TWI425977B - 將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法與其套組 - Google Patents
將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法與其套組 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI425977B TWI425977B TW099140497A TW99140497A TWI425977B TW I425977 B TWI425977 B TW I425977B TW 099140497 A TW099140497 A TW 099140497A TW 99140497 A TW99140497 A TW 99140497A TW I425977 B TWI425977 B TW I425977B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- formalin
- fixed paraffin
- mixture
- dewaxing
- aqueous solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 57
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 69
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 56
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 43
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 22
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims description 15
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 9
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 9
- GQVMHMFBVWSSPF-UHFFFAOYSA-N 2,6-Dimethyl-2,4,6-octatriene Chemical compound CC=C(C)C=CC=C(C)C GQVMHMFBVWSSPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 150000004996 alkyl benzenes Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003209 petroleum derivative Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 claims 2
- 150000002773 monoterpene derivatives Chemical class 0.000 claims 2
- 235000002577 monoterpenes Nutrition 0.000 claims 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 56
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 54
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 11
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 11
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 11
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 11
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 11
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 7
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- GQVMHMFBVWSSPF-SOYUKNQTSA-N (4E,6E)-2,6-dimethylocta-2,4,6-triene Chemical compound C\C=C(/C)\C=C\C=C(C)C GQVMHMFBVWSSPF-SOYUKNQTSA-N 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 3
- IHPKGUQCSIINRJ-UHFFFAOYSA-N β-ocimene Natural products CC(C)=CCC=C(C)C=C IHPKGUQCSIINRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MFESCIUQSIBMSM-UHFFFAOYSA-N I-BCP Chemical compound ClCCCBr MFESCIUQSIBMSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- VGVYRHYDNGFIGF-UHFFFAOYSA-N fumarin Chemical compound OC=1OC2=CC=CC=C2C(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CO1 VGVYRHYDNGFIGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- GPTFURBXHJWNHR-UHFFFAOYSA-N protopine acetate Natural products C1=C2C(=O)CC3=CC=C4OCOC4=C3CN(C)CCC2=CC2=C1OCO2 GPTFURBXHJWNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本發明係關於一種將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，且特別關於一種將福馬林固定石蠟包埋之組織快速脫蠟的方法，於此方法中不須使用乙醇或其水溶液反覆清洗的步驟。
