CN113355320A - 用于分离和/或纯化核酸的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一些用于分离和/或纯化核酸的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，分离和/或纯化核酸的方法以及相应的试剂盒。该发明属于生物技术领域。在解决生物核酸纯化和/或提取的问题方面具有的优势如下：1、快速，大约在15分钟左右。2、室温提取，不需要高温水浴等过程。3、所得核酸的质和量都很高，可以用于下游分子生物学实验，如：PCR实验等。

Description

用于分离和/或纯化核酸的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂
【技术领域】
本发明涉及用于分离和/或纯化核酸的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂、分离和/或纯化核酸的方法以及提取试剂盒。所述裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂及方法尤其适用于分子生物学实验目的。
【背景技术】
随着基因组测序技术的发展，生物基因组的序列、结构和功能研究飞速发展，而获得高纯度、高含量和高完整度的生物基因组DNA是基因组测序技术得以应用的首要前提。传统的生物基因组DNA提取方法主要有CTAB和SDS法，提取步骤主要包括生物组织进行初步处理，以及之后的细胞裂解、去除杂质、DNA沉淀、漂洗和洗脱等过程。其主要是以CTAB或SDS等去污剂对细胞进行裂解后，释放出细胞中的基因组DNA；再通过氯仿和苯酚抽提或高盐沉淀的方法，去除蛋白质、多酚和多糖等杂质；然后在提取的上清液中加入适量体积的无水乙醇、异丙醇或PEG等有机溶剂将DNA沉淀或吸附在硅胶柱、离子交换柱等介质上；最后用漂洗液进行漂洗后，用低浓度盐溶液溶解或从介质上洗脱下来。
为了更好的研究和理解基因和RNA的生物学功能，人们发展出一些提取生物组织的RNA方法。传统的生物RNA提取方法主要有Trizol法，SDS法，CTAB法，异硫氰酸胍法等。
现有技术揭示了从生物体分离和/或纯化核酸的多种方法。在这方面，有许多经典的一步法，包括在加入水性缓冲剂和有机萃取剂之后进行萃取。核酸保留在水相中，很多杂质被留在有机相而除去。但是，在水相中还会保留一些少许的核酸污染物，需要在更进一步纯化步骤中去除。因此，一些新的替代方法出现并逐渐获得重视，这些方法主要是基于把核酸选择性吸附和/或结合到基质上，包含但不限于：微柱和磁球等，然后，通过清洗把污染物去除，最后，将纯化的核酸从基质上洗脱下来。但是，这些核酸提取方法随着步骤的增加，所用的试剂种类和/或提取核酸的时间也增加了。
专利CN 102046793 A为生物样品核酸的分离和/或纯化提供了多种可行的方法。但该方法也存在一些缺点，如：1、至少一种基于聚氧乙烯的非离子型表面活性剂，而且还进一步给出限制范围，优选自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，更具体的说，聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚；2、至少一种缓冲化合物，在本发明中，缓冲化合物不是必须的；3、盐溶液是钠盐或胍盐，尤其是胍盐有毒性和对皮肤腐蚀性，提取过程会让蛋白质变性，在DNA提取时，不利于RNaseA对RNA的降解，也给该类方法很大限制；4、该方法提供的裂解液至少包含，裂解液A和裂解液B，增加了实验步骤和耗时等缺点。
【发明内容】
本发明的目的是提供克服至少一种上述现有技术缺点的方法和常温快速核酸提取试剂盒，该方法具有尽可能优异或更好的裂解、结合、洗涤和/或洗脱性质。
如权利要求1所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂实现的本发明的目的。因此，提供了一种裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，其包含：
-至少一种盐溶液或一种以上盐溶液混合物；
-至少一种或一种以上表面活性剂，即阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂和/或非离子型表面活性剂。以所述试剂的总体积计，其用量：重量/体积在0～50％之间。
-和/或一种或一种以上缓冲化合物，PH值在3～11之间都可以，优先选自，包含但不限于：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、醋酸甲缓冲剂等。
-和/或一种或一种以上螯合剂化合物，优先选自，包含但不限于：N-乙酰-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N，N′-二琥珀酸(EDDS)、1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(NTMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(DTPMP)、1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(HEDP)等)。
