ES2326341T3 - Metodo para el aislamiento de arnm a partir de tejido fijado con formalina, embebido en parafina. - Google Patents
Metodo para el aislamiento de arnm a partir de tejido fijado con formalina, embebido en parafina. Download PDFInfo
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Abstract
Método para recuperar ARN a partir de una muestra de tejido biológico fijado con formalina, embebido en parafina que comprende: a) desparafinar la muestra, b) poner en contacto dicha muestra con una disolución que comprende una concentración eficaz de proteinasa K y calentar la muestra en dicha disolución hasta una temperatura en el intervalo de aproximadamente 30 a aproximadamente 60ºC, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 12 a 20 horas, c) añadir una concentración eficaz de proteinasa K a la disolución obtenida de b) durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 minutos a un intervalo de temperatura de aproximadamente 40 a aproximadamente 75ºC, y d) recuperar dicho ARN a partir de dicha disolución.
Description
Método para el aislamiento de ARNm a partir de
tejido fijado con formalina, embebido en parafina.
La presente invención se refiere al aislamiento
de ARNm a partir de una muestra de tejido biológico fijado con
formalina, embebido en parafina.
La determinación cuantitativa de los niveles de
expresión génica es un enfoque poderoso para el análisis comparativo
de tejido normal y neoplásico. La obtención del perfil de expresión
génica es cada vez más importante tanto en la investigación
biológica como en la práctica clínica y se ha usado, por ejemplo,
para clasificar diversos tipos de cáncer, y para predecir el
desenlace clínico del cáncer, tal como cáncer de mama y cáncer de
pulmón.
El análisis de la expresión génica al nivel del
ARNm es un componente central de la obtención del perfil molecular.
Están bien descritos métodos sensibles y específicos para estudiar
el ARN derivado de células y tejidos nuevos, e incluyen técnicas
basadas en el uso de la reacción en cadena de la polimerasa con
transcriptasa inversa (RT-PCR). Recientes mejoras
tecnológicas, que incluyen la introducción de procedimientos de
RT-PCR en tiempo real basada en fluorescencia
sumamente sensible, permiten ahora una cuantificación rápida y
específica de incluso pequeñas cantidades de ARNm. Sin embargo, el
uso de métodos basados en RT-PCR para cuantificar el
ARNm en muestras clínicas ha estado restringido por la limitada
disponibilidad de tejidos de estudio congelados o nuevos adecuados.
En muchas situaciones en las que la obtención del perfil de
expresión génica es potencialmente útil, no hay material suficiente
para el análisis. Para permitir conclusiones en cuanto a la
importancia clínica de los resultados obtenidos con tales técnicas,
es esencial el examen de grandes números de muestras de tejido
patológico que representan diferentes estadios de enfermedad y
grados y tipos de tumores histológicos.
Una posible respuesta a este problema puede
encontrarse en los archivos de muestras de tejido fijado con
formalina, embebido en parafina (FFPE) que se han archivado en
cantidad en los departamentos de patología, junto con sus historias
clínicas y pronósticos por todo el mundo. Estas colecciones
representan ya un recurso de investigación incalculable para
estudiar la base molecular de la enfermedad, haciendo posible
realizar grandes estudios retrospectivos que correlacionan
características moleculares con la respuesta terapéutica y el
desenlace clínico. Por consiguiente, las muestras fijadas con
formalina atraen una atención creciente como fuentes de ARN. Las
muestras de tejido fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE)
de archivo, conjuntamente con los datos clínicos son la base más
ampliamente disponible para tales estudios retrospectivos. Sin
embargo, la cuantificación fiable de la expresión génica en tejido
fijado con formalina, embebido en parafina ha estado sometida a
serias limitaciones hasta la fecha.
Las técnicas para la extracción y el análisis de
ADN de tejidos FFPE se han optimizado permitiendo que se realice
una gama de estudios genéticos moleculares en material
histopatológico de diagnóstico rutinario y de archivo. Aunque esto
es un problema menor para el ADN, el ARN aislado a partir de bloques
de tejido embebido en parafina es de mala calidad debido a que
puede producirse una degradación extensa del ARN antes de la
finalización del procedimiento de fijación con formalina. Además,
la fijación con formalina provoca reticulación entre ácidos
nucleicos y proteínas y modifica covalentemente el ARN mediante la
adición de grupos mono-metilol a las bases. Como
resultado, las moléculas son rígidas y propensas a cizalladura
mecánica, y las reticulaciones pueden comprometer la extracción del
ARN, la transcripción inversa y el análisis de cuantificación
posteriores. Por tanto, con el fin de utilizar tejidos FFPE como
fuente para el análisis de la expresión génica, se requiere un
método fiable para la extracción de ARN a partir de la matriz
reticulada.