近年來由於基因檢測技術的發展，已能由病患腫瘤中的基因表現圖譜解讀癌症的發展趨勢。福馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)的檢體為醫院中保存檢體的常規方式，因此福馬林固定石蠟包埋檢體樣本的取得也最為容易。
目前市面已有數種用於萃取福馬林固定石蠟包埋樣本之核酸的產品，但其皆須使用步驟繁瑣又耗時的脫蠟步驟，例如以二甲苯(xylene)清洗含蠟組織，之後再接續使用乙醇或其水溶液進行數次的沖洗，以去除脂溶性的二甲苯，使得後續的水溶性試劑能與組織有較完全的滲入與反應。此種以乙醇沖洗來提升組織之親水性狀態的步驟一般稱為再水合(rehydration)。
傳統的步驟另外還有一問題。某些臨床檢體，如粗針核心切片之蠟塊(core needle biopsy FFPE sample)的組織含量十分微量，且其蠟塊切片組織在二甲苯當中大多呈現透明狀，而在高速離心後，這些脫蠟組織會在管底形成一團鬆動易漂浮的幾乎不可見之透明沈澱物，所以操作人員即使非常小心地將二甲苯移除，也無法保證珍貴的微量組織沒有連同二甲苯一起被移除了。因此，目前極需一新穎之福馬林固定石蠟包埋樣本的脫蠟方法以克服上述傳統方法的問題。
本發明提供一種將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，包括：提供一福馬林固定石蠟包埋之組織樣本；混合該福馬林固定石蠟包埋之組織樣本與一有機溶劑及水或一水溶液以形成一混合物，其中該有機溶劑之密度小於該水或該水溶液，且該有機溶劑與該水或該水溶液不互溶；以及分離該混合物成為一有機溶液層與一水溶液層，其中自該福馬林固定石蠟包埋之組織樣本溶出的石蠟位於該有機溶液層中，而來自該福馬林固定石蠟包埋之組織樣本的已脫蠟組織則位於該水溶液層及/或介於該有機溶液層與該水溶液層間的一界面層中。
本發明還提供一種套組，其用於上述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，包括：一有機溶劑；以及水或一水溶液，其中該有機溶劑之密度小於該水或該水溶液，且該有機溶劑與該水或該水溶液不互溶。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
為解決於傳統之福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟方法中需要以乙醇或其水溶液反覆沖洗組織樣本以移除殘留於組織上之用來溶蠟之有機溶劑而造成樣本流失與花費時間長的問題，於本發明一態樣中，本發明提供一種將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其不須使用乙醇或其水溶液反覆清洗的步驟。此方法可包括如下所述之步驟。
首先，提供一福馬林固定石蠟包埋之組織樣本。接著將福馬林固定石蠟包埋之組織樣本與一有機溶劑與水或一水溶液混合以形成一混合物，其中此有機溶劑之密度小於水或水溶液，且有機溶劑與水或水溶液不互溶。
將有機溶劑及水或水溶液加至福馬林固定石蠟之組織樣本的順序並無特別限制。在一實施例中，可先將有機溶劑加至福馬林固定石蠟包埋之組織樣本，然後再將水或水溶液加至其中並與前述兩者混合均勻以形成一混合物。而在另一實施例中，則可先將水或水溶液加至福馬林固定石蠟包埋之組織樣本，然後再將有機溶劑加至其中並與前述兩者混合均勻以形成一混合物。又，在另一實施例中，可同時將有機溶劑及水或水溶液加至福馬林固定石蠟包埋之組織樣本並與福馬林固定石蠟包埋之組織樣本混合以形成一混合物。
混合物之pH值並無特別限制。在一實施例中，為了樣本脫蠟後之萃取樣本核酸的步驟，混合物之pH值可維持於約pH 6-8之間。
密度比水或水溶液小且與水或水溶液不互溶之上述有機溶劑係用以將福馬林固定石蠟包埋之組織樣本中的石蠟溶出，而與上述有機溶劑不互溶之水或水溶液則用以將石蠟溶出後之福馬林固定石蠟包埋之組織樣本與溶出之石蠟分離。在一實施例中，上述密度比水或水溶液小，且與水或水溶液不互溶之有機溶劑的例子可參考美國專利號US 6632598中所述，其中包括如非極性碳氫化合物(non-polar hydrocarbon)或碳氫化合物的混和物。常使用的有芳香族碳氫化合物(aromatic hydrocarbon)的烷基苯(alkylbenzene)，如二甲苯(xylene)或甲苯(toluene)。其他還包括脂肪族碳氫化合物(aliphatic hydrocarbon)、單萜烯(terpens)(如2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯(2,6-dimethyl-2,4,6-octatriene,Allo-ocimene))、石油餾出物(petroleum distillate)及石油精(isoparaffinic hydrocarbon)。而水的例子可包括，但不限於蒸餾水、去離子水或無RNase水。又，與上述有機溶劑不互溶之水溶液的成分可包括水與其他成分。可視需要而選擇不同之其他成分。例如，在一實施例中，為了樣本脫蠟後之萃取樣本核酸的步驟，其他成分可包括，例如Tris-HCl及/或EDTA等，但不限於此。此外，水溶液之成分中的水可包括蒸餾水、去離子水或無RNase水，但不限於此。
此外，上述福馬林固定石蠟之組織樣本對有機溶劑之量的比例並無特別限制，只要所使用之有機溶劑的量足以溶解福馬林固定石蠟之組織樣本所含有的石蠟的量即可。在一實施例中，有機溶劑的量足以覆蓋過福馬林固定石蠟之組織樣本即可。
再來，在將福馬林固定石蠟包埋之組織樣本與有機溶劑及水或水溶液混合以形成混合物之後，將此混合物分離成一有機溶液層與一水溶液層，其中自福馬林固定石蠟包埋之組織樣本溶出的石蠟位於有機溶液層中，而來自福馬林固定石蠟包埋之組織樣本的經脫蠟組織則位於水溶液層及/或介於有機溶液層與水溶液層間的一界面層中。因此，完成福馬林固定石蠟包埋之組織樣本的脫蠟。
由於有機溶液與水或水溶液密度不同，因此上述混合物可自然地分成有機溶液層與水溶液層。而在一實施例中，上述將此混合物分離成有機溶液層與水溶液層的方法可包括，但不限於對混合物進行一離心處理。