-和/或一种或一种以上能溶于水的有机物，优先选自，包含但不限于：盐酸胍、异硫氰酸胍、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等。
出于本发明的目的，属于“裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂”表示裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的试剂，或者可用用作裂解试剂也可用作结合试剂也可用作洗涤试剂还可用作洗脱试剂。更具体说，出于本发明的目的，术语“裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂”也可以表示本发明的裂解试剂、结合试剂、洗涤试剂和/或洗脱试剂的混合物。
出于本发明的目的，术语“试剂”表示裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂。
出于本发明的目的，术语“盐”表示是指一类金属离子或铵根离子(NH4+)与酸根离子(阴离子)通过离子键结合形成的化合物，溶于水会离解出所有的离子。具体来说，包含但不限于无机盐化合物，如：氯化钠、碘化钠等，和/或一种盐或一种以上盐的混合物。
出于本发明的目的，术语“缓冲化合物”表示可以为水溶液提供缓冲或PH值稳定作用的化合物。
出于本发明的目的，术语“核酸”表示包含但不限于：天然，优选分离的、线性、支化或环状核酸如RNA，具体是mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA、microRNA或核酶，DNA，质粒DNA，线粒体DNA等。
出于本发明的目的，术语“表面活性剂”表示能使目标溶液表面张力显著下降的物质，可以分为：离子型表面活性剂包括阳离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、两性表面活性剂表面活性剂、复配表面活性剂、其他表面活性剂等。
出于本发明的目的，术语“螯合剂”表示能够螯合金属离子的化合物，如EDTA等。
出于本发明的目的，信息“％重量/体积”、“％(重量/体积)”或“％(w/v)”表示例如每100毫升的试剂或组合物中表面活性剂的克数的信息。
根据本发明一个尤其优选的实施方式，特别是溶解度比较大的表面活性剂对于本发明内的广泛应用是有益的。具体是在包含优选选自下组的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂中使用溶解度大的强酸强碱型的无机盐能增加裂解液的稳定性，如：NaCl化学性质稳定。
发现以裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的总体积计，表面活性剂含量在0％～50％之间，对于不同的表面活性剂，最佳浓度差别很大。
尤其适合本发明的是辛基苯基聚氧乙烯醚(Triton X-100)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、聚N-乙烯基丁内酰胺(PVP-40)、聚乙二醇200和聚乙二醇400等；商品化的涂易乐DS-960(天津赫普乐新材料有限公司)、维克乐LFS-1901(天津赫普乐新材料有限公司)等。
根据本发明一优选的实施方式，盐溶液是无机盐溶液，优选选自：氯化钠、醋酸钠、氯化钾、硝酸钾、碘化钠、高氯酸钠、醋酸钾和/或一种以上盐的混合物。
根据所述方法一优选的实施方式，裂解和/或结合组合物包括和/或一种和/或一种以上的缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠、醋酸甲等
根据所述方法一尤其优选的实施方式，裂解和/或结合组合物包含至少一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)和/或醋酸钠和/或磷酸盐缓冲剂。根据所述方法又一更优选的实施方式，裂解和/或结合组合物至少包含一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或醋酸钠。
裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂优选水溶液。
根据进一步优选的实施方式，裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的PH值在3～11之间，优选PH值在4～9之间，更优选PH值在4.5～8之间。
