CN116555247A - 一种核酸提取方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种核酸提取方法，属于生物技术领域。本申请的方法通过增加石墨相氮化碳吸附处理步骤，可分离土壤、粪便等复杂样本中的杂质，得到高纯度的DNA产物，有利于下游体系的应用。

Description

一种核酸提取方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种核酸提取方法。
背景技术
从土壤、水体或动物粪便等样本的提取核酸进行二代测序分析是研究微生物群多分布及遗传多样性的主要技术手段。但是土壤、水体或动物粪便等样本中含有大量的杂质，如植物腐烂降解形成大分子有机化合物等，这些杂质通常与核酸分子结合在一起，在核酸提取纯化的过程中影响核酸提取的质量和产量，同时对下游的PCR或qPCR或二代测序具有显著的抑制干扰作用。因此从土壤、水体或动物粪便等样本中提取核酸时，杂质的残留成为制约核酸提取的关键限制性因素。
在土壤、水体或粪便样本核酸提取上，目前市面上大多产品通过溶解去除杂质，通过矿物质吸附法，或使用硫酸铝铵、碳酸钙、二氧化钛或聚乙烯吡咯烷酮进行吸附杂质的方式从土壤或者粪便样本中提纯核酸。 虽然针对土壤、水体或粪便核酸提取有若干杂质处理方式，但除杂效果并不理想，提取完的DNA进行下游扩增时有显著的抑制作用。同时样本杂质处理需要经过多次处理，处理流程繁琐，时间较长。
发明内容
本申请的目的在于提供一种核酸提取方法，其通过石墨相氮化碳吸附处理土壤或粪便等样本中的杂质，并通过离心的方式将吸附杂质的石墨相氮化碳与核酸产物分离，再利用核酸纯化流程进行样本核酸的富集与提纯，最终得到高纯度的DNA产物，提高了核酸纯度并减少杂质对下游扩增的影响。
本申请的第一方面提供一种核酸提取方法，所述方法包括：
步骤（1） 收集生物样本或环境样本，裂解并释放核酸；
步骤（2） 加入沉淀剂混匀，所述沉淀剂包含石墨相氮化碳，离心取上清；
步骤（3） 使用固相载体吸附所述上清中的核酸；
步骤（4） 清洗已吸附核酸的固相载体；
步骤（5） 洗脱，获得提取后的核酸产物。
在一些实施方案中，所述生物样本是粪便样本。
在一些实施方案中，所述环境样本是土壤样本或水体样本。
在一些实施方案中，所述裂解包括使用化学裂解法，例如加入裂解液。
在一些实施方案中，所述裂解液包含离液剂、缓冲盐和表面活性剂。所述离液剂是例如胍盐、尿素和高氯酸锂中的一种或多种，优选胍盐，更优选盐酸胍和/或异硫氰酸胍；所述缓冲盐是磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐和Tris中的一种或多种，优选磷酸盐，更优选NaH2PO3和Na2HPO4中的一种或两种；所述表面活性剂是例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种或多种，优选非离子表面活性剂，更优选吐温20和/或癸基糖苷。
在一些实施方案中，所述裂解还包括使用机械裂解法，例如使用玻璃珠，例如在样本中加入玻璃珠涡旋震荡。
在一些实施方案中，所述沉淀剂还包含缓冲成分，所述缓冲成分是弱酸和/或弱酸盐，优选醋酸和/或醋酸钠。
在一些实施方案中，每克土壤或粪便样本使用约100-3000μg石墨相氮化碳，优选约200-2000μg石墨相氮化碳，更优选约300-1500μg石墨相氮化碳，包括所述范围内的300μg，400μg，500μg，600μg，700μg，800μg，900μg，1000μg，1100μg，1200μg，1300μg，1400μg和1500μg。
在一些实施方案中，所述沉淀剂的pH是2-7，优选2-6.5，更优选2-6，最优选2-5.5，包括所述范围内的5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.8、4.6、4.5、4.2、4、3.5、3、2.5和2。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中的石墨相氮化碳结合样本中的非核酸杂质。
在一些实施方案中，所述非核酸杂质是指抑制PCR过程的杂质，如抑制DNA聚合酶活性的杂质。
在一些实施方案中，所述固相载体是磁性吸附介质，优选磁性颗粒，更优选磁珠。
在一些实施方案中，所述固相载体是硅基质吸附介质，例如硅珠，硅基质膜。
在一些实施方案中，所述固相载体是阴离子交换材料，如阴离子交换柱。
在一些实施方案中，当所述固相载体是磁珠时，所述步骤（3）还包括外加磁场，分离已吸附核酸的磁珠。
