CN105462961A

CN105462961A - 一种提取核酸的方法及试剂盒

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Publication number: CN105462961A
Application number: CN201610023898.3A
Authority: CN
Inventors: 毕万里; 周如华; 王志峰; 石云杰; 张健; 张伟; 李鹏飞
Original assignee: SUZHOU PUBLIC SECURITY BUREAU; SUZHOU NUHIGH BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU PUBLIC SECURITY BUREAU; SUZHOU NUHIGH BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2016-01-14
Filing date: 2016-01-14
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2036-01-14
Also published as: CN105462961B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种提取核酸的方法及试剂盒。本发明所述方法向待提取样品中加入裂解液裂解释放核酸分子，然后加入吸附核酸的材料以及结合液对核酸分子进行吸附，获得核酸-吸附材料复合物；将核酸-吸附材料复合物洗涤后，用含有表面活性剂的水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱下来的溶液，获得目标核酸分子。本发明针对现有提取核酸的方法的缺陷，在洗脱环节中将表面活性剂加入到洗脱液中，进而提高了洗脱核酸的得率，获得更多量的核酸分子，同时提取后的核酸长久保存而不被吸附在管壁或者被核酸酶降解，眼馋了核酸分子的保存时间。

Description

一种提取核酸的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种提取核酸的方法及试剂盒。

背景技术

作为携带遗传信息的重要物质，核酸通常存在于复杂的实际样品中，例如血液，细胞，粪便，树叶等等。这些样品中的核酸通常无法直接被用于分子生物学实验和检测，需要进一步的纯化以去除干扰物质才能进行下游的一些实验和分析。

分离提取核酸的方法在文献中多有报道(e.g.Chapter2(DNA)andChapter4(RNA)ofF.Ausubeletal.,eds.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley-Interscience,NewYork,1993)。这些方法通常需要将样品在一定溶液中重悬并通过化学试剂或者酶的方法将细胞破裂，将核酸释放出来。这一过程称为裂解。释放出的核酸在溶液中会可逆的结合于吸附核酸的材料上。这些材料包括玻璃颗粒，玻璃纤维，磁珠，硅藻土，硅胶等，或者以上各种材料的变化或组合。高浓度的离液盐将有利于核酸结合到上述材料上。在接下来的步骤中，通过离心或者加入磁场等外界作用力，收集这些结合核酸的材料。这些结合核酸的材料接下来会被特定溶液洗涤，例如80％乙醇，以去除杂质。最后这些结合核酸的材料会被洗脱液处理并将核酸洗脱下来，一般是加热至60度并以重蒸水进行洗脱。以此原理为基础，研究者报道了大量的提取核酸的方法。(e.g.US5,075,430；Markoetal.,Anal.Biochem.121,382-387,1982；Vogelsteinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76,615-619,1979；Boometal.,J.Clin.Microbiol.28,495-503,1990；ChenandThomas,Anal.Biochem.101,339-341,1980)。但是，目前的核酸提取方法在经过洗脱后所获得的核酸分子的量仍然不够理想，需要进一步改进。

另外，在实际应用中，随着时间的推移，洗脱下来的核酸并不能稳定保存。这样，通过上述方法提取的核酸分子如果不能马上进行下游的分析实验，而是存放起来的话，核酸分子就存在着不稳定的风险，也不利于下游分子生物学实验在以后实验中的重复。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取核酸的方法及基于所述方法的试剂盒，使得所述方法能够提取更多量的核酸分子；

本发明的另一个目的在于提供一种提取核酸的方法及基于所述方法的试剂盒，使得所述方法提取的核酸分子在4度条件下保存20天后仍能成功扩增并有效分型。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种提取核酸的方法，包括：

步骤1、向待提取样品中加入裂解液裂解解释放核酸分子，然后加入吸附核酸的材料以及结合液对核酸分子进行吸附，获得核酸-吸附材料复合物；

步骤2、将核酸-吸附材料复合物洗涤后，用含有表面活性剂的水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱下来的溶液，获得目标核酸分子。

为了能够获得更多量的核酸分子，本发明在洗脱液中增加了表面活性剂，一方面有利于提高洗脱的得率，获得更多量的核酸分子；另一方面表面活性剂也有利于提取后的核酸长久保存而不被吸附在管壁或者被核酸酶降解。

其中，作为优选，所述表面活性剂为离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂。进一步优选地，所述离子型表面活性剂为阴离子表面活性剂；更进一步优选，所述阴离子表面活性剂为SDS，所述非离子型表面活性剂为TritonX-100。

