CN115725567A - 一种磁珠法快速提取小鼠骨组织dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，包含如下步骤：将小鼠尾巴直接放于含有裂解液的离心管中，加入蛋白酶K，涡旋震荡；预热，然后孵育直至样品完全溶解形成Lysate裂解产物；向深孔板中加入试剂；将加入试剂的深孔板和磁套按顺序放在全自动核酸提取仪上，运行程序。本发明采用磁珠法提取，保存裂解一体化；将样本直接放于裂解液中，无需低温放置，保护DNA不被降解；无需另外加入样本裂解液进行机器研磨，直接放置金属浴或温箱中进行消化，无需重新转移样本，不影响提取效果；使用二氧化硅包被的纳米磁性微球，并配合自动化提取仪器可实现大批量样本进行DNA的快速提取，用时仅24分钟。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体涉及一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法。
背景技术
目前随着基因分型在生命科学研究中的迅速应用，基因突变分析对于解析人类疾病发病机制的研究至关重要，同时基因突变也决定后期所有表型的展示。小鼠的基因组几乎与人类一致，且遗传、生物和行为等特征与人类非常接近，所以基因修饰的小鼠是目前生命科学研究以及生物医药研发中最重要的实验动物模型之一。这就极大地增加了以动物为模型，对哺乳动物基因修饰进行研究的实验需求，而其中对小鼠组织DNA的保存和提取是该关键技术的关键步骤。小鼠组织样本的保存条件、保存时间、提取步骤都将决定DNA的产量、质量和纯度。样本若保存不当，不能一次性处理大量样本，低温反复冻融，则会使DNA发生部分降解，不仅会造成同一批样本中提取的DNA在质量上存在差异，影响后续PCR检测，也严重减慢了检测速度。
目前提取DNA的方法主要有酸碱中和法、蛋白酶K消化法、有机溶剂抽提法、玻璃/钢化珠、免疫亲和法、磁珠法等。市面上大多数实验室采用有机溶剂抽提法，样本采集后需即刻放入液氮或-80摄氏度冰箱中保存，使用玻璃珠对低温保存的样本进行机器碾碎，后使用氯仿等有机溶剂进步提取，最后使用酒精进行洗涤和沉淀DNA。但是以上这些方法需要使用大量有机溶剂，对实验员身体产生危害；其次机器高温反复研磨会影响DNA的质量。与此同时，样本反复进行冻融，一次性提取样本数量少，操作繁琐，方法不适用于长期研究以及大批量样本提取。
发明内容
本发明目的是针对现有技术需要使用大量有机溶剂，机器高温反复研磨会影响DNA质量，操作繁琐方法不适用于长期研究以及大批量样本提取的问题，设计一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法。本发明采用磁珠法提取的方法，做到保存裂解一体化的操作，使用二氧化硅包被的纳米磁性微球，并配合自动化提取仪器可实现大批量样本进行DNA的快速提取，用时仅24分钟。具体采用如下技术方案：
一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，包含如下步骤：
(1)将新鲜采集的小鼠尾巴或耳朵直接放于含有裂解液的离心管中，加入蛋白酶K，涡旋震荡；
(2)将水浴锅或恒温混匀仪预热，然后孵育直至样品完全溶解，形成Lysate裂解产物；
(3)向深孔板中加入试剂，具体如下：
提取板Plate 1中试剂和容量为：裂解结合液1：120μL、裂解结合液2：120μL、异丙醇：300μL、Magbeads PN磁珠:20μL、其余为Lysate裂解产物；
提取板Plate 2中试剂和容量为：漂洗液1:750μL；
提取板Plate 3中试剂和容量为：漂洗液1:750μL；
提取板Plate 4中试剂和容量为：漂洗液2:750μL；
提取板Plate 5中试剂和容量为：漂洗液2:750μL；
提取板Plate 6中试剂和容量为：洗脱液:80μL；
(4)将加入试剂的深孔板和磁套按顺序放在全自动核酸提取仪上，运行相应提取程序；
(5)运行结束后将深孔板和磁套从仪器中取出，把提取板Plate6中的洗脱产物转移至离心管中-20℃保存备用。
优选的，步骤(1)中裂解液的体积为200μL，蛋白酶K的体积为20μL，离心管的容积是1.5mL，涡旋震荡的时间为10秒。
优选的，步骤(2)中预热至56℃，孵育时间是1-2小时。
优选的，步骤(1)中裂解液为Buffer SWL裂解液，由氯化钾80-300mM、氯化镁100-200mM、三羟甲基氨基甲烷20-60mM组成，pH为7.5-9。
优选的，步骤(1)中裂解液由氯化钾100mM、氯化镁150mM、三羟甲基氨基甲烷50mM组成，pH为8。
优选的，步骤(1)中蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
优选的，步骤(3)中裂解结合液1为Buffer GL裂解结合液，由10～100mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、1～10M的盐酸胍、10～100mM NaCl氯化钠、0.1～5％Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚、0.1～5％Tween-20吐温-20组成，pH6.5～8.5；裂解结合液2为Buffer GTL裂解结合液，由10～100mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、10-20％ SDS十二烷基硫酸钠、10～100mM NaCl氯化钠组成，pH6.5～8.5；漂洗液1为Buffer GW1漂洗液，由10～50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、10～100mM NaCl氯化钠和40～60％无水乙醇组成，pH6.0～7.0；漂洗液2为Buffer GW2漂洗液，由10～50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、70～80％无水乙醇组成，pH为6.0～7.0；洗脱液为Buffer EB洗脱液，由1～50mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1～10mM EDTA乙二胺四乙酸组成，pH7.5～9.0。