在一些实施方案中，当所述固相载体是磁珠时，所述步骤（3）还包括加入裂解结合液。
在一些实施方案中，所述裂解结合液包含离液剂、缓冲盐、金属螯合剂、醇和表面活性剂；所述离液剂是例如胍盐、尿素和高氯酸锂中的一种或多种，优选胍盐，更优选盐酸胍和/或异硫氰酸胍；所述缓冲盐是例如Tris和/或Tris-base；所述金属螯合剂是例如EDTA二钠；所述醇是例如乙醇和/或异丙醇，优选异丙醇；所述表面活性剂是例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种或多种，优选非离子表面活性剂，更优选非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂，还优选吐温20、PEG8000癸基糖苷、Triton X-100和/或N-月桂酰肌氨酸钠。
在一些实施方案中，所述裂解结合液还包含聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施方案中，当所述固相载体是含硅基质膜的离心柱时，所述步骤（3）还包括离心，分离已吸附核酸和杂质。
在一些实施方案中，所述清洗包括加入洗涤液。
在一些实施方案中，所述洗涤液包含缓冲成分、醇和离液剂；所述缓冲成分是例如Tris和/或Tris-base，优选Tris-base；所述醇是例如乙醇和/或异丙醇，优选异丙醇，所述离液剂是例如胍盐、尿素和高氯酸锂中的一种或多种，优选胍盐，更优选盐酸胍和/或异硫氰酸胍。
在一些实施方案中，所述清洗还包括加入漂洗液。
在一些实施方案中，所述漂洗液包括醇，优选乙醇和/或异丙醇，更优选乙醇。
在一些实施方案中，所述洗脱包括加入洗脱液，所述洗脱液是例如水或TE缓冲液。
在一些实施方案中，所述方法部分或全部通过手动操作进行。例如当所述固相载体是含硅基质膜的离心柱时，所述方法全部通过手动操作进行。
在一些实施方案中，所述方法部分或全部在自动核酸提取平台上进行，例如当所述固相载体是磁珠时，所述方法的步骤（3）-步骤（5）在核酸提取仪上进行。例如亦可采取磁力架进行手动操作。
在一些实施方案中，所述方法部分或全部在微流体平台上进行，例如在微流控芯片上进行。
在一些实施方案中，所述核酸是DNA和/或RNA，优选地，所述核酸是DNA。
本申请的第二方面提供一种核酸提取方法，所述方法包括：
步骤（1） 收集生物样本或环境样本，裂解并释放核酸；
步骤（2） 加入沉淀剂混匀，所述沉淀剂包含石墨相氮化碳，离心取上清；
步骤（3） 加入酚-氯仿溶液，混匀后，离心取上清液；
步骤（4） 向上清液中加入异丙醇/乙醇，离心分离获得DNA沉淀；
步骤（5） 洗涤DNA沉淀。
在一些实施方案中，所述酚-氯仿溶液中还包含异戊醇，即酚-氯仿-异戊醇溶液。
在一些实施方案中，所述的乙醇是95-100%（体积分数）的乙醇。
在一些实施方案中，所述步骤（5）包括使用乙醇洗涤DNA沉淀，优选75-95%（体积分数）的乙醇。
在一些实施方案中，所述方法还包括晾干残留乙醇，加入ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。
在一些实施方案中，所述生物样本是粪便样本。
在一些实施方案中，所述环境样本是土壤样本或水体样本。
在一些实施方案中，所述裂解包括使用化学裂解法，例如加入裂解液。
在一些实施方案中，所述裂解还包括使用机械裂解法，例如使用玻璃珠，例如在样本中加入玻璃珠涡旋震荡。
在一些实施方案中，所述沉淀剂还包含缓冲成分，所述缓冲成分是弱酸和/或弱酸盐，优选醋酸和/或醋酸钠。
在一些实施方案中，每克土壤或粪便样本使用约100-3000μg石墨相氮化碳，优选约200-2000μg石墨相氮化碳，更优选约300-1500μg石墨相氮化碳，包括所述范围内的300μg，400μg，500μg，600μg，700μg，800μg，900μg，1000μg，1100μg，1200μg，1300μg，1400μg和1500μg。
在一些实施方案中，所述沉淀剂的pH是2-7，优选2-6.5，更优选2-6，最优选2-5.5，包括所述范围内的5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.8、4.6、4.5、4.2、4、3.5、3、2.5和2。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中的石墨相氮化碳结合样本中的非核酸杂质。
在一些实施方案中，所述非核酸杂质是指抑制PCR过程的杂质，如抑制DNA聚合酶活性的杂质。
