CN113265398A - 一种绿色快速动物组织dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于动物组织DNA分离和/或纯化DNA的方法以及提取试剂盒。该方法的优点：1、操作简单、省时，大约在15分钟内完成；2、绿色环保，有利于实验人员的健康和不会污染环境；3、成本低，所用试剂都很便宜；4、提取的DNA质和量都很好。

Description

一种绿色快速动物组织DNA提取方法
【技术领域】
本发明涉及用于动物组织DNA分离和/或纯化DNA的方法以及提取试剂盒。
【背景技术】
随着基因组测序技术的发展，生物基因组的序列、结构和功能研究飞速发展，而获得高纯度、高含量和高完整度的生物基因组DNA是基因组测序技术得以应用的首要前提。传统的生物基因组DNA提取方法主要有CTAB、苯酚法、SDS法，提取步骤主要包括生物组织进行初步处理，以及之后的细胞裂解、去除杂质、DNA沉淀、漂洗和洗脱等过程。其主要是以CTAB或SDS等去污剂对细胞进行裂解后，释放出细胞中的基因组DNA；再通过氯仿和苯酚抽提或高盐沉淀的方法，去除蛋白质、RNA等杂质；然后在提取的上清液中加入适量体积的无水乙醇、异丙醇或PEG等有机溶剂将DNA沉淀或吸附在硅胶柱、离子交换柱等介质上；最后用漂洗液进行漂洗后，用低浓度盐溶液溶解或从介质上洗脱下来。
现有的DNA提取方法常常伴有蛋白质、盐类和杂质等污染，而且步骤繁琐，提取过程耗时较多。如高氯酸钠法、尿素法等。同时，这些方法需要的样本量比较大，而且苯酚等有机物容易在DNA溶液种残留，特别是在后续的PCR扩增过程中会干扰扩增效果，从而影响PCR的结果，使得这些方法的应用受到很大限制。
目前常见的动物组织DNA提取方法为：(a)采用氯仿、异戊醇和苯酚抽提法去除蛋白质、盐类和其他杂质。苯酚是DNA提取过程种的变性剂，和氯仿联合使用通过反复抽提可以获得比较高质量的DNA。但是苯酚和氯仿对人体是有毒害性的，不利于实验人员的身体健康和环境保护。整个提取过程步骤繁琐，耗时较长，往往容易导致DNA降解。(b)高温孵育和低温放置都会增加DNA提取的成本。(c)DNA提取耗时是非常常见的，通常都在1个小时左右。
【发明内容】
本发明的目的是提供克服至少一种上述现有技术缺点的方法及提取试剂盒。其中试剂盒包含但不限于动物组织和/或细胞绿色快速DNA提取试剂盒、血液绿色快速DNA提取试剂盒、唾液绿色快速DNA提取试剂盒以及口腔细胞绿色快速DNA提取试剂盒等。
为实现上述目的，本发明在第一方面提供一种动物组织DNA提取方法，包括以下步骤：
(a)处理动物组织；
(b)把处理后的动物组织转入第一裂解液，摇匀后，再加入第二裂解液，放置1～10分钟，优选地放置2-5分钟，更优选地放置3分钟；
(c)把动物组织DNA固定到基质上，然后加入0.4～0.9倍上清体积的支化或非支化烷醇，混匀，转入包含但不限于离心柱或结合到磁球上等；
(d)洗涤和洗脱DNA；
在优选实施的方式中，第一裂解液的组成：
-至少含有十二烷基硫酸钠(SDS)和/或与其他表面活性剂的混合物，其中SDS浓度为0.1％～10％；
-至少一种或一种以上螯合剂化合物，优先选自，包含但不限于：N-乙酰-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N，N′-二琥珀酸(EDDS)、1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(NTMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(DTPMP)、1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(HEDP)等)，优选EDTA，其浓度为20mM～300mM；
-和/或一种盐溶液或一种以上盐溶液混合物，优选NaCl，其浓度为0.1M～3M；
-和/或一种或一种以上缓冲化合物，PH值在3～11之间都可以，优先选自，包含但不限于：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、醋酸甲缓冲剂等，优选PH8.0Tris-HCl，其浓度为20mM～300mM，更优选浓度为100mM～200mM；
-和/或一种或一种以上能溶于水的有机物，优先选自，包含但不限于：盐酸胍、异硫氰酸胍、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等，优选甘油，其浓度：1％～10％；