作为优选，所述洗脱液中表面活性剂的质量百分比浓度为0.1-1％，在本发明的一些实施方式中，所述洗脱液为包含SDS的重蒸水，SDS浓度可以为0.1％、0.5％或1％，或者洗脱液为包含TritonX-100的重蒸水，TritonX-100浓度为0.1％。

对于本发明所采用的裂解液、核酸吸附材料以及结合液(也称为裂解结合液)，本领域技术人员可根据现有的提取方法进行选择并根据所提取的核酸种类以及所选择的试剂确定合适的加入量，这对于本领域技术人员来说是可以实现的。

在本领域中，所述裂解液一般为离液试剂、蛋白酶、碱、表面活性剂，可以采用其中一种或两种以上对样品进行裂解。而其中的离液试剂主要是离液盐或其组合。离液试剂指的是通过其水溶液能够破坏其他分子主要指生物大分子(例如核酸和蛋白质)的氢键从而影响其稳定性的试剂。在高浓度的离液试剂中，蛋白质的二级结构通常被破坏但其一级结构仍然保持。本发明给出了更加优选的裂解液方案，为离液试剂和蛋白酶。其中蛋白酶优选蛋白酶K。而离液试剂优选为盐酸胍，异硫氰酸胍，碘化钠，尿素中的一种或两种以上。进一步优选地，所述裂解液为异硫氰酸胍和蛋白酶K，浓度为25mM/μl异硫氰酸胍，1.5μg/μl蛋白酶K，以此增强裂解细胞的效果，释放更多核酸分子。

本发明所述核酸的吸附材料指的是能在一定的液体环境中，与核酸相互作用，能可逆的形成核酸-吸附材料复合物的材料。吸附核酸的材料在吸附的溶液环境中是固态的，常常以颗粒，粉末，纤维或者薄膜的形式出现。常见的吸附核酸的材料包括但不限于硅珠，磁珠，硅藻土等，其中广泛使用的是磁珠，通过对磁性颗粒进行一定的包被(如硅基、氨基、羧基等)，形成磁珠，从而可以实现对核酸的高通量、自动化提取。这一技术产生于20世纪80年代，已经有了成熟的试剂盒并形成为产业。磁性颗粒的内核通常由γ-Fe2O3或者Fe3O4等材料组成。

在结合液存在的情况下，核酸将更有利于被吸附至吸附核酸的材料上，形成核酸-吸附材料复合物。本发明给出包含离液试剂的结合液选择方案，更加优选的结合液方案为离液试剂和异丙醇，离液试剂采用上述优选方案。更加优选的为异硫氰酸胍和异丙醇，浓度为4000mM/μl异硫氰酸胍，10％异丙醇。

本发明所述核酸是指由许多核苷酸聚合而成的生物大分子，它是一种极为重要的生命物质。核酸广泛存在于动植物细胞，微生物体内。根据化学组成，核酸主要分为脱氧核糖核酸(DNA)与核糖核酸(RNA)两种，而本发明所述核酸分子也指DNA、RNA或两者的混合。

作为优选，所述洗涤采用乙醇洗涤，乙醇的浓度为30-100％，在本发明的具体实施方式中采用80％乙醇进行洗涤。

作为优选，所述洗脱在50-70℃下洗脱5-20min，更优选为在65℃下洗脱10min。

采用相同样品分别按照本发明方法和现有方法提取DNA，并通过荧光定量PCR反应检测Ct平均值，结果显示，在本发明方法下Ct平均值小于现有方法，这表明通过本发明方法能提取出更多量的DNA。

同时将相同DNA分别处于本发明洗脱液和重蒸水中在4℃下保存20天，然后进行毛细管凝胶电泳，结果显示，在本发明洗脱液中的多个DNA样品全部能够扩增，且可以有效分型，而重蒸水中的多个DNA样品不能全部扩增，且出峰不完全。

