MX2009000122A - Un metodo para la modificacion de una macromolecula sin extraccion previa de una muestra. - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye un método para la modificación de una macromolécula sin extracción previa desde una muestra al convertir la macromolécula en la muestra con un químico, removiendo o convirtiendo los intermedios químicos, si es necesario; y la purificación de la macromolécula modificada resultante.

Description

UN METODO PARA LA MODIFICACION DE UNA MACROMOLECULA SIN EXTRACCION PREVIA DE UNA MUESTRA ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente invención incluye un método para la modificación de una macromolécula sin extracción previa desde una muestra al convertir la macromolécula en la muestra con un químico, removiendo o convirtiendo los intermedios químicos, si es necesario; y la purificación de la macromolécula modificada resultante. Un método usado por los vertebrados y plantas superiores para la regulación de expresión génica es la metilación de citosinas encontradas en islas CpG localizadas en regiones promotoras de varios genes. Con el fin de estudiar este método de regulación génica, técnicas se desarrollan para discriminar citosinas metiladas de citosinas no metiladas. Un método es tratar químicamente ADN de tal manera que las citosinas se convierten a uracilos mientras que las 5-metil-citosinas no se convierten significativamente. Frommer et al. (1992). Una investigación sistemática en los parámetros críticos del procedimiento de modificación también se ha realizado. Grunau et al. (2001 ). El ADN tratado se puede usar como plantilla para metilación de PCR específica (MSP). La metilación de ADN y métodos relacionados a esta se discuten por ejemplo en los números de publicación de patente de E.U.A. 20020197639, 20030022215, 20030032026, 20030082600, 20030087258, 20030096289, 20030129620, 20030148290, 20030157510, 20030170684, 20030215842, 20030224040, 20030232351 , 20040023279, 20040038245, 20040048275, 20040072197, 20040086944, 20040101843, 200401 1 5663, 20040132048, 20040137474, 20040146866, 20040146868, 20040152080, 20040171118, 20040203048, 20040241704, 20040248090, 20040248120, 20040265814, 20050009059, 20050019762, 20050026183, 20050053937, 20050064428, 20050069879, 20050079527, 20050089870, 20050130172, 20050153296, 20050196792, 20050208491 , 20050208538, 20050214812, 20050233340, 20050239101 , 20050260630, 20050266458, 20050287553 y números de patente de E.U.A. 5786146, 6214556, 6251594, 6331393 y 6335165. Los equipos de modificación de ADN son comercialmente disponibles, convierten ADN genómico purificado con citosinas no metiladas en citosinas no metiladas que carecen de genómico pero con uracilos adicionales. El tratamiento es un proceso químico de dos etapas que consta de una reacción de desaminacion facilitada por bisulfito y una etapa de desulfonación facilitada por hidróxido de sodio. Normalmente la reacción de desaminacion se realiza como un líquido y se termina por medio de incubación en hielo seguido por adición de regulador de pH de unión de columna. Después de la unión y lavado de fase sólida, el ADN se eluye y la reacción de desulfonación se realiza en un líquido. La adición de etanol termina la reacción y el ADN modificado se limpia por medio de precipitación. Sin embargo, ambos equipos comercialmente disponibles (Zymo y Chemicon) realizan la reacción de desulfonación mientras el ADN se une en la columna y el lavado de la columna termina la reacción. El ADN tratado se eluye de la columna lista para el ensayo de MSP. La modificación es tediosa y tiene muchas etapas que causan pérdida de rendimiento e incremento del error del operador. Todos los procedimientos de modificación disponibles inician con ADN genómico purificado, que es un procedimiento tedioso que también tiene muchas etapas que causan pérdida de rendimiento e incremento del error del operador.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención incluye un método de modificación de una macromolécula sin extracción anterior desde una muestra al convertir la macromolécula en la muestra con un químico, removiendo o convirtiendo intermedios químicos, si es necesario; y purificando la macromolécula modificada resultante.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra que la modificación de ADN sin aislamiento de una muestra biológica es equivalente a dicha modificación después del aislamiento.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención incluye un método para la modificación de una macromolécula sin la extracción anterior de una muestra al convertir la macromolécula en la muestra con un químico, removiendo o convirtiendo intermedios químicos, si es necesario; y purificando la macromolécula modificada resultante. Las macromoléculas pueden ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, ADN, ARN, metabolitos celulares, lipidos, carbohidratos y proteínas. El ADN puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, viral, nucleico, mitocondrial, plástido, bacteriano y sintético. El ARN puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, ARNrt, ARNt, ARNmi, ARNr y ARNm. El metabolito celular puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, aquellos producidos por medio de un ciclo metabólico o efectos enzimáticos. El lípido puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, liposomas, lipidos de membrana celular, lipidos de membrana intracelular y lipidos extracelulares. El carbohidrato puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, carbohidratos de proteína unida y carbohidratos de ácido nucleico unido. La proteína puede ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, intracelular y extracelular. La modificación puede ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo bisulfito y biotinilación de ADN o ARN, fluoración y metilación de ARN, calentamiento, formación de liposoma, formación de micela, formación uni-capa y formación bi-capa de lípidos, oxidación, desoxidación, aminación y desaminación de carbohidratos y fosforilación, defosforilación, metilación, biotinilación, aminación, desaminación, glicosilación y deglicosilación de proteínas. 20070148670; Chuang et al. (2007); Emmerechts et al. (2007); Frommer et al. (1992); Grunau et al. (2001 ); Hurd et al. (2007); Jin et al. (2007); Oakeley (1999); Rathi et al. (2003); Rein et al. (1998); Sambrook et al. (2000); Wu et al. (2007). La muestra puede ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, tejido, fluido corporal, una muestra de biopsia, y tejido conservado. El tejido puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, órganos completos, órganos disecados, epitelio, neural, gastrointestinal, músculo, cardiaco, mucosal y endotelio. El fluido corporal puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, sangre entera, plasma, orina, saliva, vitreo y suero. La muestra de biopsia puede ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, aspirado de aguja fino, sección de tejido y muestra de piel. El tejido conservado puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, congelado fresco, fijado con parafina y conservado en un reactivo de conservación. El reactivo de conservación puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, formalina, RNAIater® y sulfóxido de dimetilo. La purificación puede ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, con base en partículas, precipitación, centrifugación, electroforética y cambio de carga. La purificación basada en partículas puede ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, afinidad, dimensionado y magnética. El dimensionado de partículas puede ser cualquiera conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, a base de sílice y tierras diatomáceas. La purificación de separación electroforética puede ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, por tamaño y/o carga. La purificación de separación electroforética puede ser cualquiera conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, por medio de un gel formado de polímeros de peso molecular bajo y/o capilar. La presente invención provee un método rápido y eficiente para obtener ADN modificado con bisulfito. El método descrito aquí elimina efectivamente etapas numerosas de los métodos previos reduciendo de este modo posibles errores mientras producen resultados superiores. Además ahorros de tiempo considerables de cuatro a cinco horas también se obtienen. La presente invención provee un método para la extracción y modificación de ADN al obtener una muestra de ADN; incubando la muestra con una cantidad de un bisulfito y durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para convertir al menos noventa y cinco por ciento de los residuos de citosina no metilados en el ADN a residuos de uracilo; la unión del ADN en la muestra a una columna; lavando el ADN unido para remover contaminantes; incubando el ADN unido a la columna con un reactivo de desuifonacion durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se presente la desulfonación; lavando el ADN unido para remover el reactivo de desulfonación; y eluyendo el ADN modificado con bisulfito de la columna. El ADN puede estar a una concentración de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 µ9 y se puede obtener por medio de cualquier método conocido en la técnica y puede ser ADN purificado o ADN obtenido directamente de un lisado celular. Por ejemplo, el lisado celular se puede formar de cualquier tejido adecuado por medio de cualquier método conocido en la técnica y directamente tratado con un reactivo bisulfito. Lisis celular puede ser mediante, por ejemplo, proteinasa y/o concentración alta de sal y/o detergente, sonicación, tratamiento de congelación-descongelación o disolución mecánica. Cualquier muestra celular es adecuada para usarse aquí y se puede obtener de tejido, fluido corporal, muestra de biopsia o tejido conservado. El reactivo bisulfito puede ser cualquiera conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, bisulfito de sodio o bisulfito meta. Otros reactivos se discuten, por ejemplo, en las publicaciones de patente de E.U.A. 20050089898, 20050095623 y 20050153308. Las condiciones de incubación de la etapa b son aproximadamente 1-16 horas a 50-95°C con o sin termociclación. La termociclación puede ser, por ejemplo, 3 horas a 70°C, 1 hora a 90°C o ciclación entre 50°C y 95°C. La columna puede ser cualquiera conocida en la técnica, preferiblemente, es basada en sílice o de tierras diatomáceas. La desulfonación puede ser cualquier método conocido en la técnica y preferiblemente se realiza con hidróxido de sodio y un alcohol. Preferiblemente, el alcohol es isopropanol o etanol. Más preferiblemente, cuando la columna es basada en sílice, el alcohol es etanol y cuando la columna es de tierras diatomáceas, el alcohol es isopropanol. La desulfonación preferiblemente ocurre de aproximadamente 0-30, preferiblemente aproximadamente 5-15 y más preferiblemente aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 0°C a aproximadamente 50°C. Preferiblemente, la temperatura es aproximadamente la temperatura ambiente. La macromolécula modificada se puede eluir por medio de cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación con agua o un regulador de pH adecuado. Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar, pero sin limitación, la invención reclamada. Todas las referencias citadas aquí se incorporan por la presente para referencia.

