CN111593047A - 适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒及提取方法，该提取试剂盒内含有裂解液、结合液、磁珠溶液、消化酶、洗涤液、洗脱液，对应的提取方法先采用环保脱蜡剂进行样本脱蜡，然后加入裂解液、消化酶混匀，加热裂解样本，加入结合液、磁珠溶液吸附核酸，再加入洗涤液洗涤去除磁珠表面的蛋白质和盐离子等杂质，与常规的组织样本核酸提取方法相比较，本方法脱蜡步骤环保快速，裂解样本后续提取步骤简单，除乙醇外无需自备试剂，制备的核酸浓度和纯度均优于市面同类试剂盒。

Description

适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，特别涉及一种适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒及提取方法。
背景技术
福尔马林固定石蜡包埋处理的样本(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE)指的是用福尔马林固定、石蜡包埋的样本，是临床肿瘤研究的常用生物材料。肿瘤组织样本是一种比较容易获得的样本，医生对这些组织进行回顾性研究，有助于阐明疾病机制，发现治疗靶标和指示预后恢复。但离体的组织容易丧失原有正常的结构和功能，一般医院没有合格的超低温冷藏条件，FFPE样本可以在常温保留很久，所以对肿瘤组织进行石蜡包埋保存是医院里最常用的样本储存手段。
目前依然以组织病理切片的基因检测，准确度最高，是业内公认的金标准。基因检测可以协助医护人员进行临床诊断、指导治疗选择、辅助监测疾病复发和耐药、预估生存期等医疗工作。然而目前利用组织病理切片进行基因检测存在一些缺陷：福尔马林固定容易使组织样本中的核酸发生不同程度的降解和分子间交联，石蜡高温渗入的过程也会导致核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有很大的影响，如何从石蜡切片中提取出高质量基因组对于切片的研究利用是一件棘手的难题。
当然，很多公司也在开发组织切片相关的核酸提取试剂盒，但由于成本、运输条件、配套试剂、提取效果等因素的限制，目前组织切片样本提取试剂盒大多需要二甲苯进行去蜡，这种方式存在试剂购买和存储均不方便的问题。部分试剂盒推出的环保脱蜡试剂虽能常温脱蜡，但低温使用时流动性差，往往脱蜡不彻底，提取的核酸浓度和质量不够高，对后续NGS或诊断使用造成一定影响。
发明内容
本发明的目的在于解决背景技术中的技术问题，提供了一种适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒及提取方法，该试剂盒组分简单，可用于简单快速获取组织核酸，无需二甲苯等有毒试剂处理，通过样本裂解、修复等特殊裂解交联修复过程，加入磁珠和结合液后进行核酸提取，得到的基因组DNA具有高浓度和高纯度，可满足后续实验需求。
为实现以上目的，本发明提供一种适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒以及应用该试剂盒的核酸提取方法，以下先介绍本方案提供的磁珠法核酸提取试剂盒，包括：
裂解液，至少包括柠檬酸钠，Tris-HCI，EDTA，NaCI，SDS；
结合液，至少包括Tris，EDTA，NaCI，PEG 8000；
脱蜡液；
磁珠溶液，至少包括磁珠和缓冲液；
消化酶；
第一洗涤液，至少包括NaCl，PEG8000，Tris-HCI；
第二洗涤液，至少包括Tris-HCI、EDTA、NaCI、乙醇；
洗脱液，至少包括Tris-HCI、EDTA。
其中脱蜡剂选择为矿物油、石蜡油、硅油、松节油、异己烷、柠檬烯等一种或几种混合物，在本方案中选择的都是常用的脱蜡剂，这些脱蜡剂具有无挥发性以及脱蜡简单的优势，且容易获取。在本方案中优选矿物油作为脱蜡剂。
其中消化酶选择为胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K的其中一种，其中消化酶可降解核酸，在本方案中优选消化酶为蛋白酶K，浓度优选为100mg/ml。
其中磁珠溶液中的磁珠选择为硅羟基或羧基修饰的磁珠，优选的，磁珠浓度为0.2-1mg/ml。
具体的，本方案的裂解液至少包括5-500mM柠檬酸钠，5-500mM Tris-HCI，1-200mMEDTA，0.1-5MNaCI，质量百分比0.1-5％的SDS，在本方案中，选择采用柠檬酸钠构建裂解和修复环境，消化酶和柠檬酸钠裂解液共同进行核酸的裂解及核酸交联修复，提高组织样本核酸完整性。
