BRPI0713927A2 - mÉtodo de modificar uma macromolÉcula sem extraÇço anterior de uma amostra - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE MODIFICAR UMA MACROMOLÉCULAS SEM EXTRAÇçO ANTERIOR DE AMOSTRA. A presente invenção abrange um método de modificar uma macromolécula sem extreção anterior de uma amostra convertendo a macromolécula na amostra com uma química, removendo ou convertendo os intermediários químicos, se necessário; e purificando a macromolécula modificada resultante.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE MODIFICAR UMA MACROMOLÉCULA SEM EXTRAÇÃO ANTERIOR DE UMA AMOSTRA".

Antecedentes da Invenção

A presente invenção abrange um método de modificar uma ma- cromolécula sem extração anterior de uma amostra convertendo a macromo- lécula na amostra com uma química, removendo ou convertendo intermediá- rios químicos, se necessário; e purificando a macromoiécula modificada re- sultante.

Um método usado para vertebrados e plantas mais altas para expressão do gene de regulação é a metilação das citosinas encontradas nas ilhas de CpG localizadas nas regiões de promotor dos vários genes. A fim de estudar este método de regulação do gene, técnicas foram desenvol- vidas para separar as citosinas metiladas das citosinas não-metiladas. Um método é quimicamente tratar o DNA em um tal modo que as citosinas são convertidas em uracilas enquanto que as 5-metil-citosinas não são significa- tivamente convertidas. Frommer et al. (1992). Uma investigação sistemática nos parâmetros críticos do procedimento de modificação tem também sido feita. Grunau et al. (2001). O DNA tratado pode ser usado como modelo para PCR específica para metilação (MSP). Metilação de DNA e métodos relacio- nados à mesma são debatidos, por exemplo, nas publicações de patente US números 20020197639, 20030022215, 20030032026, 20030082600, 20030087258, 20030096289, 20030129620, 20030148290, 20030157510, 2J3030170684, 20030215842, 20030224040, 20030232351, 20040023279, 20040038245, 20040048275, 20040072197, 20040086944, 20040101843, 20040115663, 20040132048, 20040137474, 20040146866, 20040146868, 20040152080, 20040171118, 20040203048, 20040241704, 20040248090, 20040248120, 20040265814, 20050009059, 20050019762, 20050026183, 20050053937, 20050064428, 20050069879, 20050079527, 20050089870, 20050130172, 20050153296, 20050196792, 20050208491, 20050208538, 20050214812, 20050233340, 20050239101, 20050260630, 20050266458, 20050287553 e nas patentes US números 5786146, 6214556, 6251594, 6331393e6335165.

Kits de modificação de DNA estão comercialmente disponíveis, eles convertem DNA genômico purificado com citosinas não-metiladas em citosinas não-metiladas desprovidas genômicas mas com uracilas adicio- nais. O tratamento é um processo químico de duas etapas que consiste em uma reação de desaminação facilitada por bissulfeto e uma etapa de dessul- fonação facilitada por hidróxido de sódio. Tipicamente, a reação de desami- nação é executada como um líquido e é terminada através de incubação em gelo seguido adicionando tampão de ligação de coluna. Seguindo ligação de fase sólida e lavagem do DNA é eluída e a reação de dessulfonação é exe- cutada em um líquido. Adicionando etanol termina a reação e o DNA modifi- cado é limpado através de precipitação. Porém, ambos os kits comercial- mente disponíveis (Zymo e Chemicon) executam a reação de dessulfonação enquanto o DNA está ligado na coluna e lavando a coluna termina a reação.

- 15 O DNA tratado é eluído da coluna pronto para o ensaio de MSP. A modifica- ção é tediosa e tem muitas etapas que causam perda de rendimento e au- mentam erro do operador. Todos os procedimentos de modificação disponí- veis começam com DNA genômico purificado que é um processo tedioso que também tem muitas etapas que causam perda de rendimento e aumen- tam erro do operador. Sumário da Invenção

A presente invenção abrange um método de modificar uma ma- cromolécula sem extração anterior de uma amostra convertendo a macromo- lécula na amostra com uma química, removendo ou convertendo intermediá- rios químicos, se necessário; e purificando a macromolécula modificada re- sultante.

Breve Descrição do Desenho

Figura 1: Mostra que modificação de DNA sem isolamento de uma amostra biológica é equivalente a tal modificação após o isolamento.

Descrição Detalhada

A presente invenção abrange um método de modificar uma ma- cromolécula sem extração anterior de uma amostra convertendo a macromo- lécula na amostra com uma química, removendo ou convertendo intermediá- rios químicos, se necessário; e purificando a macromolécula modificada re- sultante.

As macromoléculas podem ser quaisquer conhecidas na técnica incluindo, sem limitação, DNA, RNA, metabólitos celulares, lipídios, carboi- dratos e proteínas. O DNA pode ser qualquer conhecido na técnica incluin- do, sem limitação, vira!, nucleico, mitocondrial, plastídio, bacteriano e sintéti- co. O RNA pode ser qualquer conhecido na técnica incluindo, sem limitação, rtRNA, tRNA, miRNA, rRNA e mRNA. O metabólito celular pode ser qualquer conhecido na técnica incluindo, sem limitação, aqueles produzidos por um ciclo metabólico ou efeitos enzimáticos. O lipídio pode ser qualquer conheci- do na técnica incluindo, sem limitação, lipossomas, lipídios de membrana celulares, lipídios de membrana intracelulares e lipídios extracelulares. O carboidrato pode ser qualquer conhecido na técnica incluindo, sem limitação, - 15 carboidratos ligados a proteínas e carboidratos ligados a ácidos nucléicos. A proteína pode ser qualquer conhecida na técnica incluindo, sem limitação,

intracelular e extraceluiar.

A modificação pode ser qualquer conhecida na técnica incluindo

bissulíeto e biotinilação de DNA ou RNA, fluoração e metilação de RNA, a- quecimento, formação de lipossoma, formação de micela, formação de uni- camada e formação de bicamada de lipídios, oxidação, desoxidação, amina- ção e desaminação de carboidratos e fosforilação, desfosforilação, metila- ção, biotinilação, aminação, desaminação, glicosilação e desglicosilação de proteínas. 20070148670; Chuang et al. (2007); Emmerechts et al. (2007); Frommer et al. (1992); Grunau et al. (2001); Hurd et al. (2007); Jin et al. (2007); Oakeley (1999); Rathi et al. (2003); Rein et al. (1998); Sambrook et

al. (2000); Wu et al. (2007).