基于上述技术效果，本发明同时提供了一种提取核酸的试剂盒，包括：

离液试剂、结合液、核酸吸附材料和洗脱液，所述洗脱液为包含表面活性剂。

作为优选，所述洗脱液中表面活性剂的质量百分比浓度为0.1-1％。

作为优选，所述裂解液为离液试剂、蛋白酶、碱、表面活性剂中的一种或两种以上。进一步优选为离液试剂和蛋白酶。最优选地，所述裂解液为异硫氰酸胍和蛋白酶K

作为优选，所述结合液为离液试剂和异丙醇。

作为优选，所述离液试剂为盐酸胍，异硫氰酸胍，碘化钠，尿素中的一种或两种以上。

作为优选，所述吸附核酸的材料为硅珠，磁珠，硅藻土或硅胶。

在本发明所述试剂盒中，可以将上述各种试剂配制成各种浓度规格的溶液，只需在使用时进行调配即可。

由以上技术方案可知，本发明针对现有提取核酸的方法的缺陷，在洗脱环节中将表面活性剂加入到洗脱液中，进而提高了洗脱核酸的得率，获得更多量的核酸分子，同时提取后的核酸长久保存而不被吸附在管壁或者被核酸酶降解，眼馋了核酸分子的保存时间。

附图说明

图1所示为采用不同洗脱液提取的DNA的荧光定量PCR扩增图；

图2所示为本发明洗脱液下保存的DNA的毛细管凝胶电泳图；

图3所示为重蒸水下保存的DNA的毛细管凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种提取核酸的方法及试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法和试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种提取核酸的方法及试剂盒进行详细说明。

实施例1：本发明所述提取方法以及对比试验

取5ul的新鲜的人血液，滴在滤纸片上，并在烘箱中用60度烘干，将烘干后的血斑用剪刀剪下作为待提取DNA的样品。用相同的方法一共制作15个样品，并分为5组，每组3个样品。这四组使用洗脱液分别为：1，重蒸水；2，0.1％SDS水溶液；3，0.5％SDS水溶液；4，1％SDS水溶液；5，1％TritonX-100。

对样品使用磁珠法进行DNA的提取回收。具体过程如下，加入200ul离液试剂(25mM异硫氰酸胍，300ug蛋白酶K)，56度恒温金属浴上加热1个小时，98度灭活5分钟，然后13000rpm离心5分钟，取上清转移至新的EP管中，加入10ul纳米磁珠(温州安科纳米科技有限公司)混匀后再加入400ul结合液(4000mM异硫氰酸胍，10％异丙醇)混匀，静置15分钟，混匀后放置磁力架上进行磁珠分离，吸弃上清。然后加入800ul的洗涤液(80％乙醇)，混匀后放置磁力架上进行磁珠分离，吸弃上清。重复上述漂洗步骤一次。吸弃上清后的磁珠放入65度恒温金属浴上开盖干燥5分钟，最后加入洗脱液30ul，放入65度恒温金属浴上10分钟进行洗脱。上清作为下一步的PCR实验的模板。其中四个实验组分别使用上述不同的洗脱液。

为了验证本发明能够获得更多量的DNA，将上述获得的DNA进行荧光定量PCR加以验证，荧光定量PCR反应体系如下：

其中，所用SG2引物和探针是为了扩增人基因组全长序列中的一小段核苷酸序列，具体序列如下：

SG2上游引物(SEQIDNO:1):CCTCTTAATGGGGAGGTGGCC

SG2下游引物(SEQIDNO:2):TAAAAGCAGCCCTGGTGACCAG

SG2探针(SEQIDNO:3)：TCACCACCCCACTATGCCACCCC，同时在5’端标记TAMRA荧光基团，3’端标记BHQ-2淬灭基团。

另外，加入两组对照组PCR实验，每组重复3个，对照组不需要进行磁珠纯化，上述荧光定量PCR反应体系中的DNA模板分别为重蒸水稀释的0.5ng/ul的人基因组标准DNAG1471(promega购买)和1％SDS稀释的0.5ng/ul的人基因组标准DNAG1471。

使用RocheLightCycle480荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应，热循环条件为95度10分钟，(95度15秒，60度40秒)，重复括号内循环45次。荧光数据在每个循环的60度40秒期间收集。PCR实验扩增图见附图1，对应的Ct值见表1。

表1

在荧光定量PCR技术中，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11(9):1026-1030.〕，起始模板拷贝数越多，Ct值越小。

图1和表1的结果表明，对照组的实验加入1％TritonX-100，1％SDS稀释的人基因组与水稀释的人基因组相比Ct相差不大，表明在本实验条件下加入这些表面活性剂对荧光定量PCR产生的Ct影响不大。而加入SDS,TritonX-100,的洗脱液实验组Ct与水作为洗脱液实验组相比Ct大幅度提前，与对照组实验相比，说明Ct的提前不是由于洗脱液带入的表面活性剂导致的Ct提前，而是说明洗脱液加入SDS,TrionX-100,的实验组与水作为洗脱液的实验组相比，能提取出更多量的核酸。