在优选实施方式中，裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，尤其是裂解试剂还可包含酶，例如裂解酶、RNase A、DNase I，具体说，例如蛋白酶K，蛋白酶，消解酶，无色肽酶，溶细胞酶，溶葡萄球菌酶，溶菌酶和核酶等。
本发明的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，可以是裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，或者本发明裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的混合物。
在盐溶液的存在下，优选支化或非支化链烷醇的存在下，将核酸规定到微柱的基质上。因此，优选包含至少一种支链或非支链烷醇的结合试剂。
优选有用的是具有1-5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。根据本发明一优选的实施方式，支化或非支化烷醇是具有1-5个碳原子的醇，优选选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、支化或非支化丁醇或戊醇、和/或它们的混合物。
除非另有说明，定义“支化或非支化链烷醇”，具体是丙醇，丁醇和戊醇包括任何可消耗的具体集团的异构体形式。因此，例如，支化或非支化丙醇包括正丙醇和异丙醇，支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇，支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物。
本发明还涉及裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂在分离和/或纯化核酸中的应用。
本发明还涉及从包含核酸的样品分离和/或纯化核酸的方法，该方法包括一下步骤：
A)样品处理，通过包含但不限于：机械研磨法、酶解法、液氮冷冻干燥法、超声波法等，把样品粉碎；
B)裂解处理后的生物样品；
C)在含有核酸的裂解液和/或支化或非支化链烷醇的存在下，将释放的核酸固定到基于一种基质或一种以上混合物的基质上，包含但不限于微柱、磁球等；
D)任选地洗涤固定在基质上的核酸；
E)任选地洗脱结合在基质上的核酸。
其中，裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂在包含以下组分的裂解和/或结合组合物的存在下进行：
-至少一种盐溶液，和
-至少一种表面活性剂，由于表面活性剂很多，以组合物的总体积计，用量差别很大。
出于本发明的目的，术语“组合物”表示裂解和/或结合组合物。
在本发明方法优选的实施方式中，使用本发明的裂解试剂裂解样品。使裂解试剂与要裂解的生物样品相接触。根据应用，在各时间点相互独立地加入一种或一种以上的酶。样品可以是液态，例如在液态临床样品的情况下。通常，将包含固体组分的临床样品，例如粪便样品或拭子样品，悬浮在合适的水性溶液中，然后进一步分析。通常裂解之前从培养基获取细胞培养物，但大多数情况下，避免完全干燥样品。在完全干燥的样品的情况下，例如冻干样品，要先在水性溶液重建样品，再作进一步处理，例如病毒标准品的冻干品。因此需要裂解的样品通常包含一些液体。使样品中存在的液体与裂解试剂相接触。在这方面，用于从样品分离和/或纯化核酸的方法通常涉及包含裂解试剂以及样品的或已经加入所述样品的溶液的其他液体的裂解组合物。
出于本发明的目的，术语“裂解和/或结合组合物”表示从样品分离和/或纯化核酸的方法中使用的裂解和/或结合试剂，除裂解和/或洗涤试剂外还可包含液体。裂解和/或结合组合物优选包含本发明的裂解和/或结合试剂。
根据所述方法另一优选的实施方式，在本发明结合组合物存在下，使释放的核酸固定到基质上，包含但不限于各种微柱和磁球等。
优选使本发明的裂解和/或结合试剂与裂解的样品相接触。在样品与结合试剂接触之前可去除裂解组合物或另一种进行裂解的溶液。优选不去除裂解组合物。优选地，使结合试剂与包含裂解组合物的样品相接触。
根据所述方法尤其优选的实施方式，在裂解组合物的存在下进行裂解，在结合组合物的存在下进行固定。因此，固定优选在裂解组合物和结合组合物的混合物的存在下进行。
任选地，裂解试剂同时也可用作结合试剂。任选地，结合试剂同时也可用作裂解试剂。因此，优选包含至少一种支链或非支链烷醇的结合试剂。
优选有用的是具有1-5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。根据本发明一优选的实施方式，支化或非支化烷醇是具有1-5个碳原子的醇，优选选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、支化或非支化丁醇或戊醇、和/或它们的混合物。
根据一优选的实施方式，以结合组合物的总体积计，结合组合物包含体积含量在10％～200％范围内，优选在50％～120％之间，更优选在60％～90％之间。