EJEMPLO 1 Modificación rápida de bisulfito de ADN a partir de un lisado celular obtenido de tejido fijado con parafina congelado fresco El tubo de microcentrífuga que contiene pella de cultivo celular en PBS • Se agregan 100 µ? de regulador de pH de extracción de ADN (NaCI 75 mM, EDTA 25 mM, y Tween 20 0.5%), y se incuba a 56°C durante 10 minutos. • Se procede con la adición de NaOH 3M descrita posteriormente o un tubo de microcentrífuga que contiene (hasta) 5 cortes de bloque FFPE de 10 mieras. Los cortes de FFPE requieren desparafinación: • Se agrega 1 mi de xileno al tubo y se mezcla mediante inversión varias veces · Se incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y se centrifuga a velocidad máxima durante 5 minutos a temperatura ambiente • Se remueve el sobrenadante sin remover alguna pella • Se repite la extracción de xileno 1 mi • Se agrega 1 mi de EtOH (100%) a la pella y se mezcla suavemente mediante inversión • Se centrifuga a velocidad máxima durante 5 minutos a temperatura ambiente • Se remueve cuidadosamente el EtOH al pipetear sin remover algunas de las pellas · Se repite el lavado con EtOH • Se seca la pella en un bloque de calentamiento a 37°C con los tubos de microcentrífuga abiertos a procedimiento de extracción/modificación para muestras FFPE • Se agregan 90 µ? de regulador de pH de extracción (Tris 0 mM, pH 8.0, NaCI 150 mM, EDTA 2 mM, y SDS 0.5%) y 10 µ? de proteinasa K y se incuba durante la noche a 56°C • Después de la incubación el extracto debe ser claro, si no se agregan 10 µ de proteinasa K y se incuba durante 1 hora • Se repite hasta que la lisis esté clara y se procede con adición de NaOH 3M descrita posteriormente. • Se agrega 1/10 volumen de NaOH 3M y se incuba a 56°C durante 10 minutos. « Se agregan 2 volúmenes de una solución saturada de bisulfito de sodio pH 5.0 con hidroquinona 10 mM, se incuba a 70°C durante 3 horas en la oscuridad. • Se interrumpe la reacción al incubar en hielo durante 10 minutos. Se agregan 0.5 volúmenes de ispopropanol y se agita hasta tener vórtice suavemente o se pipetea hacia arriba y hacia abajo. • Se agrega la muestra a una columna de purificación de ADN Qiagen (equipo de purificación de ADN QiaAmp), giro 1 minuto y se vacia el tubo de evacuación. • Se agregan 500 µ? de regulador de pH de lavado AW1 , giro 1 minuto y se vacía el tubo de evacuación; • Se agregan 500 µ? de regulador de pH de lavado AW2, giro 1 minuto y se vacía el tubo de evacuación; • Se agregan 200 µ? de regulador de pH de desulfonación (NaOH 300 mM, isopropanol 80%), se incuban 10 minutos a temperatura ambiente, giro 1 minuto y se vacía el tubo de evacuación; • Se agregan 500 µ? de regulador de pH de lavado AW2, giro 1 minuto, se vacía el tubo de evacuación y se gira 1 minuto, « Se agregan 500 µ? de regulador de pH de lavado AW2, giro 1 minuto y se vacía el tubo de evacuación y se gira 1 minuto, • Se eluye con 50 µ? de TE, giro 1 minuto en un nuevo tubo de microcentrífuga 1.5 mi y se almacena a -20°C. La eficiencia del procedimiento se analiza usando PCR cuantitativo y ß-Actina usando GSTP1 como marcadores. El promotor ß-Actina no es metilado y el marcador se diseña para servir como un control para el procedimiento de modificación. El valor Ct producido por este marcador es reflejo del número de equivalentes de genoma agregados al ensayo. Mientras el promotor GSTP1 sea metilado de manera epigenética y pueda ser el reflejo de un estado canceroso. Por lo tanto el valor Ct del marcador GHSTP1 es más variable y usualmente mayor que el valor Ct ß-Actina. Los bloques de FFPE de próstata se obtienen de Asterand. El tratamiento "Zymo" se refiere a un equipo de modificación de ADN comercialmente disponible vendido como Equipo de Metilación EZ-ADN de Zymo Research. Un procedimiento de 2 etapas se refiere a dos procedimientos separados que usan un equipo de purificación de ADN (equipo de purificación de mini DBNA QiaAmp Qiagen) y un equipo de modificación de ADN tal como el equipo Zymo. El procedimiento de 1 etapa Zymo es idéntico al procedimiento ID hasta la etapa NaOH 3M donde el procedimiento de modificación de ADN Zymo es seguido al reemplazar el NaOH 3M con regulador de pH M-dilución. Los resultados mostrados en el cuadro 1 que usan pellas de cultivo celular indican que el método de 1 etapa produce valores Ct más bajos y de este modo resultados superiores cuando se compara con el procedimiento de 2 etapas Qiagen/Zymo. Estadísticamente, una prueba T pareada indica que los métodos, usando el marcador ß-Actina, son diferentes significativamente uno de otro con un valor P de 0.00006 mientras el marcador GSTP1 tiene un valor P de 0.0001. Los resultados mostrados en el cuadro 2 indican que la etapa 1 ID produce valores Ct más bajos cuando se compara con el método de 1 etapa Zymo con el marcador ß-Actina produce un valor P de 0.02 y el marcador GSTP1 resulta en un valor P de 0.003. Sin embargo, los resultados mostrados en el cuadro 1 que usan bloques de FFPE de próstata indican los resultados opuestos de los cultivos celulares con el procedimiento de 2 etapas Zymo que produce valores Ct más bajos que el método de 1 etapa. Los resultados del marcador ß-Actina indican que los métodos son significativamente diferentes con un valor P de 0.021 mientras los resultados GSTP1 sugieren que pueden ser diferentes con un valor P de 0.054. Los resultados diferentes sugieren que el regulador de pH de extracción para el cultivo celular puede no ser suficiente para los bloques de tejido de lisis. Los resultados del cuadro 4 comparan los métodos de 1 etapa ID y de 1 etapa Zymo usando un regulador de pH de extracción más agresivo que intercambia el Tween a SDS mientras se usan bloques de tejido de próstata. El método de 1 etapa ID una vez más muestra resultados superiores que sugieren que la falla para producir resultados superiores en el cuadro 3 se debe al regulador de pH de extracción. Los resultados del marcador ß-Actina indican que los métodos son diferentes significativamente con un valor P de 0.0008 mientras los resultados GSTP1 sugieren que pueden ser diferentes con un valor P de 0.056. Ya que el método de ensayo QPCR solo tiene 40 ciclos, una vez que un ensayo falla para producir Ct entonces no es significante para comparar con los ensayos que producen Ct. Si las dos muestras que tienen ensayos que fallan entonces los valores P pueden ser 0.0025, que indica que los métodos que usan el marcador GSTP1 son significativamente diferentes.