A amostra pode ser qualquer conhecida na técnica incluindo,

sem limitação, tecido, fluido do corpo, uma amostra de biópsia, e tecido pre- servado. O tecido pode ser qualquer conhecido na técnica incluindo, sem limitação, órgãos inteiros, órgãos dissecados, epitélio, neural, gastrointesti- nal, músculo, cardíaco, mucoso e endotélio. O fluido do corpo pode ser qualquer conhecido na técnica incluindo, sem limitação, sangue total, plas- ma, urina, saliva, vítreo e soro. A amostra de biópsia pode ser qualquer co- nhecida na técnica incluindo, sem limitação, aspirado de agulha fina, seção de tecido e amostra de pele. O tecido preservado pode ser qualquer conhe- cido na técnica incluindo, sem limitação, congelado fresco, parafina embebi- da e preservada em um reagente de preservação. O reagente de preserva- ção pode ser qualquer conhecido na técnica incluindo, sem limitação, forma- lina, RNAIater®e dimetilsulfóxido.

A purificação pode ser qualquer conhecida na técnica incluindo, sem limitação, com base em partícula, precipitação, centrifugação, eletrofo- rética e troca de carga. A purificação baseada em partícula pode ser qual- quer conhecida na técnica incluindo, sem limitação, afinidade, tamanho e magnética. A partícula de tamanho pode ser qualquer conhecida na técnica incluindo, sem limitação, com base em sílica e terra diatomácea. A purifica- - 15 ção de separação eletroforética pode ser qualquer conhecida na técnica in- cluindo, sem limitação, por tamanho e/ou carga. A purificação de separação eletroforética pode ser qualquer conhecida na técnica incluindo, sem limita- ção, por um gel formado de polímeros de peso molecular baixo e/ou capila- res.

A presente invenção fornece um método rápido e eficiente para

obter DNA modificado com bissulfeto. O método descrito aqui eficazmente elimina numerosas etapas dos métodos anteriores desse modo reduzindo possível erro ao mesmo tempo produzindo resultados superiores. Além dis- so, economias de tempo consideráveis de quatro a cinco horas são também

constatadas.

A presente invenção fornece um método de extrair e modificar DNA obtendo uma amostra de DNA; incubando a amostra com uma quanti- dade de um bissulfeto e durante um tempo e sob condições suficientes para converter pelo menos noventa e cinco por cento dos resíduos de citosina não-metilada no DNA para resíduos de uracila; ligando o DNA na amostra a uma coluna; lavando o DNA ligado para remover os contaminantes; incu- bando o DNA ligado à coluna com um reagente de dessulfonação durante um tempo e sob condições suficientes para dessulfonação ocorrer; lavando o DNA ligado para remover o reagente de dessulfonação; e eluindo o DNA modificado de bissulfeto da coluna.

O DNA pode estar em uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 30 pg e pode ser obtido por qualquer método conhecido na técnica e pode ser DNA purificado ou DNA obtido diretamente de um Iisado celular. Por exemplo, o Iisado celular pode ser formado de qualquer tecido adequado por qualquer método conhecido na técnica e diretamente tratado com um reagente de bissulfeto. Lise da célula pode ser, por exemplo, por proteinase e/ou concentração alta de sal e/ou detergente, sonicação, tratamento de congelação-descongelação ou rompimento mecânico. Qualquer amostra de célula é adequada para o uso aqui e pode ser obtida de tecido, fluido do cor- po, amostra de biópsia ou tecido preservado.

O reagente de bissulfeto pode ser qualquer conhecido na técni- ca, incluindo, sem limitação, bissulfeto ou meta bissulfeto de sódio. Outros reagentes são debatidos, por exemplo, nas publicações de patente US 20050089898, 20050095623 e20050153308.

As condições de incubação da etapa b são cerca de 1-16 horas a 50-95°C com ou sem Ciclagem térmica. Ciclagem térmica pode ser por exemplo 3 horas a 70°C, 1 hora a 90°C ou ciclagem entre 50°C e 95°C.

A coluna pode ser qualquer conhecida na técnica, preferivelmen- te, é com base em sílica ou terra diatomácea. A dessulfonação pode ser por qualquer método conhecido na técnica e pode ser preferivelmente executada com hidróxido de sódio e um álcool. Preferivelmente, o álcool é isopropanol ou etanol. Mais preferivelmente, quando a coluna for com base em sílica, o álcool é etanol e quando a coluna for terra diatomácea, o álcool é isopropa- nol. A dessulfonação preferivelmente ocorre de cerca de 0-30, preferivel- mente cerca de 5-15 e mais preferivelmente cerca de 15 minutos a cerca de 0°C a cerca de 50°C. Preferivelmente, a temperatura é cerca de temperatura ambiente.

A macromolécula modificada pode ser eluída por qualquer mé- todo conhecido na técnica, incluindo, sem limitação com água ou um tampão adequado.

Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar, mas não limi- tar, a invenção reivindicada. Todas as referências citadas aqui são por este meio incorporadas aqui por referência.

Exemplo 1

Modificação de bissulfeto rápida do DNA de um Iisado de célula obtido de tecido fresco congelado embebido em parafina

Tubo de microcentrífuga contendo pélete de cultura de célula em

PBS

· Adicionar 100 μΙ de tampão de extração de DNA (NaCI a 75 mM,

EDTA a 25 mM, e Tween 20 a 0,5%), incubar a 56°C por 10 minutos.

• Prosseguir com adição de NaOH a 3M descrita abaixo

Ou um tubo de microcentrífuga contendo (até) 5-10 mícrons de fatias de bloco de FFPE.

As fatias de FFPE requerem desparafinação:

• Adicionar 1 ml de Xileno ao tubo e misturar invertendo várias ve- zes

• Incubar em TA por 5 min e centrifugar em velocidade máxima por 5 minutos em TA

· Remover o sobrenadante sem remover qualquer pélete

• Repetir a extração de 1 ml de Xileno

• Adicionar 1 ml de EtOH (100%) ao pélete e suavemente misturar invertendo

• Centrifugar em velocidade máxima durante 5 minutos em TA

· Cuidadosamente remover o EtOH pipetando sem remover qual-

quer de pélete

• Repetir a lavagem de EtOH

• Secar o pélete em um bloco de aquecimento de 37°C com os tu- bos de microcentrífuga abertos

Procedimento de extração/modificação para amostras de FFPE

• Adicionar 90 μΙ de tampão de extração (Tris a 10 mM, pH 8,0, NaCI a 150 mM, EDTA a 2 mM, e SDS a 0,5%) e 10 μΙ de proteinase K e incubar durante a noite a 56°C

• Após incubação o extrato deveria ficar claro, se não adicionar 10 μ de proteinase K e incubar por 1 h

• Repetir até que Iise fique clara e prosseguir com adição de Na- OH a 3M descrita abaixo.

• Adicionar 1/10 volume de NaOH a 3M e incubar a 56°C por 10

minutos.

• Adicionar 2 volumes de uma solução saturada de bissulfeto de sódio pH 5,0 com hidroquinona a 10 mM, incubar a 70°C durante 3 horas na

escuridão.

• Parar a reação incubando em gelo durante 10 minutos. Adicionar 0,5 volume de Isopropanol e suavemente submeter a vórtice ou pipetar para cima e para baixo.