在一實施例中，可將上述之水溶液層及/或介於有機溶液層與水溶液層間的界面層進一步使用於一核酸萃取程序中。在一實施例中，核酸萃取程序可包括將一分解緩衝溶液與一蛋白酶加至上述之水溶液層及/或介於有機溶液層與水溶液層間的界面層。蛋白酶的例子可包括蛋白酶K(proteinase K)。
在一實施例中，上述方法可更包括在分離混合物成為有機溶液層與水溶液層之後，移除有機溶液層的步驟。
此外，在又另一實施例中，在移除有機溶液層之後，可再將有機溶劑加入至水溶液層，並將有機溶劑與水溶液層混合以形成一第二混合物，然後分離第二混合物成為一第二有機溶液層與一第二水溶液層。
可將上述之第二水溶液層及/或介於第二有機溶液層與第二水溶液層間的第二界面層進一步使用於一核酸萃取程序中。
由於有機溶液與水或水溶液密度不同，因此上述第二混合物可自然地分成第二有機溶液層與第二水溶液層。而在一實施例中，上述將此第二混合物分離成第二有機溶液層與第二水溶液層的方法可包括，但不限於對第二混合物進行一離心處理。
在一實施例中，上述方法可更包括分離第二混合物成為一第二有機溶液層與一第二水溶液層之後，移除第二有機溶液層的步驟。
而根據上述，於本發明另一態樣中，本發明還可提供一種套組，其用於上述本發明將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法。在一實施例中，此套組可包括一有機溶劑與水或一水溶液，但不限於此，其中有機溶劑之密度小於水或水溶液，且有機溶劑與水或水溶液不互溶。
密度比水或水溶液小且與水或水溶液不互溶之上述有機溶劑係用以將福馬林固定石蠟包埋之組織樣本中的石蠟溶出，而與上述有機溶劑不互溶之水或水溶液則用以將石蠟溶出後之福馬林固定石蠟包埋之組織樣本與溶出之石蠟分離。在一實施例中，上述密度比水或水溶液小，且與水或水溶液不互溶之有機溶劑的例子可包括可參考美國專利號US 6632598中所述，其中包括如非極性碳氫化合物(non-polar hydrocarbon)或碳氫化合物的混和物。常使用的有芳香族碳氫化合物(aromatic hydrocarbon)的烷基苯(alkylbenzene)，如二甲苯(xylene)或甲苯(toluene)。其他還包括脂肪族碳氫化合物(aliphatic hydrocarbon)、單萜烯(terpens)(如2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯(2,6-dimethyl-2,4,6-octatriene,Allo-ocimene))、石油餾出物(petroleum distillate)及石油精(isoparaffinic hydrocarbon)。而水的例子可包括，但不限於蒸餾水、去離子水或無RNase水。又，與上述有機溶劑不互溶之水溶液的成分可包括水與其他成分。可視需要而選擇不同之其他成分。例如，在一實施例中，為了樣本脫蠟後之萃取樣本核酸的步驟，其他成分可包括，例如Tris-HCl及/或EDTA等，但不限於此。此外，水溶液之成分中的水可包括蒸餾水、去離子水或無RNase水，但不限於此。
此外，在另一實施例中，上述套組還可更包括於一萃取樣本核酸的步驟中所需的試劑。在一實施例中，上述套組還可更包括一分解緩衝溶液與一蛋白酶，其係使用於一萃取樣本核酸的步驟中。蛋白酶的例子可包括蛋白酶K。
【實施例】
實施例1：
脫蠟：
取1片福馬林固定石蠟包埋之肺癌組織的切片樣本(組織面積約1 cm2
，厚度為10 μm)於一微量離心管中。將600 μl 100%之二甲苯(xylene)加入此微量離心管中，並藉由震盪10秒以與此樣本混合以形成一混合物。將混合物離心至微量離心管底部。之後將194 μl無RNase水(RNase-free water)加入微量離心管中，並將微量離心管置於50℃以水平搖晃3分鐘。將微量離心管於12000 rpm離心3分鐘。接著移除微量離心管中之550 μl上層液體。然後再將600 μl 100%之二甲苯加入於微量離心管中，並藉由震盪10秒以與微量離心管中之剩餘液體混合以形成一混合物。將微量離心管於12000 rpm離心3分鐘。最後移除於微量離心管中之600 μl上層液體以留下含有已脫蠟之組織的下層液體。
RNA萃取：
將16 μl分解緩衝溶液(digestion buffer)(6.3 μl 1 M Tris-HCl,pH 8.0+4.2 μl 0.5 M EDTA,pH 8.0+5.5 μl 20% SDS)及8 μl蛋白酶K(proteinase K)【Qiagen #19131】加入上述含有已脫蠟組織之下層液體的微量離心管中並與下層液體混合以形成一混合物。將微量離心管置於在50℃，以80 rpm水平搖晃約3小時。將70 μl FARB buffer【Favorgen cat#FABRK 001-1】和300 μl 1-溴-3-氯丙烷(1-bromo-3-chloro-propane)加入微量離心管中，並藉由震盪10秒以與混合物混合。微量離心管於12000 rpm離心5分鐘。取出上層水溶液。
將420 μl乙醇加至上層水溶液並與上層水溶液緩慢混和以形成一混合物。將700 μl之混合物注入Favorgen迷你管柱(Favorgen mini colμmn)【Favorgen cat#FABRK 001-1】中，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心30秒。將流出物重新注回Favorgen迷你管柱中，並將Favorgen迷你管柱於10000 g離心30秒。將700 μl Wash 2 buffer【Favorgen cat#FABRK 001-1】加至Favorgen迷你管柱，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心10秒。接著，將80 μl DNase solution(10 μl DNase I+70 μl RDD buffer，Qiagen #79254)注入Favorgen迷你管柱，靜置15分鐘。將700 μl 75%乙醇加至Favorgen迷你管柱，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心1分鐘。將Favorgen迷你管柱以12000 rpm離心1分鐘旋乾。