本申请的第三方面提供一种核酸提取方法，所述方法包括：
步骤（1） 收集生物样本或环境样本，裂解并释放核酸；
步骤（2） 加入沉淀剂混匀，所述沉淀剂包含石墨相氮化碳，离心取上清；
步骤（3） 加入饱和NaCl溶液或包含5-6M NaCl的溶液，混匀后，离心取上清，
步骤（4） 向上清液中加入异丙醇/乙醇，离心分离获得DNA沉淀；
步骤（5） 洗涤DNA沉淀。
在一些实施方案中，所述的乙醇是95-100%（体积分数）的乙醇。
在一些实施方案中，所述步骤（5）包括使用乙醇洗涤DNA沉淀，优选75-95%（体积分数）的乙醇。
在一些实施方案中，所述方法还包括晾干残留乙醇，加入ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。
在一些实施方案中，所述生物样本是粪便样本。
在一些实施方案中，所述环境样本是土壤样本或水体样本。
在一些实施方案中，所述裂解包括使用化学裂解法，例如加入裂解液。
在一些实施方案中，所述裂解还包括使用机械裂解法，例如使用玻璃珠，例如在样本中加入玻璃珠涡旋震荡。
在一些实施方案中，所述沉淀剂还包含缓冲成分，所述缓冲成分是弱酸和/或弱酸盐，优选醋酸和/或醋酸钠。
在一些实施方案中，每克土壤或粪便样本使用约100-3000μg石墨相氮化碳，优选约200-2000μg石墨相氮化碳，更优选约300-1500μg石墨相氮化碳，包括所述范围内的300μg，400μg，500μg，600μg，700μg，800μg，900μg，1000μg，1100μg，1200μg，1300μg，1400μg和1500μg。
在一些实施方案中，所述沉淀剂的pH是2-7，优选2-6.5，更优选2-6，最优选2-5.5，包括所述范围内的5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.8、4.6、4.5、4.2、4、3.5、3、2.5和2。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中的石墨相氮化碳结合样本中的非核酸杂质。
在一些实施方案中，所述非核酸杂质是指抑制PCR过程的杂质，如抑制DNA聚合酶活性的杂质。
本申请的第四方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、沉淀剂、洗涤液和洗脱液，所述沉淀剂中包含石墨相氮化碳。
在一些实施方案中，所述试剂盒是核酸提取试剂盒，优选DNA提取试剂盒。
在一些实施方案中，所述裂解液包含离液剂，缓冲盐和表面活性剂。所述离液剂是例如胍盐、尿素和高氯酸锂中的一种或多种，优选胍盐，更优选盐酸胍和/或异硫氰酸胍；所述缓冲盐是磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐和Tris中的一种或多种，优选磷酸盐，更优选NaH2PO3和Na2HPO4中的一种或两种；所述表面活性剂是例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种或多种，优选非离子表面活性剂，更优选吐温20和癸基糖苷。
在一些实施方案中，所述沉淀剂还包含缓冲成分，所述缓冲成分是弱酸和/或弱酸盐，优选醋酸和/或醋酸钠。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中石墨相氮化碳的浓度是0.5-20mg/ml，优选0.5-10mg/ml，包括所述范围内的0.5mg/ml，0.8mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml，2.5mg/ml，2.8mg/ml，3mg/ml，3.5mg/ml，4mg/ml，4.5mg/ml，5mg/ml，5.5mg/ml，6mg/ml，6.5mg/ml，7mg/ml，7.5mg/ml，8mg/ml，8.5mg/ml，9mg/ml，9.5mg/ml和10mg/ml。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中石墨相氮化碳的浓度可以以所述浓度的倍数存在，例如2倍，3倍，5倍或10倍。
在一些实施方案中，所述沉淀剂的pH是2-7，优选2-6.5，更优选2-6，更2-5.5，包括所述范围内的5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.8、4.6、4.5、4.2、4、3.5、3、2.5和2。