• Adicionar a amostra em uma coluna de purificação de DNA de Qiagen (kit de purificação de DNA QiaAmp), girar 1 min e esvaziar o tubo

residual;

• Adicionar 500 μΙ de tampão de lavagem de AW1, girar 1 min e esvaziar o tubo residual;

• Adicionar 500 μΙ de tampão de lavagem de AW2, girar 1 min e esvaziar o tubo residual;

• Adicionar 200 μΙ de tampão de dessulfonação (NaOH a 300 mM, Isopropanol 80%), incubar em temperatura ambiente por 10 min, girar 1 min e esvaziar o tubo residual;

• Adicionar 500 μΙ de tampão de lavagem de AW2, girar 1 min, es- vaziar o tubo residual e girar 1 min,

• Adicionar 500 μΙ de tampão de lavagem de AW2, girar 1 min, es- vaziar o tubo residual e girar 1 min,

• Eluir com 50 μΙ de TE, girar 1 min em um novo tubo de microcen- trífuga de 1,5 ml e armazenar a -20°C

A eficiência do procedimento é ensaiada usando PCR quantitati-

va e β-actina usando GSTP1 como marcadores. O promotor de β-actina não é mais metilado e o marcador é projetado para servir como um controle para o procedimento de modificação. O valor Ct produzido por este marcador é refletivo do número de equivalentes do genoma adicionados ao ensaio. Em- bora o promotor de GSTP1 seja epigeneticamente metilado ele pode ser re- fletivo de um estado canceroso. Portanto, o valor de Ct do marcador de GHSTP1 é mais variável e usualmente maior que o valor de Ct da β-actina. Os blocos de FFPE de próstata foram obtidos de Asterand. O tratamento de "Zymo" se refere ao kit de modificação de DNA comercialmente disponível vendido como o Kit de Metilação de DNA EZ de Zymo Research. Um proce- dimento das Etapas 2 refere-se a dois procedimentos separados que usam um kit de purificação de DNA (kit de purificação de DBNA QiaAmp Mini de Qiagen) e um kit de modificação de DNA tal como o kit de Zymo. O procedi- mento da etapa 1 de Zymo é idêntico ao procedimento de ID até a etapa de NaOH a 3 M de onde o procedimento de modificação de DNA de Zymo é seguido substituindo o NaOH de 3 M de com tampão de diluição M.

Os resultados mostrados na Tabela 1 usando péletes de cultura de célula indicam que o método da Etapa 1 produz valores Ct mais baixos e deste modo resultados mais altos quando comparados ao procedimento da Etapa 2 de Qiagen/Zymo. Estatisticamente, um teste T pareado indica os métodos, usando o marcador de β-actina, é significativamente diferente um do outro com um valor P de 0,00006 enquanto o marcador de GSTP1 teve um valor P de 0,0001. Os resultados mostrados na Tabela 2 indicam que a etapa 1 de ID produz valores Ct mais baixos quando comparado ao método da Etapa 1 de Zymo com o marcador de β-actina produz um valor P de 0,02 e o marcador de GSTP1 resulta em um valor P de 0,003.

Porém, os resultados mostrados na Tabela 1 usando blocos de FFPE de próstata indicam os resultados opostos das culturas de célula com a Etapa 2 de Zymo produzindo valores Ct mais baixos que a etapa 1 do mé- todo. Os resultados do marcador de β-actina indicam que os métodos são significativamente diferentes com um valor P de 0,021 enquanto os resulta- dos de GSTP1 sugeriram que eles podem ser diferentes com um valor P de 0,054. Os resultados diferentes sugeriram que o tampão de extração para cultura de célula poderiam não ser suficientes para os blocos de tecido de lise. Os resultados da Tabela 4 comparam os métodos da Etapa 1 de ID e da Etapa 1 de Zymo usando um tampão de extração mais agressivo trocando o Tween por SDS ao mesmo tempo usando blocos de tecido de próstata. O método da Etapa 1 de ID mostra mais uma vez resultados superiores suge- rindo que a falha para produzir resultados superiores na Tabela 3 seja devi- do ao tampão de extração. Os resultados do marcador de β-actina indicam que os métodos são significativamente diferentes com um valor P de 0,0008 enquanto os resultados de GSTP1 sugerem que eles podem ser diferentes com um valor P de 0,056. Visto que o método do ensaio de QPCR tem ape- nas 40 ciclos, uma vez um ensaio não produz Cts então não é significativo comparar com os ensaios que produzem Ct. Se as duas amostras que tive- ram ensaios falharam então os valores P seriam 0,0025, indicando que os métodos usando o marcador de GSTP1 são significativamente diferentes. Tabela 1: Resultados comparando o procedimento da Etapa 1 ao procedi- mento da Etapa 2 de Qiagen/Zymo (Zymo)

Cultura de célula LnCAP 1 χ 105 péletes de célula, 2 péletes testadas em duplicata Tratamento Procedimento Marcador Ct SD Valor P ID Etapa 1 β-actina 26,94 0,24 0,00006 Zymo Etapa 2 β-actina 27,80 0,29 ID Etapa 1 GSTP1 27,66 0,20 0,0001 Zymo Etapa 2 GSTP1 28,54 0,23

Tabela 2: Resultados comparando o procedimento da Etapa 1 ao procedi- mento da Etapa 1 de Zymo

Cultura de célula LnCAP 1 χ 105 péletes de célula, 2 péletes testadas em duplicata Tratamento Procedimento Marcador Ct SD Valor P ID Etapa 1 β-actina 27,60 0,18 0,020 Zymo Etapa 1 β-actina 29,90 0,08 ID Etapa 1 GSTP1 28,48 0,07 0,003 Zymo Etapa 1 GSTP1 30,87 0,18 Tabela 3: Resultados comparando o procedimento da Etapa 1 ao procedi- mento da Etapa 2 de Qiagen/Zymo (Zymo)

Blocos de FFPE de próstata Usando o Tampão de Extração de Cultura de Célula Tratamen- to Bloco de tecido Procedi- mento Ct Médio de β-actina SD Ct médio de GSTP1 SD ID 1 Etapa 1 30,68 0,08 32,64 0,27 ID 2 Etapa 1 33,84 0,22 37,20 0,33 ID 3 Etapa 1 31,26 0,04 35,19 0,16 ID 4 Etapa 1 34,21 0,03 38,57 0,08 Zymo 1 Etapa 2 29,68 0,19 33,40 0,07 Zymo 2 Etapa 2 28,72 0,04 32,87 0,19 Zymo 3 Etapa 2 27,69 0,01 32,11 0,22 Zymo 4 Etapa 2 27,62 0,04 33,65 0,25 Valor P 0,021 0,054

Tabela 4: Resultados comparando o procedimento da Etapa 1 ao procedi- mento da Etapa 1 de Zymo usando blocos de FFPE de próstata.