Desde que Rupp (Rupp, G.M. y Locker, J., 1988)
notificó por primera vez la hibridación de tipo Northern de
muestras fijadas con formalina, se han realizado esfuerzos
significativos hacia la recuperación de ARN a partir de tejidos
fijados con formalina. Se realizaron diversas modificaciones en las
etapas de extracción, usando RT-PCR para evaluar el
desenlace. En todos los informes, las amplificaciones satisfactorias
estaban limitadas a pequeños fragmentos y las sensibilidades en la
detección del transcrito eran mucho peores que con material nuevo,
aunque sus alteraciones en los protocolos mejoraron un tanto los
resultados. Se han establecido las siguientes tres posibilidades
como motivos para los malos resultados: el ARN se degradaba en el
tejido antes, durante o tras la fijación; el ARN era resistente a
la extracción probablemente debido a la reticulación con proteínas;
el ARN extraído a partir de las muestras fijadas estaba modificado
químicamente por la formalina de una forma que es todavía esquiva.
Sin embargo, faltan pruebas directas para cada una de estas
posibilidades e investigación seria en cuanto a la contribución de
estas tres posibilidades a los resultados globales.
El documento U.S. 6.248.535 da a conocer un
método para el aislamiento de ARN a partir de muestras de tejido
fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE). En tal método, la
muestra de tejido se desparafina en primer lugar y se homogeneiza
adicionalmente en una disolución que comprende un agente caotrópico,
como, por ejemplo, isotiocianato de guanidinio. Después de eso, el
homogeneizado se calienta a aproximadamente 100ºC en una disolución
con un agente caotrópico. Se recupera adicionalmente el ARN a partir
de la disolución mediante, por ejemplo, extracción con
fenol-cloroformo.
Krafft et al. (1997) Molecular Diagnosis
vol. 2, nº 3, páginas 217-230 describe el
aislamiento y la amplificación de ARN a partir de tejido FFPE. Se
describe un procedimiento que comprende una digestión con proteinasa
K, seguida de precipitación con alcohol y RT-PCR.
Se sometieron a prueba varias concentraciones de proteinasa K; se
obtuvo una digestión proteolítica óptima con altas concentraciones
de proteinasa K.
Masuda et al. (1999) Nucleic Acid
Research vol. 27, nº 22, páginas 4436-4443 describen
varios métodos para la extracción de ARN a partir de muestras
fijadas con formalina, encontrando que una digestión con proteinasa
K a 45ºC durante una hora, seguida de precipitación con alcohol y un
tratamiento con ADNasa.
Spetch et al. (2001) American Journal of
Pathology vol. 158, nº 2, páginas 419-429 describe
un procedimiento para el análisis cuantitativo de la expresión
génica en tejido tumoral fijado con formalina y embebido en
parafina archivado microdiseccionado a través de la extracción de
ARN a microescala conjuntamente con la reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo
real.
Finke, J. et al (1993). Biotechniques,
Informa Life Sciences, vol. 14, nº 3, páginas
448-453 describe una estrategia y un gen de
mantenimiento útil para el análisis del ARN de tejidos fijados con
formalina, embebidos en parafina mediante PCR.