CUADRO 1 Resultados que comparan el procedimiento de 1 etapa con el procedimiento de 2 etapas Qiagen/Zymo (Zymo) Cultivo celular LnCAP 1x10? pellas celulares, 2 pellas analizadas por duplicado Tratamiento Procedimiento Marcador Ct SD Valor P ID 1 etapa ß-Actina 26.94 0.24 Zymo 2 etapas ß-Actina 27.80 0.29 0.00006 ID 1 etapa GSTP1 27.66 0.20 Zymo 2 etapas GSTP1 28.54 0.23 0.0001 CUADRO 2 Resultados que comparan el procedimiento de 1 etapa con el procedimiento de 1 etapa Zymo CUADRO 3 Resultados que comparan el procedimiento de 1 etapa con el procedimiento de 2 etapas Qiaqen/Zymo (Zymo) Bloques FFPE de próstata usando el regulador de pH de extracción de cultivo celular Tratamiento Bloque Procedimien Ct ß-Actina SD Ct SD de to promedio GSTP1 tejido prom. ID 1 1 etapa 30.68 0.08 32.64 0.27 ID 2 1 etapa 33.84 0.22 37.20 0.33 ID 3 1 etapa 31.26 0.04 35.19 0.16 ID 4 1 etapa 34.21 0.03 38.57 0.08 Zymo 1 2 etapas 29.68 0.19 33.40 0.07 Zymo 2 2 etapas 28.72 0.04 32.87 0.19 Zymo 3 2 etapas 27.69 0.01 32.11 0.22 Zymo 4 2 etapas 27.62 0.04 33.65 0.25 Valor P 0.021 00.054 CUADRO 4 Resultados que comparan el procedimiento de 1 etapa con el procedimiento de 1 etapa Zymo usando bloques FFPE de próstata Bloques de FFPE de próstata usando el regulador de pH de extracción FFPE EJEMPLO 2 Tratamiento con bisulfito de ADN obtenido de la orina El propósito de este experimento es comparar el equipo DEM versus el equipo de modificación Zymo EZ en ADN purificado obtenido de células LnCAP y orina. Diez muestras aleatorias normalizadas se dividen entre los dos equipos • 5 Muestras por equipo (DEM y Zymo) • PCR se realiza por duplicado usando Taq de Inicio Rápido (GSTP1 , ß-Actina, y APC) Análisis ANOVA indica un valor P de 0.663 y una prueba T pareada indica que no hay diferencia estadística entre DEM y Zymo para GSTP1 .