將70 μl無RNase水注入Favorgen迷你管柱且靜置2分鐘，接著將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心30秒。然後，將流出物重新注回Favorgen迷你管柱中，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心30秒以獲得含有RNA之最終流出物。
最後以Nanodrop1000對此最終流出物進行260/280光譜吸收值量測。
光譜吸收值量測結果：260/280=1.6；260/230=0.8；RNA產量=1.22 μg
實施例2：
脫蠟：
取1片福馬林固定石蠟包埋之肺癌組織的切片樣本(組織面積約1 cm2
，厚度為10 μm)於一微量離心管中。將600 μl 2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯(2,6-dimethyl-2,4,6-octatriene,Allo-ocimene)及194 μl無RNase水、6.3 μl 1 M Tris-HCl(pH 8.0)與4.2 μl 0.5 M EDTA(pH 8.0)加入此微量離心管中與此樣本劇烈混合10秒鐘。之後，將微量離心管置於50℃以80 rpm水平搖晃5分鐘。將微量離心管於12000 rpm離心3分鐘。之後移除微量離心管中之500 μl上層液體。接著再將600 μl 2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯加入於微量離心管中並藉由震盪10秒以與微量離心管中之剩餘液體混合。再來，將微量離心管於12000 rpm離心3分鐘。最後移除微量離心管於中之600 μl上層液體以留下含有已脫蠟之組織的下層液體。
RNA萃取：
將5.5 μl 20% SDS及8 μl蛋白酶K【Qiagen #19131,NT$17.2/8 μl】加入上述含有已脫蠟組織之下層液體的微量離心管中，並藉由震盪10秒與下層液體混合以形成一混合物。將微量離心管置於50℃，以80 rpm水平搖晃約3小時。將70 μl FARB buffer【Favorgen cat#FABRK 001-1】和400 μl 1-溴-3-氯丙烷加入微量離心管中，並藉由震盪10秒以與混合物混合。將微量離心管於12000 rpm離心5分鐘。取出上層水溶液。
將420 μl乙醇加至上層水溶液並與上層水溶液緩慢混和以形成一混合物。將700 μl之混合物注入Favorgen迷你管柱(Favorgen mini colμmn)【Favorgen cat#FABRK 001-1】中，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心30秒。將流出物重新注回Favorgen迷你管柱中，並將Favorgen迷你管柱於10000 g離心30秒。將700 μl Wash 2 buffer【Favorgen cat#FABRK 001-1】加入Favorgen迷你管柱，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心10秒。接著，將80 μl DNase solution(10 μl DNase I+70 μl RDD buffer，Qiagen #79254)注入Favorgen迷你管柱，靜置15分鐘。將700 μl 75%乙醇加至Favorgen迷你管柱，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心1分鐘，然後重複此步驟一次。將Favorgen迷你管柱以12000 rpm離心1分鐘旋乾。
將70 μl無RNase水注入Favorgen迷你管柱，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心30秒。然後，將流出物重新注回Favorgen迷你管柱中，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心30秒以獲得含有RNA之最終流出物。
最後以Nanodrop1000對此最終流出物進行260/280光譜吸收值量測。
光譜吸收值量測結果：260/280=1.89；260/230=0.8；RNA產量=1.24 μg
實施例3：
脫蠟：
取10片福馬林固定石蠟包埋穿刺(16G needle biopsy)之人類肺癌組織切片樣本(組織面積約5-7 mm2
/片，厚度為5 μm/片)於一微量離心管中。將200 μl二甲苯及185 μl水溶液(30 mM Tris-HCl,pH 8.0、10 mM EDTA,pH 8.0)加入此微量離心管中並藉由震盪5秒以與這些切片混合以形成一混合物。之後，將微量離心管於12000 rpm離心1分鐘。最後移除微量離心管於中之上層液體以留下含有已脫蠟組織的下層液體。
DNA萃取：
將15 μl 20% SDS及10 μl蛋白酶K(Qiagen #19131)加入上述含有已脫蠟組織之下層液體的微量離心管中並藉由震盪10秒以與下層液體混合以形成一混合物。將微量離心管置於在50℃，以15 rpm旋轉搖晃約3小時。將130 μl RLT buffer(Qiagen RNeasy mini kit)加入微量離心管中並藉由震盪10秒以與混合物混合之後將。微量離心管於12000 rpm離心3分鐘。之後將上層液體自微量離心管取出並丟棄白色沈澱物。
將上述上層液體注入Favorgen微管柱(Favorgen micro colμmn)(矽膠管柱)，並將Favorgen微管柱於12000 rpm，離心30秒。保留離心步驟所產生之流出物以進行後續RNA萃取。
接著，將500 μl 75%乙醇入Favorgen微管柱，並將Favorgen微管柱於12000 rpm，離心10秒，之後重覆本步驟一次。將Favorgen微管柱以12000 rpm離心1分鐘旋乾。
將10 μl無RNase水注入Favorgen微管柱，並將Favorgen迷你管柱於12000 rpm離心30秒。然後，將流出物重新注回Favorgen微管柱中，並將Favorgen微管柱於12000 rpm離心30秒以獲得含有DNA之最終流出物。
最後以Nanodrop1000對此最終流出物進行260/280光譜吸收值量測。
光譜吸收值量測結果：260/280=2.02；260/230=1.60；DNA產量=86.3 ng
RNA萃取：