Sin embargo, los métodos anteriores no
proporcionan suficiente sensibilidad cuando han de detectarse
pequeñas cantidades de ARN. Se necesitan particularmente técnicas
más fiables y precisas para el aislamiento del ARN a partir de
tejido embebido en parafina para el estudio de la expresión génica
en tejidos tumorales. La capacidad para estudiar de manera
rutinaria la expresión del ARNm en tejidos tumorales FFPE, incluso
cuando están presentes sólo pequeñas cantidades, sería un
importante avance, que abriría el archivo de histopatología a la
obtención del perfil molecular y permitiría el análisis de la
expresión génica al nivel del ARN en muestras de diagnóstico
convencionales y permitiría establecer buenas correlaciones entre la
expresión génica y el desenlace clínico.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un método fiable para recuperar ARN a partir de una muestra de
tejido biológico fijado con formalina, embebido en parafina que
comprende:
- a)
- desparafinar la muestra,
- b)
- poner en contacto dicha muestra con una disolución que comprende una concentración eficaz de proteinasa K y calentar la muestra en dicha disolución hasta una temperatura en el intervalo de aproximadamente 30 a aproximadamente 60ºC, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 12 a 20 horas,
- c)
- añadir una concentración eficaz de proteinasa K a la disolución obtenida de b) durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 minutos a un intervalo de temperatura de aproximadamente 40 a aproximadamente 75ºC, y
- d)
- recuperar dicho ARN a partir de dicha disolución.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de la invención tiene la ventaja de
minimizar el número de manipulaciones, eliminar la necesidad de
disolventes potencialmente tóxicos y aumentar significativamente la
cantidad de ARN recuperado, y por tanto la sensibilidad, en
comparación con métodos anteriores.
Con el fin de facilitar el entendimiento de la
presente descripción, se explicará a continuación el significado de
algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:
El término "ARN" se refiere a ácido
ribonucleico. Una secuencia de ARN es una secuencia de
ribonucleótidos.
El término "ARNm" se refiere a ácido
ribonucleico mensajero, que es la fracción de ARN total que se
traduce en proteínas.
El término "ADNc" se refiere a una
secuencia de nucleótidos complementaria de una secuencia de
ARNm.
La expresión "muestra de tejido biológico
fijado con formalina, embebido en parafina" (FFPE) se refiere a
una muestra de tejido obtenida de un tejido que se ha fijado
previamente en una disolución de formalina y después de eso se ha
embebido en parafina. Aunque no está disponible ampliamente tejido
tumoral congelado, se preparan de manera rutinaria bloques de
parafina de cada tipo de tejido, tal como, por ejemplo, un tejido
tumoral, tras la cirugía, lo que permite investigaciones
retrospectivas a gran escala.
Se toman de manera rutinaria muestras
patológicas de pacientes para su uso en el diagnóstico de la
enfermedad y el estudio de patrones de marcadores de la enfermedad.
Los hospitales universitarios, las facultades de medicina y las
universidades tienen almacenes que contienen millones de tales
muestras, algunas de las cuales se remontan a más de 30 años. Estas
muestras representan un recurso importante y, en la actualidad, poco
usado para el estudio de la evolución de la enfermedad, la
detección de organismos virales, bacterianos o parásitos, anomalías
del ADN o la detección de enfermedades genéticas. Muchas muestras
patológicas, por ejemplo bloques de archivo y extensiones en
portaobjetos patológicas, están fijadas químicamente para conservar
la arquitectura del tejido y especialmente la conformación de las
proteínas in situ. El uso de fijación con formalina e
incrustación en parafina para fijar y conservar muestras de tejido
tomadas de biopsias, resecciones y frotis es casi universal.
Mientras que los fijadores comúnmente usados conservan eficazmente
la estructura de las proteínas, la extracción de ácidos nucleicos y
en particular ARN a partir de las muestras puede ser difícil. El
procedimiento de la invención mejora tal extracción y puede
aplicarse a cualquier muestra de tejido de una amplia gama de tipos
de tumores y a una gama ilimitada de genes diana.
La extracción de ARN a partir de muestras de
tejido patológico embebido en parafina de archivo es particularmente
útil en estudios retrospectivos en los que la determinación de un
diagnóstico molecular puede correlacionarse con el desenlace del
paciente, proporcionando en particular la posibilidad de
correlacionar la presencia o ausencia de una enfermedad particular,
tipo o diagnóstico morfológico, estadio de la enfermedad, pronóstico
y respuesta al tratamiento, cuando ya se sabe el desenlace clínico.
Esto tendrá implicaciones para la futura preparación de "perfiles
de expresión génica" de tumores individuales mediante los cuales
podrían determinarse los niveles de expresión en muestras de
pacientes individuales para una gama de genes que se sabe que
influyen en el desenlace clínico y la respuesta a diversos agentes
quimioterápicos, y entonces adaptar la quimioterapia a ese perfil.
También puede investigarse la presencia de polimorfismos, mutaciones
o deleciones con el método de la presente invención.