-和/或一种或一种以上作用不大或没有作用的其他物质。
在优选实施方式中，第二裂解液组成：
-2～5M PH值在3～11的钾盐溶液或钾盐混合物溶液，优选选择5M PH7.2醋酸钾。
出于本发明的目的，术语“盐”表示是指一类金属离子或铵根离子(NH4+)与酸根离子(阴离子)通过离子键结合形成的化合物，溶于水会离解出所有的离子。具体来说，包含但不限于无机盐化合物，如：氯化钠、硝酸钠、醋酸钠、硫酸钠、溴化钠、碘化钠、高氯酸钠、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵和/或其中两种或更多种盐的混合物等。
出于本发明的目的，术语“缓冲化合物”表示可以为水溶液提供缓冲或PH值稳定作用的化合物。
出于本发明的目的，术语“DNA”表示是一种遗传物质，如细胞核内DNA，线粒体DNA等。
出于本发明的目的，术语“表面活性剂”表示能使目标溶液表面张力显著下降的物质，可以分为：离子型表面活性剂包括阳离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、两性表面活性剂表面活性剂、复配表面活性剂、其他表面活性剂等。
出于本发明的目的，术语“螯合剂”表示能够螯合金属离子的化合物，如EDTA等。
出于本发明的目的，信息“％重量/体积”、“％(重量/体积)”或“％(w/v)”表示例如每100毫升的试剂或组合物中表面活性剂的克数的信息。
根据本发明一优选的实施方式，盐溶液是无机盐溶液，优选选自：氯化钠、醋酸钠、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、碘化钠、高氯酸钠和/或一种以上盐的混合物。
根据所述方法一优选的实施方式，和/或一种或一种以上的缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠、醋酸甲等。
根据所述方法一尤其优选的实施方式，和/或一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)和/或醋酸钠和/或磷酸盐缓冲剂。根据所述方法又一更优选的实施方式，裂解和/或结合组合物至少包含一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或醋酸钠。优选地选择PH8.0100mM～300mM Tris-HCl。
根据进一步优选的实施方式，裂解液的PH值在3～11之间，优选PH值在4.5～8之间。
在优选实施方式中，尤其是裂解液还可包含酶，例如裂解酶、RNase A，具体说，例如蛋白酶K，蛋白酶，消解酶，无色肽酶，溶细胞酶，溶葡萄球菌酶，溶菌酶和核酶等。
在盐溶液的存在下，优选支化或非支化链烷醇的存在下，将DNA固定到基质上，包含但不限于：离心柱和磁球。因此，优选包含至少一种支链或非支链烷醇的结合试剂。
优选有用的是具有1～5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。根据本发明一优选的实施方式，支化或非支化烷醇是具有1～5个碳原子的醇，优选选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、支化或非支化丁醇或戊醇、和/或它们的混合物。
除非另有说明，定义“支化或非支化链烷醇”，具体是丙醇，丁醇和戊醇包括任何可消耗的具体基团的异构体形式。因此，例如，支化或非支化丙醇包括正丙醇和异丙醇，支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇，支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物。
根据一优选的实施方式，以上清体积计，支化和/或非支化醇占上清体积的0.1倍～1倍，优选在0.3倍～0.8倍，一更优选在0.5倍～0.7倍。
动物组织样品DNA提取可以在室温，例如在15℃至25℃之间裂解，或者在升高温度，例如在30℃至90℃之间进行裂解。
根据本发明一优选的实施方式，从10秒～30分钟的孵育时间对于DNA是方便的。根据上述所述方法，一尤其优选的实施方式，从1分钟～5分钟的孵育时间对于DNA是方便的。根据上述所述方法，又一更优选实施方式，具体约为3分钟的孵育时间是有益的。
根据本发明一优选的实施方式，使样品与基于一种或一种以上二氧化硅化合物如二氧化硅、硅酸盐、玻璃和/或硅胶的基质接触并孵育足以实现结合的时间，从而分离DNA。基质可以使现有技术已知的常规设计，例如颗粒形式，膜形式或滤器形式等。为便于去除，优选具有磁性的颗粒。