除非另有说明，定义“支化或非支化链烷醇”，具体是丙醇，丁醇和戊醇包括任何可消耗的具体集团的异构体形式。因此，例如，支化或非支化丙醇包括正丙醇和异丙醇，支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇，支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物。
根据本发明一优选的实施方式，使样品与基于一种或一种以上二氧化硅化合物如二氧化硅、硅酸盐、玻璃和/或硅胶的基质接触并孵育足以实现结合的时间，从而分离核酸。基质可以使现有技术已知的常规设计，例如颗粒形式，膜形式或滤器形式等。为便于去除，优选具有磁性的颗粒。从10秒～30分钟的孵育时间对于核酸是方便的。根据上述所述方法，一尤其优选的实施方式，从1分钟～10分钟的孵育时间对于核酸是方便的。根据上述所述方法，又一更优选实施方式，具体约为5分钟的孵育时间是有益的。
优选才有具有胶状二氧化硅涂层的磁性颗粒来分离核酸。优选采用具有胶状二氧化硅涂层并且平均粒径在1um～40um范围内，优选在5um～20um之间，尤其优选在6um～10um之间，优选粒度分布窄的磁性颗粒来分离核酸。更优选地，采用具有胶状二氧化硅涂层并且平均粒度在6um～10um之间，优选粒度分布窄大的磁性颗粒来分离核酸。
在又一优选的实施方式中，磁性或有磁力吸引的颗粒是具有基于氧化铁的磁性的颗粒，优选选自磁铁矿(Fe3O4)，磁赤铁矿(γ-Fe2-O3)和/或铁氧体。
能够以有益方式使用的磁性二氧化硅颗粒可参见例如国际申请WO 01/71732，其内容被纳入本文作为参考。
在优选实施方式中，可使用具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性颗粒形式的基于一种或多种二氧化硅化合物的基质。
在4℃～90℃之间的温度进行结合，优选在20℃～70℃，尤其优选在45℃～70℃，最佳优选在50℃～65℃。结合也可以是室温进行，例如在15℃～25℃之间。
孵育后，从裂解和/或结合组合物中去除结合到基于一种或一种以上二氧化硅化合物的基任选的结合试剂也可用作洗涤试剂。
裂解和/或结合组合物包含至少一种盐溶液和至少一种表面活性剂。
从含核酸的生物样品和/或纯化核酸的此类方法的优点在于，如果使用包含至少一种盐溶液或至少一种表面活性剂的裂解和/或结合组合物，即使在室温或升高的温度，例如50℃，储存几个月或者一年，其提取效果基本没有发生变化。
用于从含核酸的生物样品分离和/或纯化核酸的此类方法的另一个优点在于，例如，分离的核酸，特别使病毒DNA，例如乙型肝炎病毒(HBV)DNA的尤其优良产量成为可能。
“生物样品”可理解为表示基于颗粒或分子的材料，具体是病毒、噬菌体和细胞如细菌细胞、酵母或霉菌细胞或人、动物或植物细胞。所述方法尤其适用于从人、动物或植物来源的样品材料分离核酸如DNA或RNA，例如临床样品如血液、血浆、血清、口、鼻、喉冲洗液、支气管肺泡灌洗液、尿、脑脊液、痰、唾液、粪便、抽吸物、涂片/拭子、例如口腔拭子、阴道拭子等，以及这些样品材料在合适的营养培养基中的培养物。
样品也可来自环境分析、食物分析或分子生物学研究领域，例如来自细菌培养物，酵母或真菌培养物，病毒培养物、噬菌体裂解物或扩增过程的产物，例如PCR的产物。
根据所述方法一优选的实施方式，裂解和/或结合组合物包括和/或一种和/或一种以上的缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠、醋酸甲等
根据所述方法一尤其优选的实施方式，裂解和/或结合组合物包含至少一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)和/或醋酸钠和/或磷酸盐缓冲剂。根据所述方法又一更优选的实施方式，裂解和/或结合组合物至少包含一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或醋酸钠。
生物样品可以在室温，例如在15℃至25℃之间裂解，或者在升高温度，例如在30℃至90℃之间进行裂解。
在优选实施方式中，裂解组合物还可包含酶，例如蛋白酶K、蛋白酶、溶菌酶、葡萄球菌等，以及根据应用，核酸酶，例如DNA酶和/或RNA酶。
在盐溶液的存在下，优选支化或非支化链烷醇的存在下，将核酸规定到微柱的基质上。质的核酸。当使用磁性二氧化硅颗粒时，这可以在磁场的帮助下实现。例如，通过世家磁场将磁性颗粒拖拽至在其中进行孵育的容器的壁上，已核实的吸管尖端收集或者固定到塑料涂层保护的磁棒上。用于去除裂解和/或结合组合物的合适方法步骤的例子是通过洗液或提吸液体或者使磁性颗粒在吸管尖端或者磁棒上升起，或者降低裂解和/或结合混合物进行去除，其中，分离的磁性颗粒保持在同一水平。
优选地，固定到基质上的核酸可以在去除之前进行洗涤。洗涤步骤优选通过孵育洗涤溶液与加载的颗粒来进行，优选涉及所述颗粒的重悬，例如通过震摇或应用磁场。优选去除污染的洗涤溶液，即结合后留下裂解和/或结合组合物，具体使裂解组合物和/或结合组合物的混合物。