Los ejemplos de tejidos de los que pueden
extraerse ácidos nucleicos usando la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, tejido pulmonar tanto normal como canceroso,
tejido de colon, tejido pancreático, tejido de mama, tejido de
próstata, sangre y otros líquidos corporales o material celular que
contiene ácidos nucleicos que pueden detectarse.
El ARN aislado mediante el método de la
invención es adecuado para varias aplicaciones en biología molecular
incluyendo la transcripción inversa. El ARN purificado puede usarse
para determinar el nivel de expresión génica en una muestra de
tejido biológico fijado con formalina, embebido en parafina mediante
amplificación por reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa (RT-PCR). Usando cebadores de
PCR apropiados, puede determinarse el nivel de expresión de
cualquier ARN mensajero mediante el método de la invención.
A continuación, se facilitan detalles de cada
etapa del procedimiento.
Las muestras biológicas se fijan a menudo con un
fijador. Preferiblemente, las muestras de la invención están
fijadas con formalina, aunque también pueden preverse otros
fijadores. De hecho, se usan normalmente fijadores de aldehído
tales como formalina (formaldehído) y glutaraldehído. Otras técnicas
de inducción de fijación bien conocidas por el experto en la
técnica pueden incluir, pero no se limitan a, inmersión en alcohol u
otras disoluciones de fijación. Las muestras usadas para el método
de la presente invención están incrustadas en parafina y archivadas
para el análisis posterior.
En la etapa de desparafinación, la masa de
parafina se elimina de la muestra incrustada en parafina. Las
técnicas preferidas de la invención utilizan fusión directa para la
desparafinación, evitando el uso de disolventes orgánicos que
pueden degradar la muestra y dañar al medio ambiente. También tiene
la ventaja de reducir el número de manipulaciones y la posibilidad
de degradación o contaminación del ARN. La temperatura usada para
la fusión directa está en el intervalo de 50-65ºC,
de manera preferible aproximadamente 55ºC. Deben evitarse altas
temperaturas; de lo contrario la muestra puede degradarse.
Sin embargo, cualquier experto en la técnica
conoce bien otras varias técnicas para la desparafinación e
incluyen, pero no se limitan a, lavar con un disolvente orgánico
tal como benceno, tolueno, etilbenceno, xilenos y mezclas de los
mismos. Puede usarse cualquier técnica adecuada con la presente
invención.
Tal como se explicó anteriormente, la fijación
con formalina provoca reticulación entre ácidos nucleicos y
proteínas y modifica covalentemente el ARN mediante la adición de
grupos mono-metilol a las bases. Como resultado,
las moléculas son rígidas y propensas a cizalladura mecánica, y las
reticulaciones pueden comprometer la extracción del ARN, la
transcripción inversa y el análisis de cuantificación
posteriores.
Por tanto, en el método de la invención se usa
proteinasa K como enzima proteasa que puede descomponer tejidos y
proteínas ayudando a la liberación de ácidos nucleicos. La proteasa
también puede degradar nucleasas, lo que hace que el ARN liberado
sea más estable.
Por tanto, tras la desparafinación, las muestras
se ponen en contacto con una disolución que comprende una
concentración eficaz de proteinasa K, y se digieren posteriormente
en una disolución de digestión a una temperatura de aproximadamente
30ºC a aproximadamente 60ºC, durante un periodo de tiempo de
aproximadamente 12 a aproximadamente 20 horas. La enzima proteasa
sirve para producir al menos una descomposición parcial del tejido
de manera que se liberan ácidos nucleicos. En una realización
preferida, el periodo de tiempo es de aproximadamente 16 horas.
La proteinasa K (E.C. 3.4. 21.64 de
Tritirachium album) está comercialmente disponible como un
polvo liofilizado o en suspensión o disoluciones acuosas
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las concentraciones
de proteinasa K en la composición de extracción son preferiblemente
al menos de aproximadamente 25 \mug/ml o superiores, al menos de
aproximadamente 100 \mug/ml o superiores, o al menos de
aproximadamente 200 \mug/ml o superiores. Una cantidad de
aproximadamente 500 \mug/ml es la más preferida. La composición de
extracción de la presente invención es normalmente una disolución
acuosa, sin embargo, en ciertas realizaciones, la composición de
extracción puede estar en forma de una emulsión, suspensión,
dispersión acuosa o similares.