Blocos de FFPE de próstata usando o Tamoao de Ex ração de F FPE Tratamento Bloco de te- cido Ct de β- actina SD de β- actina Ct de GSTP1 SD de GSTP1 Zymo 12 35,16 0,10 40 0,00 ID 12 31,21 0,04 40 0,00 Zymo 16 34,41 0,12 35,76 0,79 ID 16 30,23 0,33 31,98 0,25 Zymo 18 35,69 0,13 40,00 0,00 ID 18 32,63 0,16 39,27 1,03 Zymo 20 33,08 0,17 36,07 0,05 ID 20 28,29 0,03 32,34 0,19 Controle Plasm ídeo 23,15 0,79 22,86 0,34 Valor P 00,0008 00,056 Exemplo 2

Tratamento de bissulfeto de DNA obtido de urina

O propósito deste experimento foi comparar o kit de DEM versus o kit de modificação de EZ de Zymo em DNA purificado obtido de células de LnCAP e urina. Dez amostras aleatórias normalizadas foram divididas entre os dois kits.

• 5 Amostras por Kit (DEM e Zymo)

• PCR executada em duplicata usando Fast Start Taq (GSTP1, β-actina, e APC)

Análise de ANOVA indica um valor P de 0,663 e um teste T pa-

reado indica que não há nenhuma diferença estatística entre DEM e Zymo para GSTP1.

Análise de ANOVA indica um valor P de 0,008 e um teste T pa- reado indica que há uma diferença estatística entre DEM e Zymo para B- actina.

• Os resultados indicam que Zymo e o kit de DEM são equivalen- tes para GSTP1

• O kit de DEM foi otimizado para tecido ao invés de DNA purifi- cado mais otimização dentro de ProMU poderia levar a valores mais baixos

de CT.

• O kit de DEM demonstra um valor de β-actina mais alto

β-actina GSTP1 ANOVA unidirecional P = 0,000 ANOVA unidirecional P = 0,663 DEM (CT Médio) 34,990 DEM (CT Médio) 31,30 STDEV de DEM 1,341 STDEV de DEM 0,839 Zymo (CT Médio) 33,270 Zymo (CT Médio) 31,140 STDEV de Zymo 1,240 STDEV de Zymo 0,773

Número Kit β-actina GSTP1 APC 1 DEM 33,8 30,4 34,0 2 DEM 34,8 30,5 33,2 3 DEM 37,8 31,8 34,1 Número Kit β-actina GSTP1 APC 4 DEM 35,1 32,2 33,9 DEM 35,7 32,5 34,4 6 DEM 35,6 32,2 34,3 7 DEM 33,4 30,5 32,4 8 DEM 33,4 30,4 32,3 9 DEM 35,8 31,5 33,3 DEM 34,5 31,0 32,4 1 Zvmo 32,7 32,4 33,4 2 Zymo 32,3 30,8 31,5 3 Zvmo 35,6 31,9 33,3 4 Zymo 34,5 31,8 33,2 Zymo 34,2 31,6 32,6 6 Zvmo 34,2 31,4 32,5 7 Zvmo 32,1 30,4 31,5 8 Zymo 32,2 30,5 31,5 9 Zvmo 32,3 30,2 31,6 I 10 Zvmo 32,6 30,4 31,6

A ligação do Iisado bruto contendo DNA ou DNA genômico puri- ficado está exclusivamente ligada à coluna com base em sílica-gel utilizando a concentração alta de sal que está presente da conversão de bissulfeto.

Etanol é adicionado à amostra antes de ligar apenas para dis-

solver o reagente da conversão.

• Adicionar 1/10 do volume de tampão de diluição M e incubar a 70°C durante 20 minutos para quimicamente desnaturar o DNA bifilamentar

• Adicionar 2 volumes de reagente de conversão de CT (Zymo)1

incubar a 70°C durante 3 horas na escuridão. IO · Adicionar 0,5 volume de etanol (100%) e suavemente submeter

a vórtice ou pipetar para cima e para baixo.

Tubo de microcentrífuga contendo o DNA purificado de urina a

um volume iniciando de 45 μΙ

• Prosseguir com adição de tampão de diluição M descrita abaixo • Ou um tubo de microcentrífuga contendo (até) 5-10 mícrons de fatias de bloco de FFPE de um pélete de cultura de celular embebida em parafina fixada em formalina que é conhecida expressar hipermetilação para GSTP1.

As fatias de FFPE requerem desparafinação:

• Adicionar 1 ml de Xileno ao tubo e misturar invertendo várias ve- zes

• Incubar em TA por 5 min e centrifugar a 13.200 rpm por 5 min

em TA

• Remover o sobrenadante sem remover qualquer pélete

• Repetir a extração de 1 ml de Xiieno

• Adicionar 1 ml de EtOH (100%) ao pélete e suavemente misturar invertendo

• Centrifugar a 13.200 rpm por 5 min em TA

• Cuidadosamente remover o EtOH pipetando sem remover qual- quer do pélete

• Repetir a lavagem de EtOH

• Secar o pélete e remover o etanol residual em um bloco de a- quecimento de 37°C com os tubos de microcentrífuga abertos durante cerca de 10 minutos

Procedimento de extração/modificação para amostras de FFPE

• Adicionar 35 μΙ de tampão ATL (Qiagen) e 10 μΙ de proteinase K (Qiagen) e incubar durante a noite a 56°C

• Após incubação, o extrato deveria ficar claro e homogêneo

• Prosseguir com adição do tampão de diluição M (Zymo Resear- ch) descrita abaixo

• Adicionar a amostra a uma coluna de purificação de DNA de Qi- agen (kit de purificação de DNA QiaAmp Micro), girar 1 min a 13.200 rpm e esvaziar o tubo residual;

• Adicionar 500 μΙ de tampão de lavagem de AW1, girar 1 min a 13.200 rpm e esvaziar o tubo residual;

• Adicionar 200 μΙ de tampão de dessulfonação (300 mM NaOH, 90% Etanol), incubar em temperatura ambiente por 20 min, girar 1 min a 13.200 rpm e esvaziar o tubo residual;

• Adicionar 500 μ) de tampão de lavagem de AW2, girar 1 min (13.200 rpm), esvaziar o tubo residual e girar 3 min (13.200 rpm).

• Eluir com 20-25 μΙ de tampão AE, TE, ou Água Livre de Nuclea- se. Incubar a coluna por três min em temperatura ambiente e girar 1 min em novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20°C ou -80°C inver- so

Exemplo 3

Modificação de DNA em Grande Escala

Modificação de DNA em Grande Escala pode ser necessária para fazer painéis para testagem de controle de qualidade dos métodos de PCR e kits específicos para metilação.

1. Desnaturar 20 pg do DNA genômico da linhagem celuiar 22Rv1 da Cultura de Célula Prostática (ATCC) em um volume total de 225 μΙ de TE, mais 27,5 μΙ de uma solução a NaOH de 3,0 M. Incubar 10 minutos a 37°C.

2. Adicionar 2x volume do reagente de conversão (Zymo); incu- bar 3 h a 70°C seguido por 10 min em gelo.

Ligar o DNA a um suporte de fase sólida adicionando 2 ml de tampão de ligação contendo a matriz de suporte (Promega) e o acrescen- tando ao aparelho a vácuo de coluna de seringa.

Usar o vácuo, filtrar a matriz.