优选才有具有胶状二氧化硅涂层的磁性颗粒来分离DNA。优选采用具有胶状二氧化硅涂层并且平均粒径在1um～40um范围内，优选在5um～20um之间，尤其优选在6um～10um之间，优选粒度分布窄的磁性颗粒来分离DNA。更优选地，采用具有胶状二氧化硅涂层并且平均粒度在6um～10um之间，优选粒度分布窄大的磁性颗粒来分离DNA。
在又一优选的实施方式中，磁性或有磁力吸引的颗粒是具有基于氧化铁的磁性的颗粒，优选选自磁铁矿(Fe3O4)，磁赤铁矿(γ-Fe2-O3)和/或铁氧体。
能够以有益方式使用的磁性二氧化硅颗粒可参见例如国际申请WO 01/71732，其内容被纳入本文作为参考。
在优选实施方式中，可使用具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性颗粒形式的基于一种或多种二氧化硅化合物的基质。
在4℃～90℃之间的温度进行结合，优选在20℃～70℃，尤其优选在45℃～70℃，最佳优选在50℃～65℃。结合也可以是室温进行，例如在15℃～25℃之间。
孵育后，从裂解和/或结合组合物中去除结合到基于一种基质或一种以上二氧化硅化合物基质混合物上的核酸。当使用磁性二氧化硅颗粒时，这可以在磁场的帮助下实现。例如，通过施加磁场将磁性颗粒拖拽至在其中进行孵育的容器的壁上，用吸管尖端或移液枪把液体移除；或者将磁性颗粒固定到塑料涂层保护的磁棒上，可以取出磁棒，把废液去除。
优选地，固定到基质上的DNA可以在去除之前进行洗涤。洗涤步骤优选通过孵育洗涤溶液与加载的颗粒来进行，优选涉及所述颗粒的重悬，例如通过震摇或应用磁场。优选去除污染的洗涤溶液。
使用的洗涤试剂可以是常规洗涤缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤试剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液和/或EDTA等和/或0.05M～0.2M柠檬酸钠溶液等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4-6M盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。
而且，也可使用含醇的洗涤试剂，例如具有1～5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50～100％乙醇的水溶液。
优选将固定到基质的DNA洗涤几次，例如1～4次，优选用不同的洗涤试剂。在优选实施方式中，洗涤首先用具有低到中度离子强度的洗涤试剂进行，然后用含70-100％乙醇的水溶液再次洗涤DNA。
更具体说，利用磁性颗粒，由于颗粒的磁性聚集而便于进行分离和/或洗涤步骤。
最后的洗涤步骤或水洗涤之后，可干燥优选的磁性颗粒，例如真空干燥或者通过蒸发液体或者让液体蒸发。
可从基质上去除结合的DNA。去除DNA的过程被称为洗脱。
结合的DNA可借助低盐含量的洗脱试剂把DNA从颗粒上去除。更具体说，可使用含盐量小于0.1M的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脱试剂。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
在优选实施方式中，该试剂盒还包含基于一种或一种以上二氧化硅化合物的基质。具体是具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性颗粒形式的基于一种或一种以上的二氧化硅化合物的基质。优选包含在所述试剂盒中的磁性二氧化硅颗粒的例子参见国际申请WO01/71732，其全部内容被纳入本文作为参考。
在又一优选的实施方式中，试剂盒可包含除磁性二氧化硅颗粒之外的硅烷化载体材料，优选具有二氧化硅膜的离心柱。
使用的洗涤剂可以是常规缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液和/或EDTA等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4～6M盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。
而且，也可使用含醇的洗涤试剂，例如具有1～5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50～100％乙醇的水溶液。