在一些实施方案中，所述洗涤液包含缓冲成分和离液剂，所述缓冲成分是例如Tris和/或Tris-base，优选Tris-base；所述离液剂是例如胍盐、尿素和高氯酸锂中的一种或多种，优选胍盐，更优选盐酸胍和/或异硫氰酸胍。
在一些实施方案中，所述洗涤液还包括醇，所述醇是例如乙醇和/或异丙醇，优选异丙醇。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括漂洗液。
在一些实施方案中，所述漂洗液包括醇，优选乙醇和/或异丙醇，更优选乙醇。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括洗脱液。
在一些实施方案中，所述洗脱液是例如水或TE缓冲液。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括裂解结合液。
在一些实施方案中，所述裂解结合液包含离液剂、缓冲盐、金属螯合剂、醇和表面活性剂，所述离液剂是例如胍盐、尿素和高氯酸锂中的一种或多种，优选胍盐，更优选盐酸胍和/或异硫氰酸胍；所述缓冲盐是例如Tris和/或Tris-base；所述金属螯合剂是例如EDTA二钠；所述醇是例如乙醇和/或异丙醇，优选异丙醇；所述表面活性剂是例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种或多种，优选非离子表面活性剂，更优选非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂，更优选吐温20、PEG8000癸基糖苷、Triton X-100和N-月桂酰肌氨酸钠。
在一些实施方案中，所述裂解结合液还包含聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括固相载体，所述固相载体是磁珠、硅珠、离心柱和阴离子交换柱中的至少一种。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括样品裂解管，所述裂解管包含玻璃珠，优选酸洗玻璃珠。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括蛋白酶K。
在一些实施方案中，所述试剂盒用于行使第一方面所述的方法。
本申请的第五方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、沉淀剂和酚-氯仿溶液，所述沉淀剂中包含石墨相氮化碳。
在一些实施方案中，所述试剂盒是核酸提取试剂盒，优选DNA提取试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒用于实施第二方面所述的方法。
在一些实施方案中，所述沉淀剂还包含缓冲成分，所述缓冲成分是弱酸和/或弱酸盐，优选醋酸和/或醋酸钠。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中石墨相氮化碳的浓度是0.5-20mg/ml，优选0.5-10mg/ml，包括所述范围内的0.5mg/ml，0.8mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml，2.5mg/ml，2.8mg/ml，3mg/ml，3.5mg/ml，4mg/ml，4.5mg/ml，5mg/ml，5.5mg/ml，6mg/ml，6.5mg/ml，7mg/ml，7.5mg/ml，8mg/ml，8.5mg/ml，9mg/ml，9.5mg/ml和10mg/ml。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中石墨相氮化碳的浓度可以以所述浓度的倍数存在，例如2倍，3倍，5倍或10倍。
在一些实施方案中，所述沉淀剂的pH是2-7，优选2-6.5，更优选2-6，更2-5.5，包括所述范围内的5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.8、4.6、4.5、4.2、4、3.5、3、2.5和2。
在一些实施方案中，所述酚-氯仿溶液中还包含异戊醇，即酚-氯仿-异戊醇溶液。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括乙醇和/或异丙醇。
本申请的第六方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、沉淀剂以及饱和NaCl溶液或包含5-6M NaCl的溶液，所述沉淀剂中包含石墨相氮化碳。