La parte acuosa de la composición de extracción
está a un pH alcalino de aproximadamente 7,5 o superior.
Preferiblemente, el pH de la composición de extracción es de
aproximadamente 8,0. El pH se logra usando un tampón. Puede usarse
cualquiera de varios agentes de tamponamiento en la composición de
extracción, cuya selección y cuyo uso pueden realizarse fácilmente
por el experto (véase por ejemplo Beynon y Esterby, Buffer
Solutions: The basics, BIOS Scientific Publishers, Oxford, 1996).
La cantidad de tampón usada depende del pKa y es suficiente como
para mantener el pH deseado. Los tampones útiles incluyen, pero no
se limitan a, ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico, ácido
3-(N-morfolino)etanosulfónico, tricina,
glicina, TRIS, fosfato y otros fácilmente evidentes para los
expertos en la técnica.
También pueden usarse tensioactivos, tales como
dodecilsulfato de sodio, en la disolución de digestión. Si están
presentes, se usan preferiblemente bajas cantidades.
Puede usarse un quelante de Ca^{2+}, tal como
EDTA, para complejar los iones que interfieren con la actividad de
la enzima de digestión de tejido. Si está presente en la composición
de extracción, está a una concentración de aproximadamente 100 mM o
inferior, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 50
mM o inferior, preferiblemente a una concentración de
aproximadamente 10 mM o inferior, preferiblemente a una
concentración de aproximadamente 1 mM o inferior.
La muestra se pone en contacto durante un
periodo de tiempo de aproximadamente 12 a 20 horas con la disolución
de proteinasa K y el tampón de digestión en condiciones suficientes
para liberar el ARN.
En una realización preferida, y con el fin de
mejorar la calidad del ARN extraído, el intervalo de temperatura de
la etapa de calentamiento para recuperar el ARN es de desde
aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60ºC, preferiblemente
desde aproximadamente 50-55ºC. Temperaturas
superiores pueden inactivar la enzima y degradar el ARN.
Con el fin de mejorar la calidad del ARN que va
a extraerse, se usa una etapa adicional de incubación con
proteinasa K en el método de la presente invención. Al contrario que
la enseñanza de la técnica anterior, en la que normalmente tras la
digestión se usa una etapa de calentamiento para inactivar la enzima
que queda, en la presente invención se añade enzima nueva a la
disolución y se lleva a cabo una corta etapa de digestión. Se ha
encontrado que esta corta digestión adicional mejora de manera
espectacular la cantidad de ARN extraído.
Otros documentos de la técnica anterior (Finke,
J. et al citado anteriormente) describen procedimientos de
aislamiento de ARN a partir de FFPE en los que se llevan a cabo
etapas de incubación adicionales con proteinasa K. Sin embargo,
tales procedimientos son largos, de hasta 60 horas y, por tanto, se
añade proteinasa K nueva cada 24 horas durante la incubación con el
tampón de digestión hasta que se digiere completamente el
tejido.
Los inventores han descubierto ahora que una
corta etapa de incubación adicional con proteinasa K tras la
primera etapa de digestión produce una potenciación significativa de
la calidad y cantidad del ARN extraído y posteriormente se logra
una mejora en la detección de la expresión génica (véase el ejemplo
2).
Por tanto, se añade una concentración eficaz de
proteinasa K a la disolución anterior durante un periodo de tiempo
extra de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 minutos a un
intervalo de temperatura de aproximadamente 40 a aproximadamente
75ºC. Los inventores han encontrado que esta última etapa con
proteinasa K es esencial para la solubilización apropiada del
tejido y la recuperación de ARN de buena calidad. De hecho, la
proteinasa K añadida en ese momento solubiliza completamente el
tejido y permite una extracción muy eficaz del ácido nucleico.
El método de la invención comprende además
recuperar dicho ARN a partir de la disolución. En una realización
particular, el ARN se recupera mediante extracción a partir de dicha
disolución con un disolvente orgánico insoluble en agua. En una
realización preferida, dicho disolvente orgánico insoluble en agua
comprende cloroformo. Preferiblemente, se usa una mezcla de
fenol/cloroformo.
En otra realización particular, dicho ARN se
purifica adicionalmente mediante precipitación con etanol. Un
experto en la técnica conoce bien protocolos de extracción de ARN,
véase por ejemplo Chomczynski P. et al., Anal. Biochem.,
1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532.