將457 μl 100%乙醇加至上述所保留之流出物並與流出物在緩慢混和以形成一混合物。將700 μl之混合物注入Favorgen微管柱中，並將Favorgen微管柱於12000 rpm離心30秒。將流出物重新注回Favorgen微管柱中，並將Favorgen微管柱於10000 g離心30秒。將500 μl Wash 2 buffer【Favorgen cat#FABRK 001-1】加入Favorgen微管柱，並將Favorgen微管柱於12000 rpm離心10秒。接著，將24 μl DNase solution(3 μl DNase I+21 μl RDD buffer，Qiagen #79254)注入Favorgen微管柱，靜置15分鐘。將500 μl 75%乙醇加至Favorgen微管柱，並將Favorgen微管柱於12000 rpm離心10秒，然後重複此步驟一次。將Favorgen微管柱以12000 rpm離心1分鐘旋乾。
將10 μl無RNase水注入Favorgen微管柱，並將Favorgen微管柱於12000 rpm離心30秒。然後，將流出物重新注回Favorgen微管柱中，並將Favorgen微管柱於12000 rpm離心30秒以獲得含有RNA之最終流出物。
最後以Nanodrop1000對此最終流出物進行260/280光譜吸收值量測。
光譜吸收值量測結果：260/280=1.85；260/230=1.13；RNA產量=183.4 ng
將實施例1、實施例2與實施例3所萃取出之核酸的光譜吸收值列於表1中。
表1、實施例1、實施例2與實施例3所萃取出之核酸的光譜吸收值
實施例4：
傳統脫蠟法與本發明脫蠟法之核酸產量與將自其所獲得之核酸進行基因晶片分析之結果
1.組織來源：
福馬林固定石蠟包埋之人類非小細胞肺癌組織，每個微量離心管中含有5片切片樣本(厚度5 μm/片)。B1管：組織切片截面積為2x2.5 mm2
/片；B2管：組織切片截面積為2.5x3 mm2
/片；B3管：組織切片截面積為3x3 mm2
/片。
2.脫蠟方法
A.傳統脫蠟方法：
(1)在通風櫥中，將200 μl 100%二甲苯加入含樣本之微量離心管中並藉由劇烈震盪10秒以與樣本混合以形成一混合物。將微量離心管置於50℃烘箱，3分鐘，之後檢查石臘是否完全溶解，若無，重複此步驟一次。
(2)將微量離心管劇烈震盪10秒後，將其於室溫以12,000 rpm離心3分鐘。
(3)迅速將微量離心管中之上層溶液吸起丟棄。
(4)將微量離心管重複一次離心步驟，12,000 rpm，2分鐘，再移除剩餘上層溶液。
(5)將200 μl 100%乙醇加入微量離心管中，以手指輕敲離心管管壁，使沉澱物浸泡於乙醇中。
(6)將微量離心管放入室溫離心機，以轉速12,000 rpm，離心2分鐘。
(7)將微量離心管中之上層溶液(含有Xylene以及乙醇)吸起丟棄，留下沈澱物。
(8)重複一次步驟(5)-(7)。
(9)將內含沉澱物之微量離心管置於通風櫥中，於室溫15分鐘，使剩餘殘留的乙醇揮發。
(10)將175 μl無RNase水、6 μl 1 M Tris-HCl(pH 8.0)、4 μl 0.5 M EDTA(pH 8.0)、15 μl 20% SDS及10 μl蛋白酶K【Qiagen #19131】加入內含沉澱物之微量離心管中並藉由震盪10秒以與沈澱物混合以形成一混合物。將微量離心管置於在50℃，以15 rpm旋轉搖晃3小時。
(11)接續以下所描述之DNA及RNA萃取步驟。
B.本發明脫蠟方法：
(1)將175 μl無RNase水、6 μl 1 M Tris-HCl(pH 8.0)、4 μl 0.5 M EDTA(pH 8.0)加入含樣本之微量離心管中。然後於通風櫥中將200 μl二甲苯加入微量離心管中，並藉由震盪5秒以使上述溶液與樣本混合。之後將微量離心管於12000 rpm離心1分鐘。接著在通風櫥中將微量離心管中之上層透明有機層丟棄，留下下層溶液(不需將上層透明有機層完全移除，上層透明有機層剩餘體積小於20 μl即可)。
(2)於通風櫥中將15 μl 20% SDS與10 μl蛋白酶K加入微量離心管，並藉由震盪10秒以使上述溶液與下層溶液混合以形成一混合物。之後將微量離心管置於50℃以15 rpm旋轉搖晃3小時。
(3)接續以下所描述之DNA及RNA萃取步驟。
3.DNA及RNA萃取
(1)於上述傳統脫蠟方法或本發明脫蠟方法完成後，在通風櫥中將130 μl RLT buffer(Qiagen RNeasy mini kit)加入微量離心管中，並藉由震盪10秒以與上述傳統脫蠟方法或本發明脫蠟方法所產生之混合物混合。將微量離心管於12000 rpm離心3分鐘。取出微量離心管中之上層水溶液。
(2)將上述上層水溶液注入通過Favorgen微管柱(標示為DNA管柱)，並將此DNA管柱於12000 rpm離心30秒以產生一流出物。
(3)將為流出物1.5倍體積之純乙醇(absolute ethanol)加至上述流出物中並與流出物緩慢混和以形成一混合物。
(4)將混合物注入一新的Favorgen微管柱(標示為RNA管柱)，並將此RNA管柱在12000 rpm離心30秒。將流出物重新注回此RNA管柱中，12000 rpm離心30秒。之後將所產生之流出物丟棄。
(5)將500 μl Wash 2 buffer【Favorgen cat#FABRK 001-1】加入此RNA管柱，並將此RNA管柱於12000 rpm離心10秒。
(6)將16 μl DNase solution(2 μl DNase I+14 μl RDD buffer，Qiagen #79254)注入此RNA管柱，靜置15分鐘。
(7)將500 μl 75%乙醇分別加至DNA管柱及RNA管柱。DNA管柱及RNA管柱在12000 rpm離心10秒。重覆本步驟一次。
(8)將DNA管柱及RNA管柱以12000 rpm離心1分鐘旋乾。將DNA管柱及RNA管柱分別移至新的1.5 ml微量離心管中。
(9)將10 μl無RNase水分別加至DNA管柱及RNA管柱。DNA管柱及RNA管柱在12000 rpm離心30秒。將來自DNA管柱及RNA管柱的流出物分別重新注入DNA管柱及RNA管柱。之後將DNA管柱及RNA管柱再離心一次以分別獲得來自DNA管柱及RNA管柱的流出物。
(10)分別對來自DNA管柱及RNA管柱的流出物進行260/280光譜吸收值量測並換算成核酸產量。結果參見第1圖。
4.基因晶片分析：