使用的洗涤试剂可以是常规洗涤缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤试剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液和/或EDTA等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4-6M盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。
而且，也可使用含醇的洗涤试剂，例如具有1-5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50-100％乙醇的水溶液。
优选将固定到基质的核酸洗涤几次，例如1-4次，优选用不同的洗涤试剂。在优选实施方式中，洗涤首先用具有低到中度离子强度的洗涤试剂进行，然后用含70-100％乙醇的水溶液再次洗涤核酸。
更具体说，利用磁性颗粒，由于颗粒的磁性聚集而便于进行分离和/或洗涤步骤。
最后的洗涤步骤或水洗涤之后，可干燥优选的磁性颗粒，例如真空干燥或者通过蒸发液体或者让液体蒸发。
根据所述方法的步骤D)，可从基质上去除结合的核酸。去除核酸的过程被称为洗脱。
也优选使用结合到基质(具体是磁性颗粒)上的核酸，无需去除步骤，例如用于PCR或其他扩增方法，DNA检测方法或DNA鉴定方法。
结合的核酸可借助低盐含量的洗脱试剂把核酸从颗粒上去除。更具体说，可使用含盐量小于0.1M的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脱试剂。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
具体说，使用裂解和/或结合组合物产生了从生物样品分离核酸，具体是分离植物DNA的尤其有益的方法。
即使在储存之后，裂解和/或结合试剂的优点尤其在于可获得优良产品。
本发明还涉及从含核酸的生物样品分离和/或纯化核酸的试剂盒，该试剂盒包含本发明的裂解、结合和/或洗涤试剂。
在优选实施方式中，该试剂盒还包含基于一种或一种以上二氧化硅化合物的基质。具体是具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性颗粒形式的基于一种或一种以上的二氧化硅化合物的基质。优选包含在所述试剂盒中的磁性二氧化硅颗粒的例子参见国际申请WO01/71732，其全部内容被纳入本文作为参考。
在又一优选的实施方式中，试剂盒可包含除磁性二氧化硅颗粒之外的硅烷化载体材料，优选具有二氧化硅膜的离心柱。
使用的洗涤剂可以是常规缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液和/或EDTA等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4-6M盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。
而且，也可使用含醇的洗涤试剂，例如具有1-5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50-100％乙醇的水溶液。
优选将固定到基质的核酸洗涤几次，例如2-3次，优选用不同的洗涤试剂。在优选实施方式中，洗涤首先用具有低到中度离子强度的洗涤试剂进行，然后用含70-100％乙醇的水溶液再次洗涤核酸。
根据所述实施方式，可从基质去除结合的核酸。去除核酸的过程被称为洗脱核酸。也优选使用结合到基质(具体是磁性颗粒)上的核酸，无需去除步骤，例如用于PCR或其他扩增方法，DNA检测方法或DNA鉴定方法等。
结合的核酸可借助低盐含量的洗脱试剂把核酸从颗粒上去除。更具体说，可使用含盐量小于0.1M的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脱试剂。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
根据优选的实施方式，洗脱试剂洗脱次数在一次或一次以上，一优选洗脱次数在1～3次，更优选的洗脱次数为1次。
所述记载前述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的载体，典型地为纸质说明书，也可以是记载所述方法的电子版说明书的任意载体(包括但不限于可移动磁盘、光盘、电子墨水屏幕、网络资源及其地址等)，只要能通过读取该载体而获知该方法，则均在本概念范围内。
本发明在另一方面提供一种计算机可读载体，其记载包含用于实施前述裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的计算机程序。所述计算机作广义理解，包括但不限于单片机、PLC、单板机、工控机、PC机等形式。所述计算机可读载体包括但不限于Flash、EEPROM、磁盘(软盘或硬盘)、光盘等任何形式。所述计算机程序可以是任意语言编写的，例如汇编、JAVA、VB、VC、C++、Python，只要能够控制相关系统实施所述方法即可。