Tal como se muestra en los ejemplos de la
presente invención, si es necesario puede llevarse a cabo un
tratamiento con ADNasa tras la purificación del ARN. En algunos
casos, el ARN aislado de tejidos o células está contaminado con
cantidades traza de ADN genómico que puede detectarse mediante PCR
(Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la
polimerasa). Por tanto, con el fin de mejorar la calidad del ARN
extraído con el método de la presente invención, puede eliminarse
el ADN contaminante mediante tratamiento con ADNasa. Se añade ADNasa
al ARN extraído y se incuba a 37ºC durante un periodo de tiempo de,
por ejemplo, 30 minutos.
Alternativamente, puede realizarse una
amplificación por RT-PCR usando cebadores que no
amplificarán el ADN, que seleccionan por ejemplo una zona que se
superpone sobre dos exones. En tales casos, puede evitarse el
tratamiento con ADNasa, conservando adicionalmente la calidad del
ARN.
El extracto de ARN total obtenido representa el
material de trabajo para la siguiente etapa. El ARN extraído a
partir de muestras de tejido según la presente invención es adecuado
para la posterior amplificación. El experto en la técnica conoce
bien las condiciones y los principios generales para la
amplificación y detección de ácido nucleicos, tal como usando PCR,
y se describen en la bibliografía mencionada en los antecedentes de
la técnica.
Una vez que se ha obtenido la muestra y se ha
extraído el ARN total, puede llevarse a cabo la cuantificación del
nivel de ARNm cuantificando el nivel de ARNm o el nivel del ADNc
correspondiente del ARNm.
Pueden detectarse ácidos nucleicos amplificados
de varios modos conocidos, tales como los descritos en la patente
estadounidense número 4.965.188 (Gelfand et al.). Por
ejemplo, los ácidos nucleicos amplificados pueden detectarse usando
transferencia de tipo Southern, técnicas de transferencia puntual o
detección por captura de oligonucleótidos no isotópicos con una
sonda marcada. Alternativamente, la amplificación puede llevarse a
cabo usando cebadores que están marcados apropiadamente, y pueden
detectarse los productos de extensión del cebador amplificado
usando procedimientos y equipo para la detección del marcador.
En un ejemplo, la detección y cuantificación del
ARNm se llevan a cabo transfiriendo el ARNm a una membrana de
nailon por medio de técnicas de transferencia, tales como, por
ejemplo, transferencia de tipo Northern, y detectándolo con sondas
específicas del ARNm específico o de su ADNc.
En otro ejemplo, la cuantificación del ARNm
puede lograrse mediante un método de dos etapas que comprende una
primera etapa de amplificación del ARN, preferiblemente ARNm, o
amplificación del ADNc sintetizado mediante transcripción inversa
(RT) a partir del ARNm, y una segunda etapa de cuantificación del
producto de amplificación del ARNm o su ADNc correspondiente. Un
ejemplo de amplificación de ARNm consiste en transcribir de manera
inversa el ARNm en ADNc, seguido de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) usando los cebadores oligonucleotídicos apropiados
(documentos US 4.683.195, US 4.683.202 y US 4.965.188). Se han dado
a conocer anteriormente muchos métodos para detectar y cuantificar
los productos de amplificación por PCR, cualquiera de los cuales
podría usarse en esta invención. En una realización particular, la
amplificación y cuantificación del ARNm se lleva a cabo por medio
de RT-PCR cuantitativa en tiempo real
(Q-PCR) y posterior hibridación con una sonda
específica para el gen de interés, estando marcada opcionalmente
dicha sonda con un marcador apropiado, como por ejemplo una sonda
marcada radiactivamente (por ejemplo, marcadores radiactivos,
quimioluminiscentes o fluorescentes tales como fluoresceína,
Cye3-dUTP o Cye5-dUTP), hibridando
genes diana con las sondas y evaluando la hibridación
diana-sonda. Una sonda con una secuencia de ácido
nucleico que se aparea perfectamente con la secuencia diana dará
como resultado, en general, la detección de una señal de molécula
indicadora más fuerte de la que darán sondas con apareamientos
menos perfectos.
Las sondas que van a usarse son específicas para
el ARNm de interés o su ADNc. El experto en la técnica puede
diseñar fácilmente dichas sondas en vista de la secuencia de
nucleótidos del gen de interés usando cualquier software adecuado.