Usar o vácuo, lavar com a matriz com 1 ml em IPA a 80%

Adicionar 2 ml de tampão de dessuifonação de OD (NaOH a 0,3 M em IPA a 80%) e incubar em temperatura ambiente durante 10 minutos. Usar o vácuo, remover o tampão.

Usar o vácuo, lavar com 1 ml em IPA a 80%.

3. Remover a coluna da seringa e colocar em um tubo de micro- centrífuga de 1,5 ml. Eluir 5 χ 200 μΙ seguido por adição de 1 ml de EB

Tabela 5 descreve os resultados obtidos. Tabela 5

Marcador Ct médio SD Actina 33,1 0,2 GSTP1 O APC 31,1 0,2

Nesta linhagem celular o promotor de GSTP1 é conhecido ser não-metilado, portanto a carência de valores Ct para este marcador é espe- rada.

Exemplo 4

Um protocolo modificado para modificação de bissulfeto rápida e eficiente do DNA genômico

O kit de Metilação de DNA de EZ é fornecido por Zymo Resear- ch (Orange1 CA) para executar modificação de bissulfeto de DNA. Conforme recomendação do fabricante, a amostra de DNA a ser modificada é incubada com o reagente de conversão de bissulfeto a 50°C por 12 - 16 h. Estas con- dições foram modificadas para gerar DNA convertido de bissulfeto de quali- dade comparável em muito menos tempo. Várias temperaturas durante tem- pos diferentes foram testadas e demonstraram que incubação da amostra de DNA com reagente de conversão de bissulfeto a 70°C por 1 ■ 3 h fornece modificação de bissulfeto eficiente comparável às condições de modificação recomendadas no kit. Os dados abaixo mostram para análise de PCR espe- cífica para metilação com amostras de DNA incubadas com reagente de bis- sulfeto em temperaturas diferentes durante tempos diferentes. Figura 1 mostra que protocolo modificado de Veridex da conver-

são a 70°C, 2 ou 3 h, é equivalente ao recomendado pelo fabricante a 50°C por 16 h. Esta inovação torna este procedimento muito mais rápido. Exemplo 5

Um protocolo rápido e eficiente para extração de DNA e modifi- cação do Tecido Embutido em parafina

Extração de DNA genômico e sua modificação de bissulfeto an- tes de ser usado em uma reação de MSP compreende procedimentos muito significativos a montante que são parte deste ensaio diagnóstico in vitro. Es- tes procedimentos podem ser duradouros envolvendo muitas etapas tedio- sas e podem também aumentar as chances de contaminação da amostra. Combinando o uso de um tampão de lise, 10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCI, 2 mM EDTA, 0,5% SDS incluindo proteinase K e um kit de modificação de bissulfeto, um protocolo rápido e simples de processamento da amostra para restabelecer e modificar as quantidades mínimas de DNA disponíveis destes tipos de amostra foi desenvolvido.

As etapas a seguir foram executadas:

1. Tecido de FFPE (Biópsias) (seções de 5 χ 10 μ) é colocado em tubos Eppendorf.

2. Girar o tubo brevemente e adicionar 500 μΙ de Xileno, subme- ter a vórtice brevemente em velocidade média.

3. Incubar em TA por 10 min. (Durante a incubação pelo menos em 2 intervalos misturar a amostra invertendo várias vezes).

4. Centrifugar em velocidade máxima por 10 min em temperatura

ambiente.

5. Remover o sobrenadante decantando o líquido cuidadosa- mente sem perder o pélete.

6. Adicionar 500 μΙ de etanol (100%, 200 prova) ao pélete para remover o xileno residual. Submeter a vórtice brevemente em velocidade

média e deixar os tubos repousarem por 5 min, misturar invertendo várias vezes.

7. Centrifugar em velocidade máxima por 10 min em temperatura

ambiente.

8. Remover o etanol decantando o líquido cuidadosamente sem

perder o pélete.

9. Repetir as etapas 7-10. Certificar de decantar a maioria do líquido nesta etapa.

10. Incubar o tubo microcentrifugado aberto a 50 - 55°C por 10 - 15 min em um forno para evaporar o etanol residual. Antes de ir para a pró- xima etapa, certificar que todo o etanol evaporou. Se não, incubar mais tem- po. 11. Adicionar 40 μΙ de tampão de Iise de TNES (Tris pH 8,0 a 10 mM, NaCI a 150 mM, EDTA a 2 mM, SDS a 0,5%) e suspender o tecido sa- cudindo o tubo.

12. Adicionar 10 μΙ de Proteinase K (20 mg/ml), submeter a vór- tice brevemente, girar muito brevemente.

13. Incubar a amostra a 56°C O/N em um bioco de aquecimento com agitação a 500 rpm.

14. Na manhã seguinte, girar os tubos brevemente e verificar o tecido para digestão completa. Se houver qualquer tecido deixado, adicionar 2 μΙ de Proteinase K fresca (20 mg/ml), misturar mediante vórtice suave e incubar mais 1 h a 56°C, 500 rpm em bloco de aquecimento.

15. Incubar os tubos a 70°C χ 10 min no bloco de aquecimento, girar e armazenar a -20°C para armazenamento a longo prazo ou prosseguir diretamente para modificação de bissulfeto de DNA extraído usando um kit de modificação de DNA comercialmente disponível de Zymo Research.

16. Adicionar 5 μΙ de tampão de diluição M diretamente a 45 μΙ de lisado de tecido

17. Misturar a amostra sacudindo ou pipetando para cima e para baixo. Girar a amostra brevemente. Incubar a amostra a 37°C durante 15 minutos em um bloco de aquecimento com agitação a 1100 rpm.

Durante a incubação de 15 min, preparar o Reagente de Con- versão de CT (conforme as instruções do fabricante).

18. Após a incubação de 15 minutos acima, adicionar 100 μΙ do Reagente de Conversão de CT preparado (após girar brevemente) para ca- da amostra e submeter a vórtice ligeiramente (a amostra pode ficar turva). Girar a amostra brevemente. Incubar a amostra a 70°C por 3 h com o bloco de aquecimento (agitando a 1100 rpm) coberto com a chapa de alumínio. (O Reagente de Conversão CT é sensível à luz, assim tentar minimizar a expo- sição de reação à luz).

19. Girar a amostra brevemente. Incubar a amostra em gelo por

min.

20. Adicionar 400 μΙ de tampão de ligação M à amostra e mistu- rar pipetando para cima e para baixo

21. Carregar todo o sobrenadante (incluindo qualquer precipita- do) sobre uma Coluna de Zymo-Sin I e colocar a coluna em um tubo de cole- ta de 2 ml e centrifugar em velocidade máxima por 15 - 30 segundos. Des- cartar o fiuxo

22. Adicionar 200 μΙ de Tampão de lavagem M à coluna.

23. Centrifugar em velocidade máxima por 15-30 segundos. Descartar o fluxo.

24. Adicionar 200 μ! de Tampão de Dessulfonação M à coluna e deixar a coluna repousar em temperatura ambiente por 15 minutos.