具体的，柠檬酸钠可选择为10,30,50,70,90,110,130,150,170,190,210,230,250,270,290,310,330,350,370,390,410,430,450,470,490mM；Tris-HCI也可选择为10,30,50,70,90,110,130,150,170,190,210,230,250,270,290,310,330,350,370,390,410,430,450,470,490mM；EDTA可选择为5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180.190mM；NaCI可选择为：0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5；SDS的质量百分比可选择为：0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5％。
其中以上裂解液内各个试剂的浓度成分可根据实际需求在该方案内选择，进而形成不同的裂解液组合。
本方案中的结合液至少包括1-500mM Tris，1-200mM EDTA，0.1-5M NaCI，1-15％PEG 8000，在本方案中，NaCI和PEG 8000作为重要组分能析出核酸并修饰蛋白质，减少样本中蛋白质、组织碎片对核酸提取的干扰。
具体的，Tris可选择为10,30,50,70,90,110,130,150,170,190,210,230,250,270,290,310,330,350,370,390,410,430,450,470,490mM；EDTA可选择为5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180.190mM；NaCI可选择为0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5；PEG 8000可选择为：2,3,4,5,6,7,8,9,10，11,12,13,14％。
其中以上结合液液内各个试剂的浓度成分可根据实际需求在该方案内选择，进而形成不同的结合液组合。
其中第一洗涤液至少包括0.1-5M NaCl，1-15％PEG8000，0.1-2M Tris-HCI；第二洗涤液至少包括1-500mMTris-HCI、1-200mM EDTA、1-500mM NaCI、50-80％乙醇；洗脱液至少包括5-50mMTris-HCI、1-20mMEDTA。
本方案另外提供一种应用以上试剂盒的核酸提取方法，关于试剂盒内的试剂浓度见上述所述，该核酸提取方法包括以下步骤：
样本准备步骤：在离心管内加入10-50mg组织样本，加入200-800ul的脱蜡液，60℃加热2-10min，吸弃脱蜡液，加入无水乙醇，涡旋震荡后短暂离心，彻底吸弃无水乙醇，并晾干2-5min；
样本裂解步骤：加入100-500ul的裂解液、10-50ul的蛋白酶K溶液，涡旋震荡，掌上离心机短离心后样本置于60℃裂解结合0.5-2小时，然后90℃交联修复0.5-2小时；
样本结合步骤：加入200-800ul结合液，涡旋震荡后静置2-5min，转移至磁力架上静置1-5min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，得到磁珠吸附核酸溶液；
清洗步骤：将离心管从磁力架上取下，加入500-1000ul的第一洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体；将离心管中加入500-1000ml第二洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，重复洗涤一次，吸弃液体，室温晾干1-5min，以减少试剂残留的干扰；
洗脱步骤：从磁力架上取下样本管，加入50-1000ul洗脱液，涡旋震荡后静置，将离心管转移至磁力架上静置1-3min(可以是2min)至磁珠完全吸附，将洗脱核酸转移至新的离心管中。
具体的，在本方案的样本准备步骤中，组织样本的提取量可以是20,30,40mg，脱蜡液的体积量可以是300,400,500,600,700ul，无水乙醇的体积可以是0.5,1,1.5ml。在本方案的样本裂解步骤，裂解液的体积可以是200,300,400ul，蛋白酶K溶液的体积可以是20,30,40ul。在本方案的样本结合步骤，结合液的体积可以是300,400,500,600,700ul。在本方案的清洗步骤中，第一洗涤液的体积可以是600,700，800,900ul,第二洗涤液的体积可以是600,700，800，900ul。
其中组织样本由石蜡包埋保存。