Análisis ANOVA indica un valor P de 0.008 y una prueba T pareada indica que hay diferencia estadística entre DEM y Zymo para B- Actina.

• Los resultados indican que Zymo y el equipo DEM son equivalentes para GSTP1 • El equipo DEM se optimiza para el tejido como opuesto a la optimización adicional de ADN purificado dentro de ProMU puede llevar a valores CT más bajos.

• El equipo DEM demuestra un valor más alto de ß-Actina ß Actina GSTP1 ANOVA de una vía P=0.000 ANOVA de una vía P=0.663 DEM (CT media) 34.990 DEM (CT media) 31 .30 STDEV DEM 1 .341 STDEV DEM 0.839 Zymo (CT media) 33.270 Zymo (CT media) 31.140 Zymo STDEV 1.240 Zymo STDEV 0.773 La unión de lisado crudo que contiene ADN o ADN genómico purificado está unido singularmente a la columna basada en gel de sílice utilizando la concentración alta de sal que está presente de la conversión de bisulfito. Se añade etanol a la muestra antes de la unión solamente para disolver el reactivo de conversión. · Se agrega 1/10 volumen de regulador de pH M-dilución y se incuba a 70°C durante 20 minutos para desnaturalizar químicamente el ADN de doble cadena • Se agregan 2 volúmenes de reactivo de conversión CT (Zymo), se incuba a 70°C durante 3 horas en la oscuridad. • Se agregan 0.5 volúmenes de etanol (100%) y se agita hasta tener vórtice suavemente o se agrega con pipeta hacia arriba y hacia abajo. El tubo de microcentrífuga que contiene ADN purificado de orina en un volumen de inicio de 45 µ? • Se procede con adición de regulador de pH M-dilución como se describe abajo • O un tubo de microcentrífuga que contiene (hasta) 5 cortes de bloque FFPE de 10 mieras de una pella de cultivo celular fijada con parafina y con formalina que se conoce por expresar hiper metilación GSTP1. Los cortes de FFPE requieren desparafinación: • Se agrega 1 mi de xileno al tubo y se mezcla mediante inversión varias veces • Se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos y se centrifuga a 13200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente • Se remueve el sobrenadante sin remover alguna pella • Se repite la extracción de xileno 1 mi • Se agrega 1 mi de EtOH (100%) a la pella y se mezcla suavemente mediante inversión · Se centrifuga a 13200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente • Se remueve cuidadosamente el EtOH al agregar con pipeta sin remover algunas de las pellas • Se repite el lavado con EtOH • Se seca la pella y se remueve el etanol residual en un bloque de calentamiento a 37°C con los tubos de microcentrífuga abiertos por aproximadamente 10 minutos a procedimiento de extracción/modificación para muestras FFPE • Agregar 35 µ? de regulador de pH ATL (Qiagen) y 10 µ? de proteinasa K (Qiagen) y se incuba durante la noche a 56°C • Después de la incubación, el extracto debe ser claro y homogéneo « Se procede con adición de regulador de pH M-dilución (Zymo Research) descrita posteriormente • Se agrega la muestra a una columna de purificación de ADN Qiagen (equipo de purificación de ADN Micro QiaAmp), giro 1 minuto a 3200 rpm y se vacía el tubo de evacuación; « Se agregan 500 µ? de regulador de pH de lavado AW1 , giro 1 minuto a 13200 rpm y se vacía el tubo de evacuación; • Se agregan 200 µ? de regulador de pH de desulfonación (NaOH 300 mM, etanol 90%), se incuban 20 minutos a temperatura ambiente, giro 1 minuto a 13200 rpm y se vacía el tubo de evacuación; · Se agregan 500 µ? de regulador de pH de lavado AW2, giro 1 minuto (13200 rpm), se vacía el tubo de evacuación y se gira 3 minutos (13200 rpm). • Se eluye con 20-25 µ? de regulador de pH AE, TE, o agua libre nucleasa. Se incuba la columna durante tres minutos a temperatura ambiente y se gira 1 minuto en un tubo de microcentrífuga nuevo 1.5 mi y se almacena a -20°C o -80°C.

EJEMPLO 3 Modificación de ADN a gran escala La modificación de ADN a gran escala puede ser necesaria para hacer paneles para la prueba de control de calidad de métodos PCR específicos de metilación y equipos. 1 . Se desnaturalizan 20 µg de ADN genómico 22Rv1 de línea celular de cultivo celular de próstata (ATCC) en un volumen total de 225 µ? TE, más 27.5 µ? de una solución de NaOH 3.0 M. Se incuban 10 minutos a 37°C. 2. Se agrega reactivo de conversión 2x volumen (Zymo); se incuba 3 horas a 70°C seguido por 10 minutos en hielo. Unir el ADN a un soporte de fase sólida al agregar 2 mi de regulador de pH de unión que contiene la matriz de soporte (Promega) y se agrega al aparato de vació de la columna de jeringa. Usando el vacío, se filtra la matriz. Se usa el vacío, se lava con la matriz con 1 mi de IPA 80% Se agregan 2 ml de regulador de pH de desulfonación OD (NaOH 0.3 M en IPA 80%) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Usando el vacío, se remueve el regulador de pH.

Usando el vacío, se lava con 1 mi de IPA 80%. 3. Se remueve la columna de la jeringa y se coloca en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi Elute 5 x 200 µ? seguido por la adición de 1 mi de EB El cuadro 5 representa los resultados obtenidos.

CUADRO 5 En esta línea celular el promotor GSTP1 se sabe que no es metilado por lo tanto se espera la carencia de valores Ct para este marcador.

