CN105821034A - 一种提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法 - Google Patents

一种提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭露一种提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法，其步骤为样本裂解、核酸的游离与杂质的抽除及磁珠法回收微生物基因组，磁珠为硅基生物磁珠，其表面涂覆一层疏水基团。与现有技术相比，本发明提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法的有益效果在于：在传统硅化磁珠表面增加疏水基团，可在磁珠完成对核酸亲和吸附后，在温和液体中改变吸附特性，对蛋白质、多糖等影响扩增的杂质进行吸附，从而提高纯化质量，特别是对微量、小片段的核酸的纯化及富集。

Description

一种提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，尤其涉及一种磁珠法核酸提取方法。
背景技术
磁珠法核酸提取为运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的核酸和RNA分离出来，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
磁珠法核酸提取一般可以分为四步：裂解——结合——洗涤——洗脱。具有传统核酸提取方法无法比拟的优势，主要体现在：①能够实现自动化、大批量操作，目前已有96孔的核酸自动提取仪，用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理，符合生物学高通量的操作要求，使得传染性疾病爆发时能够进行快速及时的应对，这一特点使得传统方法望尘莫及；②操作简单、用时短，整个提取流程只有四步，大多可以在36-40分钟内完成；③安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少，完全符合现代环保理念；④磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。
但该方法在提取过程中，会残留一些少量的杂质(如蛋白质、多糖、脂肪等)，无法达到最大的纯化效果。
因此，有必要提出新的一种磁珠法核酸提取方法来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种磁珠法核酸提取方法，提高纯化质量的效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法，其步骤为样本裂解、核酸的游离与杂质的抽除及磁珠法回收微生物基因组，所述磁珠法回收微生物基因组的步骤如下：将所述核酸的游离与杂质的抽除后的溶液样本中加入等体积的第八种缓冲剂，振荡，室温放置，将盛装该溶液样本的离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，去掉液体，保留磁珠，向磁珠的离心管中加入第九种缓冲剂，打匀后室温静置，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，再去掉液体，保留磁珠；再向含有磁珠离心管中加入第十种缓冲剂，待磁珠吸附到离心管一侧时西区液体；该液体即为粪便样本的核酸；磁珠为硅基生物磁珠，其表面涂覆一层疏水基团。
所述疏水基团为C10～C20的烃基或含有芳基、酯、醚、胺、酰胺基团的烃基或含有双键的烃基。
所述样板裂解的步骤为：提供一种0.3-05g粪便样本，将粪便样板放入2ml的离心管中，加入1-2ml第一种缓冲剂进行振荡1-2min，通过旋转离心管，转移上清至新的离心管中，再次高速旋转，丢弃上清，保留沉淀物；向沉淀物中加入450-600ul第二种缓冲剂及第三种缓冲剂，再加入分别为第65-60ul的第四种缓冲剂与第五种缓冲剂，混匀后37-60度水浴1-2小时；核酸的游离与杂质的抽除的步骤为：向溶液中加入600-800ul第六种缓冲剂，振荡30-60s后，离心10-20分钟，将上清移至新的离心管中，加入等体积的第七中缓冲剂，高速旋转10-20分钟，将上清移至新的离心管中；第一种缓冲剂包括0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾，0.175-0.2mol/L的氢氧化钠，PH＝7-8，第二种缓冲剂包括10-20mM三羟甲基氨基甲烷、1-10mM乙二胺四乙酸，PH＝5.0-8.0；第三种缓冲剂为10-50mg/ml的溶菌酶，第四种缓冲剂与第五种缓冲剂：蛋白酶K(20-50mg/ml)与十二烷基硫酸钠(质量体积比：10-20％)；第六种缓冲剂：酚：氯仿：异戊醇的体积比25:24:1，第七种缓冲剂：氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
第八种缓冲剂：异丙醇：磁珠混悬液的体积比24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水安装1:2体积比配置，第九种缓冲剂：4.3-21.4mol/L三羟甲基氨基甲烷，2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸，42.9-85.7mmol/L氯化钠，60％-80无水乙醇，第十种缓冲剂：8-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，PH＝8.0-9.0。
与现有技术相比，本发明提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法的有益效果在于：在传统硅化磁珠表面增加疏水基团，可在磁珠完成对核酸亲和吸附后，在温和液体中改变吸附特性，对蛋白质、多糖等影响扩增的杂质进行吸附，从而提高纯化质量，特别是对微量、小片段的核酸的纯化及富集。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法，其包括如下步骤：
本实施例，提供一种0.3-05g粪便样本，将粪便样板放入2ml的离心管中，加入1-2ml第一种缓冲剂进行振荡1-2min，第一种缓冲剂包括0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾，0.175-0.2mol/L的氢氧化钠，PH＝7-8，通过旋转离心管，转移上清至新的离心管中，再次高速旋转，丢弃上清，保留沉淀物；