Según la invención, se seleccionan sondas del grupo de ácido
nucleicos incluyendo, pero sin limitarse a, ADN, ADN genómico
(ADNg), ADNc y oligonucleótidos; y pueden ser naturales o
sintéticas. Las sondas oligonucleotídicas son preferiblemente
oligonucleótidos de 20 a 25 meros mientras que las sondas de
ADN/ADNc tienen preferiblemente de 500 a 5.000 bases de longitud; no
obstante, en ambos casos, pueden usarse otras longitudes.
La etapa final del método consiste en comparar
el nivel (cantidad o concentración) de ARNm de interés o el nivel
de su ADNc determinado en una muestra del sujeto en análisis, con el
nivel de ARNm de interés o con el nivel de su ADNc determinado en
muestras control, tales como muestras de sujetos control, es decir,
muestras de sujetos sanos o en muestras anteriores del mismo
sujeto. Puede usarse cualquier método convencional dentro del marco
de la invención, siempre que la medición in vitro del ARNm
transcrito del gen específico o su ADNc complementario pueda
realizarse en muestras tomadas de los sujetos que van a someterse a
análisis (muestras de prueba) y de muestras control.
La invención se ilustra adicionalmente con los
siguientes ejemplos. Se proporcionan para ilustrar ciertas
realizaciones de la presente invención, y no deben interpretarse
como limitativas de la invención.
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
- Lavar los portaobjetos dos veces (5 minutos cada vez) con agua bidestilada y dejarlos secar al aire.
- \bullet
- Exponer los portaobjetos secados a una lámpara de luz UV de 234 nm de longitud de onda durante 30 minutos.
- \bullet
- Sumergir los portaobjetos en un recipiente de acoplamiento con poli-L-lisina al 0,1% (nº de cat. de Sigma: P8920).
- \bullet
- Dejarlos secar al aire.
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \medcirc
- Desparafinar a 55ºC durante una hora en un horno.
- \medcirc
- Sumergirlas en la parafina líquida fundida durante 15 minutos.
- \medcirc
- Dejar a temperatura ambiente o a 4ºC durante 15 minutos.
Antes de comenzar la microdisección por captura
láser, deben eliminarse las cargas eléctricas de cada portaobjetos,
tocando cada uno con un trozo de metal unas cuantas veces. Si se
salta esta etapa, entonces el fragmento de tejido microdiseccionado
permanecerá sobre el portaobjetos tras catapultar, lo que hace que
sea casi imposible de recuperar.
- \bullet
- La cantidad mínima de tejido necesario para el análisis de la expresión de ARNm es de aproximadamente 4 mm^{2}.
- \bullet
- Se recoge el tejido microdiseccionado en un tubo con tapón de 0,5 ml con 2 \mul de tampón de digestión (Tris HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0, SDS al 2% y 500 \mug/ml de proteinasa K).
- \bullet
- Tras catapultar, añadir 195 \mul de tampón de digestión al tubo y taparlo con el tapón que contiene el tejido microdiseccionado. Agitar con vórtex y centrifugar durante 5 minutos a 13000 rpm.
- \bullet
- Traspasar el sedimento resuspendido a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- \bullet
- Incubar a 60ºC durante 16 horas en el termoagitador a 850 rpm.
- \bullet
- Añadir 10 \mul de proteinasa K 20 mg/ml.
- \bullet
- Incubar durante 15 minutos a 60ºC.
- \bullet
- Preparar la disolución de fenol en hielo (500 \mul de fenol saturado con agua GIBCO BRL: 15594-047 + 100 \mul de cloroformo (nº de cat. de Merck: 1.024451000) + 2 \mul de alcohol isoamílico, nº de cat. de Sigma: I-9392).
- \bullet
- Añadir un volumen de disolución de fenol (aprox. 210 \mul) al producto digerido.
- \bullet
- Agitar con vórtex y colocar en hielo durante 10 minutos.
- \bullet
- Centrifugar a 12600 rpm durante 10 minutos a 4ºC.
- \bullet
- Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- \bullet
- Añadir 0,1 volúmenes de acetato de sodio (nº de cat. de Applied Biosystems: 4331560) y 2,5 \mul de glucógeno (20 mg/ml) (nº de cat. de Roche: 0901393).