EJEMPLO 4 Protocolo modificado para modificación con bisulfito rápida y eficiente de ADN genómico El equipo de metilación EZ ADN se proporciona por Zymo Research (Orange, CA) para realizar la modificación con bisulfito de ADN. Según la recomendación del fabricante la muestra de ADN a ser modificada se incuba con el reactivo de conversión de bisulfito a 50°C durante 12-16 horas. Estas condiciones se han modificado para generar ADN convertido con bisulfito de calidad comparable en mucho menos tiempo. Varias temperaturas en diferentes momentos se analizan y demuestran que la incubación de la muestra de ADN con reactivo de conversión de bisulfito a 70°C durante 1 -3 horas provee modificación de bisulfito eficiente comparable con las condiciones de modificación recomendadas en el equipo. Los datos posteriores muestran análisis de PCR específica de metilación con muestras de ADN incubadas con reactivo de bisulfito en diferentes temperaturas para momentos diferentes. La figura 1 muestra que el protocolo modificado Veridex de conversión a 70°C, 2 o 3 horas es equivalente a los 50°C recomendados por el fabricante durante 16 horas. Esta innovación hace que este procedimiento sea mucho más rápido.

EJEMPLO 5 Protocolo rápido y eficiente para la extracción de ADN y modificación de tejido fijado con parafina La extracción de ADN genómico y su modificación con bisulfito antes de usarse en una reacción MSP comprende procedimientos corriente arriba muy significativos que son parte de este ensayo de diagnóstico in vitro. Estos procedimientos pueden ser consumidores de tiempo que involucran muchas etapas tediosas y también pueden incrementar la oportunidad de contaminación de la muestra. Al combinar el uso de un regulador de pH de lisis, Tris 10 mM con pH 8.0, NaCI 150 mM, EDTA 2 mM, SDS 0.5% incluyendo proteinasa K y un equipo de modificación de bisulfito, un protocolo de procesamiento de muestra rápido y simple para recuperar y modificar cantidades mínimas de ADN disponible de estos tipos de muestra se han desarrollado. Las siguientes etapas se realizan: 1. Tejido de FFPE (Biopsias) (secciones 5 x 10 µ) se colocan en tubos Eppendorf. 2. Se hace girar el tubo brevemente y se agregan 500 µ? de xileno, se hace girar hasta obtener un vórtice brevemente a velocidad media. 3. Se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. (Durante la incubación al menos en 2 intervalos se mezcla la muestra por inversión varias veces). 4. Se centrífuga a velocidad máxima durante 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Se remueve el sobrenadante por decantación cuidadosa del líquido sin la pérdida de la pella. 6. Se añaden 500 µ? de etanol (100%, 200 prueba) a la pella para remover xileno residual. Se agita con vórtice brevemente a velocidad media y se deja que los tubos reposen durante 5 minutos, se mezcla mediante inversión varias veces. 7. Se centrifuga a velocidad máxima durante 10 minutos a temperatura ambiente. 8. Se remueve el etanol por decantación cuidadosa del líquido sin la pérdida de la pella. 9. Se repiten las etapas 7-10. Se debe asegurar decantar la mayor parte del líquido en esta etapa. 10. Se incuba el tubo de microcentrífuga abierto a 50-55°C durante 10-15 minutos en un horno para evaporar etanol residual. Antes de moverse para la siguiente etapa se debe asegurar que todo el etanol se haya evaporado. Si no es así se incuba más tiempo. 1 1 . Se agregan 40 µ? de regulador de pH de lisis TNES (Tris pH 8.0 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 2 mM, SDS 0.5%) y se suspende el tejido por medio de golpes al tubo. 12. Se agregan 10 µ? de proteinasa K (20 mg/ml), se agita en vórtice brevemente, se gira muy brevemente. 13. Se incuba la muestra a 56°C O/N en un bloque de calentamiento con agitación a 500 rpm. 14. La siguiente mañana se hacen giran los tubos brevemente y se verifica el tejido para la digestión completa. Si hay algo de tejido se agregan 2 µ? de proteinasa K fresca (20 mg/ml), se mezcla por medio de agitación con vórtice suave y se incuba otra hora a 56°C, 500 rpm en bloque de calentamiento. 15. Se incuban los tubos a 70°C x 10 minutos en el bloque de calentamiento, se gira y almacena a -20°C durante un largo plazo de tiempo o se procede directamente para modificación con bisulfito de ADN extraído usando equipo de modificación de ADN comercialmente disponible de Zymo Research. 16. Se agregan 5 µ? de regulador de pH M-dilución directamente a 45 µ? de lisado de tejido 17. La muestra se mezcla por golpecitos o se pipetea hacia arriba y hacia abajo. Se hace girar la muestra brevemente. Se incuba la muestra a 37°C durante 5 minutos en un bloque térmico con agitación a 1100 rpm. Durante los 15 minutos de incubación, se prepara el reactivo de conversión CT (según las instrucciones del fabricante). 18. Después de los 15 minutos de incubación anterior, se agregan 100 µ? del reactivo de conversión CT preparado (después de girar brevemente) a cada muestra y se agita con vórtice ligeramente (la muestra puede tornase turbia). Se hace girar la muestra brevemente. Se incuba la muestra a 70°C durante 3 horas con el bloque de calentamiento (se agita a 1100 rpm) se cubre con una hoja delgada de aluminio. (El reactivo de conversión CT es ligeramente sensible, de modo que se trata de minimizar la exposición de la reacción a la luz). 19. Se hace girar la muestra brevemente. Se incuba la muestra en hielo durante 10 minutos. 20. Se añaden 400 µ? de regulador de pH M-unión a la muestra y se mezcla al agregar con pipeta hacia arriba y hacia abajo. 21. Se carga todo el sobrenadante (incluyendo cualquier precipitado) sobre una columna Zymo-Spin I y se coloca la columna en un tubo de colección de 2 mi y se centrifuga a una velocidad máxima durante 15-30 segundos. Se descarta el flujo que pasó. 22. Se agregan 200 µ? de regulador de pH M-lavado a la columna. 23. Se centrifuga a velocidad máxima durante 15-30 segundos. Se descarta el flujo que pasó. 24. Se agregan 200 µ? de regulador de pH M-desulfonación a la columna y se deja que la columna repose a temperatura ambiente durante 15 minutos. 25. Se centrifuga a velocidad máxima durante 15-30 segundos. Se descarta el flujo que pasó. 26. Se agregan 200 µ? de regulador de pH M-lavado a la columna. 27. Se centrifuga a velocidad máxima durante 5-30 segundos. 28. Se agregan otros 200 µ? de regulador de pH M-lavado a la columna. 29. Se centrifuga a velocidad máxima durante 30 segundos (una duración de giro más larga para este último lavado si es necesaria para la remoción completa de residuos de regulador de pH de lavado). Se descarta el flujo que pasó. 30. Se coloca la columna en un tubo limpio de .5 mi. 31 . Se agregan 25 µ? de regulador de pH M-elución directamente a la matriz de columna. Se deja que la columna repose durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se centrifuga a velocidad máxima durante 1 minuto para eluir el ADN. 32. Se almacena el ADN eluido a -80°C. 33. Se usan 5 µ? en reacción MSP. El protocolo descrito anteriormente excluye el uso de un equipo de purificación de ADN antes de la modificación de bisulfito, con lo cual se reducen los tiempos de procesamiento de la muestra, previniendo las pérdidas de ADN durante la purificación, reduciendo costos, y reduciendo las oportunidades de contaminación. El cuadro 6 muestra que el uso del lisado de tejido directamente para la modificación de bisulfito de ADN proporciona Ct comparables y aún más bajos que el ADN purificado usando un equipo de aislamiento de ADN Qiagen. De este modo la purificación adicional de ADN no se requiere antes de la modificación de ADN usando un equipo de metilacion de ADN EZ Zymo Research. También, los datos muestran que la combinación de digestión TNES/PK y equipo de metilacion de ADN EZ produce más muestra de ADN.