在一些实施方案中，所述试剂盒是核酸提取试剂盒，优选DNA提取试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒用于实施第三方面所述的方法。
在一些实施方案中，所述沉淀剂还包含缓冲成分，所述缓冲成分是弱酸和/或弱酸盐，优选醋酸和/或醋酸钠。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中石墨相氮化碳的浓度是0.5-20mg/ml，优选0.5-10mg/ml，包括所述范围内的0.5mg/ml，0.8mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml，2.5mg/ml，2.8mg/ml，3mg/ml，3.5mg/ml，4mg/ml，4.5mg/ml，5mg/ml，5.5mg/ml，6mg/ml，6.5mg/ml，7mg/ml，7.5mg/ml，8mg/ml，8.5mg/ml，9mg/ml，9.5mg/ml和10mg/ml。
在一些实施方案中，所述沉淀剂中石墨相氮化碳的浓度可以以所述浓度的倍数存在，例如2倍，3倍，5倍或10倍。
在一些实施方案中，所述沉淀剂的pH是2-7，优选2-6.5，更优选2-6，更2-5.5，包括所述范围内的5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.8、4.6、4.5、4.2、4、3.5、3、2.5和2。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括乙醇和/或异丙醇。
附图说明
图1：粪便、土壤样本DNA提取产物电泳图；
图2：粪便、土壤样本DNA提取产物细菌16S rRNA位点PCR扩增产物电泳图；
图3：含有不同浓度石墨相氮化碳的Buffer X处理粪便、土壤样本得到的DNA扩增产物凝胶电泳图；
图4：平湖根部土壤样本DNA提取产物电泳图；
图5：平湖根部土壤样本DNA提取产物细菌16S rRNA位点PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案，但下述的实例仅仅是本申请的简易例子，并不代表或限制本申请的权利保护范围，本申请的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
试剂配制
样品裂解管：含有玻璃珠（Sigma，酸洗玻璃珠），玻璃珠直径为0.4-0.6 mm、质量为0.6 g/管；
Lysis buffer（裂解液）：200 mM NaH2PO3；200 mM Na2HPO4； 3M 异硫氰酸胍；5%癸基糖苷；5% Tween 20，pH 7；
Binding buffer（裂解结合液）：75 mM Tris-base；10mM EDTA·2Na·2H2O；0.1%PEG8000；3M 异硫氰酸胍；25% 异丙醇；10mM N-月桂酰肌氨酸钠；10% Tween20；0.01%Triton X-100；1.5% 聚乙烯吡咯烷酮，4% 癸基糖苷，pH 7；
Buffer X（沉淀剂）：1.5 mg/mL石墨相氮化碳（麦克林，G862684），100mM 醋酸钠，100mM醋酸，pH 5.5；
磁珠：超顺磁性氧化硅羟基纳米微球（瑞贝西，Rebeads® Mag OH 60），直径为20～1000nm，浓度为50mg/mL；
洗涤液：20mM Tris-base；60% 异丙醇；2M 盐酸胍，pH 7.5；
漂洗液：80% 乙醇；
洗脱液：纯水（Nuclease-free Water）。
实施例1
使用DNA提取试剂配合核酸自动化提取仪（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，VNP-32P），实现快速高通量提取，具体步骤如下：
1、样本裂解：
（1）向样品裂解管1中加入0.25g小麦地表皮土壤样品，以及700 μl Lysis buffer，涡旋或匀浆处理5-10分钟，在70℃水浴5分钟。
（2）向样品裂解管2中加入0.25g小鼠粪便样品，以及700 μl Lysis buffer，涡旋或匀浆处理5-10分钟，在70℃水浴5分钟。
2、 15，000 × g 离心1分钟。分别取500μl上清液于置于新的2ml离心管。
3、向前述步骤2中的离心管内分别加入150μl Buffer X，涡旋15S，涡旋混匀后冰浴10min，在冰浴过程中上下颠倒混匀2-3次，15，000 × g离心3-5min。无buffer X的对照组无这一步处理。