25. Centrifugar em velocidade máxima durante 15-30 segun- dos. Descartar o fluxo.

26. Adicionar 200 μΙ de Tampão de lavagem M à coluna.

27. Centrifugar em velocidade máxima por 15 - 30 segundos.

28. Adicionar outros 200 μΙ de Tampão de lavagem M à coluna.

29. Centrifugar em velocidade máxima durante 30 seg (Uma du- ração de giro mais longa para esta última lavagem é necessária para a re- moção completa dos resíduos do tampão de lavagem). Descartar o fluxo.

30. Colocar a coluna em um tubo limpo de 1,5 ml.

31. Adicionar 25 μΙ de tampão de eluição M diretamente à matriz da coluna. Deixar a coluna repousar 1 min em TA. Centrifugar em velocidade máxima durante 1 minuto para eluir o DNA.

32. Armazenamento o DNA eluído a -80°C.

33. Use 5 μΙ em reação de MSP.

O protocolo descrito acima exclui o uso de um Kit de purificação de DNA antes da modificação de bissulfeto, assim, reduzindo os tempos de processamento da amostra, impedindo perdas do DNA durante a purifica- ção, reduzindo o custo, e reduzindo as chances de contaminação.

Tabela 6 mostra que usando o tecido Iisado diretamente para modificação de bissulfeto do DNA dá Cts comparáveis e até mesmo mais baixos que o DNA purificado usando o kit de isolamento de DNA de Qiagen. Desse modo, purificação adicional do DNA não é requerida antes da modifi- cação do DNA usando o kit de metilação de DNA EZ de Zymo Research. Também, os dados mostram que combinando a digestão de TNES/PK e o kit de metilação de DNA de EZ rende mais amostra de DNA. Tabela 6

Tecido de FFPE Procedimento de extração de DNA Ct de β- actina Ct de GSTP1 Seções de 2 χ 5 μ Kit de isolamento de DNA de Qia- gen 30,1 30,9 Seções de 2 χ 5 μ Digestão de TNES/PK 25,4 26,7

Tabela 7 mostra que o iisado direto do tecido de biópsia de FF-

PE pode ser usado de forma bem sucedida para modificação de DNA a ju- sante com resultados comparáveis e até mesmo melhores quando compara- dos usando Kit de isolamento de DNA de Qiagen1 desse modo evitando eta- pas de purificação de DNA desnecessárias e perdas.

Tabela 7

Cts médio de β actina Cts médio de β ac- tina Biópsias do núcleo de próstata Protocolo de TNES/PK Isolamento de DNA de Qiagen Prep da amostra (40 mícrons) (50 mícrons) Vol. da elução de Zymo 25 μΙ 50 μΙ Introdução em PCR 5 μΙ 5 μΙ 60A 34,45 33,95 60B1 32,75 34,30 60B2 32,90 33,25 64A 33,30 34,20 64B 35,70 indeterminado

Ensaio de metilação de DNA é desenvolvido para ser usado em

amostras de paciente tais como tecidos fixos em formalina, tecidos embebi- dos em parafina, amostras de urina e de sangue recentemente colhidas compreendendo um recurso inestimável para estudos translacionais de cân- cer e uma variedade de outras doenças. Processamento das amostras é uma parte a montante fundamental deste ensaio de diagnóstico. Convencio- nalmente, DNA é purificado destes tipos de amostra usando procedimentos com base em coluna ou extração de fenol-clorofórmio padrões e depois submetido a procedimentos de modificação de bissulfeto. Vários kits comer- ciais existem para purificação de DNA de tecidos embebidos em parafina, e fluidos do corpo. Porém, perdas durante tais procedimentos de purificação extensivos podem reduzir significativamente os rendimentos do DNA quando quantidade muito pequena de amostra de partida de tecido ou fluido do cor- po estiver disponível. Rendimentos baixos de DNA podem causar impacto severamente ao desempenho do ensaio a jusante e pode também ser dura- douro. Para evitar perdas de DNA, alguns estudos usaram Iisado de tecido digerido diretamente para modificação de bissulfeto de DNA genômico u- sando padrão em protocolos de modificação de bissulfeto da solução. O pro- tocolo desenvolvido nesta invenção (referido como protocolo de TNES) rápi- da e eficientemente extrai e modifica com bissulfeto o DNA genômico usan- do o extrato de tecido Iisado desproteinado ou células Iisadas de sedimento de urina e diretamente usando este com um kit de metilação de DNA comer- cialmente disponível tal como Zymo Research EZ para modificação de bis- sulfeto a jusante sem qualquer etapa de purificação adicional. Além disso, a presente invenção melhora o desempenho do ensaio de PCR de multiplexa- ção minimizando a perda durante as etapas de purificação adicionais. Exemplo 6

Processar as amostras de DNA de urina A. Protocolo para extração de DNA das amostras de urina (pro-

tocolo de TNES)

1. Após coleta, a urina será mantida a 4°C até processada.

2. A urina é colocada em um tubo de polipropileno Falcon de 50 ml rotulado e as células LNCap (10.000 células/50 ml) representando as cé-

lulas tumorais protegidas em um paciente de câncer de próstata são espiga- das por tubo. Depois as células e particulados são peletizados através de centrifugação a 3.000 χ g a 4°C. 3. Seguindo centrifugação, cuidadosamente decantar o sobre- nadante da urina em tubo de 50 ml estéril rotulado e executar as lavagens dos péletes nas Etapas 2.

4. Para a primeira lavagem, o pélete é lavado a 4°C com 40 ml de PBS frio no tubo original de 50 ml, suavemente inverter o tubo várias ve- zes para ressuspender o pélete, e centrifugar a 3.000 χ g. Aspirar a lavagem de PBS usando um vácuo conectado a um tubo de vidro ou de plástico es- treito longo (pipetar de Pasteur de extração ou ponta de plástico longa) para remover tanto quanto possível da lavagem e impedir desalojamento do péle-

te em uma área grande do tubo (lavagem de descarte).

5. Para a segunda lavagem, o pélete é ressuspenso em um vo- lume menor de 1 ml de PBS frio suavemente pipetando para cima e para baixo com um Pipetman. Uma vez o pélete seja suspenso, depois transferir do tubo de 50 ml para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Com um adi-

cional de 0,4 ml de PBS, enxaguar a ponta e o tubo de 50 ml para restabele- cer tanto quanto possível o pélete e combinar com o 1 ml original do tubo de 1,5 ml.

6. Centrifugar a 10.000 χ g durante 5 min e remover a lavagem por aspiração a vácuo com uma pipeta/ponta de plástico de extração. Usar

inclinação suave do tubo para remover como tanto líquido quanto possível (lavagem de descarte). O tubo contendo o pélete de urina lavada é depois colocado na mesma caixa como o tubo de 50 ml de urina clarificada e arma- zenada a -20°C até transporte.