CUADRO 6 Tejido FFPE Procedimiento de Ct ß-actina Ct GSTP1 extracción de ADN 2 x 5 µ secciones Equipo de aislamiento 30.1 30.9 de ADN Qiagen 2 x 5 µ secciones Digestión TNES/PK 25.4 26.7 El cuadro 7 muestra que el lisado directo de tejido de biopsia de FFPE se puede usar de manera exitosa para una modificación de ADN corriente abajo con resultados comparables o aún mejores en comparación al uso de un equipo de aislamiento de ADN Qiagen, evitando de este modo las etapas de purificación de ADN innecesarias y pérdidas.

CUADRO 7 El ensayo de metilación de ADN se desarrolla para ser usado en muestras de pacientes tal como tejidos fijados en parafina, fijados en formalina archivados, orina colectada recientemente y muestras de sangre que comprenden una fuente invaluabie para estudios de traducción de cáncer y una variedad de otras enfermedades. El procesamiento de la muestra es una parte clave corriente arriba de este ensayo de diagnóstico. Convencionalmente, el ADN se purifica a partir de estos tipos de muestra al usar extracción de fenol-cloroformo estándar o procedimientos basados en columna y entonces se somete a procedimientos de modificación con bisulfito. Varios equipos comerciales existen para la purificación de ADN a partir de tejidos archivados fijados con parafina, y fluidos corporales. Sin embargo, pérdidas durante dichos procedimientos de purificación extensivos pueden reducir de manera significativa los rendimientos de ADN cuando una cantidad muy pequeña de tejido de inicio o tipo de muestra de fluido corporal está disponible. Rendimientos de ADN bajos pueden impactar severamente el desempeño del ensayo corriente abajo y también pueden ser consumidores de tiempo. Para evitar pérdidas de ADN algunos estudios han usado lisado de tejido digerido directamente para la modificación con bisulfito de ADN genómico usando estándar en protocolos de modificación con bisulfito en solución. El protocolo desarrollado en esta invención (referido como protocolo TNES) rápidamente y eficientemente extrae y el bisulfito modifica ADN genómico al usar el extracto de tejido lisado desproteinizado o células lisadas de sedimento de orina y usa directamente esto con un equipo de metilación de ADN comercialmente disponible tal como Zymo Research EZ para la modificación con bisulfito corriente abajo sin alguna etapa de purificación adicional. Además, la presente invención mejora el desempeño de ensayo PCR múltiple al minimizar la pérdida durante etapas de purificación adicionales.

EJEMPLO 6 Procesamiento de muestras de ADN a partir de la orina A. Protocolo para la extracción de ADN a partir de muestras de orina (protocolo TNES) 1. Después de la colección, la orina se debe mantener a 4°C hasta que se procese. 2. La orina se coloca en una tubo de polipropileno Falcon de 50 mi marcado y células LNCap (10000 células/50 mi) que representan células tumorales esparcidas en un paciente con cáncer de próstata son marcadas por tubo. Entonces las células y particulados son formados en pellas mediante centrifugación a 3000 x g a 4°C. 3. Después de la centrifugación, se decanta cuidadosamente el sobrenadante de orina en un tubo de 50 mi marcado estéril y se hacen lavados de la pella en 2 etapas. 4. Para el primer lavado, la pella se lava a 4°C con 40 mi de PBS frío en el tubo original de 50 mi, se invierte suavemente el tubo varias veces para resuspender la pella, y se centrifuga a 3000 x g. Se aspira el lavado de PBS usando un vacío unido a un tubo de vidrio o de plástico estrecho largo (pipeta Pasteur alargada o punta de plástico larga) para remover tanto lavado como sea posible y prevenir el desalojo de la pella sobre una gran área del tubo (desechar lavado). 5. Para el segundo lavado, la pella se resuspende en un volumen más pequeño de 1 mi de PBS frío al pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo con un Pipetman. Una vez que la pella se suspende, entonces se transfiere del tubo de 50 mi a un tubo de microcentrífuga de 1 .5 mi. Con 0.4 mi de PBS adicionales, se enjuaga la punta y el tubo de 50 mi para recuperar tanta pella como sea posible y se combina con 1 mi original en el tubo de .5 mi. 6. Se centrífuga a 10000 x g durante 5 minutos y se remueve el lavado por medio de aspiración de vacío con una pipeta estirada/punta de plástico. Se inclina ligeramente el tubo para remover tanto líquido como sea posible (se desecha el lavado). El tubo que contiene la pella de orina lavada entonces se coloca en la misma caja como el tubo de 50 mi de orina clarificada y se almacena a -20°C hasta su envío. 7. A ~ 100 µ? de pella lavada se añaden 100 µ? de regulador de pH de lisis TNES (Tris 10 mM pH 8.0, NaCI 150 mM, EDTA 2 mM, SDS 0.5%), se incuba a 56°C durante 30 minutos y entonces se almacena a -20°C hasta que se procese con un equipo de modificación con bisulfito (ver abajo, en la parte II). En caso de células solamente, 20 µ? de regulador de pH TNES se añade a 20 µ? de suspensión celular.