- \bullet
- Agitar con vórtex durante 30 segundos.
- \bullet
- Añadir 1 volumen de 2-propanol y agitar con vórtex de nuevo.
- \bullet
- Dejar durante 30 minutos a -20ºC.
- \bullet
- Centrifugar a 12600 rpm durante 10 minutos a 4ºC.
- \bullet
- Eliminar el sobrenadante y añadir 150 \mul de etanol al 70%.
- \bullet
- Centrifugar a 12600 rpm durante 5 minutos.
- \bullet
- Eliminar el sobrenadante y dejar secar al aire.
- \bullet
- Resuspender en 20-50 \mul de agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC).
- \bullet
- Incubar a 65ºC durante 5 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Usar 10 \mul de ARN y añadir 1 \mul de ADNasa (libre de ADN, nº de cat. de AMBION: 1906) y 1,2 \mul de tampón de ADNasa 10 x.
- \bullet
- Incubar a 37ºC durante 30 minutos.
- \bullet
- Añadir 0,1 volúmenes de reactivo de inactivación de ADNasa al producto de digestión.
- \bullet
- Centrifugar a 14000 rpm durante 1 minuto.
- \bullet
- Traspasar el sobrenadante a un nuevo tubo.
- \bullet
- Usar 9,4 \mul de ARN tratado con ADNasa.
- \bullet
- Añadir 2 \mul de mezcla 1 de RT (cebador al azar 250 ng/\mul, nº de cat. de ROCHE: 48190-011 + 1 \mul de dNTP 10 mM, nº de cat. de Roche: 1.814.362).
- \bullet
- Desnaturalizar el ARN a 65ºC durante 5 minutos.
- \bullet
- Enfriar inmediatamente en hielo.
- \bullet
- Añadir 6 \mul de mezcla 2 de RT (4 \mul de tampón de RT 5 x y 2 \mul de DTT 0,1 M) + 1 \mul de ARN guard (nº de cat. de Amersham Pharmacia: 27-0815-01).
- \bullet
- Incubar las muestras a 25ºC durante 10 minutos.
- \bullet
- Llevar las muestras hasta 37ºC y añadir 1 \mul de MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse transcriptase, transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney) (200 unidades) e incubar durante 45 minutos.
- \bullet
- Inactivar MMLV calentándola a 70ºC durante 10 minutos.
- \bullet
- El ADNc está ahora listo para su uso o puede almacenarse a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 1,
se sometieron varias muestras al método de extracción del ARN de la
invención. Para el control, se sometieron las mismas muestras al
mismo protocolo pero omitiendo la segunda adición de proteinasa K.
Tras la amplificación y cuantificación tal como se describió, los
siguientes resultados fueron, tal como se facilitan en la siguiente
tabla:
Los resultados muestran claramente la mejora
significativa de la adición adicional de proteinasa K y la corta
digestión tras la primera etapa de digestión.
Claims (7)
1. Método para recuperar ARN a partir de una
muestra de tejido biológico fijado con formalina, embebido en
parafina que comprende:
a) desparafinar la muestra,
b) poner en contacto dicha muestra con una
disolución que comprende una concentración eficaz de proteinasa K y
calentar la muestra en dicha disolución hasta una temperatura en el
intervalo de aproximadamente 30 a aproximadamente 60ºC, durante un
periodo de tiempo de aproximadamente 12 a 20 horas,
c) añadir una concentración eficaz de proteinasa
K a la disolución obtenida de b) durante un periodo de tiempo de
aproximadamente 5 a aproximadamente 30 minutos a un intervalo de
temperatura de aproximadamente 40 a aproximadamente 75ºC, y
d) recuperar dicho ARN a partir de dicha
disolución.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el intervalo de temperatura del calentamiento en la etapa b) es de
desde aproximadamente 45 hasta aproximadamente 60ºC, preferiblemente
desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 55ºC.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho ARN se recupera en d) mediante extracción a partir de dicha
disolución con un disolvente orgánico insoluble en agua.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
dicho disolvente orgánico insoluble en agua comprende
cloroformo.
5. Método según la reivindicación 4, que
comprende además purificar dicho ARN.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
dicho ARN se purifica mediante precipitación con etanol.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
la etapa a) de desparafinar la muestra se consigue mediante fusión
directa.
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