优选将固定到离心柱的DNA洗涤几次，例如2～3次，优选用不同的洗涤试剂。在优选实施方式中，洗涤首先用具有低到中度离子强度的洗涤试剂进行，然后用含70～100％乙醇的水溶液再次洗涤DNA。
根据所述实施方式，可从离心柱去除结合的DNA。去除DNA的过程被称为洗脱DNA。结合的DNA可借助低盐含量的洗脱试剂把DNA从离心柱上去除。更具体说，可使用含盐量小于0.1M的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脱试剂。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
根据优选的实施方式，洗脱试剂洗脱次数在一次或一次以上，一优选洗脱次数在1～3次，更优选的洗脱次数为1次。
所述记载前述的快速提取动物组织DNA方法的载体，典型地为纸质说明书，也可以是记载所述方法的电子版说明书的任意载体(包括但不限于可移动磁盘、光盘、电子墨水屏幕、网络资源及其地址等)，只要能通过读取该载体而获知该方法，则均在本概念范围内。
本发明在另一方面提供一种计算机可读载体，其记载包含用于实施前述裂解、结合、洗涤和/或洗脱试剂的计算机程序。所述计算机作广义理解，包括但不限于单片机、PLC、单板机、工控机、PC机等形式。所述计算机可读载体包括但不限于Flash、EEPROM、磁盘(软盘或硬盘)、光盘等任何形式。所述计算机程序可以是任意语言编写的，例如汇编、JAVA、VB、VC、C++、Python，只要能够控制相关系统实施所述方法即可。
本发明提出的快速提取动物组织DNA方法以及试剂盒，至少能产生如下有益效果：
1.操作简单，省时，如DNA提取约15分钟内，不包括样品处理过程；
2.成本低，DNA提取在室温下就可以完成，不需要提供维持高温和低温环境的费用，以及该方法提供的试剂成本都很低；
3.提取DNA的质和量都非常高；
4.所用试剂都是无毒的，有利于实验者的健康和减少对环境的破坏；
【附图说明】
图1是本发明所述方法提取小鼠心脏组织DNA的凝胶电泳图；
图2是本发明所述方法提取小鼠肝脏组织DNA的凝胶电泳图；
图3是本发明所述方法提取人唾液DNA的凝胶电泳图；
图4是本发明所述方法提取口腔细胞DNA的凝胶电泳图；
图5是本发明所述方法提取黑鱼全血DNA的凝胶电泳图；
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述，这些描述仅用于帮助理解本发明。
实施例1——小鼠心脏组织DNA提取
如前所述，取小鼠心脏约25mg，用液氮冷冻干燥研磨法处理小鼠心脏组织，然后，转入600ul第一裂解液(1％SDS、0.6M NaCl、3％甘油、50mM EDTA、PH8.0 100mM Tris-HCl、临时加入8ul 10mg/ml RNase A)，摇匀，再加入160ul第二裂解液(5M PH7.2KAc)，摇匀，放置3分钟，12000rpm，离心一分钟，取上清放入新的EP管，加入0.6倍上清体积异丙醇，摇匀，转入离心柱，洗涤2次，室温放置2分钟，用100ul洗脱液将DNA从离心柱上洗脱。整个DNA提取过程都是在室温下完成的，用时大约在15分钟之内。
将结果在biaosharp上测定(表1)，并通过凝胶电泳检测(图1)，可见本发明所述的DNA提取方法可以在室温下快速完成对小鼠心脏DNA的提取。
表1：提取小鼠心脏组织DNA质量
动物组织 鼠心
DNA浓度 85.21ng/ul
A260/A280 1.842
实施例2——小鼠肝脏组织DNA提取
如前所述，取小鼠心脏约20mg，用液氮冷冻干燥研磨法处理小鼠心脏组织，然后，转入600ul第一裂解液(1％SDS、0.6M NaCl、3％甘油、50mM EDTA、PH8.0 100mM Tris-HCl、临时加入8ul 10mg/ml RNase A)，摇匀，再加入160ul第二裂解液(5M PH7.2KAc)，摇匀，放置3分钟，12000rpm，离心一分钟，取上清放入新的EP管，加入0.6倍上清体积异丙醇，摇匀，转入离心柱，洗涤2次，室温放置2分钟，用100ul洗脱液将DNA从离心柱上洗脱。整个DNA提取过程都是在室温下完成的，用时大约在15分钟之内。
将结果在biaosharp上测定(表2)，并通过凝胶电泳检测(图2)，可见本发明所述的DNA提取方法可以在室温下快速完成对小鼠肝脏DNA的提取。
表2：提取小鼠肝脏组织DNA质量
动物组织 鼠肝
DNA浓度 95.34ng/ul
A260/A280 1.808
实施例3——人唾液DNA提取