相较现有技术，本技术方案具有以下的特点和有益效果：采用常用试剂做环保脱蜡剂，试剂具有无挥发性，脱蜡步骤简单的优势，在脱蜡样本加入裂解液和消化酶处理，交联修复后加入磁珠和磁珠结合液，两次清洗后加入洗脱液洗脱，即可得到高浓度和高纯度核酸，且其内采用的裂解液、结合液、清洗液组分无胍盐等组分，安全环保，操作简单，提取试剂预分装于深孔板，只需自备乙醇试剂，配合核酸提取仪使用的，可实现全自动核酸提取。
具体的，该方案主要采用脱蜡剂加热进行脱蜡，切片石蜡在60℃时易融化，与脱蜡剂更容易互溶而与组织分离，无水乙醇清洗去除残留的脱蜡剂，以此方式实现彻底脱蜡且能增加样本水溶性。采用蛋白酶K和柠檬酸钠裂解液进行核酸的裂解及核酸交联修复，提高组织样本核酸完整性，改变核酸与蛋白的交联而提高核酸提取效率。SDS作为表面活性剂，能改变蛋白质构象，促进样本裂解。NaCI和PEG 8000作为重要组分能析出核酸并修饰蛋白质，减少样本中蛋白质、组织碎片对核酸提取的干扰。磁珠吸附析出的核酸，经过第一洗涤液时，部分析出蛋白质会溶解而核酸仍保持吸附。第二洗涤液能进一步去除蛋白等杂质，并减少盐组分，同样达到较少干扰的作用。
本技术方案采用柠檬酸钠构建裂解和修复环境，核酸修复后质量提高；独创地采用PEG在高氯化钠浓度下析出核酸并修饰蛋白质，且配合磁珠法减少了蛋白质对核酸提取的干扰；整个核酸提取方法具有方法简单安全，核酸提取浓度高完整度好纯度高，该试剂盒和自动核酸提取仪配合使用，安全高效，适用于大批量样本的高效处理，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例中人基因组18S rRNA引物PCR扩增示意图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型，在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明精神和范围的其他方案。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以提取30mg石蜡组织样本中的DNA基因组为实验内容，选择本方案的试剂盒和市面上常规的TL、Bec、XJ、ZA、AD试剂盒在相同的条件下进行实验比对。
以上字母为公司简称：TL:苏州天隆；Bec：贝克曼；XJ：杭州新景生物；ZA：志昂生物；AD：厦门艾德生物。
本试验中涉及到的仪器设备：奥盛的金属浴(60℃/90℃加热)，掌上离心机，ABIStepone荧光定量仪，Nanodrop测定核酸浓度。
具体实验内容如下：
实验组：
1.样本准备步骤：在离心管中加入约35mg组织样本，加入400ul的脱蜡液，60℃加热5min，吸弃脱蜡液，加入1ml无水乙醇，涡旋震荡后短暂离心，彻底吸弃无水乙醇，并晾干2min；
2.样本裂解步骤：往步骤1样本内加入400ul的裂解液、20ul的蛋白酶K溶液，涡旋震荡，掌上离心机短离心后样本置于60℃裂解结合1小时，然后90℃交联修复1小时；
3.样本结合步骤：往步骤2制备的样本内加入400ul结合液，20ul磁珠液，涡旋震荡后静置2min，转移至磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，得到磁珠吸附核酸溶液；；
4.清洗步骤：将步骤3离心管从磁力架上取下，加入500ul的洗涤液1，震荡混匀，将离心管置于磁力架上2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体。
5.将步骤4离心管中加入600ml洗涤液2，震荡混匀，将离心管置于磁力架上2min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，重复洗涤一次，吸弃液体，室温晾干5min，以减少试剂残留的干扰；
6.洗脱步骤：从磁力架上取下样本管，加入100ul洗脱液，涡旋震荡后静置2min，将离心管转移至磁力架上静置2min至磁珠完全吸附，将洗脱核酸转移至新的离心管中。
对照组：
对照试剂分别为TL、Bec、XJ、ZA、AD试剂盒，样本为约35mg石蜡组织样本，核酸提取操作步骤按照使用说明书进行。
核酸测定：
将实验组和对照组得到的采用Nanodrop进行核酸测定，观察DNA核酸浓度、A260/A280比值，并采用人18S基因引物进行扩增比较，得到数据如下表一，结果图如图1所示。
表一核酸测定结果
分组 核酸浓度(ng/ul) A260/A280 A260/A230 CT值
TL 475.107 1.926 2.182 19.624
Bec 750.873 1.897 1.690 18.137