7. A -100 μΙ da pélete lavada adicionar 100 μΙ de tampão de Iise

de TNES (Tris pH 8,0 a 10 mM, NaCI a 150 mM, EDTA a 2 mM, SDS a

0,5%), incubar @ 56°C por 30 min e depois armazenados a -20°C até pro- cessamento com kit de modificação de bissulfeto (vide abaixo, parte II). No caso de células apenas, 20 μΙ de tampão de TNES foram adicionados a 20 μΙ da suspensão celular.

II. Modificação de bissulfito de sódio de DNA genômico usando kit de metila- ção de EZ-DNA de Zymo Research

O Kit de Metilação de EZ DNA é fornecido por Zymo Research (Orange, CA) para executar a modificação de bissulfeto de DNA. Conforme recomendação do fabricante, a amostra de DNA a ser modificada é incubada com o reagente de conversão de bissulfeto a 50°C por 12 - 16 h. Estas con- dições foram agora modificadas para gerar DNA convertido com bissulfeto de qualidade comparável em muito menos tempo. Várias temperaturas e tempos diferentes foram testados e foi demonstrado que incubação da a- mostra de DNA com reagente de conversão de bissulfeto a 70°C por 1 - 3 h fornece modificação de bissulfeto eficiente comparável às condições de mo- dificação recomendadas no kit.

O protocolo é como segue para processar as amostras de urina:

TAMPÃO DE LAVAGEM M (Preparar antes de iniciar o uso do

kit)

Preparação do tampão de lavagem M: Adicionar 24 ml de etanol absoluto ao Concentrado de tampão de lavagem M para fazer o tampão de

lavagem M final para D5001 (Usar 96 ml de Etanol para D5002).

1. Procedimento de modificação de DNA

a. Adicionar 5 μΙ de tampão de diluição M diretamente a 45 μΙ de Iisado de urina ou para volume de amostra mais alta escalonar tampão de diluição M e Iisado bruto de urina proporcionalmente. Por exemplo, para 150

μΙ de Iisado de urina adicionar 20 μΙ de tampão de diluição M e 30 μΙ de água (total de 200 μΙ).

b. Misturar a amostra sacudindo ou pipetando para cima e para baixo. Girar a amostra brevemente. Incubar a amostra a 37°C por 15 min em um bloco de aquecimento com agitação a 1100 rpm.

Durante a incubação de 15 min, preparar o Reagente de Con-

versão CT (conforme instruções do fabricante).

c. Após a incubação de 15 minutos acima, adicionar 100 μΙ do Reagente de Conversão CT preparado (após girar brevemente) a cada a- mostra (ou adicionar 400 μΙ de reagente de CT para um protocolo escalona-

do) e submeter a vórtice ligeiramente (a amostra pode ficar turva). Girar a amostra brevemente, incubar a amostra a 70°C por 3 h com o bloco de a- quecimento (agitando a 1100 rpm) coberto com chapa de alumínio. (O Rea- gente de Conversão CT é sensível à luz, assim tentar minimizar a exposição de reação à luz).

2. Dessalgar

a. Girar a amostra brevemente. Incubar a amostra em gelo por 10 min. No caso do volume mais alto de amostra de urina, dividir em dois

tubos de 300 μΙ cada.

b. Adicionar 400 μΙ de tampão de ligação M à amostra e misturar pipetando para cima e para baixo ou para amostras de urina escalonadas adicionar 800 μΙ de tampão de ligação M a cada alíquota, misturada e rapi-

damente girada.

c. Carregar todo o sobrenadante (incluindo qualquer precipitado) sobre uma coluna de Zymo-Spin I e colocar a coluna em um tubo de coleta de 2 ml e centrifugar em velocidade máxima por 15 - 30 segundos. Descartar o fluxo. Para um volume de amostra mais alto, esta etapa é repetida adicio-

- 15 nando o sobrenadante de cada tubo dividido de uma vez na coluna e centri- fugar até toda a amostra ser carregada sobre a coluna.

d. Adicionar 200 μΙ de tampão de lavagem M à coluna.

e. Centrifugar em velocidade máxima por 15 - 30 segundos. Descartar o fluxo.

3. Dessulfonação, 2Q dessalgação e eluição

a. Adicionar 200 μΙ de Tampão de Dessulfonação M à coluna e deixar a coluna repousar em temperatura ambiente por 15 minutos.

b. Centrifugar em velocidade máxima por 15 - 30 segundos. Descartar o fluxo.

c. Adicionar 200 μΙ de tampão de lavagem M à coluna.

d. Centrifugar em velocidade máxima por 15 - 30 segundos.

e. Adicionar mais 200 μΙ de tampão de lavagem M à coluna.

f. Centrifugar em velocidade máxima durante 30 seg (uma dura- ção de giro mais longa para esta última lavagem é necessária para a remo-

ção completa dos resíduos do tampão de lavagem). Descartar o fluxo.

g. Colocar a coluna em um tubo limpo de 1,5 ml.

h. Adicionar 25 μΙ de tampão de eluição M diretamente à matriz de coluna. Deixar a coluna repousar 1 min em TA. Centrifugar em velocidade máxima durante 1 minuto para eluir o DNA.

i. Armazenar o DNA eluído a -80°C. j. Usar 5 μΙ em reação de MSP.

Resultados:

O protocolo descrito acima exclui o uso de um Kit de purificação de DNA antes da modificação de bissulfeto, assim, reduzindo os tempos de processamento da amostra, impedindo perdas de DNA durante a purifica- ção, reduzindo o custo, e reduzindo as chances de contaminação. 1O Tabela 8 mostra os resultados finais do ensaio de MSP em Ce-

pheid Smart Cycler com amostras de DNA processadas por protocolo de TNES de 50 ml de urina. Cts melhores de β-actina e GSTP1 (até 3 Cts mais baixos) são observados usando o protocolo de digestão de TNES/PK acima descrito no uso de DNA purificado usando Kit de isolamento de DNA de Qia- -15 gen comercialmente disponível (kit de RNA Viral de QiAmp). Desse modo, purificação adicional de DNA não é requerida antes da modificação de DNA usando este método. Também, os dados mostram que combinando digestão de TNES/PK e kit de metilação de DNA EZ rende mais amostra de DNA. Tabela 8. Protocolo de TNES vs Kit de isolamento de DNA de Qiagen (10.000 células LNCaP /50 ml de urina)

ENTRADA Protocolo de extra- ção Ct médio de β-actina Ct médio de GSTP1 50 ml de Urina / 104 células LNCaP TNES 29,9 32,9 50 ml de Urina / 104 células LNCaP Qiagen 30,9 34,6 104 células LNCaP TNES 32,15 30,6 104 células LNCaP Qiagen 35,3 33,7

Resultados com protocolo de extração de TNES são até mesmo

mais compelativos em diluições seriais de células de próstata LNCaP (faixa de 10.000 a 100 espigadas por 50 ml de urina de fundo geral de doadores saudáveis). Protocolo combinado para extração de DNA seguido diretamen- te por modificação de bissulfeto permite melhorar a sensibilidade do ensaio de metilação de próstata em 10 vezes (Tabela 9) quando comparado com dois kits comerciais combinados. Protocolo de TNES permite a detecção de 100 células por 50 ml de urina, o nível sendo indetectável através do proto- colo de Qiagen usando valor de Ct e análise de número de cópias.