如前所述，取300ul新鲜唾液，12000rpm，离心一分钟，弃上清，加入80ul保护液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA)，用液氮冷冻干燥研磨法处理唾液里面的细胞，然后，转入300ul第一裂解液(1％SDS、0.6M NaCl、3％甘油、50mM EDTA、PH8.0 100mM Tris-HCl、临时加入5ul 10mg/ml RNase A)，摇匀，再加入80ul第二裂解液(5M PH7.2KAc)，摇匀，放置3分钟，12000rpm，离心一分钟，取上清放入新的EP管，加入0.6倍上清体积异丙醇，摇匀，转入离心柱，洗涤2次，室温放置2分钟，用60ul洗脱液将DNA从离心柱上洗脱。整个DNA提取过程都是在室温下完成的，用时大约在15分钟之内。
将结果在biaosharp上测定(表3)，并通过凝胶电泳检测(图3)，可见本发明所述的DNA提取方法可以在室温下快速完成对唾液里面细胞的DNA提取。
表3：提取唾液细胞DNA质量
动物组织 唾液
DNA浓度 56.27ng/ul
A260/A280 1.836
实施例4——人口腔细胞DNA提取
如前所述，用拭子棒从口腔取细胞，放入1ml保护液，强烈震荡约30秒，12000rpm，离心一分钟，弃上清，加入80ul保护液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA)，用液氮冷冻干燥研磨法处理唾液里面的细胞，然后，转入300ul第一裂解液(1％SDS、0.6M NaCl、3％甘油、50mMEDTA、PH8.0 100mM Tris-HCl、临时加入5ul 10mg/ml RNase A)，摇匀，再加入80ul第二裂解液(5M PH7.2 KAc)，摇匀，放置3分钟，12000rpm，离心一分钟，取上清放入新的EP管，加入0.6倍上清体积异丙醇，摇匀，转入离心柱，洗涤2次，室温放置2分钟，用60ul洗脱液将DNA从离心柱上洗脱。整个DNA提取过程都是在室温下完成的，用时大约在15分钟之内。
将结果在biaosharp上测定(表4)，并通过凝胶电泳检测(图4)，可见本发明所述的DNA提取方法可以在室温下快速完成对口腔细胞的DNA提取。
表4：提取口腔细胞DNA质量
动物组织 口腔细胞
DNA浓度 72.81ng/ul
A260/A280 1.847
实施例5——新鲜黑鱼全血DNA提取
如前所述，取80ul新鲜黑鱼全血，用液氮冷冻干燥研磨法处理黑鱼全血，然后，转入600ul第一裂解液(1％SDS、0.6M NaCl、3％甘油、50mM EDTA、PH8.0 100mM Tris-HCl、临时加入8ul 10mg/ml RNase A)，摇匀，再加入160ul第二裂解液(5M PH7.2KAc)，摇匀，放置3分钟，12000rpm，离心一分钟，取上清放入新的EP管，加入0.6倍上清体积异丙醇，摇匀，转入离心柱，洗涤2次，室温放置2分钟，用100ul洗脱液将DNA从离心柱上洗脱。整个DNA提取过程都是在室温下完成的，用时大约在15分钟之内。
将结果在biaosharp上测定(表5)，并通过凝胶电泳检测(图5)，可见本发明所述的DNA提取方法可以在室温下快速完成对新鲜黑鱼全血的DNA提取。
表5：提取新鲜黑鱼全血DNA质量
动物组织 黑鱼全血
DNA浓度 83.15ng/ul
A260/A280 1.809
由结果可见，本发明提供的快速提取动物组织DNA的方法具有较好的普适性。更为突出的是，操作都是在室温进行的，而且操作时间非常短，为缩短整体实验时间、提高实验效率提供了更多可能性。所用试剂全部无毒，有利于实验人员的健康和环境保护。
本发明所用试剂的来源：
Figure BSA0000245609950000091
Figure BSA0000245609950000101
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和结构的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、组合、替换和变型，本发明的保护由所附权利要求及其等同范围限定。

Claims (11)

1.一种绿色快速动物组织DNA提取方法，其特征在于包括一下步骤：
(a)处理动物组织；
(b)把处理后的动物组织转入一种或一种以上的溶液；
(c)把动物组织DNA固定到基质上；
(d)洗涤和洗脱DNA。
2.根据权利要求1所述的动物组织DNA提取方法，其特征在于：步骤(a)中所述处理动物组织，具体来说包含但不限于液氮冷冻干燥研磨法、机械研磨法、酶解法、超声波法等把动物组织变成细小的组织颗粒。在样品处理过程中可能会用到保护液，其中含有螯合剂和/或缓冲化合物等。