將200 ng之以傳統脫蠟法自B3管中之福馬林固定石蠟包埋組織切片樣本萃取出的RNA與200 ng之以本發明脫蠟法自B3管中之福馬林固定石蠟包埋組織切片樣本萃取出的RNA，依照原廠操作說明進行基因晶片分析(Whole-Genome DASL Assay)(Illumina cat#DA-903-0024)。結果參見第2圖。
5.結果：
(A)DNA與RNA產量
第1圖顯示傳統脫蠟方法與本發明脫蠟方法之核酸產量(B1：組織切片截面積為2x2.5 mm2
/片；B2：組織切片截面積為2.5x3 mm2
/片；B3：組織切片截面積為3x3 mm2
/片。每一數據重覆進行三次實驗所得)。由第1圖結果可清楚得知本發明之脫蠟方法可藉由降低組織損失量達到提高DNA及RNA產量。
(B)基因晶片分析：
第2圖顯示分別自傳統脫蠟方法與本發明脫蠟方法所獲得之RNA進行基因晶片分析的比較結果(X軸為自傳統脫蠟方法所獲得之RNA的基因表現強度，Y軸為自本發明脫蠟方法所獲得之RNA的基因表現強度)。由第2圖可得知，自本發明脫蠟方法所獲得之RNA可比傳統脫蠟方法所獲得之RNA偵測到更多基因訊號。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖顯示傳統脫蠟方法與本發明脫蠟方法之核酸產量。
第2圖顯示分別自傳統脫蠟方法與本發明脫蠟方法所獲得之RNA進行基因晶片分析的比較結果。
Claims (12)
- 一種將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，包括：提供一福馬林固定石蠟包埋之組織樣本；混合該福馬林固定石蠟包埋之組織樣本與一有機溶劑及水或一水溶液以形成一混合物，其中該有機溶劑之密度小於該水或該水溶液，且該有機溶劑與該水或該水溶液不互溶；以及分離該混合物成為一有機溶液層與一水溶液層，其中自該福馬林固定石蠟包埋之組織樣本溶出的石蠟位於該有機溶液層中，而來自該福馬林固定石蠟包埋之組織樣本的已脫蠟組織則位於該水溶液層及/或介於該有機溶液層與該水溶液層間的一界面層中，其中於該將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法中，不需要使用乙醇或其水溶液反覆清洗該福馬林固定石蠟包埋之組織樣本的步驟。
- 如申請專利範圍第1項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其中分離該混合物成為該有機溶液層與該水溶液層的方法包括對該混合物進行一離心處理。
- 如申請專利範圍第1項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，更包括在分離該混合物成為該有機溶液層與該水溶液層之後，移除該有機溶液層。
- 如申請專利範圍第3項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，更包括： 在移除該有機溶液層之後，加入該有機溶劑至該水溶液層；混合該有機溶劑與該水溶液層以形成一第二混合物；以及分離該第二混合物成為一第二有機溶液層與一第二水溶液層。
- 如申請專利範圍第4項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其中分離該第二混合物成為該第二有機溶液層與該第二水溶液層的方法包括對該第二混合物進行一離心處理。
- 如申請專利範圍第4項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，更包括在分離該第二混合物成為該第二有機溶液層與該第二水溶液層之後，移除該第二有機溶液層。
- 如申請專利範圍第1項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其中該有機溶劑包括非極性碳氫化合物或碳氫化合物的混和物。
- 如申請專利範圍第1項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其中該有機溶劑包括烷基苯。
- 如申請專利範圍第8項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其中該烷基苯包括二甲苯或甲苯。
- 如申請專利範圍第1項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其中該有機溶劑包括脂肪族碳氫化合物、單萜烯、石油餾出物或石油精。
- 如申請專利範圍第10項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其中該單萜烯包括2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯。
- 如申請專利範圍第1項所述之將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法，其中該水溶液之成分包括水、Tris-HCl與EDTA。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW099140497A TWI425977B (zh) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | 將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法與其套組 |
| US12/979,979 US8574868B2 (en) | 2010-11-24 | 2010-12-28 | Method for deparaffinizing formalin-fixed paraffin-embedded tissue |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW099140497A TWI425977B (zh) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | 將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法與其套組 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201221210A TW201221210A (en) | 2012-06-01 |