优选的，步骤(3)中裂解结合液1由50mMTris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10mMEDTA乙二胺四乙酸、100mM NaCl氯化钠、2M的盐酸胍、1％Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚、3％Tween-20吐温-20组成，pH为7.5；裂解结合液2由50mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10mM EDTA乙二胺四乙酸、10％ SDS十二烷基硫酸钠组成，pH为7.5；漂洗液1由50mMTris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5mM EDTA乙二胺四乙酸、100mM NaCl氯化钠和56％无水乙醇组成，pH为8.0；漂洗液2由50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5mM EDTA乙二胺四乙酸、80％无水乙醇组成，pH为8.0；洗脱液由5mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，2mM EDTA乙二胺四乙酸组成，pH为8.0。
优选的，步骤(3)中Magbeads PN磁珠为超顺磁微球，二氧化硅包被磁珠，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/mL，pH为5.0。
与最接近的现有技术比，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
1、本发明的裂解液即可用作裂解液也可作为保存液，无需另外加入样本裂解液进行机器研磨，可以直接放置金属浴或温箱中进行消化，无需重新转移样本，不影响提取效果；
2、发明的裂解液成分不含有毒的有机溶剂、无刺激性，组织裂解无需借助研磨仪器和液氮研磨，不需要机器高温反复研磨不会影响DNA的质量；
3、本发明的裂解液具有长期常温保存DNA的作用，样本无需低温保存，避免反复冻融，做到保存裂解一体化；裂解液加入后可室温保存一周，DNA不会降解；
4、本发明采用磁珠法提取的方法即可满足手提，又可搭配磁珠和核酸提取仪进行自动化提取，所获得的DNA片段较长、纯度较高，片段在1万以上，纯度A260/A280>1.8；可用于电泳、PCR、DNA分型等下游实验；
5、本发明使用二氧化硅包被的纳米磁性微球，并配合自动化提取仪器可实现大批量样本进行DNA的快速提取，用时仅需24分钟，大大缩减了样本DNA提取时间。
附图说明
图1为本发明磁珠法提取产物琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。请参阅图1，图1为提取产物5ul，加入1ul 6x LoadingBuffer指示剂混合后，加入1％浓度琼脂糖凝胶电泳中，120V，30min的电泳结果图。
实施例1：
一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，包含如下步骤：
(1)剪取小鼠尾巴末端或小鼠整只耳朵放入含有200ul裂解液的1.5mL离心管中，加入20μL Proteinase K，涡旋震荡10秒；
(2)将水浴锅或恒温混匀仪预热至56℃，孵育1-2小时直至样品完全溶解，形成Lysate裂解产物；
(3)按下表1向96DW深孔板中加入试剂：
表1深孔板中试剂表
(4)将加入试剂的深孔板和磁套按表2顺序放在CWE960 96通道核酸全自动提取仪上，运行相应提取程序“Mouse DNA程序”；仪器操作程序如表3所示。
| 提取板 | CWE960位置 |
| Plate 1 | 1 |
| Plate 2 | 2 |
| Plate 3 | 3 |
| Plate 4 | 4 |
| Plate 5 | 5 |
| Plate 6 | 6 |
| 磁套 | 4 |
表2深孔板和磁套放置顺序表
表3仪器操作程序表
(5)运行结束后将深孔板和磁套从仪器中取出，把提取板Plate6中的洗脱产物转移至离心管中-20℃保存备用。
进一步的，步骤(1)中蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
进一步的，步骤(1)中裂解液为Buffer SWL裂解液，由氯化钾80-300mM、氯化镁100-200mM、三羟甲基氨基甲烷20-60mM组成，pH为7.5-9。