II. Modificación con bisulfito de sodio de ADN qenómico usando un equipo de metilación EZ-ADN de Zvmo Research El equipo de metilación EZ-ADN se provee por Zymo Research (Orange, CA) para realizar la modificación con bisulfito de ADN. Según la recomendación del fabricante la muestra de ADN a ser modificada se incuba con el reactivo de conversión de bisulfito a 50°C durante 12-16 horas. Estas condiciones ahora se han modificado para generar ADN convertido con bisulfito de calidad comparable en mucho menos tiempo. Varias temperaturas y diferentes tiempos se analizan y se demuestra que la incubación de la muestra de ADN con reactivo de conversión con bisulfito a 70°C durante 1-3 horas provee modificación con bisulfito eficiente comparable a condiciones de modificación recomendadas en el equipo. El protocolo es como sigue para el procesamiento de muestras de orina: Regulador de pH M-lavado (se prepara antes del inicio usando el equipo) Preparación de regulador de pH M-lavado: Agregar 24 mi de etanol absoluto al concentrado de regulador de pH M-lavado para hacer el regulador de pH M-lavado final para D5001 (se usan 96 mi de etanol para D5002). 1 . Procedimiento de modificación de ADN a. Se agregan 5 µ? de regulador de pH M-dilución directamente a 45 µ? de lisado de orina o para el regulador de pH M-dilución de escala ascendente de volumen de muestra más alto y lisado crudo de orina proporcionalmente. Por ejemplo, para 150 µ? de lisado de orina se agregan 20 µ? de regulador de pH M-dilución y 30 µ? de agua (total de 200 µ?). b. Se mezcla la muestra al golpear o pipetear hacia arriba y hacia abajo. Se gira la muestra brevemente. Se incuba la muestra a 37°C durante 15 minutos en un bloque de calentamiento con agitación a 1100 rpm. Durante los 15 minutos de incubación, se prepara el reactivo de conversión CT (según las instrucciones del fabricante). c. Después de los 15 minutos anteriores de incubación, se agregan 100 µ? del reactivo de conversión CT preparado (después de girar brevemente) a cada muestra (o se agregan 400 µ? de reactivo CT para un protocolo de escala ascendente) y se gira con vórtice ligeramente (la muestra puede tornarse turbia). Se hace girar la muestra brevemente. Se incuba la muestra a 70°C durante 3 horas con el bloque de calentamiento (se agita a 1100 rpm) cubierto con una hoja delgada de aluminio. (El reactivo de conversión CT es ligeramente sensible, de modo que se trata de minimizar la exposición de la reacción a la luz). 2. Desalación a. Se hace girar la muestra brevemente. Se incuba la muestra en hielo durante 10 minutos. En el caso del volumen más alto de una muestra de orina, se añade en alícuotas en dos tubos de 300 µ? cada uno. b. Se añaden 400 µ? de regulador de pH M-unión a la muestra y se mezcla al agregar con pipeta hacia arriba y hacia abajo o para muestras de orina de escala ascendente se agregan 800 µ? de regulador de pH M-unión a cada alícuota, se mezcla y se gira rápidamente. c. Se carga todo el sobrenadante (incluyendo cualquier precipitado) sobre una columna Zymo-Spin I y se coloca la columna en un tubo de colección de 2 mi y se centrifuga a velocidad máxima durante 15-30 segundos. Se descarta el fluido que pasó. Para un volumen de muestra más alto, esta etapa se repite mediante la adición del sobrenadante de cada tubo con alícuota en un tiempo en la columna y se centrífuga hasta que toda la muestra se cargue en la columna. d. Se añaden 200 µ? de regulador de pH M-Lavado a la columna. e. Se centrífuga a velocidad máxima durante 15-30 segundos.

Se descarta el flujo que pasó. 3. Desulfonación, 2a desalación y elución a. Se añaden 200 µ? de regulador de pH M-Desulfonación a la columna y se deja a la columna permanecer a temperatura ambiente durante 15 minutos. b. Se centrifuga a velocidad máxima durante 15 - 30 segundos. Se descarta el flujo que pasó. c. Se añaden 200 µ? de regulador de pH M-Lavado a la columna. d. Se centrifuga a velocidad máxima durante 15- 30 segundos. e. Se añaden otros 200 µ? de regulador de pH M-Lavado a la columna. f. Se centrifuga a velocidad máxima durante 30 segundos (una duración de giro más larga para este último lavado es necesario para completar la remoción de residuos de regulador de pH de lavado). Se descarta el flujo que pasó. g. Se coloca la columna en un tubo de 1 .5 mi limpio. h. Se añaden 25 µ? de regulador de pH M-elución directamente a la matriz de columna. Se deja a la columna permanecer durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se centrifuga a velocidad máxima durante 1 minuto para eluir el ADN. i. Se almacenar el ADN eluido a -80°C j. Se usan 5 µ? en la reacción MSP.

Resultados El protocolo descrito anteriormente excluye el uso de un equipo de purificación de ADN antes de la modificación con bisulfito, con lo cual, se reducen los tiempos de procesamiento de muestra, previniendo las pérdidas de ADN durante la purificación, reducción de costos y reducción de oportunidades de contaminación). El cuadro 8 muestra resultados finales del ensayo MSP en Cepheid Smart Cycler con muestras de ADN procesadas por el protocolo TNES desde 50 mi de orina, ß-actina mejor y GSTP1 Cts (hasta 3 Cts más bajos) se observan usando el protocolo de digestión TNES/PK descrito anteriormente sobre el uso de ADN purificado usando equipo de aislamiento de ADN Qiagen disponible comercialmente (equipo de ARN viral QiAmp). De esta manera la purificación adicional de ADN no se requiere antes de la modificación de ADN usando este método. También, los datos muestran que la combinación de equipos de digestión TNES/PK y metilación de EZ ADN produce más muestra de ADN.

CUADRO 8 Protocolo TNES vs. equipo de aislamiento de ADN Qíagen (10,000 células LNCaP/50 mi de orina) Los resultados con el protocolo de extracción TNES son aún más precisos en diluciones en serie de células de próstata LNCaP (intervalo de 10,000 a 100 marcadas por 50 mi de orina agrupada de donadores saludables). El protocolo combinado para la extracción de ADN seguido directamente por la modificación con bisulfito permite mejorar la sensibilidad del ensayo de metilación de próstata por 10 veces (cuadro 9) en comparación con dos equipos comerciales combinados. El protocolo TNES permite la detección de 100 células por 50 mi de orina, el nivel que es indetectable por el protocolo Qiagen usando el valor Ct y el análisis de número de copia.