本发明提出的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂至少能产生如下有益效果：
1.操作简单，省时，如DNA提取约15分钟内，RNA提取约10分钟内完成，不包括样品处理过程；
2.成本低，核酸提取在室温下就可以完成，不需要提供维持高温和低温环境的费用，可使用便宜的试剂，如氯化钠、曲拉通等；
3.提取核酸的质和量都非常高；
4.提供核酸提取的试剂很多，可以选择一些无毒试剂，有利于实验者的健康和减少对环境的破坏；
5.稳定性好。
【附图说明】
图1是本发明所述试剂提取6种生物组织DNA的凝胶电泳图。
图2是本发明所述试剂放置1年后，与新试剂提取DNA结果对比凝胶电泳图；
图3是本发明所述试剂提取小鼠肝脏组织RNA的凝胶电泳图；
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述，这些描述仅用于帮助理解本发明。
实施例1——6种生物样品DNA提取
如前所述，分别对6种生物样品(鼠肝和鼠肺分别约30mg，杨树叶片、柳树叶片和月季叶片分别约100mg，大肠杆菌1ml)进行液氮冷冻干燥研磨处理，然后转入600ul裂解液(15％Triton X-100、1.8M NaCl、50mM EDTA、200mM Tris-HCl(PH 8.0)，临时加入8ul10mg/ml RNase A)摇匀，室温放置5分钟，12000rpm离心1分钟，取上清，加入0.8倍上清体积的异丙醇，摇匀并转入微柱，12000rpm离心30秒，用600ul 75％的乙醇，清洗2次，用100ul洗脱液将DNA从微柱上洗脱。整个DNA提取过程都在室温下进行的。
将结果在biaosharp上测定(表1)，并通过凝胶电泳检测(图1)，可见所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂在提取生物样品DNA的效果非常好。
表1：Triton X-100 DNA试剂盒提取6种生物组织DNA质量
生物名称 鼠肝 鼠肺 大肠杆菌 杨树 柳树 月季
DNA浓度 459.2ng/ul 381.2ng/ul 54.94ng/ul 395.7ng/ul 154.6ng/ul 311.2ng/ul
A260/A280 1.839 1.834 1.840 1.859 1.838 1.846
实施例2——试剂室温放置1年后与新配制试剂提取DNA比较
实施例1试剂室温放置1年(RNase A是-20℃保存)与新配制的同样试剂提取花叶青木叶片DNA，操作方法同实施例1一样。将结果在biaosharp上测定(表2)，并通过凝胶电泳检测(图2)，可见本发明所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂稳定性非常好。
表2：新旧试剂提取花叶青木DNA质量
试剂 新试剂 旧试剂
DNA浓度 352.4ng/ul 326.1ng/ul
A260/A280 1.852 1.836
实施例3——室温提取小鼠肝脏组织RNA
根据如前所述试剂，取约30mg小鼠肝脏，用液氮冷冻研磨法处理后，转入500ul裂解液(2％PVP40、1.5M NaCl、200mM NaAc PH4.5)并摇匀，加入100ul 5M NaCl，摇匀，加入400ul重蒸苯酚，摇匀，12000rpm离心1分钟，取上清，加入0.6倍上清体积的无水乙醇，摇匀并转入微柱，12000rpm离心30秒，用500ul 75％的乙醇，清洗2次，用100ul洗脱液将RNA从微柱上洗脱。
将结果在biaosharp上测定(表3)，并通过凝胶电泳检测(图3)，可见本发明所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂稳定性非常好。
表3：室温提取小鼠肝脏组织RNA质量
试剂 小鼠肝脏
RNA浓度 337.9ng/ul
A260/A280 2.037
由结果可见，本发明提供的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂在生物组织核酸提取方面具有较好的普适性。更为突出的是，操作都是在室温进行的，而且操作时间非常短，为缩短整体实验时间、提高实验效率提供了更多可能性。
本发明所用试剂的来源：
Figure BSA0000232508770000121
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和结构的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、组合、替换和变型，本发明的保护由所附权利要求及其等同范围限定。

Claims (9)

1.一种裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，其包含：
-至少一种盐溶液或一种以上盐溶液混合物；
-至少一种或一种以上表面活性剂，即阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂和/或非离子型表面活性剂。以所述试剂的总体积计，其用量：重量/体积在0～50％之间。