T^bela 9. Protocolo de TNES vs. Kit de isolamento de DNA de Qiagen (célu- las LNCaP: 10.000, 1000 e 100/50 ml de urina).

Protocolo de TNES-ZR BMK Protocolo de Qiaqen-ZR BMK Tarefa Ct de Cópias Razão Gst- Ct de Có- Razão de # célu- GSTP de pi Μ/β- GSTP1 pias Gst-pi Μ/β- las/ml GSTP actina (có- de actina (có- de urina pias) X 1000 GST P1 pias) X 1000 104/50 29,70 6365 487 30,88 3051 575 104/50 31,10 2651 113 33,63 546 68 104/50 31,38 2232 126 33,83 482 58 103/50 35,05 224 17 38,93 20 2 103/50 34,43 331 22 38,58 25 3 102/50 38,60 24 2 00,00 0 0 102/50 0,00 0 0 00,00 0 0 Os valores de Ct, números de cópias e razões de metilação são apresen- tados para réplicas de amostra da mesma carga de célula em 50 ml de urina.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum deta- lhe por via de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendi-

mento, as descrições e exemplos não deveriam ser interpretados como limi- tando o escopo da invenção. Referências

20020197639, 20030022215, 20030032026, 20030082600, 20030087258, 20030096289, 20030129620, 20030148290, 20030157510, 20030170684, 20030215842, 20030224040, 20030232351, 20040023279, 20040038245, 20040048275, 20040072197, 20040086944, 20040101843, 20040115663, 20040132048, 20040137474, 20040146866, 20040146868, 20040152080, 20040171118, 20040203048, 20040241704, 20040248090, 20040248120, 20040265814, 20050009059, 20050019762, 20050026183, 20050053937, 20050064428, 20050069879, 20050079527, 20050089870, 20050130172, 20050153296, 20050196792, 20050208491, 20050208538, 20050214812, 20050233340, 20050239101, 20050260630, 20050266458, 20050287553, 20070148670 e patentes US números 5786146, 6214556, 6251594, 6331393 e 6335165.

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Claims (38)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de modificar uma macromolécula sem extração ante- rior de uma amostra compreendendo as etapas de a. converter a macromolécula na amostra com uma química b. remover ou converter intermediários químicos, se necessário; e c. purificar a macromolécula modificada resultante.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as macro- moléculas são selecionadas do grupo que consiste em DNA, RNA1 metabóli- tos celulares, lipídios, carboidratos e proteínas.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a macromo- lécula é DNA e é selecionado de viral, nucíeico, mitocondrial, plastídio, bac- teriano e sintético.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a macromo- lécula é RNA e é selecionado de rtRNA, tRNA, miRNA, rRNA e mRNA.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a macromo- lécula é um metabólito celular e é selecionado daqueles produzidos por um ciclo metabólico ou efeitos enzimáticos.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a macromo- lécula é lipídio e é selecionado de Iipossomasf lipídios de membrana celular, lipídios de membrana intracelular e lipídios extracelulares.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a macromo- lécula é carboidrato e é selecionado de carboidratos ligados a proteína e carboidratos ligados a ácido nucleico.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a macromo- lécula é proteína e é selecionada de intracelular e extracelular.

9. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a modifica- ção é selecionada de bissulfeto e biotinilação.

10. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a modifica- ção é selecionada de fluoração e metilação.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a modifica- ção é selecionada de aquecimento, formação de lipossoma, formação de micela, formação de unicamada e formação de bicamada.

12. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a modifica- ção é selecionada de oxidação, desoxidação, aminação e desaminação.

13. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a modifica- ção é selecionada de fosforilação, desfosforilação, metilação, biotinilação, aminação, desaminação, glicosilação e desglicosilação.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é selecionada de tecido, fluido do corpo, uma amostra de biópsia, e tecido preservado.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é tecido e é selecionado de órgãos inteiros, órgãos dissecados, epitélio, neu- ral, gastrointestinal, músculo, cardíaco, mucoso e endotélio.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é fluido do corpo e é selecionado de sangue total, plasma, urina, saliva, ví- treo e soro.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é uma amostra de biópsia e é selecionada de aspirado de agulha fina, seção de tecido e amostra de pele.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é tecido preservado e é selecionado de congelado fresco, parafina embebida e preservada em um reagente de preservação.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o reagen- te de preservação é selecionado de formalina, RNAIater® e dimetilsulfóxido.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a purifica- ção é selecionada de, com base em, partícula, precipitação, centrifugação, eletroforética e troca de carga.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a purifi- cação é com base em partícula e é selecionada de afinidade, classificação por tamanho e magnética.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a partícu- la de classificação por tamanho é selecionada de, com base em, sílica e ter- ra diatomácea.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a separa- ção eIetroforética é através de tamanho e/ou carga.

24. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a separa- ção eletroforética é por um gel formado de polímeros de peso molecular bai- xo e/ou capilar.

25. Método de extrair e modificar DNA compreendendo as eta- pas de a. obter uma amostra contendo o DNA; b. incubar a amostra com uma quantidade de um bissulfeto e durante um tempo e sob condições suficientes para converter uma quantida- de suficiente dos resíduos de citosina não-metilada no DNA para resíduos de uracila; c. aplicar o DNA na amostra a uma coluna; d. lavar o DNA ligado para remover os contaminantes; e. incubar o DNA ligado à coluna com um reagente de dessulfo- nação durante um tempo e sob condições suficiente para dessulfonação o- correr; f. lavar o DNA ligado para remover o reagente de dessulfonação; e g. eluir o DNA modificado de bissulfeto da coluna.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o DNA é obtido por um método compreendendo as etapas de: a. obter uma amostra de célula; e b. Iisar a amostra de célula para obter um lisado.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o lisado é de cerca de 0,01 a 30 pg.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o lisado é diretamente aplicado à coluna na etapa b da reivindicação 25.

29. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o lisado é obtido através de incubação com uma concentração alta de proteinase e/ou de sal e/ou detergente, sonicação, tratamento de congelação-descongeiação ou rompimento mecânico.

30. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o bissul- feto é bissulfeto de sódio ou meta bissulfeto.

31. Método de acordo com a reivindicação 25, em que as condi- ções de incubação da etapa b são cerca de 1-16 horas a 50-95°C com ou sem termociclização.

32. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a dessul- tonação é executada alterando o pH.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a dessul- fonação é executada sob condições básicas.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que as condi- ções incluem hidróxido de sódio e um álcool.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o álcool é isopropanol ou etanol.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a dessul- íonação ocorre de cerca de 0-30 minutos em cerca de 0°C a cerca de 50°C.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que a dessul- fonação ocorre a cerca de 15 minutos.

38. Método de acordo com a reivindicação 36, em que a dessul- fonação ocorre em temperatura ambiente.