CUADRO 9 Protocolo TNES vs. equipo de aislamiento de ADN Qiagen (células LNCaP: 10,000, 1000 y 100/50 mi de orina) Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no se deben construir como limitantes del alcance de la invención.

Referencias 20020197639, 20030022215, 20030032026, 20030082600, 20030087258, 20030096289, 20030129620, 20030148290, 20030157510, 20030170684, 20030215842, 20030224040, 20030232351 , 20040023279, 20040038245, 20040048275, 20040072197, 20040086944, 20040101843, 200401 15663, 20040132048, 20040137474, 20040146866, 20040146868, 20040152080, 20040171 1 18, 20040203048, 20040241704, 20040248090, 20040248120, 20040265814, 20050009059, 20050019762, 20050026183, 20050053937, 20050064428, 20050069879, 20050079527, 20050089870, 20050130172, 20050153296, 20050196792, 20050208491 , 20050208538, 20050214812, 20050233340, 20050239101 , 20050260630, 20050266458, 20050287553, 20070148670 y Patentes de E.U.A. números 5786146, 6214556, 6251594, 6331393 y 6335165 Chuang et al. (2007) Epigenetics and microRNAs Ped Res 61 :24R-29R Emmerechts et al. (2007) Post-transcriptional modification mapping in the Colstridium acetobutylicum 16S rRNA by mass spectrometry and reverse transcriptase assays Nucl Acids Res 35:3494-3503 Frommer et al. (1992) A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands Proc Nati Acad Sci USA 89:1827-31 Grunau et al. (2001 ) Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters Nucl Acids Res 29:E65-5.

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Un método para la modificación de una macromolécula sin extracción previa a partir de una muestra que comprende las etapas de a. convertir la macromolécula en la muestra con un químico, b. remover o convertir los intermedios químicos, si es necesario; y c. purificar la macromolécula modificada resultante. 2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las macromoléculas se seleccionan del grupo que consta de ADN, ARN, metabolitos celulares, lípidos, carbohidratos y proteínas. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la macromolécula es ADN y se selecciona de viral, nucleico, mitocondrial, plástido, bacteriano y sintético. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la macromolécula es ARN y se selecciona de ARNrt, ARNt, ARNmi, ARNr y ARNm. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la macromolécula es un metabolito celular y se selecciona de aquellos producidos por medio de un ciclo metabólico o efectos enzimáticos. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la macromolécula es lípido y se selecciona de liposomas, lípidos de membrana celular, lípidos de membrana intracelular y lipidos extracelulares. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la macromolécula es carbohidrato y se selecciona de carbohidratos de proteína unida y carbohidratos de ácido nucleico unido. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la macromolécula es proteína y se selecciona de intracelular y extracelular. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la modificación se selecciona de bisulfito y biotinilación. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la modificación se selecciona de fluoración y metilación. 1 1 . - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la modificación se selecciona de calentamiento, formación de liposoma, formación de micelas, formación uní-capa y formación bi-capa. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la modificación se selecciona de oxidación, desoxidación, aminación y desaminación. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la modificación se selecciona de fosforilación, defosforilación, metilación, biotinilación, aminación, desaminación, glicosilación y deglicosilación. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra se selecciona de tejido, fluido corporal, una muestra de biopsia, y tejido conservado. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra es tejido y se selecciona de órganos completos, órganos disecados, epitelio, neural, gastrointestinal, músculo, cardiaco, mucosal y endotelio. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra es fluido corporal y se selecciona de sangre entera, plasma, orina, saliva, vitreo y suero. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra es una muestra de biopsia y se selecciona de aspirado de aguja fina, sección de tejido y muestra de piel. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra es tejido conservado y se selecciona de congelado fresco, fijado con parafina y conservado en un reactivo de conservación. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el reactivo de conservación se selecciona de formalina, RNAIater® y sulfóxido de dimetilo. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la purificación se selecciona de basada en partículas, precipitación, centrifugación, electroforética y cambio de carga. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la purificación es basada en partículas y se selecciona de afinidad, dimensionado y magnética. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el dimensionado de partículas se selecciona de basado en sílice y tierras diatomáceas. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la separación electroforética es por tamaño y/o carga. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la separación electroforética es por medio de un gel formado de polímeros de peso molecular bajo y/o capilar. 25.- Un método para la extracción y modificación de ADN que comprende las etapas de a. incubar las muestras con una cantidad de un bisulfito y durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para convertir una cantidad suficiente de los residuos de citosina no metilados en el ADN a residuos de uracilo; b. aplicar el ADN en la muestra a una columna; c. lavar el ADN unido para remover contaminantes; d. incubar el ADN unido a la columna con un reactivo de desulfonación durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se presente la desulfonación; e. lavar el ADN unido para remover el reactivo de desulfonación; y f. eluir el ADN modificado con bisulfito de la columna. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el ADN se obtiene por un método que comprende la etapa de: lisar una muestra celular para obtener un lisado. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el lisado es de aproximadamente 0.01 a 30 µg. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el lisado se aplica directamente a la columna en la etapa b de la reivindicación 25. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el lisado se obtiene por incubación con una proteinasa y/o concentración alta de sal y/o detergente, sonicación, tratamiento de congelación-descongelación o disolución mecánica. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el bisulfito es bisulfito de sodio o bisulfito meta. 31. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque las condiciones de incubación de la etapa b son aproximadamente 1-16 horas a 50-95°C con o sin termociclación. 32. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la desulfonación se realiza cambiando el pH. 33. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la desulfonacion se realiza bajo condiciones básicas. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque las condiciones incluyen hidróxido de sodio y un alcohol. 35. - El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el alcohol es isopropanol o etanol. 36. - El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la desulfonacion ocurre desde aproximadamente 0-30 minutos a aproximadamente 0°C a aproximadamente 50°C. 37. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la desulfonacion ocurre en aproximadamente 15 minutos. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la desulfonacion ocurre a temperatura ambiente.