粪便样本裂解：向沉淀物中加入450-600ul第二种缓冲剂及第三种缓冲剂，第三种缓冲剂为溶菌酶(10-50mg/ml)，第二种缓冲剂包括10-20mM三羟甲基氨基甲烷、1-10mM乙二胺四乙酸，PH＝5.0-8.0；混匀在37-40度水浴1-2h，
再加入分别为第65-60ul的第四种缓冲剂与第五种缓冲剂，混匀后37-60度水浴1-2小时；第四种缓冲剂与第五种缓冲剂：蛋白酶K(20-50mg/ml)与十二烷基硫酸钠(质量体积比：10-20％)，
核酸的游离与杂质的抽除：向溶液中加入600-800ul第六种缓冲剂，振荡30-60s后，离心10-20分钟，将上清移至新的离心管中，加入等体积的第七中缓冲剂，高速旋转10-20分钟，将上清移至新的离心管中。
磁珠法回收微生物基因组：加入等体积的第八种缓冲剂，振荡10-20s，室温放置5-10分钟，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，去掉液体，保留磁珠。向磁珠的离心管中加入1-20ml第九种缓冲剂，打匀后室温静置5-10分钟，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，再去掉液体，保留磁珠。再向含有磁珠离心管中加入50-100ul第十种缓冲剂，经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时西区液体。该液体即为粪便样本的核酸。
其中：第六种缓冲剂：酚：氯仿：异戊醇的体积比25:24:1；
第七种缓冲剂：氯仿：异戊醇的体积比为24:1；
第八种缓冲剂：异丙醇：磁珠混悬液的体积比24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水安装1:2体积比配置。
第九种缓冲剂：4.3-21.4mol/L三羟甲基氨基甲烷，2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸，42.9-85.7mmol/L氯化钠，60％-80无水乙醇。
第十种缓冲剂：8-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，PH＝8.0-9.0。
该磁珠为硅基生物磁珠，及表面涂覆一层疏水基团。
疏水基团通常是C10～C20的烃基；含有芳基、酯、醚、胺、酰胺等基团的烃基；或含有双键的烃基中的一种。
在传统硅化磁珠表面增加疏水基团，可在磁珠完成对核酸亲和吸附后，在温和液体中改变吸附特性，对蛋白质、多糖等影响扩增的杂质进行吸附，从而提高纯化质量，特别是对微量、小片段的核酸的纯化及富集。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容知直接或间接运用在其它相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法，其步骤为样本裂解、核酸的游离与杂质的抽除及磁珠法回收微生物基因组，所述磁珠法回收微生物基因组的步骤如下：将所述核酸的游离与杂质的抽除后的溶液样本中加入等体积的第八种缓冲剂，振荡，室温放置，将盛装该溶液样本的离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，去掉液体，保留磁珠，向磁珠的离心管中加入第九种缓冲剂，打匀后室温静置，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，再去掉液体，保留磁珠；再向含有磁珠离心管中加入第十种缓冲剂，待磁珠吸附到离心管一侧时西区液体；该液体即为粪便样本的核酸；其特征在于：磁珠为硅基生物磁珠，其表面涂覆一层疏水基团。
2.如权利要求1所述的提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：所述疏水基团为C10～C20的烃基或含有芳基、酯、醚、胺、酰胺基团的烃基或含有双键的烃基。
3.如权利要求1所述的提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：所述样板裂解的步骤为：提供一种0.3-05g粪便样本，将粪便样板放入2ml的离心管中，加入1-2ml第一种缓冲剂进行振荡1-2min，通过旋转离心管，转移上清至新的离心管中，再次高速旋转，丢弃上清，保留沉淀物；向沉淀物中加入450-600ul第二种缓冲剂及第三种缓冲剂，再加入分别为第65-60ul的第四种缓冲剂与第五种缓冲剂，混匀后37-60度水浴1-2小时；核酸的游离与杂质的抽除的步骤为：向溶液中加入600-800ul第六种缓冲剂，振荡30-60s后，离心10-20分钟，将上清移至新的离心管中，加入等体积的第七中缓冲剂，高速旋转10-20分钟，将上清移至新的离心管中；第一种缓冲剂包括0.25-0.37mol/L磷酸二氢钾，0.175-0.2mol/L的氢氧化钠，PH＝7-8，第二种缓冲剂包括10-20mM三羟甲基氨基甲烷、1-10mM乙二胺四乙酸，PH＝5.0-8.0；第三种缓冲剂为10-50mg/ml的溶菌酶，第四种缓冲剂与第五种缓冲剂：20-50mg/ml蛋白酶K与质量体积比：10-20％的十二烷基硫酸钠；第六种缓冲剂：酚：氯仿：异戊醇的体积比25:24:1，第七种缓冲剂：氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
4.如权利要求1所述的提高纯化效果的磁珠法核酸提取方法，其特征在于：第八种缓冲剂：异丙醇：磁珠混悬液的体积比24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水安装1:2体积比配置，第九种缓冲剂：4.3-21.4mol/L三羟甲基氨基甲烷，2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸，42.9-85.7mmol/L氯化钠，60％-80无水乙醇，第十种缓冲剂：8-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，PH＝8.0-9.0。
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