实施例2：DNA保存对比试验

将人类基因组模板99481ng/ul分别使用0.1％TritonX-100，传统洗脱液(ddH2O)来稀释，稀释至样品浓度为0.2ng/ul,0.1ng/ul，0.05ng/ul。

样品均存放在4摄氏度冰箱中，分别隔0天，1天，2天，5天，10天，20天各取1ul作为模板，使用IDplus(lifetechnology公司)试剂盒中进行扩增，每组做四个平行对照。扩增产物进行毛细管电泳。比较两者的扩增情况。

PCR循环反应条件：95℃，11min(94℃，20s；59℃，180s)×28循环60℃，10min

毛细管凝胶电泳：甲酰胺15ul+PCR扩增样品1.5ul；

实验结果表明：0.1％TritonX-100保存的样品在存放20天后，扩增效果优于ddH₂O稀释的实验组，结果见表2，(4/4表明四个平行对照中扩增成功4个)。

表2

0.2ng组

0天

1天

2天

5天

10天

20天

0.1％TritonX-100

4/4

ddH2O

4/4

0.1ng组

0天

1天

2天

5天

10天

20天

0.1％TritonX-100

4/4

ddH2O

4/4

3/4

0.05ng组

0天

1天

2天

5天

10天

20天

0.1％TritonX-100

4/4

ddH2O

4/4

2/4

0/4

0.05ng实验组毛细管电泳图见图2与图3，由图中结果可以看出，在0.05ng实验组，0.1％TritonX-100保存的模板可以在4度条件下保存20天仍能有效分型，而用重蒸水保存的模板则出现了出峰不完全的情况。同时，0.1ng组和0.2ng组也属于上述情况。

按照本实施例的方法将TritonX-100替换成SDS，结果显示，0.1％SDS保存的样品在存放60天后，扩增效果仍优于ddH₂O稀释的实验组，4个平行对照中全部扩增成功。在0.05ng实验组，0.1％SDS保存的模板可以在4度条件下保存60天仍能有效分型，而用重蒸水保存的模板则出现了出峰不完全的情况。同时，0.1ng组和0.2ng组也属于上述情况。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种提取核酸的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述表面活性剂为离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述离子型表面活性剂为阴离子表面活性剂。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述阴离子表面活性剂为SDS。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为TritonX-100。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述洗脱液中表面活性剂的质量百分比浓度为0.1-1％。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述裂解液为离液试剂、蛋白酶、碱、表面活性剂中的一种或两种以上。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述裂解液为离液试剂和蛋白酶。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述结合液包含离液试剂。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述结合液为离液试剂和异丙醇。

11.根据权利要求7-10任意一项所述方法，其特征在于，所述离液试剂为盐酸胍，异硫氰酸胍，碘化钠，尿素中的一种或两种以上。

12.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述吸附核酸的材料为硅珠，磁珠，硅藻土或硅胶。

13.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述核酸分子为DNA、RNA或两者的混合。

14.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述洗涤采用乙醇洗涤。

15.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述洗脱在50-70℃下洗脱5-20min。

16.一种提取核酸的试剂盒，其特征在于，包括：

裂解液、结合液、核酸吸附材料和洗脱液，所述洗脱液为包含表面活性剂的水溶液。

17.根据权利要求16所述试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂。

18.根据权利要求17所述试剂盒，其特征在于，所述离子型表面活性剂为阴离子表面活性剂。

19.根据权利要求18所述试剂盒，其特征在于，所述阴离子表面活性剂为SDS。

20.根据权利要求17所述试剂盒，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为TritonX-100。

21.根据权利要求16所述试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中表面活性剂的质量百分比浓度为0.1-1％。

22.根据权利要求16所述试剂盒，其特征在于，所述裂解液为离液试剂、蛋白酶、碱、表面活性剂中的一种或两种以上。

23.根据权利要求22所述试剂盒，其特征在于，所述裂解液为离液试剂和蛋白酶。

24.根据权利要求16所述试剂盒，其特征在于，所述结合液包含离液试剂。

25.根据权利要求24所述试剂盒，其特征在于，所述结合液为离液试剂和异丙醇。

26.根据权利要求22-25任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述离液试剂为盐酸胍，异硫氰酸胍，碘化钠，尿素中的一种或两种以上。

27.根据权利要求16所述试剂盒，其特征在于，所述吸附核酸的材料为硅珠，磁珠，硅藻土或硅胶。