进一步的，步骤(3)中裂解结合液1为Buffer GL裂解结合液，由10～100mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、1～10M的盐酸胍、10～100mMNaCl氯化钠、0.1～5％Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚、0.1～5％Tween-20吐温-20组成，pH6.5～8.5；裂解结合液2为Buffer GTL裂解结合液，由10～100mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、10-20％ SDS十二烷基硫酸钠、10～100mMNaCl氯化钠组成，pH6.5～8.5；漂洗液1为Buffer GW1漂洗液，由10～50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、10～100mM NaCl氯化钠和40～60％无水乙醇组成，pH为6.0～7.0；漂洗液2为Buffer GW2漂洗液，由10～50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、70～80％无水乙醇组成，pH6.0～7.0；洗脱液为Buffer EB洗脱液，由1～50mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸组成，pH7.5～9.0。
进一步的，步骤(3)中Magbeads PN磁珠为超顺磁微球，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/mL，pH为5.0。
实施例2
步骤(1)中裂解液为Buffer SWL裂解液，由氯化钾100mM、氯化镁150mM、三羟甲基氨基甲烷50mM组成，pH为8。
步骤(3)中裂解结合液1由50mMTris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10mM EDTA乙二胺四乙酸、100mM NaCl氯化钠、2M的盐酸胍、1％Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚、3％Tween-20吐温-20组成，pH为7.5；裂解结合液2由50mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10mM EDTA乙二胺四乙酸、10％ SDS十二烷基硫酸钠组成，pH为7.5；漂洗液1由50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5mM EDTA乙二胺四乙酸、100mM NaCl氯化钠和56％无水乙醇组成，pH为8.0；漂洗液2由50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5mM EDTA乙二胺四乙酸、80％无水乙醇组成，pH为8.0；洗脱液由5mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2mMEDTA乙二胺四乙酸组成，pH为8.0。
步骤(3)中Magbeads PN磁珠为超顺磁微球，二氧化硅包被磁珠，粒径介于50nm，悬浮液浓度为100mg/mL，pH为5.0。
综上，分别用5个小鼠尾巴和5个小鼠耳朵样本经过以上操作步骤后，提取DNA浓度和纯度数据表如表4所示。(Conc(ng/ul)代表DNA浓度、A260/A280、A260/A230代表纯度，有无盐类和蛋白质残留)
| 样本类型 | Conc(ng/ul) | A260/A280 | A260/A230 |
| 鼠尾巴1 | 199.7 | 1.86 | 1.81 |
| 鼠尾巴2 | 210.4 | 1.82 | 1.83 |
| 鼠尾巴3 | 198 | 1.88 | 1.77 |
| 鼠尾巴4 | 175 | 1.82 | 1.83 |
| 鼠尾巴5 | 182.5 | 1.83 | 1.77 |
| 鼠耳朵1 | 152.4 | 1.83 | 1.79 |
| 鼠耳朵2 | 154.9 | 1.83 | 1.85 |
| 鼠耳朵3 | 164.45 | 1.84 | 1.85 |
| 鼠耳朵4 | 146.1 | 1.89 | 1.82 |
| 鼠耳朵5 | 144.8 | 1.83 | 1.76 |
表4为提取DNA浓度和纯度数据表
综上所述，从图1和表4的实验数据可以看出本发明配合核酸提取仪使用能够高效地提取小鼠组织样本中的DNA，并且提取产物得率高，片段完整性高，可用于PCR、基因分型等下游检测。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在申请待批的本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (9)
1.一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：包含如下步骤：
(1)将新鲜采集的小鼠尾巴或耳朵直接放于含有裂解液的离心管中，加入蛋白酶K，涡旋震荡；
(2)将水浴锅或恒温混匀仪预热，然后孵育直至样品完全溶解，形成Lysate裂解产物；
(3)向深孔板中加入试剂，具体如下：
提取板Plate 1中试剂和容量为：裂解结合液1：120μL、裂解结合液2：120μL、异丙醇：300μL、Magbeads PN磁珠:20μL、其余为Lysate裂解产物；
提取板Plate 2中试剂和容量为：漂洗液1:750μL；
提取板Plate 3中试剂和容量为：漂洗液1:750μL；
提取板Plate 4中试剂和容量为：漂洗液2:750μL；
提取板Plate 5中试剂和容量为：漂洗液2:750μL；
提取板Plate 6中试剂和容量为：洗脱液:80μL；
(4)将加入试剂的深孔板和磁套按顺序放在全自动核酸提取仪上，运行相应提取程序；