4、取步骤3中无buffer X的对照组上清500μl加置于96孔板第1列，为对照组，取步骤3实验组离心后的全部上清加置于96孔板第7列孔位，为实验组。样本添加好后将96深孔板放入核酸提取仪中，装上磁棒套，确认磁棒套安装到位，按表1程序进行自动化提取。
其中96孔板每列组分说明如下：
第1、7列全部孔位：Binding buffer 600μL；
第2、8列全部孔位：磁珠液 700μL；
第3、9列全部孔位：洗涤液 700μL；
第4、5、10和11列全部孔位：漂洗液 700μL；
第6、12列全部孔位：洗脱液80μL；
其中VNP-32P核酸自动提取仪程序设置如表1所示。
表1 VNP-32P核酸自动提取仪程序设置
5、提取产物检测分析
首先将从土壤和粪便样本中提取的DNA在NanoDrop 微量紫外/可见光分光光度计上进行浓度和纯度的测定，得到结果如表2所示。然后取5μL提取产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中，以110V电压进行电泳，然后再紫外凝胶成像系统中成像并观察结果，如图1所示。
表2 粪便、土壤样本DNA浓度及纯度
分别取2μL提取产物作为模板DNA，按照如下表3反应体系和表4程序进行细菌V3-V4可变区16S测序扩增PCR扩增，其中表5为上下游扩增引物的具体序列，分别取5μL PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中，以110V电压进行电泳，然后再紫外凝胶成像系统中成像并观察结果，得到PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图2所示。其中，PCR检测反应体系配置参考2 × Phanta Max Master Mix (VAZYME，P515)试剂盒。
表3 2 × Phanta Max Master Mix 反应体系
表4 PCR反应程序：
表5 细菌V3-V4可变区16S测序扩增引物序列
6、结果分析
（1）粪便土壤样本DNA提取产物结果分析
如表2，对于粪便和土壤样本，经过Buffer X处理后，DNA提取产物的浓度和纯度明显升高，说明Buffer X能够有效降低土壤和粪便样本中的杂质。如图1，与未经Buffer X处理的对照组相比，经过Buffer X处理的实验组电泳条带更加清晰。
（2）提取产物用细菌16S rRNA位点338F/806R PCR扩增结果分析
从土壤和粪便样本提取的DNA含有细菌DNA，对细菌16S rRNA可变区V3-V4进行PCR扩增以鉴定细菌多样性。当DNA产物杂质过多时会抑制PCR的扩增。图2中的扩增条带显示，当无Buffer X处理时，粪便和土壤样本的DNA提取产物均无法被338F/806R引物进行PCR扩增，经过Buffer X处理土壤和粪便样本后，DNA的提取产物均能被338F/806R 进行PCR扩增，说明Buffer X能够有效降低粪便和土壤样本中的杂质，提升DNA提取产物的扩增能力。
实施例2
Buffer X（沉淀剂）：N mg/mL石墨相氮化碳，100mM 醋酸钠，100mM醋酸，pH 5.5。
准备含有不同浓度石墨相氮化碳的Buffer X，其中N分别为0 mg/ml、0.5 mg/ml、1mg/ml、1.5 mg/ml、2 mg/ml和2.5 mg/ml，其余试剂及用量同实施例1。
样本准备、核酸提取、提取产物扩增以及电泳检测方法同实施例1，得到PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图3所示。
结果分析：如图3所示，Buffer X中石墨相氮化碳的浓度发生变化时，PCR产物的扩增能力也相应发生改变。当Buffer X中无石墨相氮化碳时，凝胶电泳图显示没有扩增条带，说明从土壤和粪便样本中提取得到的DNA产物杂质过多，无法进行338F/806R PCR扩增。当Buffer X中石墨相氮化碳浓度升高时，338F/806R PCR扩增能力升高，其中Buffer X含有1.5mg/ml和2mg/ml石墨相氮化碳时的扩增条带最清晰。综上，石墨相氮化碳能有效的处理土壤和粪便样本中的杂质，提升DNA的纯度和浓度，且杂质的去除也进一步提升下游的PCR扩增能力。
实施例3
Buffer X（沉淀剂）：1.5 mg/mL石墨相氮化碳，100mM 醋酸钠，100mM醋酸，pH 5.5。
对照：0.3 M硫酸铝铵，0.5M乙酸铵。