XJ 240.221 2.046 1.700 21.366
ZA 216.072 1.841 1.252 20.079
AD 243.639 1.889 1.120 25.990
本发明 1673.374 1.911 2.152 14.476
可见，本发明试剂方法提取的DNA核酸浓度和纯度显著高于对照试剂盒，PCR扩增结果也显示提取效果优于对照试剂。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，包括：
裂解液，至少包括柠檬酸钠，Tris-HCI，EDTA，NaCI，SDS；
结合液，至少包括Tris，EDTA，NaCI，PEG 8000；
脱蜡液；
磁珠溶液，至少包括磁珠和缓冲液；
消化酶；
第一洗涤液，至少包括NaCl，PEG8000，Tris-HCI；
第二洗涤液，至少包括Tris-HCI、EDTA、NaCI、乙醇；
洗脱液，至少包括Tris-HCI、EDTA。
2.根据权利要求1所述的适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，裂解液至少包括5-500mM柠檬酸钠，5-500mM Tris-HCI，1-200mM EDTA，0.1-5MNaCI，质量百分比0.1-5％的SDS。
3.根据权利要求1所述的适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，结合液至少包括1-500mM Tris，1-200mM EDTA，0.1-5M NaCI，1-15％PEG 8000。
4.根据权利要求1所述的适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，第一洗涤液至少包括0.1-5M NaCl，1-15％PEG8000，0.1-2M Tris-HCI；第二洗涤液至少包括1-500mMTris-HCI、1-200mM EDTA、1-500mM NaCI、50-80％乙醇；洗脱液至少包括5-50mMTris-HCI、1-20mMEDTA。
5.根据权利要求1所述的适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，脱蜡剂选择为矿物油、石蜡油、硅油、松节油、异己烷、柠檬烯其中一种或几种的混合物。
6.根据权利要求1所述的适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，消化酶选择为胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K的其中一种。
7.根据权利要求1所述的适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，磁珠选择为硅羟基或羧基修饰的磁珠。
8.根据权利要求1所述的适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，其特征在于，适用于石蜡包埋的组织样本。
9.一种适用于组织样本的磁珠法核酸提取方法，其特征在于，采用其上权利要求1到8任一所述的适用于组织样本的磁珠法核酸提取试剂盒，包括以下步骤：
样本准备步骤：在离心管内加入10-50mg组织样本，加入200-800ul的脱蜡液，60℃加热2-10min，吸弃脱蜡液，加入无水乙醇，涡旋震荡后短暂离心，彻底吸弃无水乙醇，并晾干2-5min；
样本裂解步骤：加入100-500ul的裂解液、10-50ul的蛋白酶K溶液，涡旋震荡，掌上离心机短离心后样本置于60℃裂解结合0.5-2小时，然后90℃交联修复0.5-2小时；
样本结合步骤：加入200-800ul结合液，涡旋震荡后静置2-5min，转移至磁力架上静置1-5min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，得到磁珠吸附核酸溶液；
清洗步骤：将离心管从磁力架上取下，加入500-1000ul的第一洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体；将离心管中加入500-1000ml第二洗涤液，震荡混匀，将离心管置于磁力架上1-3min，磁珠完全吸附后，吸弃液体，重复洗涤一次，吸弃液体，室温晾干1-5min，以减少试剂残留的干扰；
洗脱步骤：从磁力架上取下样本管，加入50-1000ul洗脱液，涡旋震荡后静置，将离心管转移至磁力架上静置1-3min至磁珠完全吸附，将洗脱核酸转移至新的离心管中。
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