(5)运行结束后将深孔板和磁套从仪器中取出，把提取板Plate6中的洗脱产物转移至离心管中-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)中裂解液的体积为200μL，蛋白酶K的体积为20μL，离心管的容积是1.5mL，涡旋震荡的时间为10秒。
3.根据权利要求1所述的一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中预热至56℃，孵育时间是1-2小时。
4.根据权利要求1所述的一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)中裂解液为Buffer SWL裂解液，由氯化钾80-300mM、氯化镁100-200mM、三羟甲基氨基甲烷20-60mM组成，pH为7.5-9。
5.根据权利要求4所述的一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)中裂解液由氯化钾100mM、氯化镁150mM、三羟甲基氨基甲烷50mM组成，pH为8。
6.根据权利要求1所述的一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)中蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：所述步骤(3)中裂解结合液1为Buffer GL裂解结合液，由10～100mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、1～10M的盐酸胍、10～100mM NaCl氯化钠、0.1～5％Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚、0.1～5％Tween-20吐温-20组成，pH为6.5～8.5；裂解结合液2为Buffer GTL裂解结合液，由10～100mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、10-20％SDS十二烷基硫酸钠、10～100mM NaCl氯化钠组成，pH为6.5～8.5；漂洗液1为Buffer GW1漂洗液，由10～50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、10～100mM NaCl氯化钠和40～60％无水乙醇组成，pH为6.0～7.0；漂洗液2为Buffer GW2漂洗液，由10～50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸、70～80％无水乙醇组成，pH为6.0～7.0；洗脱液为Buffer EB洗脱液，由1～50mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1～10mM EDTA乙二胺四乙酸组成，pH为7.5～9.0。
8.根据权利要求7所述的一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：所述步骤(3)中裂解结合液1由50mMTris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10mM EDTA乙二胺四乙酸、100mM NaCl氯化钠、2M的盐酸胍、1％Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚、3％Tween-20吐温-20组成，pH为7.5；裂解结合液2由50mMTris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10mMEDTA乙二胺四乙酸、10％SDS十二烷基硫酸钠组成，pH为7.5；漂洗液1由50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5mM EDTA乙二胺四乙酸、100mM NaCl氯化钠和56％无水乙醇组成，pH为8.0；漂洗液2由50mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5mM EDTA乙二胺四乙酸、80％无水乙醇组成，pH为8.0；洗脱液由5mM Tris-HCL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2mM EDTA乙二胺四乙酸组成，pH为8.0。
9.根据权利要求1所述的一种磁珠法快速提取小鼠骨组织DNA的方法，其特征在于：所述步骤(3)中Magbeads PN磁珠为超顺磁微球，二氧化硅包被磁珠，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/mL，pH为5.0。
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| CN116410973A (zh) * | 2023-06-09 | 2023-07-11 | 天根生化科技（北京）有限公司 | 一种基因组dna提取试剂盒及基因组dna的提取方法 |
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| CN116410973B (zh) * | 2023-06-09 | 2023-09-19 | 天根生化科技（北京）有限公司 | 一种基因组dna提取试剂盒及基因组dna的提取方法 |
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