本实施例样本为平湖根部土，具体样本准备、核酸提取、提取产物扩增以及电泳检测方法同实施例1，得到提取产物和PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图4-图5所示。
结果分析：相比于硫酸铝铵和乙酸铵组合的沉淀剂，使用含有石墨相氮化碳的Buffer X进行提取获得的DNA凝胶电泳图和338F/806R PCR扩增电泳图均更加清晰。综上，石墨相氮化碳对土壤样本的除杂能力显著优于现有技术，使用石墨相氮化碳提取得到的DNA纯度和浓度高，下游PCR扩增能力强。

Claims (19)

1.一种核酸提取方法，所述方法包括：
步骤（1）收集生物样本或环境样本，裂解并释放核酸；
步骤（2）加入沉淀剂混匀，所述沉淀剂包含石墨相氮化碳，离心取上清；
步骤（3）使用固相载体吸附上清中的核酸；
步骤（4）清洗已吸附核酸的固相载体；
步骤（5）洗脱，获得提取后的核酸产物。
2.一种核酸提取方法，所述方法包括：
步骤（1）收集生物样本或环境样本，裂解并释放核酸；
步骤（2）加入沉淀剂混匀，所述沉淀剂包含石墨相氮化碳，离心取上清；
步骤（3）加入酚-氯仿溶液，混匀后，离心取上清液；
步骤（4）向上清液中加入异丙醇/乙醇，离心分离获得DNA沉淀；
步骤（5）洗涤DNA沉淀。
3.一种核酸提取方法，所述方法包括：
步骤（1）收集生物样本或环境样本，裂解并释放核酸；
步骤（2）加入沉淀剂混匀，所述沉淀剂包含石墨相氮化碳，离心取上清；
步骤（3）加入饱和NaCl溶液或包含5-6M NaCl的溶液，混匀后，离心取上清液；
步骤（4）向上清液中加入异丙醇/乙醇，离心分离获得DNA沉淀；
步骤（5）洗涤DNA沉淀。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述生物样本是粪便样本，所述环境样本是土壤样本或水体样本。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述裂解包括加入裂解液，所述裂解液包含离液剂，缓冲盐和表面活性剂。
6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述沉淀剂中石墨相氮化碳的浓度是0.5-20mg/ml，所述沉淀剂的pH是2-7。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述沉淀剂还包含缓冲成分，所述缓冲成分是弱酸和/或弱酸盐。
8.根据权利要求1所述的方法，所述固相载体是磁性吸附介质，或所述固相载体是硅基质吸附介质，或所述固相载体是阴离子交换材料。
9.根据权利要求1所述的方法，所述步骤（3）还包括加入裂解结合液，所述裂解结合液包含离液剂、缓冲盐、金属螯合剂、醇和表面活性剂。
10.根据权利要求1所述的方法，所述清洗包括加入洗涤液，所述洗涤液包含缓冲成分、醇和离液剂。
11.根据权利要求10所述的方法，所述清洗还包括加入漂洗液，所述漂洗液包括醇。
12.根据权利要求1所述的方法，所述洗脱包括加入洗脱液，所述洗脱液是水或TE缓冲液。
13.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述方法部分或全部通过手动操作进行，或所述方法部分或全部在自动核酸提取平台上进行，或所述方法部分或全部在微流体平台上进行。
14.一种试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、沉淀剂、洗涤液和洗脱液，所述沉淀剂中包含石墨相氮化碳。
15.一种试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、沉淀剂和酚-氯仿溶液，所述沉淀剂中包含石墨相氮化碳。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、沉淀剂以及饱和NaCl溶液或包含5-6M NaCl的溶液，所述沉淀剂中包含石墨相氮化碳。
17.根据权利要求14-16任一项所述的试剂盒，所述石墨相氮化碳的浓度是0.5-20mg/ml。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，所述沉淀剂中还包含缓冲成分，所述缓冲成分是弱酸和/或弱酸盐。
19.根据权利要求14-16任一项所述的试剂盒，所述沉淀剂的pH是2-7。
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