| TWI425977B true TWI425977B (zh) | 2014-02-11 |
Family
ID=46064707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW099140497A TWI425977B (zh) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | 將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法與其套組 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8574868B2 (zh) |
| TW (1) | TWI425977B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI462930B (zh) * | 2013-06-06 | 2014-12-01 | Rbc Bioscience Corp | 福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法 |
| CN104655460B (zh) * | 2013-11-25 | 2017-09-12 | 无锡市江原实业技贸总公司 | 一种病理组织透明脱蜡液及其制备方法 |
| US10274405B2 (en) | 2016-11-25 | 2019-04-30 | Exscale Biospecimen Solutions Ab | Deparaffinization of FFPE tissue samples |
| US20220349787A1 (en) * | 2019-03-19 | 2022-11-03 | Microvizual, Inc. | Automatic system and method for tissue sectioning, staining, and scanning |
| CN110146354B (zh) * | 2019-05-14 | 2021-11-23 | 东部战区总医院秦淮医疗区 | 改性三羟甲基丙烷脂肪酸酯溶解石蜡的新方法 |
| CN113755486A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-07 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 用于处理石蜡包埋样本的脱蜡剂及从石蜡包埋样本中提取核酸的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6248535B1 (en) * | 1999-12-20 | 2001-06-19 | University Of Southern California | Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens |
| US20070026411A1 (en) * | 2005-07-30 | 2007-02-01 | Hui Wang | Preparing RNA from a wax-embedded tissue specimen |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4659498A (en) * | 1985-10-15 | 1987-04-21 | Stoufer Wilmer B | Ski and surfboard wax remover |
| GB9323305D0 (en) | 1993-11-11 | 1994-01-05 | Medinnova Sf | Isoaltion of nucleic acid |
| US6183995B1 (en) | 1997-09-05 | 2001-02-06 | Lifespan Biosciences, Inc. | Methods of measuring gene expression using wax-embedded tissue specimens |
| US6428936B1 (en) | 1999-12-16 | 2002-08-06 | Intel Corporation | Method and apparatus that compensates for phase shift mask manufacturing defects |
| US7364846B2 (en) | 2002-10-11 | 2008-04-29 | Molecular Devices Corporation | Gene expression profiling from FFPE samples |
| ATE514791T1 (de) | 2003-07-09 | 2011-07-15 | Genvault Corp | Raumtemperatur-eluierung der nukleinsäuren |
| US9243241B2 (en) | 2005-05-31 | 2016-01-26 | Life Technologies Corporation | Separation and purification of nucleic acid from paraffin-containing samples |
| EP1777291A1 (en) | 2005-10-20 | 2007-04-25 | Fundacion para la Investigacion Clinica y Molecular del Cancer de Pulmon | Method for the isolation of mRNA from formalin fixed, paraffin-embedded tissue |
| DE102005060738A1 (de) | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus fixierten Geweben |
| EP2173874A2 (en) | 2007-06-22 | 2010-04-14 | Response Genetics, Inc | Methods for isolating long fragment rna from fixed samples |