-和/或一种或一种以上缓冲化合物，PH值在3～11之间都可以，优先选自，包含但不限于：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、醋酸甲缓冲剂等。
-和/或一种或一种以上螯合剂化合物，优先选自，包含但不限于：N-乙酰-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N，N′二琥珀酸(EDDS)、1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(NTMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(DTPMP)、1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(HEDP)等)。
-和/或一种或一种以上能溶于水的有机物，优先选自，包含但不限于：盐酸胍、异硫氰酸胍、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等。
-和/或一种或一种以上作用不大或没有作用的其他物质。
2.如前所述权利要求中任一项所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，其特征在于，所述的盐包含但不限于，如：氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、醋酸钠、醋酸钾、硫酸钠、硫酸钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠、高氯酸钾和/或其中两种或更多种盐的混合物等。
3.如前所述权利要求中任一项所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，其特征在于，所述的表面活性剂溶解度大的，只需要一种裂解液可以把核酸提取到裂解液中；所述的表面活性剂溶解度小的，用一种裂解液提取核酸的量会减小，需要添加另一种溶液，具体说另一种溶液包含但不限于盐溶液；当然，也可以把一种裂解液分成两种或两种以上的溶液。
4.一种从含核酸的生物样品分离和/或纯化核酸的方法，所述方法包括一下步骤：
A)生物样品处理方法，包含但不限于：机械研磨法、酶解法、液氮冷冻干燥法、超声波法等，把生物样品粉碎；
B)裂解或溶解处理后的生物样品；
C)在含有核酸的裂解液或溶解液和/或支化或非支化链烷醇的存在下，将释放的核酸固定到基于一种基质或一种以上混合物的基质上，包含但不限于微柱、磁球等；
D)任选地洗涤固定在基质上的核酸；
E)任选地洗脱结合在基质上的核酸。
5.如前所述权利要求中任一项所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，其特征在于，所述的结合试剂包含但不限于支化或非支化的链烷醇，具体说，具有1-5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇；支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物。
6.如前所述权利要求中任一项所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，其特征在于，所述的使用的洗涤剂可以是常规缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4-6M盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。例如具有1-5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50-100％乙醇的水溶液。清洗次数：一次或一次以上。
7.如前所述权利要求中任一项所述的裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂，其特征在于，所述的洗脱试剂，可使用低盐含量的核酸洗脱剂，如：含盐量小于0.1M的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脱试剂。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)等。还可以使用包含被高温高压处理过的0.2％DEPC水。洗脱次数：一次或一次以上。
8.一种用于实施如权利要求1～8任一项所述方法的试剂盒，以及记载如权利要求1～9任一项所述方法的载体。
9.一种计算机可读载体，其记载包含用于实施如权利要求1～8任一项所述方法的计算机程序。连接的控制器；所述控制器包含如权利要求9所述的计算机可读载体。
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