3.根据权利要求1所述的动物组织DNA提取方法，其特征在于：步骤(b)溶液包含但不限于2种或两种以上溶液，其中第一溶液组成：
-至少包含十二烷基硫酸钠(SDS)和/或其他表面活性剂的混合物，其中SDS浓度为0.1％～10％；
-至少一种或一种以上螯合剂化合物，优先选自，包含但不限于：N-乙酰-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N，N′-二琥珀酸(EDDS)、1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(NTMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(DTPMP)、1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(HEDP)等)，优选EDTA，其浓度为20mM～300mM；
-和/或一种盐溶液或一种以上盐溶液混合物，优选NaCl，其浓度为0.1M～3M；
-和/或一种或一种以上缓冲化合物，PH值在3～11之间都可以，优先选自，包含但不限于：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、醋酸甲缓冲剂等，优选PH8.0 Tris-HCl，其浓度为20mM～300mM；
-和/或一种或一种以上能溶于水的有机物，优先选自，包含但不限于：盐酸胍、异硫氰酸胍、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等，优选甘油，其浓度：1％-10％；
-和/或一种或一种以上作用不大或没有作用的其他物质。
4.根据权利要求1所述的动物组织DNA提取方法，其特征在于：步骤(b)第二溶液为2～5M PH在3～11的钾盐溶液和/或钾盐溶液混合物。第二溶液体积为50ul～300ul。
5.根据权利要求1所述的动物组织DNA提取方法，其特征在于：步骤(c)通过结合试剂包含但不限于支化或非支化的链烷醇，具体说，具有1～5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇；支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物，优选地选择异丙醇，其用量：0.3～0.9倍上清体积。
6.根据权利要求1所述的动物组织DNA提取方法，其特征在于：步骤(c)把DNA固定到能结合DNA的离心柱或磁球上。
7.根据权利要求1所述的动物组织DNA提取方法，其特征在于：步骤(d)所用的洗涤剂可以是常规缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液和/或0.05M～0.2M柠檬酸钠溶液等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4～6M盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。例如具有1～5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50～100％乙醇的水溶液。清洗次数：一次或一次以上。
8.根据权利要求1所述的动物组织DNA提取方法，其特征在于：步骤(d)所用的洗脱试可以室低盐含量的核酸洗脱剂，如：含盐量小于0.1M的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脱试剂。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)等。洗脱次数：一次或一次以上。
9.根据权利要求1所述的动物组织DNA提取方法，其特征在于：步骤(b)、(c)、(d)均在室温下完成的，也可以在高温下完成，例如：30℃～95℃。
10.一种用于实施如权利要求1～9任一项所述方法的试剂盒，其中试剂盒包含但不限于动物组织和/或细胞绿色快速DNA提取试剂盒、血液绿色快速DNA提取试剂盒、唾液绿色快速DNA提取试剂盒以及口腔细胞绿色快速DNA提取试剂盒等，以及记载如权利要求1～9任一项所述方法的载体。
11.一种计算机可读载体，其记载包含用于实施如权利要求1～9任一项所述方法的计算机程序。
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