-
2010
- 2010-11-24 TW TW099140497A patent/TWI425977B/zh active
- 2010-12-28 US US12/979,979 patent/US8574868B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6248535B1 (en) * | 1999-12-20 | 2001-06-19 | University Of Southern California | Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens |
| US20070026411A1 (en) * | 2005-07-30 | 2007-02-01 | Hui Wang | Preparing RNA from a wax-embedded tissue specimen |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8574868B2 (en) | 2013-11-05 |
| US20120129251A1 (en) | 2012-05-24 |
| TW201221210A (en) | 2012-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI425977B (zh) | 將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法與其套組 | |
| JP2022009735A (ja) | 固定生物学的試料から生体分子を抽出するためのターゲット細胞または組織を決定するための方法 | |
| Rosenbaum et al. | Genomic heterogeneity of ALK fusion breakpoints in non-small-cell lung cancer | |
| JP5950415B2 (ja) | ワックス包埋サンプルからの核酸抽出 | |
| Asp et al. | Spatial detection of fetal marker genes expressed at low level in adult human heart tissue | |
| Willmore‐Payne et al. | c‐KIT mutation analysis for diagnosis of gastrointestinal stromal tumors in fine needle aspiration specimens | |
| TWI462930B (zh) | 福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法 | |
| CN108076644A (zh) | 自动核酸提取的装置和方法 | |
| CN109371107A (zh) | 一种石蜡切片组织核酸的快速自动化提取方法与试剂 | |
| US20220315987A1 (en) | Fully automated nucleic acid extraction methods for tissue samples | |
| CN111424097B (zh) | 用于开发胃癌诊断产品的分子标志物及应用 | |
| Aubry et al. | Chromosomal rearrangements and copy number abnormalities of TP63 correlate with p63 protein expression in lung adenocarcinoma | |
| US11078476B2 (en) | Methods and kits for extracting nucleic acids from paraffin embedded samples | |
| CN114395638B (zh) | 适用于高淀粉果实的ATAC-seq方法 | |
| CN106755406A (zh) | 一种卵巢癌检测产品及试剂盒 | |
| CN110317804A (zh) | 从石蜡包埋组织中提取rna的方法及其试剂盒 | |
| Kramer et al. | Tissue microarrays in clinical urology–Technical considerations | |
| US10274405B2 (en) | Deparaffinization of FFPE tissue samples | |
| CN107583052A (zh) | miR‑6734‑5p在制备Luminal型乳腺癌诊断工具中的应用 | |
| CN109439655A (zh) | 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 | |
| TWI671407B (zh) | 微生物核酸萃取方法 | |
| Sura et al. | Molecular testing opportunities on cytology effusion specimens: the pre-analytic effects of various body fluid cytology preparation methods on RNA extraction quality and targeted sequencing | |
| Jarsch et al. | Quantitative image analysis of membrane microdomains labelled by fluorescently tagged proteins in Arabidopsis thaliana and Nicotiana benthamiana | |
| CN114107307B (zh) | 一种体外筛选pd-l1的dna核酸适配体的方法及其应用 | |
| CN108707661A (zh) | 用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及clc基因作为生物标志物的应用 |