하에 항온처리하는 단계;

    c. 상기 시료 중의 DNA를 컬럼에 공급하는 단계;

    d. 결합된 DNA를 세척하여 오염물을 제거하는 단계;

    e. 컬럼에 결합된 DNA와 탈설폰화 시약을, 탈설폰화가 일어나기에 충분한 시간과 조건 하에 항온처리하는 단계;

    f. 결합된 DNA를 세척하여 탈설폰화 시약을 제거하는 단계; 및

    g. 중아황산염에 의해 변형된 DNA를 컬럼으로부터 용출시키는 단계

    를 포함하는 방법.
26. 제25항에 있어서, DNA를

    a. 세포 시료를 수득하는 단계; 및

    b. 세포 시료를 용해시켜 용해물을 수득하는 단계

    를 포함하는 방법에 의해 수득하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 용해물이 약 0.01 내지 30㎍인 방법.
28. 제27항에 있어서, 용해물을 제25항의 단계 b의 컬럼에 직접 공급하는 방법.
29. 제25항에 있어서, 용해물을 프로테이나제 및/또는 고농도의 염 및/또는 세제와의 항온처리, 초음파처리, 동결-해동 처리 또는 기계적 파괴에 의해 수득하는 방법.
30. 제25항에 있어서, 중아황산염이 중아황산나트륨 또는 메타중아황산염인 방법.
31. 제25항에 있어서, 단계 b의 항온처리 조건은 열순환(thermocycling)을 수행하거나 수행하지 않고 50 내지 95℃에서 약 1 내지 16시간인 방법.
32. 제25항에 있어서, 탈설폰화를 pH 변화에 의해 수행하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 탈설폰화를 염기성 조건 하에 수행하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 조건이 수산화나트륨 및 알콜을 포함하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 알콜이 이소프로판올 또는 에탄올인 방법.
36. 제35항에 있어서, 탈설폰화를 약 0℃ 내지 약 50℃에서 약 0 내지 30분간 수행하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 탈설폰화를 약 15분간 수행하는 방법.
38. 제36항에 있어서, 탈설폰화를 실온에서 수행하는 방법.

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